Name: Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę generowania jednolitych organoidów nerkowych z ludzkich komórek pluripotencjalnych. Protokół ten umożliwia skalowalne, powtarzalne i ekonomiczne badania rozwoju nerki oraz modelowania chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 i P30-DK079307 oraz ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program dla AP.

Wszystkie eksperymenty z użyciem hPSC zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały przeprowadzone w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej. Wszystkie odczynniki są przeznaczone do hodowli komórkowych, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie kultury inkubuje się w temperaturze 37 °C, 5% atmosferyCO2 . Na wszystkich etapach testu można pobrać ciała zarodkowe lub organoidy nerkowe i utrwalić je lub przygotować do analizy. Linie hPSC użyte do wygenerowania tych danych zostały w pełni scharakteryzowane i opublikowane18.
1. Przygotowanie płytek hodowlanych
UWAGA: Około 1 godziny przed rozszczepieniem hPSC, pokryj 2 x 100 mm płytki hodowli tkankowej ekstraktem z macierzy błony podstawnej (BME) kwalifikowanym do komórek macierzystych. Płytki można wstępnie pokryć, uszczelnić folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C zgodnie z zaleceniami producenta.
<ol>
	<li>Przygotować 2 płytki o średnicy 100 mm poddane działaniu kultur tkankowych (1 do testu organoidów nerkowych, 1 do utrzymania linii komórkowej) oraz stożkową probówkę o pojemności 15 ml w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.</li>
	<li>Porcję 8 ml zimnego, pozbawionego surowicy Zmodyfikowanego Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ~4 ml do każdej z płytek o średnicy 100 mm, co wystarczy, aby pokryć spód każdej płytki pożywką.</li>
	<li>Wyjąć z zamrażarki 100 μl porcji BME (-20 °C). Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml weź ~1 ml zimnego DMEM z probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Powoli rozmrażaj podwielokrotność BME, delikatnie pipetując w górę i w dół zimnym DMEM, unikając tworzenia pęcherzyków. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby podwielokrotność BME znajdowała się w temperaturze pokojowej. Zużyć natychmiast.</li>
	<li>Przenieś rozmrożony DMEM/BME z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z pozostałym DMEM. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie wymieszać rozcieńczony BME, pipetując w górę i w dół co najmniej 8 razy, aby równomiernie rozprowadzić BME, unikając tworzenia pęcherzyków.</li>
	<li>Przenieść 4 ml rozcieńczonego BME do każdej płytki z DMEM i delikatnie zakręcić płytką, aby BME zostało równomiernie rozprowadzone. Inkubować powlekaną płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Użyj 50 μL BME na płytkę 100 mm. Stosowanie innych pożywek hodowlanych hPSC i linii komórkowych może wymagać różnych stężeń BME.</li>
</ol>
2. Przekazywanie hPSC
UWAGA: Dla rutynowej hodowli hPSC, linie komórkowe pasażują przy 70-80% konfluencji.
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z płytki hPSC, która ma być pasażowana. Dodaj ~ 8 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco do płytki hPSC i delikatnie zamieszaj, aby umyć komórki.</li>
	<li>Odessać DBPS i dodać 2 ml delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek (GCDR) do płytki o średnicy 100 mm, kropla po kropli na wierzchu, aby pokryć komórki. 
	UWAGA: Można również stosować inne odczynniki dysocjacyjne. Dostosuj odpowiednio.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez ~ 6-8 minut, aż kolonie się rozpadną, a komórki zaczną załamywać się pod wpływem kontrastu fazowego (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A). 
	UWAGA: Czas może się różnić w zależności od linii komórkowych. Dostosuj odpowiednio.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml pożywki hPSC (8 ml na płytkę 100 mm) i dodać inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCKi) do końcowego stężenia 5 μM.</li>
	<li>Odessać DMEM z płytek pokrytych BME i dodać 8 ml pożywki hPSC plus ROCKi do każdej płytki.</li>
	<li>Gdy komórki są gotowe (jak opisano w punkcie 2.3, <silna klasa="xfig">Rysunek 2A), odessać GCDR i przechylić płytkę ~45° w kierunku eksperymentatora i zeskrobać komórki za pomocą podnośnika komórkowego. 
	UWAGA: Jeśli komórki się odczepiają, pomiń zasysanie GCDR i kontynuuj.</li>
	<li>Obróć płytkę o ~90° i ponownie zeskrob, aby podnieść pozostałe komórki. Utrzymuj płytkę w temperaturze ~45° i przemyj komórki 3 ml pożywki hPSC za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić duże grudki (nie więcej niż 2-3 razy) i wysiewaj komórki w proporcjach odpowiednich dla interesującej nas linii komórkowej na przygotowanych płytkach. Umieść płytkę z komórkami w inkubatorze i delikatnie przesuwaj płytkę ruchami ósemkowymi, aby równomiernie rozprowadzić komórki. 
	UWAGA: W tym eksperymencie linie hPSC zostały podzielone w stosunku 1:5, może się to różnić w przypadku innych linii komórkowych i warunków. Pozostaw talerz w spokoju na noc.</li>
	<li>Po ~ 24 h sprawdź komórki pod kątem przyczepienia. Poszukaj przyczepionych małych pojedynczych kolonii. Odessać zużytą pożywkę i uzupełnić 8 ml świeżej pożywki hPSC (bez dodatku ROCKi).</li>
	<li>Kontynuuj obserwację i karmienie codziennie, aż komórki osiągną ~60% zbieżności, aby rozpocząć test organoidów nerkowych (zwykle osiągany od 48 do 72 godzin po pasażowaniu). Idealnie byłoby, gdyby kolonie były dyskretne i nie łączyły się (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby ograniczyć komórki do nie więcej niż 80% zbieżności, aby utrzymać ich stan pluripotencji. Zlewające się ze sobą kultury, nieostrożne obchodzenie się z nimi lub wyższe pasaże mogą prowadzić do niepożądanego spontanicznego różnicowania lub niskiej efektywności tworzenia organoidów nerkowych.</li>
</ol>
3. Dzień 0 - Konfiguracja testu na organoidy nerkowe
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy przygotować zarówno pożywkę E5-ILP, jak i pożywkę etapu II zgodnie z recepturami (tabela 1 i tabela 2). 
	UWAGA: Nośnik można przechowywać do 14 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dla jednego testu organoidowego nerki (jedna płytka hodowlana 100 mm jest potrzebna na jedną płytkę 6-dołkową), przygotuj kompletną pożywkę E5-ILP w stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 18 ml E5-ILP uzupełnionych 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM beta-merkaptoetanolu (32,7 μL).</li>
	<li>Umieścić 2 ml kompletnej pożywki E5-ILP w każdym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu.</li>
	<li>Przemyj hPSC przy ~60% konfluencji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) dwukrotnie ~ 8 ml DPBS. Odessać DPBS, a następnie dodać 2 ml dypazy na 100 mm płytkę, kropla po kropli, aby przykryć komórki i inkubować przez 6 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Po 6 minutach krawędzie kolonii zaczną się zwijać (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C, czerwone strzałki), podczas gdy reszta kolonii pozostanie przyczepiona. Jeśli nie zostanie to uzyskane po 6 minutach, umieść komórki z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 30 sekund. Inne nośniki i matryce hPSC mogą nie być zgodne z tym timingiem. Powłoka BME na bazie laminy nie jest kompatybilna z dypasą. Jeżeli BME na bazie lamininy jest standardową matrycą hPSC, należy pokryć jedną z płytek w sekcji 1 BME opisanym w tej metodzie, który ma być użyty do testu organoidów nerkowych.</li>
	<li>Umyj komórki 3x ~10 ml DPBS. Zassać DPBS, a następnie przechylić płytkę o ~45° i zeskrobać ją za pomocą podnośnika komórkowego. 
	UWAGA: Dispase nie jest dezaktywowany, dlatego należy go dokładnie zmyć. Nie zmniejszaj liczby prań.</li>
	<li>Przepłukać kolonie od góry 6 ml kompletnej pożywki E5-ILP za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić duże kolonie (zwykle wystarczają 2 lub 3 razy).</li>
	<li>Rozprowadź skupiska kolonii równomiernie, dodając 1 ml na dołek do płytki 6-dołkowej. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej (ustawienia: orbitalna = 30, odwrotna = 330°, wibracja = 5° - 2 s), która jest umieszczona w inkubatorze o temperaturze 37 °C (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2D). 
	UWAGA: Funkcja wibracji jest ważna dla odpowiedniego rozprowadzenia organoidów i zapobiegania zbrylaniu.</li>
</ol>
4. Dzień 2 - Karmienie przez połowę średniej zmiany
UWAGA: W ciągu 48 godzin klastry kolonii utworzą ciała embrionalne.
<ol>
	<li>Przygotuj kompletne podłoże: Na jedną płytkę 6-dołkową przygotuj 12 ml pożywki E5-ILP + 8 μM CHIR99021 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Beta-merkaptoetanol i ROCKi nie są wymagane.</li>
	<li>Pozwól ciału zarodka osiąść na dnie płytki, przechyl płytkę o ~ 45°, a następnie powoli odsysaj pożywkę od góry, pozostaw ~ 1 ml na dołek. 
	UWAGA: Ciała zarodkowe na tym etapie szybko się zbijają. Nie zostawiaj ich na > 5 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml przygotowanej kompletnej pożywki (sekcja 4.1) do dołka. Umieść płytkę z powrotem na shakerze.</li>
</ol>
5. Dzień 3 - Transfer ciał embrionalnych na pożywkę Stadium II
<ol>
	<li>Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml i DMEM (niski poziom glukozy). Pozwól ciału zarodka osiąść na dnie płytki. Przechylić płytkę o ~45° i powoli zasysać pożywkę od góry, pozostawić ~1 ml na studzienkę.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać wszystkie ciała zarodków z każdej studzienki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj każdą studzienkę, aby zebrać pozostałe ciała zarodkowe ~ 1 ml DMEM (niski poziom glukozy) i dodaj je do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Pozostaw ciała zarodkowe, aby osiadły na dnie probówki, ~5 min. Czekając, dodaj 2 ml pożywki etapu II do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Wyodrębnij duże ciała embrionoidalne (>300 μm) za pomocą sitka komórkowego o średnicy 200 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).
	<ol>
		<li>Użyj nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umieść na niej sitko o pojemności 200 μm. Ostrożnie odpipetować wszystkie ciała zarodków za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml nad sitkiem do komórek.</li>
		<li>Przepłucz sitko komórkowe dodatkowym ~5 ml DMEM (niski poziom glukozy), aby zebrać wszelkie ciała embrionalne, które utknęły w sitku komórkowym. Pozwól ciału zarodka osiąść na dnie stożkowej rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy ciała zarodkowe zostaną osadzone, odessać supernatant i przemyć ~10 ml DMEM (niski poziom glukozy).</li>
	<li>Odessać DMEM i ponownie zawiesić ciała zarodków w 6 ml pożywki w stadium II.</li>
	<li>Przenieś ciała zarodkowe z powrotem do 6-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie, rozprowadzając je równomiernie między 6 dołkami.</li>
	<li>Wprowadzaj zmiany w połowie podłoża zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.3 co drugi dzień. 
	UWAGA: Począwszy od 3 dnia, ciała embrionów będą miały "złoty" i gładki, kulisty wygląd (<silna klasa="xfig">Ryc. 2F). Od ~ dnia 6 tworzenie się kanalików w poszczególnych ciałach embrionalnych stanie się widoczne, przy czym rosnąca liczba w ciągu następnych dni osiągnie optymalną liczbę i wzrost do 14 dnia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G,H). W celu wyeliminowania sporadycznego tworzenia się zlepialni, po wzrokowej obserwacji organoidów nerkowych lub bardzo małych ciał zarodkowych bez kanalików, należy przesiać organoidy o wielkości <200 i dużych >500 μm za pomocą siatek do komórek o średnicy 500 i 200 μm, jak opisano w krokach 5.4.1 i 5.4.2.</li>
</ol>
6. Przeniesienie do kolby obrotowej i karmienie
UWAGA: Kolba obrotowa może być używana w dowolnym momencie od 3 dnia do eksperymentów, które wymagają dużej liczby organoidów. Rutynowy transfer organoidów odbywa się w naszym laboratorium między 6 a 8 dniem. Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi rozwiązaniami, jeśli sprzęt nie jest dostępny.
<ol>
	<li>Przenieść ciała zarodków do kolby wirowej o pojemności 125 ml z 45 ml pożywki II stopnia. Ustaw prędkość mieszadła magnetycznego na 120 obr./min i umieść w inkubatorze (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2I).</li>
	<li>Aby nakarmić ciała zarodkowe lub organoidy nerkowe, pozwól organoidom nerkowym na chwilę osiąść na dnie kolby przędzarki. Podnieść pokrywkę z jednego bocznego ramienia kolby i umieścić pipetę zasysającą w środku, tak aby końcówka dotykała przeciwległej ścianki wewnętrznej.</li>
	<li>Powoli pochylić pipetę zasysającą w dół i zassać około połowy pożywki. Uzupełnić 20 ml świeżej pożywki etapu II, pipetując ją przez ten sam otwór.</li>
</ol>
7. Ustawianie 6-dołkowej płytki mieszającej magnetycznej (6MSP)
UWAGA: Format 6MSP może być używany zamiast kolb obrotowych, jeśli konieczne jest przetestowanie wielu warunków. Stosuj 6MSP do leczenia złożonego lub nefrotoksynami. Pozwala to zaoszczędzić ilość pożywki użytej w drugim etapie przy jednoczesnym zachowaniu dostępności składników odżywczych poprzez dyfuzję.
<ol>
	<li>Wyczyść owalne mieszadła magnetyczne w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, myjąc krótko w odpowiednim detergencie do kultur tkankowych (jeśli nigdy nie był używany) lub moczyć przez > 1 godzinę, jeśli był wcześniej używany.</li>
	<li>Krótko umyć 3x w sterylnym DPBS.</li>
	<li>Prać 1x przez 5 min w 70% etanolu, 1x w sterylnym DPBS.</li>
	<li>Spłukać roztworem zapobiegającym zaleganiu chorób i umyć 1x w sterylnym DPBS i aspirat.</li>
	<li>Ostrożnie, używając długich sterylnych kleszczy, umieść jedno mieszadło magnetyczne w każdym dołku 6-dołkowej płytki z ciałami zarodkowymi lub organoidami nerkowymi.</li>
	<li>Umieść płytkę na 6MSP i ustaw prędkość na 120 obr./min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J). Utrzymać organoidy nerkowe z połową zmiany pożywki, zgodnie z sekcjami 4.2 i 4.3. 
	UWAGA: Aby mieszadła magnetyczne zatrzasnęły się na swoim miejscu i zaczęły się obracać, może być konieczne najpierw krótkie ustawienie poziomu mocy na 100, a następnie, gdy wszystkie zaczną się obracać, obniżenie poziomu mocy do 25.</li>
</ol>

<ol><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715(2015).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li>
<li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715(2015).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).</li>
<li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li>
<li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li>
<li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150(2020).</li>
<li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li>
<li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li>
<li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li>
<li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+of+New+Zealand%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li>
<li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li>
<li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li>
<li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li>
<li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniejsze badania wykazały, że początkowe etapy protokołu mają kluczowe znaczenie dla pośredniego różnicowania mezodermy 5,19,20 i dlatego konieczne jest wdrożenie rygorystycznego składu pożywki na tym etapie. Usunięcie niezdefiniowanych składników, takich jak surowica, albumina, pożywka hybrydoma II bez białka z pierwszego etapu protokołu, może pomóc w poprawie spójnej skuteczności różnicowania między testami<sup class="xref...

W ostatnich latach opracowano szereg protokołów różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w organoidy nerkowe1,2,3,4,5. Organoidy nerkowe stanowią ważne narzędzie wspomagające badania nad nowymi metodami medycyny regeneracyjnej, modelowanie chorób związanych z nerkami, przeprowadzanie badań toksyczności i opracowywanie leków terapeutycznych. Pomimo ich szerokiego zastosowania, organoidy nerkowe mają ograniczenia, takie jak brak dojrzewania, ograniczona długoterminowa zdolność hodowli in vitro oraz niedostatek kilku typów komórek występujących w ludzkiej nerce6,7,8. Ostatnie prace koncentrowały się na poprawie poziomu dojrzewania organoidów, wydłużeniu okresów hodowli i zwiększeniu złożoności populacji komórek nerkowych poprzez modyfikację istniejących protokołów9,10,11,12. W tej obecnej iteracji naszego ustalonego protokołu5,13, zmodyfikowaliśmy składniki pożywki w pierwszym etapie protokołu na pożywkę bazową wolną od surowicy, uzupełnioną insuliną-transferyną-selenem-etanoloaminą (ITSE), lipidami, alkoholem poliwinylowym (E5-ILP) i CHIR99021 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dzięki tym zmianom uzyskano w pełni zdefiniowaną, pozbawioną surowicy, niskobiałkową pożywkę, zawierającą mniej składników niż w poprzednim składzie pożywki5,13 i bez dodatkowych czynników wzrostu. W rezultacie, przygotowanie podłoża pierwszego etapu jest mniej pracochłonne niż nasza poprzednio opublikowana wersja i może zmniejszyć zmienność między partiami5. Wcześniejsze badania wykazały, że zarówno insulina, jak i transferyna są ważne w hodowli bez surowicy14,15, jednak wysoki poziom insuliny może hamować różnicowanie mezodermy16. Utrzymaliśmy niski poziom insuliny przewidziany w pierwotnym protokole i jeszcze bardziej obniżyliśmy poziom KOSR (zawierający insulinę) w drugim etapie testu. Zgodnie z innymi protokołami tworzenia organoidów nerkowych, niższe poziomy KOSR są korzystne dla utrzymania równowagi między proliferacją a różnicowaniem tkanki nerkowej17. Dodatkowo obniżyliśmy stężenie glukozy w naszym Stage II medium13.
Nasza metoda opisuje konfigurację do oznaczania zawiesiny organoidów nerkowych, dając do ~1,000 organoidów z początkowej ~60% zlewającej się płytki hodowlanej hPSC 100 mm, jak opisano w oryginalnej publikacji5,13. Protokół ten można łatwo przeskalować do początku z wieloma płytkami 100 mm lub 150 mm, aby jeszcze bardziej zwiększyć liczbę organoidów.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-985-023</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do płukania zapobiegający przywieraniu</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72054</td><td>10 mM zapas w DMSO</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; jednorazowe kolby obrotowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-152</td><td></td></tr><tr><td>Corning Ultra-Low Attachment 6-dołkowe płytki</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła wolnoobrotowe Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-495-03</td><td>Mieszadło magnetyczne wielopłytkowe do hodowli w kolbach spinner</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>Podwielokrotność i zamrożenie</td></tr><tr><td>DMEM, niska glukoza, pirogronian, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Jajko / Owalne batony mieszające</td><td>2mag</td><td>PI20106</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta ogólnego przeznaczenia Excelta</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-103</td><td>Utrzymuj sterylność w kapturze do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>EZBio Jednorazowa butelka na media, 250 ml</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>138-3211-FLS</td> Używany do produkcji standardowych naczyń do kultur <td>tkankowych PVA 10%</td></tr><tr><td>Falcon (100 mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Sterylna pipeta zasysająca 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-135</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Podnośniki komórkowe - Podnośnik komórkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Wielofunkcyjne rotatory 3D</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-047</td><td>Wytrząsarka orbitalna</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Obniżony współczynnik wzrostu Membrana podstawna Matrix</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1413302</td><td>BME. Podwielokrotność na lodzie i zamrozić. Inną odpowiednią alternatywą dla matrycy jest Matrigel lub Cultrex.</td></tr><tr><td>Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td>GCDR</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td>Suplement L-glutaminy.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-Etanolamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>51-500-056</td><td>ITSE</td></tr><tr><td>KnockOut&nbsp; Zamiennik surowicy - wielogatunkowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3181502</td><td>KOSR. Podwielokrotność i zamrożenie</td></tr><tr><td>Mieszanina lipidów 1, chemicznie zdefiniowana</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L0288-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterylny system filtracji próżniowej 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma&nbsp; Sterylny system filtracji próżniowej Stericup Quick Release-GP 250mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol Jednostka sterująca MTP</td><td>2mag</td><td>VMF 90250 U</td><td></td></tr><tr><td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Mieszadło do mikropłytek</td><td>2mag</td><td>VMF 40600</td><td>6MSP</td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; 7X roztwór czyszczący</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP0976670A4</td><td> Detergent odpowiedni do hodowli tkankowej. Przygotuj 5% roztwór w wodzie</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF i mTeSR Plus medium również zostały przetestowane i stanowią odpowiednie alternatywy.&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 50 ml stożkowe, sterylne probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15mL stożkowe sterylne probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-140-122</td><td>Podwielokrotność i zamrożenie</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt</td><td>Odczynnik antymykoplazmowy. Podwielokrotność i zamrażanie</td></tr><tr><td>pluriSitko&reg; 200 &mikro; </td><td>m Fisher Scientific</td><td>NC0776417</td><td>Sitko</td></tr><tr><td>komórkowe pluriStrainer&reg; 500 &micro; </td><td>m Fisher Scientific</td><td>NC0822591</td><td>Sitko do komórek</td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy) 87-90% hydrolizowane&nbsp; (PVA)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P8136-250G</td><td>10% w DPBS mieszając w temperaturze 98 stopni C aż do rozpuszczenia, zrobić w inhibitorze 138-3211-FLS</td></tr><tr><td>ROCK Y-27632 (ROCKi)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>10 mM w</td></tr><tr><td>sterylnych jednorazowych pipetach serologicznych DPBS&nbsp; - 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td> Sterylne jednorazowe <td></td></tr><tr><td>pipety serologiczne - 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna jednorazowa pipeta serologiczna - 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-12D</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E5</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5916</td><td>Bez surowicy, niskobiałkowa pożywka bazowa do E5-ILP</td></tr><tr><td>Variomag distriBOX 2 Dystrybutor</td><td>2mag</td><td>VMF 90512</td><td>Jeśli używasz więcej niż jednego MIXdrive</td></tr></tbody></table>

uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Organoidy nerkowe generowane z hPSC stanowią nieograniczone źródło tkanki nerkowej. Ludzkie organoidy nerkowe są nieocenionym narzędziem do badania chorób i urazów nerek, opracowywania terapii komórkowych i testowania nowych terapii. Do takich zastosowań potrzebna jest duża liczba jednolitych organoidów i wysoce powtarzalne testy. Oparliśmy się na naszym wcześniej opublikowanym protokole organoidów nerkowych, aby poprawić ogólny stan zdrowia organoidów. Ten prosty, solidny protokół 3D obejmuje tworzenie jednolitych ciał zarodkowych w pożywce zawierającej minimalny składnik zawierający lipidy, suplement insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy i alkohol poliwinylowy z inhibitorem GSK3 (CHIR99021) przez 3 dni, a następnie hodowlę w pożywce zawierającej wymianę surowicy z nokautem (KOSR). Ponadto testy mieszające pozwalają na zmniejszenie zlepiania się ciał zarodków i utrzymanie jednolitej wielkości, co jest ważne dla zmniejszenia zmienności między organoidami. Ogólnie rzecz biorąc, protokół zapewnia szybką, wydajną i opłacalną metodę generowania dużych ilości organoidów nerkowych.

W tej najnowszej wersji naszego protokołu różnicowanie organoidów nerkowych jest inicjowane w zdefiniowanym medium o niskiej zawartości białka. Analizy są przeprowadzane w całości w zawiesinie i opierają się na wrodzonej zdolności hPSC do różnicowania i organizacji w celu zainicjowania tubulogenezy. Pojedyncza analiza pochodząca z płytki hodowlanej hPSC o średnicy 100 mm i konfluencji ok. 60% rutynowo daje 500–1000 organoidów nerkowych, jak pokazano w naszej poprzedniej publikacji5. Ze względu na ...

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Protokół ten generuje organoidy nerkowe w ciągu dwóch tygodni. Powstałe w ten sposób organoidy nerkowe można hodować w dużych kolbach obrotowych lub wielodołkowych magnetycznych płytkach mieszających w celu równoległego testowania leków.

Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Metodę tę można wykonać w dowolnym laboratorium wyposażonym do eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Korzystając z tej metody, możemy pogłębić naszą wiedzę na temat rozwoju nerek i szlaków chorobowych. Jest to stosunkowo prosta i niedroga metoda generowania organoidów nerkowych w porównaniu z innymi.Największym wyzwaniem tej techniki jest utrzymanie wysokiej jakości hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Bardzo ważne jest, aby komórki były utrzymywane na poziomie zbiegu mniejszym niż 80% i regularnie się dzieliły. Naukowcy, którzy nie mają doświadczenia w hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, powinni zapoznać się z liniami komórek macierzystych przed przystąpieniem do różnicowania.Rozpocznij test organoidów nerkowych od dodania dwóch mililitrów kompletnej pożywki E5-ILP do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Hoduj ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub hPSC na 100-milimetrowych płytkach poddanych kulturze tkankowej, aż osiągną 60% konfluencję. Umyj hPSC dwukrotnie około ośmioma mililitrami DPBS.Odessać DPBS, a następnie dodać kroplami dwa mililitry Dispase, aby przykryć komórki i inkubować je przez sześć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj komórki trzykrotnie około 10 mililitrami DPBS. Zassać DPBS, a następnie przechylić płytkę o 45 stopni i zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek.Przemyj kolonie od góry sześcioma mililitrami kompletnej pożywki E5-ILP za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Następnie, trzymając pipetę pionowo, rozdrobnij duże kolonie, delikatnie pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie dotknąć boków płytki hodowlanej. Rozprowadź klastry kolonii równomiernie, dodając jeden mililitr na studzienkę do płytki sześciodołkowej, a następnie umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Alternatywnie, jeśli wytrząsarka orbitalna nie jest dostępna, komórki można hodować statycznie. Drugiego dnia, po pozostawieniu ciał zarodkowych na dnie płytki, przechyl płytkę o 45 stopni i powoli odsysaj pożywkę od góry, pozostawiając jeden mililitr na dołek. Dodać dwa mililitry przygotowanego kompletnego podłoża do dołka i włożyć płytkę z powrotem do shakera.Trzeciego dnia, po zasysaniu pożywki, jak pokazano wcześniej, należy ostrożnie zebrać wszystkie ciała zarodków z każdej studzienki za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej i przenieść je do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Aby zebrać pozostałe ciała zarodkowe, przepłucz każdą studzienkę jednym mililitrem DMEM o niskiej glukozie i dodaj je do tej samej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Czekając, aż ciała zarodkowe osiądą na dnie probówki, dodaj dwa mililitry pożywki etapu II do każdego dołka sześciodołkowej płytki.Następnie przesiej duże ciała zarodkowe, umieszczając sitko do komórek o średnicy 200 mikrometrów na nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i ostrożnie pipetując wszystkie ciała zarodków na sitku komórkowym. Przepłucz sitko komórkowe dodatkowymi pięcioma mililitrami DMEM, aby zebrać wszelkie ciała zarodków utknęły w sitku. Na późniejszych etapach najpierw należy użyć sitka o średnicy 500 mikrometrów, aby odsiać bardzo duże ciała zarodkowe, a następnie przepuścić filtrat przez sitko o średnicy 200 mikrometrów, aby odsiać bardzo małe ciała zarodkowe bez kanalików.Zbierz ciała zarodkowe o odpowiedniej wielkości, od 200 do 500 mikrometrów, odwracając sitko o średnicy 200 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów i myjąc sitko DPBS. Po odcedzeniu pozwól ciału zarodka osiąść na dnie stożkowej rurki, a następnie odessać supernatant i przemyć około 10 mililitrami DMEM. Następnie ponownie zawieś zarodki w sześciu mililitrach pożywki etapu II.Przenieś ciała zarodkowe z powrotem do sześciodołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie, rozprowadzając je równomiernie między studzienkami. Ponieważ większość organoidów zbiera się w górnej części pipety, pozostaw około pół mililitra na końcu, a następnie delikatnie dotknij końcówką pożywki w każdej studzience, umożliwiając przepływ organoidów do studzienki. Przenieś ciała zarodków do 125-mililitrowej kolby obrotowej z 45 mililitrami pożywki Stage II.Ustaw prędkość mieszania magnetycznego na 120 obr./min i umieść kolbę w inkubatorze. Aby nakarmić ciała zarodkowe lub organoidy nerkowe, pozwól im na chwilę osiąść na dnie kolby przędzarki, a następnie podnieść pokrywkę z jednego bocznego ramienia kolby i umieścić pipetę zasysającą w środku tak, aby końcówka dotykała przeciwległej ścianki wewnętrznej. Powoli pochylić pipetę w dół i zassać około połowy pożywki.Uzupełnić 20 mililitrami świeżej pożywki Stage II, pipetując ją przez ten sam otwór. Użyj długich sterylnych kleszczy, aby ostrożnie umieścić jeden magnetyczny pręt mieszający w każdym dołku sześciodołkowej płytki z ciałami zarodkowymi lub organoidami nerkowymi. Umieść płytkę na sześciokołowej magnetycznej płycie mieszającej i ustaw prędkość na 120 obr./min.Aby mieszadła magnetyczne zatrzasnęły się na swoim miejscu i zaczęły się obracać, najpierw ustaw poziom mocy na 100. Gdy wszystkie paski zaczną się obracać, zmniejsz poziom mocy do 25. Utrzymuj organoidy nerkowe, zmieniając połowę pożywki, jak wykazano wcześniej.Immunofluorescencja skrawków parafiny organoidów nerkowych dnia 14 wykazuje obecność segmentów nefronowych, takich jak kanaliki nerkowe eksprymujące czynnik jądrowy hepatocytów-1 beta i lektyna Lotus tetragonolobus, a także klastry podocytów eksprymujące włókniakomięsaka mięśniowo-rozcięgnicznego V-maf, onkogen homolog B i nefrynę. Modyfikacje w tym protokole mogą wspierać ekspansję komórek śródbłonka, co potwierdza barwienie cząsteczką adhezyjną płytek krwi i komórek śródbłonka-1 w 26 dniu hodowli. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste muszą być traktowane Dispase przez odpowiedni czas, a następnie dokładnie umyte, aby usunąć wszelkie ślady.Jeśli Dispase nie zostanie całkowicie usunięty, może to prowadzić do śmierci komórek i grupowania się ciał zarodkowych. Metoda ta pomogła nam zbadać rozwój wrodzonych chorób nerek, a także różne ścieżki uszkodzenia nerek i potencjał interwencji terapeutycznych in vitro.

a-simplified-method-for-generating-kidney-organoids-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez różnicowanie komórek w określonych warunkach chemicznych. Wygenerowane podocyty mogą być wykorzystane do badań nefrotoksyczności i modelowania chorób.

Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Prezentowany tutaj jest chemicznie zdefiniowany protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych o wysokiej skuteczności (&gt;90%) i niezależny od manipulacji genetycznych czy selekcji subpopulacji. Protokół ten pozwala na uzyskanie pożądanego typu komórek w ciągu 26 dni i może być przydatny do testowania nefrotoksyczności i modelowania choroby.

Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie

Hodowle kanalików nerkowych stanowią cenny model in vitro do badania fizjologii i chorób nerek. Kanaliki można ustalić z tkanki nerkowej (zdrowej i chorej), a także z moczu, który stanowi łatwo dostępne i mniej inwazyjne źródło materiału badawczego.

Wytwarzanie ludzkich kanalików nerkowych z tkanek i moczu

Tutaj opisujemy protokół do efektywnego tworzenia istotnych dla rozwoju organoidów ludzkiego serca (hHO) przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez samoorganizację. Protokół opiera się na sekwencyjnej aktywacji sygnałów rozwojowych i wytwarza wysoce złożone, funkcjonalnie istotne tkanki ludzkiego serca.

Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj uproszczoną metodę generowania jednolitych organoidów nerkowych z ludzkich komórek pluripotencjalnych. Protokół ten umożliwia skalowalne, powtarzalne i ekonomiczne badania rozwoju nerki oraz modelowania chorób.

Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów