Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną ¹H _{R 1ρ} RNA

Protokół ten opisuje przygotowanie próbki RNA i konfigurację NMR do pomiarów dyspersji relaksacji protonów R1rho w celu zbadania wymiany potwierdzającej w cząsteczkach RNA. Ponieważ protony są badane, metoda nie wymaga znakowania izotopowego i może bezpośrednio uzyskać dostęp do cech strukturalnych, takich jak przesunięte parowanie zasad. Pipeta jest dość modułowa w tym sensie, że dyspersję relaksacyjną R1rho można zmierzyć, nawet jeśli próbka jest wytwarzana inną metodą.

Rozpocznij od przygotowania próbki plazmidu i skonfigurowania reakcji transkrypcji i rozszczepienia in vitro, jak opisano w rękopisie tekstu. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie rozcieńczyć jeden mikrolitr próbki dziesięciokrotnie w roztworze ładującym.

I uruchom jeden mikrolitr na denaturującym żelu PAGE. Jeśli reakcja rozszczepienia zakończy się sukcesem, przeskaluj reakcję do żądanej objętości i uruchom ją przez noc. Następnie uruchom kolejny denaturujący żel PAGE i oceń, czy reakcja rozszczepienia została zakończona.

W przypadku niepełnego rozszczepienia podgrzej roztwór reakcyjny w konwencjonalnej kuchence mikrofalowej o mocy 450 watów przez 15 sekund. Następnie powoli schładzaj roztwór do 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby ponownie zanować RNA i prowadnik rozszczepienia. I zwróć uwagę na tworzenie się nowego osadu.

Dodaj więcej nieorganicznej pirofosfatazy i RNazy H.Inkubuj reakcję przez jedną do trzech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie potwierdź zakończenie reakcji rozszczepienia za pomocą denaturacji PAGE. Po zakończeniu reakcji rozszczepienia RNazy H, wygasić reakcję, dodając EDTA do końcowego stężenia 50 milimolów.

I dokładnie wiruj. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona. I stężyć roztwór do objętości wstrzykiwanej do systemu HPLC w celu oczyszczenia.

Przed dodaniem zagęszczonej i oczyszczonej próbki do probówki NMR należy oczyścić probówkę, przepłukując ją dużą ilością wody. Następnie odczynnik do odkażania RNazy, woda i 95% etanol. Po ostatnim spłukaniu wodą pozostaw do wyschnięcia.

Przepłukać tłok wodą i użyć niestrzępiącej się chusteczki do czyszczenia odczynnikiem do odkażania RNazy i 95% etanolem. Po wysuszeniu probówki i tłoka dodać 10%D2O do próbki NMR. Użyj dużej końcówki pipety, aby przenieść próbkę RNA do probówki NMR, przepływając ją wzdłuż boku ścianki probówki.

Włóż tłok do rurki, naciskając go szybkim ruchem obrotowym w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie powoli pociągnij tłok do góry, nie tworząc nowych pęcherzyków powietrza. I napraw to folią z wosku parafinowego. Utwórz nowy zestaw danych na podstawie zestawu danych HSQC aromatycznego węgla protonowego używanego na w pełni znakowanych próbkach RNA w celu przypisania RNA.

Ustaw parametry ogólne i parametry specyficzne dla RD. Następnie ustaw moc blokady wirowania protonów na 1,2 kiloherca w celu przetestowania. Wygeneruj testową listę vd z tylko jednym wpisem, zerową milisekundą, ustaw TDF1 na jeden i zaktualizuj D30, aby uruchomić widmo testowe.

Po skonfigurowaniu testowej listy vd zaktualizuj D30 i TDF1. I wykreśl intensywność szczytu dla różnych długości blokady wirowania. Określ długość blokady wirowania, przy której intensywność pierwotnego piku zmniejsza się do jednej trzeciej.

Na podstawie wyniku przebiegów testów utwórz ostateczną listę vd, która ma być używana w eksperymencie. Wybierz liczbę skanowań tak, aby najsłabszy szczyt listy miał stosunek sygnału do szumu wynoszący co najmniej 10. Przedstawiono tutaj wyniki kilku reakcji rozszczepienia transkryptów tandemowych.

W udanej reakcji wygenerowano 20-nukleotydowe docelowe RNA. Nieudane reakcje skutkowały niekompletnym i nieudanym rozszczepieniem próbki. Wstrzyknięcie HPLC próbki RNA ujawniło pik czystego docelowego RNA po 38 minutach.

Natomiast dłuższe i krótsze produkty były dobrze oddzielone od szczytu zainteresowania. Analiza spinki do włosów RNA wykazała, że liczba obserwowanych protonów imino odpowiadała liczbie protonów imino oczekiwanej na podstawie symulacji struktury drugorzędowej. Widmo HSQC węgla protonowego rezonansów aromatycznych RNA wykazało cztery sygnały po złożeniu.

I tylko trzy sygnały przed złożeniem. W reprezentatywnym na krzywych rezonansowych uzyskanych dla dwóch różnych atomów H8 i dwóch różnych syntetycznych spinek do włosów RNA, G6H8 doświadcza wymiany potwierdzającej. Podczas gdy A4H8 nie.

W przypadku G6H8 wybrano kolorowe moce blokady wirowania i zarejestrowano dane dotyczące rezonansu. W konstrukcji CG, w której wymiana jest powolna, wartości wierszy R1rho w funkcji wykresu przesunięcia wykazywały już niewielką asymetrię krzywej, wskazując na znak różnicy przesunięcia chemicznego delta omega. Staje się to jeszcze bardziej widoczne na wykresie R2 plus REX, gdzie wkład R1 jest usuwany.

Z drugiej strony, konstrukt GC doświadcza szybszej wymiany, a wykres wartości R1rho w funkcji przesunięcia przedstawia szerszą krzywą, w której ekstrakcja delta omega staje się mniej oczywista nawet na wykresie R2 plus REX. Po wyjaśnieniu dynamiki RNA stany można scharakteryzować i uwięzić. Te uwięzione stany można na przykład przetestować w testach biologicznych.

Metoda ta pozwala na obserwację funkcjonalnych, istotnych przesunięć par zasad w aktywnym kompleksie miRNA mikroRNA, rearanżacji pętli w rybosomalnym RNA oraz stabilności par zasad na wybrzuszeniach pojedynczego nukleotydu.