Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych stanów wytwardzania podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza. Technika ta stanowi główną zaletę, umożliwiając badanie różnych stanów fagocytozy Leishmania i udziału kilku białek.

Warto zauważyć, że technika ta może być również rozszerzona na inne rodzaje badań, w tym infekcję bakteriami, drożdżami, czy też pochłonięcie przez inne typy komórek. Osoby próbujące tej techniki powinny zadbać o czas ekspozycji komórek na roztwór Nucleofectora. Ponadto sugerujemy rozpoczęcie testowania transfekcji przy użyciu maksymalnie dwóch plazmidów.

Procedurę zademonstruje Amanda Reboucas, doktorantka z naszego laboratorium. Na początek zasiej 0,2 miliona komórek THP-1 lub makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów w 500 mikrolitrach RPMI na studzienkę na 24-dołkowej płytce z 13-milimetrowymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla, dwukrotnie umyć komórki 0,9% soli fizjologicznej i inkubować komórki w kompletnym pożywce RPMI.

Dodaj do komórek gatunki Leishmania w fazie stacjonarnej w stosunku pasożyta 10 do jednej komórki gospodarza, a następnie odwiruj w temperaturze 720 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji komórek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, umyj komórki dwukrotnie 0,9% roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane promastigoty. Inkubuj komórki w dodanym pożywce RPMI w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie utrwalaj komórki 4% PFA przez 15 minut.

Następnie zamontuj szkiełka nakrywkowe przy użyciu preferowanych mediów montażowych. Następnie policz co najmniej 400 komórek w losowych polach pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby zbadać indukowaną przez Leishmanię biogenezę PV, rozpocznij transfekcję komórek THP-1 plazmidem, umieszczając 15 milionów komórek THP-1 w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zawierających 10 mililitrów pożywki Complete RPMI Medium uzupełnionej 100 nanogramami na mililitr PMA i 50 mikromolami do merkaptoetanolu przez 48 godzin.

Następnie umyj komórki raz w 0,9% roztworze soli fizjologicznej i odłącz komórki za pomocą nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek. Następnie odwirować w temperaturze 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś ogniwa THP-1 w jednym mililitrze pożywki RPMI i wykonaj zliczenia w komorze Neubauera.

Ponownie odwirować komórki w temperaturze 250 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić 2 miliony komórek w 100 mikrolitrach roztworu Nucleofector i inkubować z 0,5 mikrograma powłoki plazmidowej dla interesującego białka, oznaczonego białkiem fluorescencyjnym. Przenieś zawiesinę zawierającą komórki THP-1 i kwas nukleinowy do kuwety Nucleofectora.

Następnie przeprowadź transfekcję komórek za pomocą programu Nucleofector Y jeden. Odzyskaj transfekowane komórki i nasiona w 500 mikrolitrach pożywki RPMI na 24-dołkowych płytkach z 13-milimetrowymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Inkubuj komórki i wypełnij pożywkę RPMI w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 0,5, 2, 4, 6, 12 i 24 godziny.

Pozostaw 13-milimetrowe szklane szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej i chroń je przed światłem co najmniej 30 minut przed pobraniem. Wyczyść szkiełka nakrywkowe chusteczką chłonną. Następnie dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu, a następnie dodaj szkiełko.

Przesuń obiektyw w górę, aż olej dotknie suwaka. Obserwuj i dostosuj ostrość w mikroskopie i wybierz opcję Obiektyw 63x z olejem. Otwórz program LIQA i wyreguluj lasery w długościach fal 488, 552 i 405.

Wybierz rozdzielczość obrazu jako 1024 x 1024. Po kliknięciu na przycisk na żywo ustaw Z-stack i naciśnij opcję start. Poczekaj na akwizycję obrazu, a następnie wybierz opcję maksymalna projekcja w narzędziach.

Zapisz eksperyment i wyeksportuj obrazy w formacie TIFF do komputera. Wyniki wykazały, że zarówno Leishmania Braziliensis LCL, jak i Leishmania Braziliensis DL w podobny sposób wiążą się z makrofagami. Nie zaobserwowano również różnic w fagocytozie DL Leishmania Braziliensis LCL i Leishmania Braziliensis przez komórki gospodarza.

Rekrutację LC3 do wakuoli parazytoforycznej lub PV, indukowaną przez Leishmania Braziliensis LCL lub Leishmania Braziliensis DL, porównano w zakażonych komórkach. Po czterech godzinach infekcji zaobserwowano podobny odsetek PV ozdobionych LC3 w makrofagach zakażonych Leishmania Braziliensis LCL i Leishmania Braziliensis DL. W związku z tym wyniki wykazały, że Leishmania Braziliensis LCL i Leishmania Braziliensis DL podobnie oddziałują z makrofagami podczas wiązania, fagocytozy i biogenezy PV w odniesieniu do rekrutacji LC3.

Reprezentatywne obrazy mikroskopowe wykazały skuteczną transfekcję komórek THP-1 plazmidami PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Osoby próbujące tego protokołu muszą zwracać uwagę na inkubację w temperaturze i chronić próbki mikroskopowe przed światłem, wszystkimi rodzajami. Modulowanie ekspresji zidentyfikowanych białek wywołujących fagocytozę Leishmania wykaże znaczenie tych białek w wyniku zakażenia Leishmania.

Możemy rozszerzyć tę technikę na różne rodzaje badań patologicznych i mechanizmy związane z osiedlaniem się pasożytów i identyfikacją celu w celu opracowania strategii terapeutycznych.