Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Protokół ten mierzy konkurencyjność kojarzenia się samców komarów, co jest warunkiem wstępnym dla programów tłumienia populacji komarów opartych na uwalnianiu samców. To kryterium przydatności jest oceniane w ramach kontroli jakości i oceny szczepu. Metoda ta skraca czas doświadczenia o 90% i pozwala na bezpośrednie porównanie konkurencyjności krycia między dwiema liniami sterylnymi lub zakażonymi Wolbachią.

Zabieg ten wykonają Irene Li i Keng Wai Mak. Na początek dokonaj płci męskiej i żeńskiej komarów w stadium poczwarki, zgodnie z ich różnicami wielkości. Dla każdej grupy komarów przenieś 100 poczwarek płci męskiej do wstępnie oznakowanej klatki w celu karmienia sacharozą lub sacharozy rodaminą B.

Poczwarki samic należy umieszczać w małych partiach po 40 do 50 sztuk na klatkę. Po pojawieniu się imago sprawdź klatki pod kątem obecności samców komarów. Aby przygotować 0,2% roztwór sacharozy Rhodaminy B, rozpuść 200 miligramów proszku Rhodaminy B na każde 100 mililitrów 10% roztworu sacharozy.

Dobrze wymieszaj, aby upewnić się, że cały proszek się rozpuścił. Przygotuj 20 butelek z podajnikiem cukru z. Dodaj 10 mililitrów 10% sacharozy do 10 butelek podajnika i 10 mililitrów 0,2% roztworu sacharozy rodaminy B do pozostałych 10 butelek podajnika.

Umieść pięć butelek do karmienia w każdej przygotowanej klatce dla samców i pozwól samcom komarów żerować przez trzy dni przed eksperymentem godowym. Włącz palnik rtęciowy lamp i mikroskop stereoskopowy. Pozwól, aby źródło światła do palnika rtęciowego lamp ustabilizowało się przez 10 minut.

Następnie ustaw filtry fluorescencyjne na czerwone białko fluorescencji jeden. Odessać niewielką liczbę komarów na raz do szklanej rurki aspiratora doustnego. Przez szklaną rurkę obserwuj ciało samców komarów pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.

Do eksperymentu używaj tylko samców komarów oznaczonych rodaminą B. Zestaw do przenoszenia samców komarów A do 12 papierowych kubków zabezpieczonych siatką. Umieść 10 samców komarów karmionych sacharozą na filiżankę w sześciu filiżankach, a 10 samców komarów karmionych sacharozą B w filiżance w pozostałych sześciu filiżankach.

Powtórz ten krok dla samców komarów z zestawu B. Ustaw 12 klatek do testu krycia. W każdej z sześciu klatek znajduje się 10 samców komarów z zestawu A, które są oznaczone rodaminą B, 10 nieoznaczonych samców komarów z zestawu B i 10 dziewiczych samic komarów typu dzikiego.

W pozostałych sześciu klatkach znajduje się 10 nieoznaczonych samców komarów z grupy A, 10 samców komarów z grupy B z rodaminą B i 10 dziewiczych samic komarów typu dzikiego. Oznacz te koszyki, aby wyraźnie odróżnić dwie współpracujące kombinacje. Umieść odpowiednie miseczki samców w klatkach godowych zgodnie z etykietami.

Zdejmij siatkę i delikatnie postukaj w kubek, aby wypchnąć samce z kubka. Ostrożnie wyjmij papierowy kubek i siatkę z klatki, aby upewnić się, że żadne komary nie wydostają się z klatki. Pozwól samcom komarów zaaklimatyzować się w klatce godowej przez co najmniej godzinę.

Za pomocą aspiratora doustnego przenieś dziewicze samice komarów typu dzikiego do 12 papierowych kubków, z których każdy zawiera 10 komarów. Po okresie aklimatyzacji samców komarów przenieść jedną miseczkę samic do każdej klatki godowej i zdjąć siatkę. Delikatnie potrząśnij kubkiem, aby zachęcić pozostałe samice komarów do wyjścia z kubka, a następnie ostrożnie wyjmij papierowy kubek i siatkę z klatki, aby upewnić się, że żadne komary nie wydostają się z klatki.

Pozwól, aby krycie miało miejsce przez trzy godziny, a następnie zakończ eksperyment godowy, usuwając wszystkie komary z każdej klatki za pomocą mechanicznego aspiratora. Znieczulaj komary na zimno na lodzie przez co najmniej pięć minut. Gdy komary są w pełni znieczulone, delikatnie podnieś samice komarów i umieść je w osobnym papierowym kubku zabezpieczonym siatką.

Oznacz papierowy kubek, przenosząc odpowiednią etykietę z pasującej klatki na kubek. Aby ocenić żeńskie plemniki, znieczulenie na zimno znieczula samice komarów na lodzie przez co najmniej pięć minut przed sekcją pod mikroskopem stereoskopowym. Przeanalizuj samicę komara pod mikroskopem stereoskopowym.

Zbadaj plemniki pod mikroskopem. Jeśli samica nie zostanie zapłodniona, wszystkie trzy plemniki będą puste, a jeśli zostaną zapłodnione, dwie lub trzy plemniki zostaną wypełnione ruchliwymi plemnikami. W przypadku osób zapłodnionych należy określić, czy plemniki zawierają płyn nasienny oznaczony rodaminą B, badając je pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w filtr RFP1.

Jeśli plemniki są wypełnione płynem nasiennym, który nie jest oznaczony rodaminą B, nie obserwuje się fluorescencji. Z drugiej strony, jeśli spermateka zawiera płyn nasienny oznaczony rodaminą B, fluoryzuje na pomarańczowo. Celem tego testu konkurencyjności krycia było ustalenie, czy może dojść do utraty zdolności krycia samców po kilku pokoleniach chowu wsobnego.

Przeprowadzono eksperymentalne trzy próby oceny konkurencyjności krycia, a dane dotyczące inseminacji przedstawiono tutaj. Samice typu dzikiego były zapładniane przez samce wsobne lub krzyżówkowe, z wzajemnym znakowaniem. Wyniki pokazują, że odsetek samic zapłodnionych przez samce wsobne lub krzyżowane nie miał wpływu znakowanie rodaminą B.

Znacznie wyższy odsetek samic kojarzył się z samcami krzyżującymi niż z samcami wsobnymi we wszystkich trzech replikantach, co wskazuje, że chów wsobny może prowadzić do utraty zdolności godowej. Ważne jest, aby przygotować dodatkowe klatki dla samic komarów. Nie używaj samic komarów z klatki, która została skażona samcami komarów, ponieważ wstępnie zapłodnione samice sprawią, że wszystkie dane będą nieważne.

Oprócz laboratoryjnego testu konkurencyjności krycia, procedura ta może być stosowana w eksperymentach uwalniania i ponownego chwytania znaczników w celu zbadania biologii kojarzenia się owadów, dynamiki populacji i jej rozprzestrzeniania się.