System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Proces indukcji od hPSC do komórek siatkówki jest skomplikowany i czasochłonny. Ten zoptymalizowany protokół może generować tkanki siatkówki o wysokiej odtwarzalności i bez kosztów. Zaletą tego protokołu jest ilościowe określenie wielkości EB i gęstości posiewu w celu znacznego zwiększenia wydajności i powtarzalności indukcji siatkówki z hPSC.

Dzięki tej metodzie wszystkie główne komórki siatkówki pojawiają się sekwencyjnie i podsumowują główne etapy rozwoju siatkówki. Ułatwi to modelowanie chorób i terapię komórkową chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Demonstrując procedurę, jesteśmy z Yuanyuan Guan, doktorantem, i Bingbingiem Xie, technikiem z laboratorium.

Rozpocząć od przygotowania 50 ml roztworu ECM, dodając 1 ml trzeciego 50-krotnego roztworu podstawowego do 50 ml DMEM. Następnie dodaj 1 ml tego przygotowanego roztworu ECM do każdego dołka na sześciodołkowej płytce i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przygotuj pożywkę konserwacyjną hPSC zgodnie z instrukcją producenta i podgrzej ją do temperatury pokojowej przez 30 minut.

Wlej kriogeniczną fiolkę z hPSC ze zbiornika z ciekłym azotem, inkubując ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Ostrożnie zdezynfekuj go za pomocą sprayu na 75% alkohol i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść zawiesinę komórek z fiolki do 15-milimetrowej probówki.

Następnie dodaj krople do probówki 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki konserwacyjnej za pomocą pipety o pojemności 5 ml, delikatnie potrząsając probówką, aby zmieszać hPSC. Odwirować probówkę o stężeniu 170 razy G przez pięć minut. Ostrożnie usunąć większość supernatantu za pomocą pipety o pojemności 1 ml, pozostawiając około 50 mikrolitrów supernatantu, aby uniknąć utraty komórek.

Ponownie zawiesić osad z 1 ml pożywki konserwacyjnej, pipetując w górę i w dół. Usuń ECM z wstępnie pokrytych studzienek i dodaj 1,5 mililitra pożywki konserwacyjnej do każdej studzienki. Następnie rozprowadź 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.

Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić hPSC. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na co najmniej 24 godziny, aby ułatwić przyleganie komórek. Codziennie zmieniaj pożywkę i przechodź hPSC przy 80% zbiegu.

W dniu 0 zainicjuj różnicowanie, usuwając 80% komórek konfluencji z jednego dołka z sześciodołkowej płytki. Zbierz komórki za pomocą roztworu dysocjacyjnego EDTA, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Usunąć roztwór EDTA i dodać 1 ml pożywki podtrzymującej zawierającej 10 mikromolowych fluwastatyny, aby zatrzymać dysocjację komórek.

Zebrać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Przenieść zawiesinę komórek na 100-milimetrową bardzo nisko przymocowaną szalkę Petriego i dodać do szalki 9 ml pożywki podtrzymującej zawierającej 10 mikromolową fluwastatynę. Delikatnie potrząśnij naczyniem dwukrotnie, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Następnie umieść go w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po hodowli komórek przez co najmniej 24 godziny obserwuj je pod mikroskopem. Dodać 9 ml pożywki konserwacyjnej i 3 ml NIM do probówki o pojemności 15 ml.

Przenieść kultury komórkowe do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 10 ml wstępnie podgrzanej mieszaniny NIM do naczynia. Odwirować probówkę przy 60 razy G przez 3 minuty, aby zebrać agregaty. Następnie usuń supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 ml, pozostawiając około 500 mikrolitrów, aby uniknąć utraty komórek.

Dodać 2 ml mieszaniny do probówki i przenieść zawiesinę z powrotem na tę samą szalkę Petriego. Delikatnie potrząśnij naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić agregaty komórek. Następnie włóż naczynie z powrotem do inkubatora.

W dniu 5 usuń ECM z wstępnie pokrytych naczyń i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego NIM do każdego naczynia. Wyjmij naczynie zawierające Ebs i sprawdź jakość EB pod mikroskopem, upewniając się, że są jasne i okrągłe. Zbierz wszystkie EB w probówce o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść przez 5 minut.

Następnie usuń większość supernatantu, pozostawiając około 2 ml pożywki. Po policzeniu EBs, wysiewaj je kropla po kropli w gęstości około 2-3 EB na centymetr kwadratowy do powlekanych naczyń zawierających 10 ml NIM. Delikatnie potrząśnij naczyniami, aby równomiernie rozprowadzić EB i umieść je w inkubatorze na co najmniej 24 godziny.

Użyj igły wolframowej lub igły ze strzykawką o pojemności 1 ml, aby mechanicznie usunąć morfologicznie identyfikowalne pęcherzyki wzrokowe wraz z sąsiednim nabłonkiem barwnikowym siatkówki w dniach od 28 do 35. Hoduj je w zawieszeniu. Umieść 50-60 pęcherzyków wzrokowych w każdym 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym o niskim przyczepie, zawierającym 15 ml RDM do tworzenia organoidów siatkówki.

Zmieniaj podłoże co 2 do 3 dni aż do 42 dnia. Aby zainicjować różnicowanie siatkówki, hPSC zdysocjowano na małe grudki i wyhodowano w zawiesinie, która tworzyła EB od pierwszego dnia. W dniu 5 EB posiewano na szalkach hodowlanych pokrytych ECM, a komórki stopniowo migrowały z EB.

W dniu 16 pożywka indukcyjna została zastąpiona przez RDM, powodując tworzenie się domen siatkówki nerwowej i stopniowe wystające z naczynia, a także komórki tworzące struktury przypominające pęcherzyki wzrokowe otoczone komórkami RPE. W dniach od 28 do 35 organoidy siatkówki składające się z siatkówki nerwowej, przyczepione do sfery RPE. Po jednej stronie uformowały się komórki.

Wraz z postępem różnicowania i specyfikacji siatkówki hPSC wytwarzały podtypy siatkówki nerwowej, które stopniowo układały się w warstwy, naśladując cechy architektoniczne siatkówki rodzimego człowieka. Komórki zwojowe siatkówki zostały najpierw wygenerowane z komórek progenitorowych siatkówki i zgromadzone w podstawowej stronie siatkówki nerwowej. Dzięki temu protokołowi organoidy siatkówki rozwinęły się w wysoce dojrzałe fotoreceptory z bogatymi pręcikami i czopkami.

Komórki fotoreceptorowe znajdowały się po stronie wierzchołkowej, podczas gdy komórki amakrynowe, komórki poziome, komórki dwubiegunowe i komórki glejowe Müllera znajdowały się w pośredniej warstwie siatkówki nerwowej. Kluczowymi punktami tego protokołu są tworzenie wysokiej jakości Ebs i wysiewanie ich w odpowiedniej gęstości.