Name: Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę szybkiego zamrażania kanapkowego do zachowania ultrastruktury komórek w mikroskopii elektronowej. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, zamrażanie, substytucję i obrazowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UWAGA: Protokół badania dla próbek ludzkich został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Biomedycznych Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Chiba (3085). Tetrtlenek osmu jest niebezpieczną substancją chemiczną; Należy obchodzić się z nim w rękawicach w okapie. Rysunek 1 przedstawia urządzenie do zamrażania kanapek i niezbędne narzędzia28. Rysunek 2 pokazuje materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentów z zamrażaniem kanapek. Szklane fiolki są napełniane acetonem zawierającym tetratlenek osmu i przechowywane w temperaturze -80°C do momentu użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Miedziane krążki mają średnicę 3 mm, nie mają otworów, mają literę po jednej stronie i są dostępne w handlu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).
1. Szybkie zamrażanie zawiesin komórkowych w celu zamrożenia-substytucji
UWAGA: Cała procedura jest pokazana w Rysunek 3.
<ol>
	<li>Komórek
	<ol>
		<li>Użyj zawiesin komórkowych bakterii, drożdży (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A), komórek hodowlanych i izolowanych komórek do zamrażania kanapek. 
		UWAGA: Można używać zarówno żywych, jak i utrwalonych w aldehydzie glutarowym komórek28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ciekłego propanu 
	UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać rękawic kriogenicznych i okularów ochronnych. Ponieważ propan jest wybuchowy, należy uważać, aby nie używać ognia w tym samym pomieszczeniu, a okna powinny być otwarte.
	<ol>
		<li>Napełnij pojemnik z ciekłym azotem SFD ciekłym azotem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A). Napełnij pojemnik na płynny propan ciekłym propanem, wprowadzając gaz propan za pomocą drobnej dyszy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B, C). Przyspiesz krzepnięcie propanu za pomocą chłodzonego metalowego pręta (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4D,E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie krążków miedzianych
	<ol>
		<li>Umieść miedziane krążki na szkle szkiełkowym stroną bez liter do góry (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D) i traktuj wyładowaniem jarzeniowym o napięciu 10 Pa, 400 woltów, 1 mA przez 30 s (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4F,G), aby powierzchnia dysku była hydrofilowa za pomocą aparatu do rozpylania jonów30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekładanie i zamrażanie wgłębne zawiesiny komórek
	<ol>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 5A) i wiruj przy 2,900 × g przez 10 s w temperaturze pokojowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 5B,C). Usunąć supernatant i zawiesić osad w celu uzyskania gęstej zawiesiny (patrz omówienie).</li>
		<li>Umieść niewielką ilość zawiesiny komórek (~0,02 μL) na miedzianym krążku (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D-F), przykryj go innym miedzianym krążkiem (<silna klasa="xfig">Rysunek 5G) i podnieś krążki pęsetą (<silna klasa="xfig">Rysunek 5H). 
		UWAGA: Aby zmierzyć ~0,02 μl zawiesiny komórek, obserwuj 0,1 μl kropli zawiesiny pod mikroskopem stereoskopowym i podziel je na kropelki, które stanowią 1/5 tej objętości.</li>
		<li>Zrób studzienkę w środku stałego propanu za pomocą cienkiego metalowego pręta (<silna klasa="xfig">Rysunek 5I). Umieść pęsetę w SFD i szybko ją zamroź, naciskając przycisk wstrzykiwania aparatu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5J,K). 
		UWAGA: Należy uważać, aby nie wysuszyć próbek i nie położyć dwóch krążków całkowicie jeden na drugim (w przeciwnym razie ich odłączenie stanie się bardzo trudne w następnym kroku).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekładanie i zamrażanie wgłębne tkanek zwierzęcych i ludzkich
	<ol>
		<li>Użyj tkanek zwierzęcych i ludzkich (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) utrwalonych w 2,5% buforze fosforanowym aldehydu glutarowego-0,1 M (pH 7,4) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 6A,B). Pokrój je na odcinki o grubości od 0,1 do 0,2 mm za pomocą żyletki pod mikroskopem stereoskopowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C,D).
		<ol>
			<li>Umieść małą kroplę (~0,02 μL) roztworu aldehydu glutarowego na miedzianym krążku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6E, F). Następnie za pomocą pęsety umieść kawałek tkanki w aldehydzie glutarowym na miedzianym krążku (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 6G, H) i przykryj go innym miedzianym krążkiem (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 6I-K).</li>
			<li>Szybko zamrozić krążki z tkankami w topiącym się propanu SFD, jak opisano w sekcji 1.4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 5J,K). 
			UWAGA: Ponieważ aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną, należy obchodzić się z nim w rękawiczkach pod wyciągiem. Chusteczki nie powinny być myte po umieszczeniu na miedzianym krążku, ale trzymane w roztworze aldehydu glutarowego, ponieważ aldehyd glutarowy ma działanie zapobiegające zamarzaniu1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie i substytucja acetonem osmu
	<ol>
		<li>Przenieś dyski do ciekłego azotu w kąpieli roboczej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 7A,B). Używając pęsety schłodzonej ciekłym azotem, odłącz dyski od siebie, aby odsłonić próbkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C-E).</li>
		<li>Umieść krążki z komórkami w szklanej fiolce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7F) wypełnionej 1 ml acetonu zawierającego 2% tetratlenku osmu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B), która została umieszczona w ciekłym azocie i zestalona (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4H).</li>
		<li>Przenieś dyski do głębokiej zamrażarki i przechowuj je w temperaturze -80°C przez 2-4 dni w celu zamrożenia komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Namocz zużytą pęsetę w wodzie o temperaturze pokojowej, aby je ogrzać (<silna klasa="xfig">Rysunek 7G) w celu zamrożenia następujących próbek. 
		UWAGA: Pęseta do obchodzenia się z próbką powinna być ciepła (temperatura pokojowa), ponieważ zimna pęseta może zamrozić próbkę przed szybkim zamrożeniem, prowadząc do tworzenia się kryształków lodu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzewanie i osadzanie próbki
	<ol>
		<li>Stopniowo doprowadzaj próbki do temperatury pokojowej (2 godziny w temperaturze -20°C, 2 godziny w temperaturze 4°C i 15 minut w temperaturze pokojowej, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 8A) i przenieś krążki do plastikowych probówek o pojemności 2 ml wypełnionych 1 ml acetonu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3 i <silna klasa = "xfig">Rysunek 8B,C).</li>
		<li>Przygotuj żywicę epoksydową, mieszając odczynniki w jednorazowym plastikowym pojemniku za pomocą mieszadła (<silna klasa = "xfig">Rysunek 8D-F).</li>
		<li>Aceton w kroku 1.7.1 wymieniać kolejno na 30% żywicy (w acetonie), 60% żywicy i 90% żywicy w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę każde. Następnie wymień 90% żywicę na 100% żywicę w temperaturze 37°C przez noc. Na koniec zanurz próbki w 100% żywicy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 8G-J) w formie do zatapiania krzemu i polimeryzuj je w temperaturze 60 ° C przez 24 godziny (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3). 
		UWAGA: Próbki powinny pozostać przymocowane do miedzianych krążków przez cały czas trwania procedury (aby ułatwić cięcie). Nie zaleca się stosowania aparatu obrotowego lub wytrząsającego podczas procesu zatapiania, ponieważ w niewielkim stopniu przyczyniają się one do przenikania żywicy do komórki. Co więcej, wibracje z aparatu czasami powodują odklejanie się próbek od miedzianych dysków. Inkubacja w temperaturze 37°C przez noc przyspieszyłaby przenikanie żywicy do ogniwa pod wpływem energii cieplnej (żywica nie polimeryzowałaby się, ponieważ nie zawiera żadnego akceleratora).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przycinanie bloków próbek
	<ol>
		<li>Wyjmij spolimeryzowane bloki z silikonowych form do zatapiania (<silna klasa="xfig">Rysunek 9A). Napisz numer próbki na bloku (<silna klasa="xfig">Rysunek 9B).</li>
		<li>Usuń miedziane krążki z bloku za pomocą żyletki (<silna klasa="xfig">Rysunek 9C,D) i przytnij próbki osadzone na powierzchni bloku do 0,7 mm x 0,7 mm za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania (<silna klasa="xfig">Rysunek 9E) i żyletki (<silna klasa="xfig">Rysunek 9F-H) pod mikroskopem stereoskopowym31.</li>
		<li>Umieść blok w uchwycie na próbki ultramikrotomu (<silna klasa="xfig">Rysunek 9I) i gładko wytnij powierzchnię bloku za pomocą diamentowego noża do przycinania (<silna klasa="xfig">Rysunek 9J,K).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcie ultracienkich odcinków
	<ol>
		<li>Usuń blok z ultramikrotomu (<silna klasa="xfig">Rysunek 10A)31, umieść go w mikroskopie stereoskopowym i przytnij go dalej do 0,2 mm x 0,3 mm za pomocą żyletki (<silna klasa="xfig">Rysunek 10B,C).</li>
		<li>Nałóż neopren na kratki, aby były przyczepne (<silna klasa="xfig">Rysunek 10D). Umieść blok z powrotem na ultramikrotomie, przykryj ultramikrotom plastikową osłoną (<silna klasa="xfig">Rysunek 10E)31 i wytnij odcinki o grubości 50-70 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 10F-H).</li>
		<li>Odzyskaj sekcje za pomocą pętli (<silna klasa="xfig">Rysunek 10I), zamontuj je na miedzianych kratkach o siatce 300 lub 400 potraktowanych neoprenem i wysusz je (<silna klasa="xfig">Rysunek 10J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przekrojów i obserwacja pod mikroskopem elektronowym
	<ol>
		<li>Ustaw siatki z sekcjami w rowku połówki rurki silikonowej (Rysunek 11A)31, i namocz w roztworze octanu uranylu i cytrynianu ołowiu przez 3 minuty każdy w celu barwienia (Rysunek 11B-E)32.</li>
		<li>W przypadku próbek drożdży i grzybów umieść siatki na bibule filtracyjnej (4 mm x 4 mm), podnieś je pęsetą i przykryj plazmowo polimeryzowaną folią naftalenową 33 na powierzchni wody (<silna klasa="xfig">Rysunek 11F,G). Włóż siatki do mikroskopu elektronowego i obserwuj pod napięciem 100 kV (<silna klasa="xfig">Rysunek 11H,I).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Szybkie zamrażanie wirusów i makrocząsteczek
<ol>
	<li>Przygotowanie ciekłego etanu 
	UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać rękawic kriogenicznych i okularów ochronnych. Ponieważ etan jest materiałem wybuchowym, należy uważać, aby nie palić ognia w tym samym pomieszczeniu, a okna powinny być otwarte. Etan jest używany, ponieważ odparowuje w mikroskopie elektronowym, podczas gdy propan nie.
	<ol>
		<li>Napełnij pojemnik z ciekłym azotem SFD ciekłym azotem. Napełnij pojemnik ciekłym etanem ciekłym etanem, wprowadzając etan przez cienką dyszę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i szybkie zamrażanie mikrosiatek i próbek
	<ol>
		<li>Spraw, aby obie powierzchnie mikrosieci były hydrofilowe, traktując je wyładowaniem jarzeniowym (10 Pa, 400 V, 1 mA) za pomocą aparatu do rozpylania jonowego30.</li>
		<li>Umieść mikrosiatkę w SFD i nałóż 2 μl wirusa lub zawiesiny wielkocząsteczkowej (1 mg białka/ml) na mikrosiatki. Usunąć nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej i szybko zamrozić mikrosiatkę, naciskając przycisk wstrzykiwania aparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczenie zamrożonej mikrosieci w uchwycie do kriotransferu i obserwacja pod mikroskopem elektronowym
	<ol>
		<li>Przenieś zamrożone mikrosiatki w ciekłym azocie, umieść je wcześniej w uchwycie do kriotransferu schłodzonym temperaturą ciekłego azotu i obserwuj pod mikroskopem elektronowym w niskiej temperaturze34.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Poniższa dyskusja opiera się na ponad 120 eksperymentach z zamrażaniem i zamrażaniem kanapek na ponad 1000 próbkach oraz na ponad 70 eksperymentach z mikroskopią krioelektronową na ponad 75 próbkach przeprowadzonych w ciągu 36 lat.
Wskaźnik sukcesu dobrego zamrażania przez zamrażanie kanapek Wskaźnik sukcesu w osiągnięciu dobrego zamrażania zależy od próbek. Komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae (drożdże) hodowane w pożywce YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy) dały prawie 100% sukces w dobrym zamrażaniu bez tworzenia się kryształków lodu 10,11,15,35,36. Inne gatunki drożdży, w tym Shizosaccharomyces 37,38,39, Cryptococcus 14,40,41,42,43,44,45, Exophiala 13,41,46,47,48, 49, Fusarium 50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57 i Trichosporon, również wykazały dobre zamrażanie. Bakterie, w tym Mycobacterium58,59 i E. coli16, również wykazały dobre mrożenie. Hodowane komórki i izolowane komórki zwierzęce wykazywały dobre zamrażanie zarówno dla komórek żywych, jak i utrwalonych aldehydem glutarowym 1,25,26,27,60. Tkanki zwierzęce i ludzkie utrwalone aldehydem glutarowym pokrojone na grubość od 0,1 do 0,2 mm również wykazywały dobre zamrożenie w większości przypadków 1,28.
Warunki dobrego zamrażania Używaj tylko komórek w odpowiednim etapie wzrostu i stanie. Komórki w hodowli powinny znajdować się w fazie wykładniczej. Nałóż bardzo małe ilości zawiesin komórkowych skoncentrowanych próbek (dla S. cerevisiae, ~0,02 μl 3-5 × 109 komórek/ml) na miedziany krążek. Plastry tkanek zwierzęcych lub ludzkich utrwalone aldehydem glutarowym powinny być również bardzo małe (najlepiej 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Ponieważ cięcie plastrów chusteczek o grubości 0,1 mm jest trudne, pokrój wiele tkanek i wybierz cienkie i półprzezroczyste plasterki. Pracuj szybko, ale ostrożnie i nie pozwól, aby próbki wyschły. Podnosząc ułożone w stos miedziane krążki za pomocą pęsety, nie należy naciskać dysków zbyt mocno, aby uniknąć zmiażdżenia komórek i tkanek. Załadunek próbki jest najważniejszym krokiem do udanego zamrażania, a wymagane warunki są takie same, jak warunki dobrego zamrażania w przypadku zamrażania pod wysokim ciśnieniem. Czytelnicy powinni zapoznać się ze znakomitą recenzją McDonald61.
Inne zastosowania W pracy przedstawiono mikrofotografie elektronowe bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek zwierzęcych, tkanek ludzkich i cząstek wirusa. Zaobserwowaliśmy dobre zamarzanie alg morskich związanych aldehydem glutarowym. Jednak struktury komórkowe żywych słodkowodnych zielonych alg zostały zniszczone przez tworzenie się kryształków lodu. Mieszanie komórek z 20% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) zapewniło, że ultrastruktura była dobrze zachowana bez uszkodzeń kryształów lodu. Zastosowanie 20% BSA było również korzystne dla zachowania ultrastruktury komórek łodygi grzyba. Eksperymenty nad zamrażaniem komórek i tkanek roślinnych poprzez zastosowanie 20% BSA są w toku. Chociaż nie podjęto próby skaningowej mikroskopii elektronowej próbek podstawionych metodą zamrażania i zamrażania, wcześniej opisywano obserwację dobrze zachowanych struktur komórkowych9.
Uwagi dotyczące metody zamrażania kanapek Ultrastrukturę komórek zbliżoną do natywnej najlepiej obserwuje się poprzez szybkie zamrażanie i zamrażanie żywych komórek. Tworzenia się kryształków lodu za pomocą SFD można uniknąć, ograniczając grubość komórek do ≤30μm1. Utrwalanie tkanek za pomocą aldehydu glutarowego często zapewnia lepsze zachowanie struktury komórkowej w celu obserwacji komórek hodowanych w zawiesinie, ponieważ wiązanie aldehydu glutarowego usztywnia strukturę komórkową i zapobiega możliwym zmianom ultrastrukturalnym podczas pobierania i wirowania żywych komórek1. Utrwalanie aldehydu glutarowego pozwala również na zwiększenie głębokości zamrażania nawet do 0,2 mm1, podobnie jak w przypadku metody zamrażania wysokociśnieniowego (HPF). Dlatego maszynę HPF można zastąpić maszyną SFD do głębokiego zamrażania tkanek zwierzęcych i ludzkich.
Ponieważ tkanki utrwalone aldehydem glutarowym mogą być przechowywane przez ponad 2 lata28, zamrażanie kanapek można przeprowadzić zgodnie z wygodą użytkownika. Mocowanie tkanek za pomocą aldehydu glutarowego ułatwia również sekcjonowanie tkanek, ponieważ tkanki stają się sztywniejsze wraz z utrwalaniem. W przeciwieństwie do maszyny HPF, SFD może być używany do szybkiego zamrażania wirusów do mikroskopii krioelektronowej oraz do bakterii i komórek eukariotycznych. Co więcej, w porównaniu z maszyną HPF, SFD jest mały, przenośny, tańszy i może być nabyty przez więcej laboratoriów. Mamy nadzieję, że te cechy SFD pomogą większej liczbie laboratoriów osiągnąć ich cele badawcze28.
Cechy naturalnej morfologii komórek Struktury komórkowe są w swoim naturalnym stanie, jeśli wykazują następujący wygląd: Struktury błonowe błony zewnętrznej (ryc. 12A, B), błony plazmatycznej (ryc. 12B,C; Rysunek 13A-D; i Rysunek 14E), otoczka jądrowa (Rysunek 12C, Rysunek 13B-D i Rysunek 14D-E), mitochondria (Rysunek 12C, Rysunek 13C i Rysunek 14D) i wakuole (Rysunek 12C) wykazują gładkie kontury. Jądro i wakuole są prawie okrągłe (ryc. 12C). Rybosomy wykazują wyraźny wygląd gęsty elektronu o średnicy ~20 nm (Rysunek 12B,C; Rysunek 13C; i rysunek 14D). Cytoplazma jest przezroczysta jak elektron (ryc. 12B,C; Rysunek 13C; i rysunek 14D).
Wpływ wiązania aldehydu glutarowego na morfologię komórek Wiązanie aldehydu glutarowego przeprowadzono dla tkanek zwierzęcych lub ludzkich przed zamrożeniem kanapkowym w celu uzyskania ultrastruktury wolnej od kryształków lodu. Mikrofotografie uzyskane tą metodą pokazują wyjątkowo wyraźne obrazy podobne do tych uzyskanych w wyniku szybkiego zamrożenia żywych tkanek (ryc. 14)1. Badania na komórkach drożdży, mikroorganizmach głębinowych i hodowanych komórkach pokazują, że deformacja ultrastruktury jest głównie spowodowana wiązaniem i odwadnianiem tetratlenku osmu przez etanol w temperaturze pokojowej 1,17,18,28. Small poinformował również, że chociaż wiązanie aldehydu glutarowego nie niszczy organizacji aktyny w hodowanych fibroblastach, wiązanie i odwadnianie tetratlenku osmu przez aceton lub etanol w temperaturze pokojowej niszczy organizację aktyny62.
W związku z tym należy przeprowadzić szczegółowe badania nad wpływem wiązania aldehydu glutarowego na morfologię komórek. Ohno opracował metodę kriofiksacji in vivo , w której żywe tkanki są szybko zamrażane bez zatrzymywania dopływu krwi63. Tkanki poddano likupyzacji i zatopiono w żywicy epoksydowej, obserwowano ultracienkie skrawki. Obrazy z mikroskopu elektronowego wykazały najbardziej zbliżoną do natywnej ultrastrukturę żywych tkanek w porównaniu z tymi uzyskanymi przez konwencjonalne odwodnienie chemiczne i szybkie zamrażanie świeżych, nieutrwalonych tkanek. W związku z tym interesujące może być porównanie ultrastruktury uzyskanej przez substytucję przez utrwalanie i zamrażanie aldehydu glutarowego (obecna metoda) oraz ultrastruktury uzyskanej przez substytucję in vivo metodą kriofiksacji i zamrażania w celu zbadania efektów wiązania aldehydu glutarowego.
Troska o środowisko i zwiększona wydajność eksperymentów Do zastąpienia żywicy używamy plastikowych tubek o pojemności 2 ml. Jeden ml rozcieńczonej żywicy wystarcza na każdy etap podstawiania. Zużyte plastikowe rurki można wyrzucić po każdym doświadczeniu. Może to zaoszczędzić czas i wysiłek związany z myciem szklanych fiolek, gdy są one używane do zastępowania żywicy. Dodatkowo roztwór octanu uranylu może być wielokrotnie stosowany do barwienia przekrojów32. Po zabarwieniu skrawków roztwór octanu uranylu można zapisać i ponownie wykorzystać. Ponieważ octan uranylu jest substancją radioaktywną, jego ponowne użycie pomaga uniknąć wytwarzania odpadów i przyczynia się do ochrony środowiska.
Folia naftalenowa polimeryzowana plazmowo Polimeryzowana plazmowo folia naftalenowa to trójwymiarowo spolimeryzowana folia węglowa wykonana z gazowego naftalenu przez polimeryzację plazmową pod wyładowaniem jarzeniowym33. Folia jest odporna na bombardowanie elektronami i chemikaliami, bardzo czysta, przezroczysta na elektrony, ma płaską powierzchnię i amorficzną strukturę. Tak więc polimeryzowana plazmowo folia naftalenowa, która jest dostępna na rynku, jest doskonała i jest zalecana jako folia nośna.

Mikroskopia elektronowa to potężne narzędzie do badania ultrastruktury komórek. Utrwalanie chemiczne za pomocą konwencjonalnych procedur odwadniania zostało wykorzystane do obserwacji ultrastruktury komórek i tkanek. Jednak metoda ta nie zachowuje odpowiednio ultrastruktury komórek, a zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórek. Szybkie zamrażanie i substytucja komórek i tkanek przez zamrożenie są lepszą alternatywą dla zachowania struktury komórkowej.
Trzy główne metody zostały zastosowane do szybkiego zamrażania komórek1: 1) zamrażanie wgłębne odbywa się poprzez zanurzanie próbek w schłodzonym kriogenie, takim jak propan, i było używane od wczesnych lat 50-tych2; 2) Zamrażanie zimnych bloków metalowych odbywa się poprzez szybkie uderzanie komórek i tkanek o metalowy blok chłodzony ciekłym azotem lub ciekłym helem3,4; oraz 3) Zamrażanie wysokociśnieniowe odbywa się poprzez zamrażanie komórek i tkanek ciekłym azotem pod wysokim ciśnieniem5,6,7.
Zamrażanie kanapkowe to rodzaj zamrażania metodą zanurzania, która polega na umieszczeniu cienkich materiałów biologicznych między dwoma miedzianymi dyskami i szybkim zamrożeniu ich poprzez zanurzenie w ciekłym propanie8,9,10. W tej metodzie bardzo cienkie próbki (o grubości kilku mikrometrów) są szybko schładzane kriogenem przy użyciu metalu, który ma dobrą przewodność cieplną z obu stron. W ten sposób metoda ta skutecznie usuwa ciepło z próbek, umożliwiając stabilne zamrażanie komórek bez uszkodzenia kryształków lodu. Zamrożenie kanapkowe, a następnie podstawienie żywych komórek drożdży i bakterii przez zamrożenie, ujawnia naturalną ultrastrukturę komórek10,11,12,13,14,15,16.
Ostatnio ta metoda okazała się przydatna do zachowania przejrzystych obrazów komórek mikroorganizmów utrwalonych aldehydem glutarowym17,18,19,20,21,22,23,24, hodowla komórek25,26,27, oraz ludzkie komórki i tkanki1,28. Chociaż badania te zostały przeprowadzone przy użyciu ręcznie robionego urządzenia do zamrażania kanapek29, a zastosowania do innych badań w innych laboratoriach zostały ograniczone, wyprodukowano nowe urządzenie do zamrażania kanapek (SFD)28 i jest już dostępne na rynku.
Niniejszy artykuł pokazuje, jak używać SFD do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazano również przygotowanie próbek do ultracienkiego przekroju po szybkim zamrożeniu, a także procedury zamrażania i substytucji, zatapiania żywicy, przycinania bloków, cięcia ultracienkich odcinków, odzyskiwania skrawków, barwienia i pokrywania siatek foliami nośnymi.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do zamrażania kanapek</td><td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japonia</td><td>MW-SFD-01</td><td>z metalowym prętem, cienkim metalowym prętem, pęsetą i kąpielą roboczą</td></tr><tr><td>Fiolki</td><td></td> szklane 10 ml <td>-</td> <td>Fiolki scyntylacyjne do utrwalacza</td></tr><tr><td>Aceton-tetratlenek</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>osmu</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>3004</td><td>0,1 g</td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td><td>MDF-C8V1</td><td></td></tr><tr><td>Dysk miedziany</td><td>Nisshin EM Co. Ltd.,</td> <td>Tokio-Zapoznaj</td> <td>się z tym</td></tr><tr><td>artykułem Szkło</td><td></td> <td>przesuwne-Dwustronna</td><td></td></tr> <tr><td>taśma klejąca-Jednosieczna</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>żyletka</td><td>Nisshin EM Co. Ltd.,</td> <td>Tokio-Pióro, FAS-10</td><td></td></tr> <tr><td>Żyletka obosieczna</td><td>Nisshin EM Co. Ltd.,</td> <td>Tokyo-Feather</td><td>, FA-10</td></tr><tr><td>Rozdrobniona deska</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>428</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Nisshin EM Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokio-Kilka par</td></tr><tr><td>Pęsety z pianką polistyrenową-Jedna</td><td></td> <td>para</td>Aldehyd glutarowy Nisshin EM Co. Ltd., Tokio 3052 Ciekły azot-<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Gaz</td><td></td> propan <td>-</td> <td>Kriogeniczny</td></tr><tr><td>aparat do rozpylania jonów</td><td>Hitachi wysokie technologie, Tokyo</td><td>Hitachi E102</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta-Do</td><td></td><td></td> <td>1 mL, 200 &mu; L oraz 2 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td><td>Capsulefuge, PMC-060</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokio i wsp.</td><td>-</td><td>Oświetlenie LED SMZ 645</td></tr><tr><td>do stereomikroskopu</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokio i wsp.</td><td>SM-LW 61 Ji</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy plastikowy pojemnik-50</td><td></td><td></td> <td>ml i 200 ml</td></tr><tr><td>Etan</td><td></td> <td>gazowy-Kriogeniczne</td><td></td></tr> <tr><td>2 ml probówki Eppendorfa-Do</td><td></td><td></td> <td>zatapiania</td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe strzykawki-1</td><td></td><td></td> <td>ml, 5 ml, 10 ml i 20 ml</td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>magnetyczne-Żywica epoksydowa</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>340</td><td>Quetol 812 zestaw</td></tr><tr><td>silikonowa forma do zatapiania</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>4217</td><td>o średnicy 7 mm, głębokości 13 mm</td></tr><tr><td>Incubater-For</td><td></td><td></td> <td>37 & deg; C oraz 60 &deg; C</td></tr><tr><td>Etap przycinania</td><td>Sunmag Co. Ltd., Tokio</td> <td>-</td> <td>Wyposażony w mechanizm przechylania, Patrz ten artykuł</td></tr><tr><td>Oświetlenie LED do przycinania stage</td><td>Sunmag Co. Ltd., Tokio</td> <td>-</td> <td>Zapoznaj się z tym dokumentem</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowe ostrze do przycinania</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>5240</td><td>EM-240, Zapoznaj się z tym artykułem</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr><tr><td>Siatki</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2633, 2634</td><td>300 oczek, 400 oczek</td></tr><tr><td>0,5% Roztwór neoprenu W</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2351</td><td>Do pobierania sekcji</td></tr><tr><td>Pół rurki do barwienia sekcji</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>463</td><td>Zapoznaj się z tym pape</td></tr><tr><td>Super Support Film</td><td>Nisshin EM Co. Ltd, Tokio</td><td>647</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokio</td><td>DISMIC-03CP</td><td>Octan celulozy, 0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokio</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemiczne utrwalanie zostało użyte do obserwacji ultrastruktury komórek i tkanek. Jednak metoda ta nie zachowuje odpowiednio ultrastruktury komórek; Zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórek. Szybkie zamrażanie jest lepszą alternatywą dla zachowania struktury komórkowej. Zamrażanie kanapkowe żywych drożdży lub bakterii, a następnie substytucja przez zamrożenie zostało wykorzystane do obserwacji wyjątkowej naturalnej ultrastruktury komórek. Ostatnio zamrażanie kanapkowe komórek hodowlanych lub tkanek ludzkich utrwalonych aldehydem glutarowym zostało również wykorzystane do ujawnienia ultrastruktury komórek i tkanek. 
Te badania były do tej pory przeprowadzane za pomocą ręcznie robionego urządzenia do zamrażania kanapek, a zastosowania do badań w innych laboratoriach były ograniczone. Niedawno wyprodukowano nowe urządzenie do zamrażania kanapek, które jest już dostępne na rynku. W niniejszej pracy pokazano, jak wykorzystać urządzenie do zamrażania kanapkowego do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, komórek hodowlanych, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazano również przygotowanie próbek do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu oraz procedury zamrażania-substytucji, zatapiania żywicy, przycinania bloków, cięcia ultracienkich odcinków, odzyskiwania skrawków, barwienia i pokrywania siatek foliami nośnymi.

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Aby zaobserwować znakomitą naturalną ultrastrukturę komórek, konieczne jest utrwalenie komórek poprzez szybkie zamrażanie. Zamrażanie kanapkowe to jedna z najlepszych metod zamrażania komórek bez tworzenia kryształków lodu. Protokół ten demonstruje zastosowanie urządzenia do zamrażania kanapek, a także opisuje procedurę wytwarzania ultracienkich odcinków próbek podmienionych przez zamrażanie po zamrożeniu kanapek.Przygotowanie ciekłego propanu należy rozpocząć od napełnienia pojemnika na ciekły azot urządzenia do zamrażania kanapkowego lub SFD ciekłym azotem. Napełnij pojemnik na ciekły propan ciekłym propanem, wprowadzając gaz propan za pomocą drobnej dyszy. Przyspiesz krzepnięcie propanu za pomocą schłodzonego metalowego pręta.Aby przygotować miedziane krążki płaskie i koszowe, umieść je na szklanym szkiełku stroną bez liter do góry i potraktuj wyładowaniem jarzeniowym o napięciu 10 paskalów, 400 woltów, jednym miliamperze przez 30 sekund, aby powierzchnia dysku była hydrofilowa za pomocą aparatu do wykrywania jonów. Przenieść zawiesinę komórkową do dwumililitrowej probówki wirówkowej i wirować przy 2 900 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i zawiesić osad do uzyskania gęstej zawiesiny.Umieść niewielką ilość lub około 0,02 mikrolitra zawiesiny komórek na miedzianym krążku. Przykryj go kolejnym miedzianym krążkiem i podnieś krążki pęsetą. Zrób studzienkę w środku stałego propanu za pomocą cienkiego metalowego pręta.Umieść pęsetę w SFD i szybko ją zamroź, naciskając przycisk wstrzykiwania w aparacie. Namocz zużytą pęsetę w wodzie o temperaturze pokojowej, aby je ogrzać i zamrozić następujące próbki. Używaj tkanek zwierzęcych i ludzkich utrwalonych w 2,5% aldehydzie glutarowym, 0,1-molowym buforze fosforanowym o pH 7,4.Pokrój je na odcinki o grubości od 0,1 do 0,2 milimetra za pomocą żyletki pod mikroskopem stereoskopowym. Umieść niewielką kroplę roztworu aldehydu glutarowego na miedzianym krążku typu koszowego, a następnie za pomocą pęsety umieść kawałek tkanki w aldehydzie glutarowym na miedzianym krążku i przykryj go płaskim miedzianym krążkiem. Szybko zamroź krążki z tkankami w topniejącym propanu SFD, jak pokazano wcześniej.Przenieś krążki do ciekłego azotu w kąpieli roboczej. Za pomocą pęsety schłodzonej ciekłym azotem odłącz krążki od siebie, aby odsłonić próbkę. Umieść krążki z komórkami w szklanej fiolce wypełnionej jednym mililitrem acetonu zawierającego 2% tetratlenku osmu, który został umieszczony w ciekłym azocie i zestalony.Przenieś krążki do głębokiej zamrażarki i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez dwa do czterech dni w celu zamrożenia komórek. Stopniowo doprowadzaj próbki do temperatury pokojowej, inkubując je przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś krążki do dwóch mililitrowych plastikowych rurek, które są wypełnione jednym mililitrem acetonu.Przygotuj żywicę epoksydową, mieszając odczynniki w jednorazowym plastikowym pojemniku za pomocą mieszadła. Wymieniaj aceton kolejno na 30% żywicy w acetonie, 60% żywicy i 90% żywicy w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę każda, a następnie wymieniaj 90% żywicę na 100% żywicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Na koniec zanurz próbki w 100% żywicy w silikonowej formie do zatapiania i polimeryzuj je w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Wyjmij spolimeryzowane bloki z silikonowych form do zatapiania i napisz numer próbki na bloku. Usuń miedziane krążki z bloku za pomocą żyletki i przytnij próbki osadzone na powierzchni bloku za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania i żyletek pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie nałóż taśmę na uchwyt bloku próbki i uchwyt próbki mikrotomu i odetnij taśmę na granicy.Usuń blok z ultramikrotomu, umieść go w mikroskopie stereoskopowym i przytnij go dalej do 0,2 milimetra na 0,3 milimetra za pomocą żyletki. Nałóż neopren na kratki, aby były przyklejone. Umieść blok z powrotem na ultramikrotomie, wyrównując zaklejone części.Przykryj ultramikrotom plastikową osłoną i wytnij odcinki o grubości od 50 do 70 nanometrów. Odzyskaj sekcje za pomocą pętli. Zamontuj je na miedzianych kratkach o siatce 300 lub 400 potraktowanych neoprenem i wysusz.Ustaw kratki z sekcjami w rowku połówki rurki silikonowej. Namocz próbki w roztworze octanu uranylu przez trzy minuty. Zebrać zużyty roztwór uranylu i przechowywać go w strzykawce.Umyj próbki w pół probówki strumieniem wody, a następnie namocz próbki w cytrynianie ołowiu przez trzy minuty. W przypadku próbek drożdży i grzybów umieść siatki na bibule filtracyjnej, podnieś je pęsetą i przykryj plazmowo polimeryzowaną folią naftalenową na powierzchni wody. Włóż siatki do uchwytu próbki mikroskopu elektronowego, a następnie włóż uchwyt próbki do mikroskopu elektronowego i obserwuj przy 100 kilowoltach.Ultracienkie skrawki zarówno E. coli, jak i S. cerevisiae obserwowane pod mikroskopem elektronowym wykazywały naturalną morfologię i wyraźne obrazy. Pod mikroskopem elektronowym obserwowano ultracienkie skrawki hodowanych komórek szybko zamrożonych za pomocą SFD. Obrazy ultra cienkich odcinków ludzkiej skóry były bardzo wyraźne i pokazywały naturalną morfologię.Cząstki rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B zostały szybko zamrożone za pomocą SFD i obserwowane za pomocą kriomikroskopii elektronowej. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że należy nałożyć bardzo małą ilość komórek na miedziane krążki, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu po zamrożeniu. Dzięki uprzedniemu utrwaleniu tkanek zwierzęcych aldehydem glutarowym uzyskuje się dobre zamrażanie na głębokości około 200 mikrometrów podobną do głębokości osiąganej przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem.Technika ta toruje badaczom drogę do łatwej obserwacji wyjątkowej naturalnej ultrastruktury komórek przy niskich kosztach.

rapid-freezing-using-sandwich-freezing-device-for-good

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie zaprezentowano techniki błyskawicznego mrożenia i sekcjonowania tkanki zarodkowego mózgu myszy. Przedstawiono przydatne wskazówki dotyczące obsługi kriostatu, w tym metody rozwiązywania problemów, które można zastosować podczas cięcia, aby zapewnić, że uzyskane przekroje tkankowe będą wolne od pęknięć i innych zniekształceń.

Szybkie mrożenie i kriosekcjonowanie mózgu myszy w stadium E12.5

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Ten film demonstruje kriokonserwację mózgu myszy w celu odizolowania dyskretnych obszarów anatomicznych lub określonych populacji komórek z tkanek nowotworowych. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnej rozdzielczości optycznej morfologii tkanki mózgowej do późniejszej analizy.

Kriokonserwacja mózgu myszy przez szybkie zamrażanie: technika szybkiego zamrażania całej próbki mózgu myszy do analizy histologicznej

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Opisano podstawowe techniki i udoskonalenia przetwarzania próbek biologicznych i nanomateriałów do badania metodą zamrażania i pękania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta jest preferowaną metodą ujawniania cech ultrastrukturalnych i specjalizacji błon biologicznych oraz uzyskiwania danych wymiarowych i przestrzennych na poziomie ultrastrukturalnym w materiałoznawstwie i produktach nanotechnologii.

Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Poznaj metodę szybkiego zamrażania kanapkowego do zachowania ultrastruktury komórek w mikroskopii elektronowej. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, zamrażanie, substytucję i obrazowanie.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów