Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej
19 lipca 2021
Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.
Aby zaobserwować znakomitą naturalną ultrastrukturę komórek, konieczne jest utrwalenie komórek poprzez szybkie zamrażanie. Zamrażanie kanapkowe to jedna z najlepszych metod zamrażania komórek bez tworzenia kryształków lodu. Protokół ten demonstruje zastosowanie urządzenia do zamrażania kanapek, a także opisuje procedurę wytwarzania ultracienkich odcinków próbek podmienionych przez zamrażanie po zamrożeniu kanapek.
Przygotowanie ciekłego propanu należy rozpocząć od napełnienia pojemnika na ciekły azot urządzenia do zamrażania kanapkowego lub SFD ciekłym azotem. Napełnij pojemnik na ciekły propan ciekłym propanem, wprowadzając gaz propan za pomocą drobnej dyszy. Przyspiesz krzepnięcie propanu za pomocą schłodzonego metalowego pręta.
Aby przygotować miedziane krążki płaskie i koszowe, umieść je na szklanym szkiełku stroną bez liter do góry i potraktuj wyładowaniem jarzeniowym o napięciu 10 paskalów, 400 woltów, jednym miliamperze przez 30 sekund, aby powierzchnia dysku była hydrofilowa za pomocą aparatu do wykrywania jonów. Przenieść zawiesinę komórkową do dwumililitrowej probówki wirówkowej i wirować przy 2 900 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i zawiesić osad do uzyskania gęstej zawiesiny.
Umieść niewielką ilość lub około 0,02 mikrolitra zawiesiny komórek na miedzianym krążku. Przykryj go kolejnym miedzianym krążkiem i podnieś krążki pęsetą. Zrób studzienkę w środku stałego propanu za pomocą cienkiego metalowego pręta.
Umieść pęsetę w SFD i szybko ją zamroź, naciskając przycisk wstrzykiwania w aparacie. Namocz zużytą pęsetę w wodzie o temperaturze pokojowej, aby je ogrzać i zamrozić następujące próbki. Używaj tkanek zwierzęcych i ludzkich utrwalonych w 2,5% aldehydzie glutarowym, 0,1-molowym buforze fosforanowym o pH 7,4.
Pokrój je na odcinki o grubości od 0,1 do 0,2 milimetra za pomocą żyletki pod mikroskopem stereoskopowym. Umieść niewielką kroplę roztworu aldehydu glutarowego na miedzianym krążku typu koszowego, a następnie za pomocą pęsety umieść kawałek tkanki w aldehydzie glutarowym na miedzianym krążku i przykryj go płaskim miedzianym krążkiem. Szybko zamroź krążki z tkankami w topniejącym propanu SFD, jak pokazano wcześniej.
Przenieś krążki do ciekłego azotu w kąpieli roboczej. Za pomocą pęsety schłodzonej ciekłym azotem odłącz krążki od siebie, aby odsłonić próbkę. Umieść krążki z komórkami w szklanej fiolce wypełnionej jednym mililitrem acetonu zawierającego 2% tetratlenku osmu, który został umieszczony w ciekłym azocie i zestalony.
Przenieś krążki do głębokiej zamrażarki i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez dwa do czterech dni w celu zamrożenia komórek. Stopniowo doprowadzaj próbki do temperatury pokojowej, inkubując je przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś krążki do dwóch mililitrowych plastikowych rurek, które są wypełnione jednym mililitrem acetonu.
Przygotuj żywicę epoksydową, mieszając odczynniki w jednorazowym plastikowym pojemniku za pomocą mieszadła. Wymieniaj aceton kolejno na 30% żywicy w acetonie, 60% żywicy i 90% żywicy w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę każda, a następnie wymieniaj 90% żywicę na 100% żywicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Na koniec zanurz próbki w 100% żywicy w silikonowej formie do zatapiania i polimeryzuj je w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Wyjmij spolimeryzowane bloki z silikonowych form do zatapiania i napisz numer próbki na bloku. Usuń miedziane krążki z bloku za pomocą żyletki i przytnij próbki osadzone na powierzchni bloku za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania i żyletek pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie nałóż taśmę na uchwyt bloku próbki i uchwyt próbki mikrotomu i odetnij taśmę na granicy.
Usuń blok z ultramikrotomu, umieść go w mikroskopie stereoskopowym i przytnij go dalej do 0,2 milimetra na 0,3 milimetra za pomocą żyletki. Nałóż neopren na kratki, aby były przyklejone. Umieść blok z powrotem na ultramikrotomie, wyrównując zaklejone części.
Przykryj ultramikrotom plastikową osłoną i wytnij odcinki o grubości od 50 do 70 nanometrów. Odzyskaj sekcje za pomocą pętli. Zamontuj je na miedzianych kratkach o siatce 300 lub 400 potraktowanych neoprenem i wysusz.
Ustaw kratki z sekcjami w rowku połówki rurki silikonowej. Namocz próbki w roztworze octanu uranylu przez trzy minuty. Zebrać zużyty roztwór uranylu i przechowywać go w strzykawce.
Umyj próbki w pół probówki strumieniem wody, a następnie namocz próbki w cytrynianie ołowiu przez trzy minuty. W przypadku próbek drożdży i grzybów umieść siatki na bibule filtracyjnej, podnieś je pęsetą i przykryj plazmowo polimeryzowaną folią naftalenową na powierzchni wody. Włóż siatki do uchwytu próbki mikroskopu elektronowego, a następnie włóż uchwyt próbki do mikroskopu elektronowego i obserwuj przy 100 kilowoltach.
Ultracienkie skrawki zarówno E. coli, jak i S. cerevisiae obserwowane pod mikroskopem elektronowym wykazywały naturalną morfologię i wyraźne obrazy. Pod mikroskopem elektronowym obserwowano ultracienkie skrawki hodowanych komórek szybko zamrożonych za pomocą SFD. Obrazy ultra cienkich odcinków ludzkiej skóry były bardzo wyraźne i pokazywały naturalną morfologię.
Cząstki rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B zostały szybko zamrożone za pomocą SFD i obserwowane za pomocą kriomikroskopii elektronowej. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że należy nałożyć bardzo małą ilość komórek na miedziane krążki, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu po zamrożeniu. Dzięki uprzedniemu utrwaleniu tkanek zwierzęcych aldehydem glutarowym uzyskuje się dobre zamrażanie na głębokości około 200 mikrometrów podobną do głębokości osiąganej przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem.
Technika ta toruje badaczom drogę do łatwej obserwacji wyjątkowej naturalnej ultrastruktury komórek przy niskich kosztach.
Przegląd
Niniejszy artykuł demonstruje zastosowanie urządzenia do mrożenia kanapkowego (SFD) do szybkiego mrożenia próbek biologicznych, co umożliwia lepszą konserwację ultrastruktury komórkowej do mikroskopii elektronowej. Protokół szczegółowo opisuje przygotowanie próbek, szybkie mrożenie, mrożenie z substytucją, zatapianie w żywicy, poniecienie ultracienkich przekrojów, barwienie oraz obrazowanie, co ma zastosowanie do bakterii, drożdży, hodowli komórkowych, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikroskopia elektronowa
- Techniki przygotowania próbek
Wprowadzenie
- Fiksacja chemiczna często wprowadza artefakty i nie zachowuje w sposób odpowiedni ultrastruktury komórkowej.
- Szybkie mrożenie, w szczególności mrożenie metodą kanapkową (sandwich freezing), zapobiega tworzeniu się kryształków lodu i lepiej utrzymuje natywną strukturę komórek.
- Własnoręcznie wykonane urządzenia do mrożenia metodą kanapkową ograniczały szersze zastosowanie tej techniki; nowy, dostępny komercyjnie aparat rozwiązuje ten problem.
- Zamiana mrożenia (freeze-substitution) oraz zatapianie w żywicy są niezbędne do przygotowania ultraw cienkich przekrojów do mikroskopii elektronowej.
Cel badania
- Zaprezentowanie zastosowania komercyjnego urządzenia do zamrażania metodą kanapkową w celu szybkiego zamrażania różnorodnych próbek biologicznych.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu przygotowania próbek do mikroskopii elektronowej po szybkim zamrażaniu.
- Wykazanie skuteczności tej metody w zachowaniu naturalnej morfologii komórkowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie ciekłego propanu i miedzianych krążków do zamrażania.
- Aplikacja próbek komórek lub tkanek pomiędzy miedziane krążki i szybkie zamrażanie w stałym propanie przy użyciu urządzenia SFD.
- Mroźna substytucja w acetonie z zastosowaniem tetrautlenku osmu w temperaturze -80°C, a następnie stopniowe ogrzewanie.
- Zalewanie żywicą, przycinanie bloków, cięcie ultrazupek (50–70 nm) i montaż na miedzianych siatkach.
- Barwienie octanem uranylu i cytrynianem ołowiu oraz obrazowanie za pomocą mikroskopii elektronowej.
Główne wyniki
- Ultracienkie przekroje E. coli, S. cerevisiae, hodowlanych komórek oraz ludzkiej skóry wykazały wyraźną, naturalną morfologię w badaniu za pomocą mikroskopii elektronowej.
- Cząsteczki rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B zostały pomyślnie zaobserwowane przy użyciu krio-mikroskopii elektronowej po szybkim zamrażaniu.
- Fiksacja glutaraldehydem przed zamrażaniem umożliwiła dobrą konserwację do głębokości 200 µm, co jest porównywalne z mrożeniem wysokociśnieniowym.
- Minimalne tworzenie się kryształów lodu osiągnięto poprzez zastosowanie bardzo małych objętości próbek.
Wnioski
- Urządzenie do mrożenia metodą „kanapkową” umożliwia łatwą, niedrogą i skuteczną konserwację ultrastruktury komórkowej do mikroskopii elektronowej.
- Metoda ta ma szerokie zastosowanie w przypadku różnych próbek biologicznych, w tym komórek, tkanek i wirusów.
- Prawidłowa obsługa próbek oraz stosowanie minimalnych objętości są kluczowe dla uzyskania optymalnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zachowanie natywnej ultrastruktury komórkowej jest kluczowe dla mechanistycznej minimalizacji ryzyka oraz walidacji punktów uchwytu w fazie wczesnego odkrywania i badań translacyjnych. Urządzenie do mrożenia kanapkowego umożliwia szybkie przygotowanie próbek do mikroskopii elektronowej z minimalną liczbą artefaktów, co pozwala na przeprowadzenie wysokoniezawodnej analizy morfologicznej w różnorodnych układach biologicznych. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w kluczowych punktach zwrotnych w procesie badawczo-rozwojowym w branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia wysokiej jakości wizualizację struktur komórkowych i subkomórkowych w celu testowania hipotez mechanistycznych.
- Redukuje artefakty utrwalania, wspierając walidację funkcjonalną celów oraz biologiczne ograniczanie ryzyka.
- Ułatwia porównawczą analizę ultrastrukturalną różnych typów komórek i tkanek w celu selekcji projektów w portfelu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia standaryzowane i powtarzalne przygotowanie próbek do późniejszych analiz opartych na EM.
- Umożliwia ilościową ocenę morfologiczną w celu sprawdzenia gotowości do przesiewu oraz walidacji testu.
- Pozwala na skalowalne przygotowanie różnorodnych preparatów biologicznych, w tym bakterii, drożdży, komórek ssaków i tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność analizy tkanek w kontekście chorobowym z zachowaniem ultrastruktury dla ciągłości translacyjnej.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez umożliwienie uzyskania wiarygodnych punktów końcowych w zakresie morfologii.
- Ułatwia porównania międzygatunkowe i między-modelowe dla walidacji przedklinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Urządzenie do mrożenia metodą kanapkową integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając solidne przygotowanie próbek do analizy EM, od wczesnych faz odkrywania po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie architektury komórkowej i lokalizacji szlaków w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów ultrastrukturalnych do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze dane morfologiczne do statystycznego porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność ultrastrukturalną w tkankach istotnych klinicznie, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Oferuje zestandaryzowany, skalowalny protokół, który można dostosować do wielu modeli biologicznych i zespołów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek, poprawiając powtarzalność i skalowalność w różnych projektach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka oraz rozwój programów odkrywczych i translacyjnych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii elektronowej i przygotowywania próbek w celu uzyskania optymalnych wyników.
- Wymaga dostępu do aparatury do szybkiego mrożenia, kriogenów oraz infrastruktury EM.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość zastosowania w szerokim zakresie preparatów biologicznych, w tym komórek, tkanek i wirusów.
- Objętość próbki i sposób jej obchodzenia są kluczowe dla zapobiegania tworzeniu się kryształków lodu i zachowania ultrastruktury.
