Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
13 kwietnia 2021
Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Protokół ten generuje organoidy nerkowe w ciągu dwóch tygodni. Powstałe w ten sposób organoidy nerkowe można hodować w dużych kolbach obrotowych lub wielodołkowych magnetycznych płytkach mieszających w celu równoległego testowania leków.
Metodę tę można wykonać w dowolnym laboratorium wyposażonym do eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Korzystając z tej metody, możemy pogłębić naszą wiedzę na temat rozwoju nerek i szlaków chorobowych. Jest to stosunkowo prosta i niedroga metoda generowania organoidów nerkowych w porównaniu z innymi.
Największym wyzwaniem tej techniki jest utrzymanie wysokiej jakości hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Bardzo ważne jest, aby komórki były utrzymywane na poziomie zbiegu mniejszym niż 80% i regularnie się dzieliły. Naukowcy, którzy nie mają doświadczenia w hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, powinni zapoznać się z liniami komórek macierzystych przed przystąpieniem do różnicowania.
Rozpocznij test organoidów nerkowych od dodania dwóch mililitrów kompletnej pożywki E5-ILP do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Hoduj ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub hPSC na 100-milimetrowych płytkach poddanych kulturze tkankowej, aż osiągną 60% konfluencję. Umyj hPSC dwukrotnie około ośmioma mililitrami DPBS.
Odessać DPBS, a następnie dodać kroplami dwa mililitry Dispase, aby przykryć komórki i inkubować je przez sześć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj komórki trzykrotnie około 10 mililitrami DPBS. Zassać DPBS, a następnie przechylić płytkę o 45 stopni i zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek.
Przemyj kolonie od góry sześcioma mililitrami kompletnej pożywki E5-ILP za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Następnie, trzymając pipetę pionowo, rozdrobnij duże kolonie, delikatnie pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie dotknąć boków płytki hodowlanej. Rozprowadź klastry kolonii równomiernie, dodając jeden mililitr na studzienkę do płytki sześciodołkowej, a następnie umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Alternatywnie, jeśli wytrząsarka orbitalna nie jest dostępna, komórki można hodować statycznie. Drugiego dnia, po pozostawieniu ciał zarodkowych na dnie płytki, przechyl płytkę o 45 stopni i powoli odsysaj pożywkę od góry, pozostawiając jeden mililitr na dołek. Dodać dwa mililitry przygotowanego kompletnego podłoża do dołka i włożyć płytkę z powrotem do shakera.
Trzeciego dnia, po zasysaniu pożywki, jak pokazano wcześniej, należy ostrożnie zebrać wszystkie ciała zarodków z każdej studzienki za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej i przenieść je do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Aby zebrać pozostałe ciała zarodkowe, przepłucz każdą studzienkę jednym mililitrem DMEM o niskiej glukozie i dodaj je do tej samej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Czekając, aż ciała zarodkowe osiądą na dnie probówki, dodaj dwa mililitry pożywki etapu II do każdego dołka sześciodołkowej płytki.
Następnie przesiej duże ciała zarodkowe, umieszczając sitko do komórek o średnicy 200 mikrometrów na nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i ostrożnie pipetując wszystkie ciała zarodków na sitku komórkowym. Przepłucz sitko komórkowe dodatkowymi pięcioma mililitrami DMEM, aby zebrać wszelkie ciała zarodków utknęły w sitku. Na późniejszych etapach najpierw należy użyć sitka o średnicy 500 mikrometrów, aby odsiać bardzo duże ciała zarodkowe, a następnie przepuścić filtrat przez sitko o średnicy 200 mikrometrów, aby odsiać bardzo małe ciała zarodkowe bez kanalików.
Zbierz ciała zarodkowe o odpowiedniej wielkości, od 200 do 500 mikrometrów, odwracając sitko o średnicy 200 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów i myjąc sitko DPBS. Po odcedzeniu pozwól ciału zarodka osiąść na dnie stożkowej rurki, a następnie odessać supernatant i przemyć około 10 mililitrami DMEM. Następnie ponownie zawieś zarodki w sześciu mililitrach pożywki etapu II.
Przenieś ciała zarodkowe z powrotem do sześciodołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie, rozprowadzając je równomiernie między studzienkami. Ponieważ większość organoidów zbiera się w górnej części pipety, pozostaw około pół mililitra na końcu, a następnie delikatnie dotknij końcówką pożywki w każdej studzience, umożliwiając przepływ organoidów do studzienki. Przenieś ciała zarodków do 125-mililitrowej kolby obrotowej z 45 mililitrami pożywki Stage II.
Ustaw prędkość mieszania magnetycznego na 120 obr./min i umieść kolbę w inkubatorze. Aby nakarmić ciała zarodkowe lub organoidy nerkowe, pozwól im na chwilę osiąść na dnie kolby przędzarki, a następnie podnieść pokrywkę z jednego bocznego ramienia kolby i umieścić pipetę zasysającą w środku tak, aby końcówka dotykała przeciwległej ścianki wewnętrznej. Powoli pochylić pipetę w dół i zassać około połowy pożywki.
Uzupełnić 20 mililitrami świeżej pożywki Stage II, pipetując ją przez ten sam otwór. Użyj długich sterylnych kleszczy, aby ostrożnie umieścić jeden magnetyczny pręt mieszający w każdym dołku sześciodołkowej płytki z ciałami zarodkowymi lub organoidami nerkowymi. Umieść płytkę na sześciokołowej magnetycznej płycie mieszającej i ustaw prędkość na 120 obr./min.
Aby mieszadła magnetyczne zatrzasnęły się na swoim miejscu i zaczęły się obracać, najpierw ustaw poziom mocy na 100. Gdy wszystkie paski zaczną się obracać, zmniejsz poziom mocy do 25. Utrzymuj organoidy nerkowe, zmieniając połowę pożywki, jak wykazano wcześniej.
Immunofluorescencja skrawków parafiny organoidów nerkowych dnia 14 wykazuje obecność segmentów nefronowych, takich jak kanaliki nerkowe eksprymujące czynnik jądrowy hepatocytów-1 beta i lektyna Lotus tetragonolobus, a także klastry podocytów eksprymujące włókniakomięsaka mięśniowo-rozcięgnicznego V-maf, onkogen homolog B i nefrynę. Modyfikacje w tym protokole mogą wspierać ekspansję komórek śródbłonka, co potwierdza barwienie cząsteczką adhezyjną płytek krwi i komórek śródbłonka-1 w 26 dniu hodowli. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste muszą być traktowane Dispase przez odpowiedni czas, a następnie dokładnie umyte, aby usunąć wszelkie ślady.
Jeśli Dispase nie zostanie całkowicie usunięty, może to prowadzić do śmierci komórek i grupowania się ciał zarodkowych. Metoda ta pomogła nam zbadać rozwój wrodzonych chorób nerek, a także różne ścieżki uszkodzenia nerek i potencjał interwencji terapeutycznych in vitro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół generowania organoidalnych nerek z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) w ciągu dwóch tygodni. Organoidy mogą być hodowane w dużych pojemnikach obrotowych lub wielopłytkowych naczyniach z mieszadłem magnetycznym do zastosowań w testach leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- Organoidy nerek są cenne dla badań nad rozwojem nerek.
- Dostarczają informacji o szlakach chorobowych.
- Ta metoda jest prostsza i bardziej ekonomiczna niż tradycyjne techniki.
- Utrzymanie wysokiej jakości kultury hPSC jest kluczowe dla sukcesu.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu do generowania organoidalnych nerek.
- Ułatwienie testów leków i badań nad chorobami nerek.
- Zgłębienie rozwoju i funkcji nerek.
Stosowane metody
- Hodowla i różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
- Generowanie organoidalnych nerek w ciągu dwóch tygodni.
- Zastosowanie technik hodowli w dużej skali do utrzymania organoidalnych nerek.
- Integracja podejść do testowania leków w systemie hodowli.
Główne wyniki
- Udana generacja organoidalnych nerek z hPSC.
- Organoidy mogą być hodowane w różnych formatach do badań.
- Metoda wykazuje potencjał do zastosowań w skali przemysłowej.
- Identyfikacja wyzwań związanych z utrzymaniem jakości kultury komórkowej.
Wnioski
- Protokół oferuje prosty sposób generacji organoidalnych nerek.
- Wspiera postęp w badaniach nad nerkami i testach leków.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie do badania chorób związanych z nerkami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Uniform kidney organoids derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) address a critical need for scalable, reproducible renal models in early drug discovery and disease research. This protocol enables high-throughput generation of consistent organoids, supporting predictive confidence in preclinical assays and translational studies. The approach streamlines workflow integration for renal target validation and compound screening across biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of renal developmental pathways and disease mechanisms in a controlled 3D system.
- Supports functional validation of kidney-specific targets using human-derived tissue models.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing reproducible, disease-relevant organoid platforms.
Screening & Assay Development
- Delivers large quantities of uniform organoids for standardized, quantitative compound testing.
- Reduces assay variability through size selection and agitation, improving reproducibility.
- Prepares validated biological systems for downstream screening and phenotypic analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human kidney biology for translational biomarker studies.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation of renal therapeutics.
- Supports in vitro modeling of congenital kidney diseases and injury pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits from early discovery through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for renal biology studies and compound evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in human kidney tissue context.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for reliable compound assessment.
- Analytics: Enables measurement of nephron segment markers and organoid uniformity for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases with disease-relevant organoid models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various renal research and screening initiatives across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal studies.
- Operational Value: Standardizes organoid production for scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in renal drug discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of renal targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hPSC culture and differentiation protocols.
- Needs access to cell culture infrastructure, orbital shakers, and size selection strainers.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptable to different hPSC lines and renal disease models with protocol optimization.
- Dependent on precise Dispase treatment and washing to prevent cell death and clumping.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Setting up the Kidney Organoid Assay and Feeding by Half-Medium Change
2:49
Transfer of Embryoid Bodies to Stage II Medium
4:49
Transfer to Spinner Flask and Feeding
5:37
Setting up a 6-Well Magnetic Stir Plate
6:14
Results: Immunofluorescence of the Kidney Organoids
6:51
Conclusion
