Name: Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj przygotowanie próbek RNA i konfigurację eksperymentów NMR R1rho do badania wymiany konformacyjnej. Metoda umożliwia obserwację dynamiki RNA z rozdzielczością atomową bez konieczności izotopowego znakowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy ośrodkowi nauk o białkach (PSF) w Instytucie Karolinska za ekspresję i oczyszczenie polimerazy T7 RNA i E. coli RNazy H, Martinowi Hällbergowi za hojny dar fosfatazy nieorganicznej i całemu Petzoldlab za cenne dyskusje. Dziękujemy Luce Retattino za przygotowanie konstrukcji U-bulge oraz Emilie Steiner i Carolinie Fontanie za ich wkład w tworzenie makr i pasujących skryptów. Dziękujemy Instytutowi Karolinska oraz Zakładowi Biochemii Medycznej i Biofizyki za wsparcie zakupu spektrometru 600 MHz oraz finansowanie pozycji (KI FoAss i KID 2-3707/2013). Jesteśmy wdzięczni za wkład finansowy ze strony Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 i FFL15-0178) oraz The Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 i 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 i M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. potwierdza finansowanie w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie" (projekt UE H2020, MSCA-IF nr 747446).

K.P. jest konsultantem Arrakis Therapeutics, firmy, która odkrywa małe cząsteczki celujące w RNA.

Przedstawiony w nim protokół jest syntezą kilku protokołów opublikowanych wcześniej w formie artykułów naukowych 10,20,21,31. W związku z tym segmenty protokołu mogą być stosowane, podczas gdy inne mogą być wymieniane zgodnie z preferencjami czytelnika. Na przykład pomiary R1ρ można przeprowadzić na próbce RNA wytworzonej dowolną metodą, pod warunkiem, że założy się fałdowanie i jednorodność długości. Co więcej, protokół nie zawiera informacji na temat rezonansowego przypisania sekwencji RNA - kroku wymaganego w eksperymentach RD - ponieważ zostało to obszernie omówione w poprzedniej literaturze 19,37,38. Częściowe, segmentowe lub specyficzne dla miejsca schematy znakowania 36,41,42,43,44 są podejściami ułatwiającymi przypisywanie rezonansów lub zmniejszającymi nakładanie się rezonansów, które są przedmiotem zainteresowania w eksperymentach RD i zostały szczegółowo opisane w literaturze. Metoda ta pozwala na zastosowanie jednolitego znakowania dowolnej tożsamości nukleotydowej, co już teraz może znacznie uprościć przypisywanie rezonansu.
Przedstawiona tutaj metoda IVT przezwycięża znane problemy z sekwencjami i etykietowaniem, zwiększa wydajność oraz zmniejsza koszty i czas pracy w porównaniu z innymi metodami. Zastosowanie sekwencji inicjacji wirusa zmniejsza potrzebę optymalizacji reakcji, co jest znanym problemem w tej dziedzinie, którego wykonanie może być czasochłonne i daje tylko kilka kopii transkryptu w przypadku inicjacji bez przeciążenia. Rozszczepienie T7 IVT i RNazy H transkryptu tandemowego można przeprowadzić jednocześnie w tym samym naczyniu. Wzór multimerycznych powtórzeń tandemowych można zaobserwować na denaturującym żelu PAGE podczas reakcji, który łączy się w pojedyncze pasmo na docelowym RNA po zakończeniu reakcji RNazy H (Figura 3A, pasy 1 i 2b). Typowe plony przy użyciu tej metody wahają się od 30 do 70 nmol RNA na 1 ml IVT. Jednak metoda oparta na rozszczepieniu RNazy H powtórzeń tandemowych nie jest pozbawiona pewnych problemów. Reakcja rozszczepienia RNazy H często nie przechodzi do zakończenia, gdy jest prowadzona jednocześnie z transkrypcją T7 (Figura 3A, ścieżka 2a).
Separację jednostek tandemowych można sfinalizować poprzez wyżarzanie prowadnicy rozszczepienia do transkryptu i dodanie większej ilości RNazy H (Rysunek 3A, pas 2b, krok 2.1.2). Ponieważ podgrzewanie dużych objętości jest powolne i prowadzi do katalizowanej Mg2+ hydrolizy RNA, zastosowano konwencjonalną kuchenkę mikrofalową, która podgrzewa próbkę do >95 °C w ciągu 10-15 s. Dotychczas nie zaobserwowano niekorzystnego wpływu na wyprodukowane próbki. Niektóre konstrukty pokazują małe drugie pasmo, którego nie można było wyeliminować przez optymalizację warunków reakcji (rysunek 3A, tor 4). Zazwyczaj są one dość wyraźnie widoczne jako ramię na chromatogramie HPLC, jeśli stosuje się dobrze zoptymalizowany gradient elucji, i mogą być usunięte (krok 2.2.5). Poniższa dyskusja ma na celu podkreślenie krytycznych etapów w protokole, w szczególności w odniesieniu do uzyskania wysokiej jakości danych, które pozwalają na interpretację dynamiki konformacyjnej.
Zanieczyszczenie RNazą Zewnątrzkomórkowe RNazy są wszechobecne, wysoce stabilne i stanowią największe zagrożenie dla długoterminowej stabilności próbek NMR. Dlatego tak ważne jest, aby pracować w środowisku wolnym od RNaz i utrzymywać wszystkie odczynniki i wyroby z tworzyw sztucznych wolne od RNaz. Zaleca się stosowanie końcówek filtrujących, a może nawet masek na twarz. Jest to szczególnie ważne po oczyszczeniu metodą HPLC. Próbki NMR zanieczyszczone RNazami zwykle wykazują wąskie piki widoczne w widmach 1H-1D po dniach lub tygodniach z powodu produktów degradacji pojedynczych nukleotydów. Taka próbka nie nadaje się do pomiarów R1ρ.
Próbka NMR Ze względu na swój wysoce naładowany charakter, RNA może być stosowany w wysokich stężeniach bez wytrącania w porównaniu z większością białek. Zastosowanie probówek Shigemi NMR (patrz Tabela Materiałów) jest korzystne, ponieważ umożliwiają one wyśrodkowanie wysoce skoncentrowanej próbki w środku cewki, zapewniając jednocześnie idealne warunki podkładkowania i blokowania dzięki dopasowanemu do podatności szklanemu dnu i tłokowi. W ten sposób zmniejsza się niejednorodność B1, co prowadzi do powstania węższych linii. Typowa objętość próbki w probówce NMR wynosi 250 μl, a typowe stężenie to 1-2 mM. Próbki poniżej 500 μM nie są zalecane do eksperymentów RD, ponieważ eksperyment trwałby zbyt długo i dobrze by się nabrał. Podobnie, objętość próbki poniżej 200 μl nie jest zalecana, ponieważ wymagana jest dobra podkładka podporowa i stabilność w terenie (blokada). Podczas wkładania tłoka ważne jest, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w próbce (krok 2.4.5). Jeśli nie zostanie prawidłowo zamocowany, tłok może wsunąć się do próbki, zmniejszając wykrywalną objętość. Ponadto gwałtowne zmiany temperatury mogą prowadzić do powstawania nowych pęcherzyków w próbce. W związku z tym należy zachować ostrożność podczas transportu próbki oraz przy zmianie temperatury sondy w spektrometrze NMR. Sprawdź próbkę pod kątem pęcherzyków powietrza podczas ponownego pomiaru po dłuższym czasie.
Fałdowanie RNA Dynamiczne cząsteczki RNA mogą istnieć w wielu konformacjach, gdy nie są prawidłowo złożone. Mimo że temperatury topnienia struktur wtórnych mogą być tylko nieznacznie wyższe od temperatury pokojowej, przed pomiarem zaleca się dokładną procedurę ogrzewania i chłodzenia zatrzaskowego. Wysoce skoncentrowane próbki spinki do włosów składające się pod kontrolą kinetyczną (ogrzewanie i chłodzenie błyskawiczne) mogą z czasem tworzyć homodimery, co wymaga rygorystycznej kontroli fałdowania RNA przed każdym pomiarem NMR. Jeśli zmierzone RNA nie jest strukturą typu hairspin, ale duplex RNA, należy zastosować powolne fałdowanie pod kontrolą termodynamiczną.
W takim przypadku proces chłodzenia po podgrzaniu powinien odbywać się w zakresie godzin, podczas gdy RNA jest wykorzystywane w swojej końcowej objętości i stężeniu w próbce NMR. Wstępne zliczanie oczekiwanych rezonansów imino i aromatycznych może dostarczyć informacji na temat jednorodności próbki. Jeśli próbka nie wygląda zgodnie z oczekiwaniami, należy ją ponownie złożyć. Mg2+ (dodany jako sól chlorkowa) może pomóc w fałdowaniu struktur RNA45. W praktyce kontrola składania służy jako porównanie z próbką, która została wykorzystana do przynajmniej częściowego przypisania rezonansów NMR i eksperymentalnego rozwiązania struktury drugorzędowej.
Zagadnienia dotyczące mocy blokady wirowania i ogrzewania W przypadku przeprowadzania eksperymentów 1H R1ρ RD jako eksperymentów przeglądowych 2D, moc SL nie powinna być mniejsza niż 1,2 kHz. Częstotliwość nadajnika częstotliwości radiowej powinna być umieszczona w środku obszaru ppm pików będących przedmiotem zainteresowania (np. 7,5 ppm dla protonów aromatycznych). Szerokość pasma 1,2 kHz będzie wtedy wystarczająco duża, aby zablokować te protony bez żadnych większych efektów rezonansowych. Takie efekty można zidentyfikować w profilu RD. Jeśli wystąpią, wartości R2 + REX rosną zamiast maleć wraz ze wzrostem wartości mocy SL, szczególnie w przypadku niskiej mocy SL. Sprawdź, czy obliczone wartości mocy SL odpowiadają mocy dostarczonej do próbki. W praktyce obliczona moc SL może być użyta, jeśli twardy impuls 1H 90° został starannie skalibrowany na nowszych spektrometrach; można to jednak sprawdzić, kalibrując moc SL dla każdej żądanej szerokości pasma.
Zakres mocy SL, która może być wykorzystana w eksperymentach 1H R1ρ RD jest bardzo szeroki, co prowadzi do różnego nagrzewania próbki (od 1,2 kHz do 15 kHz dla HSQC dla sekwencji opartych na HCP i od 50 Hz do 15 kHz dla eksperymentów SELOPE). Nierównomierne nagrzewanie próbki można wykryć jako niewielką zmianę przesunięcia chemicznego, porównując 1D uzyskane dla SL małej mocy vs. SL o dużej mocy. Efekt ten zwykle nie jest brany pod uwagę w kompensacji ciepła w doświadczeniach R1ρ na heterojądrach. Kompensacja ciepła w tych eksperymentach jest zwykle ustawiana tak, aby korygować różne nagrzewanie ze względu na różne czasy trwania blokady wirowania określone na liście vd każdej serii mocy blokady wirowania. Szczególnie w eksperymencie SELOPE należy zastosować drugą kompensację ciepła dla wszystkich zastosowanych mocy SL, jak opisano w20.
Zagadnienia dotyczące listy VD Jak wspomniano wcześniej, lista vd powinna zawierać punkt czasowy wystarczająco długi, aby uzyskać znaczny zanik intensywności (najlepiej do 30% początkowego sygnału lub tak niski, jak to możliwe, jeśli nie jest możliwe osiągnięcie 70% zaniku w specyfikacji sondy). Chociaż lista vd została zoptymalizowana pod kątem niskiej mocy SL (1,2 kHz), ta lista vd powinna być również testowana przy najwyższej mocy SL, jaka ma być używana (np. 15 kHz). Wynika to z faktu, że dla szczytów ze znacznym udziałem REX , zanik będzie znacznie wolniejszy przy wysokiej mocy SL. Tak więc wystarczający rozpad powinien być również zweryfikowany przy wysokiej mocy SL. To samo należy wziąć pod uwagę w przypadku rozpadów przy dużych przesunięciach w eksperymentach z rezonansem. Idealny maksymalny punkt czasowy listy vd może być znacząco różny dla różnych regionów eksperymentu dyspersyjnego. W takim przypadku więcej punktów może zostać uwzględnionych na liście vd, a dłuższe punkty z listy vd dla wyższej mocy SL lub wyższych przesunięć podczas analizy, w oparciu o niskie SINO, do którego doprowadzą, mogą zostać odrzucone. Ogólnie rzecz biorąc, należy wziąć pod uwagę 5-8 punktów listy vd, aby móc dostrzec potencjalne artefakty prowadzące do rozpadów niewykładniczych, takich jak sprzężenie J (patrz poniżej).
Zagadnienia dotyczące selektywności 1D-HCP Należy zachować szczególną ostrożność podczas uruchamiania wersji 1D opartej na HCP, jeśli występuje inny pik pokrywający się z pikiem zainteresowania w wymiarze 1H eksperymentu opartego na HSQC 2D. Transfery oparte na HCP są bardzo, ale nigdy w 100% selektywne, a zatem może się zdarzyć, że kolejny pik przyczynia się do intensywności i zaniku interesującego go piku w 1D. Wskazówką do tego byłaby różnica w wartościach rezonansowych R1ρ uzyskanych przy użyciu wersji 1D i 2D znakowanego eksperymentu.
Rozważania dotyczące ROE: Dla krzywych rezonansowych atomów z powolną wymianą pośrednią, artefakty ROE można zidentyfikować na podstawie porównania otrzymanego Δω z widmem NOESY lub ROESY. Jeśli pik krzyżowy można zidentyfikować przy różnicy przesunięć chemicznych odpowiadającej Δω, to obserwowany stan wzbudzony może być w rzeczywistości artefaktem ROE (np. ROE znaleziono między aromatycznymi protonami, które znajdują się w tym samym zakresie przesunięcia chemicznego, a zatem są objęte tymi krzywymi rezonansowymi20). Z doświadczenia wiem, że zawsze prowadziło to również do słabego pasowania z dużymi błędami, prawdopodobnie z powodu tego, że ROE nie podążało za tym samym wzorcem co REX ze wzrostem mocy SL. Sytuacja staje się trudniejsza w przypadku wymiany średnio szybkiej. Podczas gdy krzywa rezonansowa jest (z porównania z danymi 13C uzyskanymi na sąsiednim jądrze) nadal reprezentatywna dla procesu wymiany między GS i ES, na krzywą rezonansową wpływa wiele artefaktów ROE.
W takim przypadku moc SL do wykrywania procesu wymiany jest większa (>1,5 kHz) i dlatego obejmuje większą liczbę protonów, ponieważ krzywe offrezonansowe obejmują różnice przesunięć chemicznych różnych kandydatów na ROE (dla H8 byłyby to: protony aminowe przy ok. ±1000 Hz, H5/H1 przy ok. -1200 Hz, imino protonów o częstotliwości ok. 3500 Hz). Do tej pory nie znaleziono żadnej metody tłumienia tych artefaktów ROE (innej niż użycie częściowo deuterowanych nukleotydów46), a dane off-rezonansowe nie powinny być rejestrowane w przypadku szybkiej wymiany pośredniej, ponieważ za pomocą tej metody nie można uzyskać wiarygodnych informacji na temat rzeczywistego Δω, jeśli nie można wykluczyć udziału NOE/ROE za pomocą widm NOESY.
Uwagi dotyczące sprzęgła J (Hartmann-Hahn) Chociaż krzywe rezonansowe dla homojądrowych protonów sprzężonych z literą J, takich jak H6, udało się zarejestrować10,20, należy zachować szczególną ostrożność przy pomiarach poza rezonansem, zwłaszcza dla niskiej mocy SL, ponieważ warunki dopasowania Hartmanna-Hahna mogą obejmować szeroki zakres badanych przesunięć. Artefakty Hartmanna-Hahna można zidentyfikować jako oscylacje na rozpadzie wykładniczym lub rosnące wartości R2 + REX wraz ze wzrostem siły SL na rezonansowych wykresach RD20.

RNA pełnią wiele funkcji regulacyjnych1, catalytic2, and structural3 funkcje w komórce, z których wiele jest skorelowanych z elastyczną strukturą molekularną i skomplikowanymi zmianami tych struktur4,5,6,7. Stany o niskim zaludnieniu pozostają niewidoczne dla większości metod wyznaczania struktury lub nie pozwalają na badanie tych ukrytych stanów w wysokiej rozdzielczości atomowej. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w stanie roztworu łączy oba aspekty, zapewniając dostęp do pojedynczych jąder atomowych, a także oferując duży zestaw eksperymentów ukierunkowanych na dynamikę we wszystkich reżimach czasowych8. Eksperymenty RD NMR zapewniają dostęp do wymiany konformacyjnej w pośredniej skali czasowej, w której można spodziewać się zmian we wzorcach parowania zasad i lokalnych rearanżacjach strukturalnych5,9,10,11,12,13,14. Eksperymenty RD są wykonywane jako długie pomiary R2 w postaci ciągu impulsów Carra-Purcella-Meibooma-Gilla15 lub jako pomiary relaksacji w obracającej się ramce, zwane R1ρ RD experiments16.
Chociaż oba mogą być używane do wyodrębniania populacji i różnicy kursu wymiany oraz przesunięcia chemicznego do stanu mniejszego, eksperymenty R1ρ RD również dają znak różnicy przesunięcia chemicznego stanu wzbudzonego. Pozwala to na wnioskowanie o strukturze drugorzędowej, która silnie koreluje z przesunięciem chemicznym w strukturach RNA17. Przesunięcie chemiczne jest dobrym wskaźnikiem spiralności w przypadku aromatycznych protonów i atomów węgla na zasadach nukleotydowych, partnerów parowania zasad dla protonów imino oraz zmarszczek cukru na atomach C4' i C1'18,19. Należy zauważyć, że niedawno opublikowano eksperyment z transferem nasycenia wymiany chemicznej (CEST) z wykorzystaniem wyższej mocy blokady spinowej (SL), przesuwając tym samym zastosowanie eksperymentu CEST do szybszych skal czasowych wymiany, jako alternatywa dla eksperymentu R1ρ RD dla układów o jednym stanie wzbudzonym.
Chociaż izotopy 13C i 15N były często używane do uzyskania dostępu do wymiany strukturalnej, ostatnie prace z tego laboratorium używały protonów aromatycznych i imino jako sond do wymiany konformacyjnej9,10. Wykorzystanie 1H jako obserwowanego jądra niesie za sobą szereg korzyści, na przykład dostęp do wymiany w szybszych i wolniejszych skalach czasowych, wyższą czułość i krótsze czasy pomiarów. Jest to dodatkowo ułatwione dzięki podejściu SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), zapewniającemu dostęp do aromatycznych protonów poprzez depulację jednowymiarowego (1D) widma za pomocą homojądrowych sprzężeń skalarnych, zamiast heterojądrowego transferu magnesowania, oraz eliminując potrzebę etykietowania izotopów20. Protokół ten dotyczy pomiaru w eksperymentach 1H R1ρ RD jednolicie 13C/15próbek znakowanych N i nieznakowanych. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono metodę przygotowania próbki, która została uznana za najbardziej uniwersalną dla różnych potrzeb związanych z przygotowaniem próbek21 i omówiono alternatywy w ostatniej sekcji tego artykułu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</silna>
W tym momencie czytelnik powinien zauważyć, że inne techniki przygotowania próbek są dopuszczalne dla eksperymentów 1H R1ρ RD, oraz że inne metody analizy strukturalnej i funkcjonalnej mogą być przeprowadzone na próbkach zsyntetyzowanych za pomocą prezentowanej techniki. 1Eksperymenty H R1ρ RD wymagają wysokich stężeń RNA (najlepiej &gt;1 mM), a także wysokiej jednorodności, zarówno pod względem długości RNA, jak i konformacji strukturalnej, aby zapewnić wiarygodną charakterystykę dynamiki molekularnej. Transkrypcja in vitro (IVT) jest metodą wybieraną przez wielu badaczy do produkcji 13próbek RNA znakowanych C/15N ze względu na dostępność znakowanych trifosforanów nukleozydów (NTP) i łatwe włączenie do reakcji enzymatycznej22. Jednak szeroko stosowana polimeraza RNA T7 (T7RNAP)23,24,25 cierpi na niską jednorodność 5' w przypadku niektórych sekwencji inicjacyjnych26,27 i często również jednorodność 3' podczas spływu transkrypcji28. Oczyszczanie docelowych gatunków RNA staje się droższe i bardziej pracochłonne ze względu na zapotrzebowanie na duże ilości ~200 nmol. Zastosowana tutaj metoda została przedstawiona wcześniej, gdzie zalety zostały omówione na large21. Krótko mówiąc, rozwiązuje opisane problemy poprzez transkrypcję większego transkryptu tandemowego, który jest następnie specyficznie dla miejsca rozszczepiany przez RNazę Escherichia coli, kierowaną przez chimeryczny oligonukleotyd 29,30 (zobacz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe informacje).
Włączenie sekwencji dystansowej na końcach 5' i 3' transkryptu tandemowego pozwala na użycie sekwencji inicjacji o wysokiej wydajności i usunięcie zwisów końcowych w pobliżu miejsca linearyzacji matrycy plazmidu, odpowiednio (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Wykazano, że metoda ta znacznie poprawiła plony, jednocześnie zmniejszając koszty i robociznę, z zastrzeżeniem bardziej złożonej syntezy matrycy i potrzeby dodatkowego enzymu i oligonukleotydu. Wysoka specyficzność łupliwości RNazy H ułatwia oczyszczanie ze względu na brak gatunków RNA w podobnym zakresie wielkości. Obecny protokół wykorzystuje etap wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z wymianą jonową, który został niedawno opublikowany przez to laboratorium31, chociaż możliwe są inne metody. 1H R1ρ RD można na ogół uzyskać na znakowanych lub nieznakowanych próbkach z dwiema odpowiednimi sekwencjami impulsów, "znakowanym" eksperymentem opartym na heterojądrowej pojedynczej korelacji kwantowej (HSQC) 1 H R1ρ z wymiarem pośrednim 13C &lt; klasa sup = "xref"&gt;10 i "nieznakowanym" 1 H R1ρ Eksperyment oparty na SELOPE z 1H wymiar pośredni20.</silna>
Te dwuwymiarowe (2D) eksperymenty mogą służyć jako pierwsze sprawdzenie, niezależnie od tego, czy dynamika na skali czasowej R1ρ jest obecna w próbce. Można uzyskać przegląd RD dla wszystkich rozwiązanych pików w widmach i zidentyfikować piki będące przedmiotem zainteresowania w celu dokładniejszej analizy RD. Oznacza to, że nawet nieoznakowane próbki mogą zostać sprawdzone przed podjęciem decyzji o wyprodukowaniu droższej, oznakowanej próbki. Po wybraniu piku z wkładem wymiany konformacyjnej do dokładniejszego zbadania, najlepiej jest przełączyć się na wersje 1D powyższych eksperymentów (jeśli pik można jeszcze rozwiązać) w celu przeprowadzenia tak zwanych eksperymentów offrezonansowych. W wersji oznaczonej transfer HSQC do 13C jest zastępowany etapem selektywnej heterojądrowej polaryzacji krzyżowej (HCP), jak to jest używane w eksperymentach 13C R1ρ 32,33,34,35, podczas gdy w przypadku eksperymentu SELOPE eksperyment jest po prostu uruchamiany jako 1D, co jest szczególnie przydatne dla sygnałów H8 i H2, które leżą na przekątna w każdym razie w 2D. Jednym z kryteriów dotyczących tego, którą sekwencję zastosować, pod warunkiem, że dostępne są zarówno znakowane, jak i nieznakowane próbki, jest to, jak dobrze wyizolowany jest szczyt zainteresowania w dwóch eksperymentach.
Ogólnie, eksperyment SELOPE jest zalecany dla próbek RNA do 50 nukleotydów. W przypadku większych RNA nakładanie się będzie większe; jednak strukturalnie interesujące nukleotydy często pojawiają się w regionach przesunięć chemicznych, które mniej się na siebie nakładają i nadal mogą być dostępne w jeszcze większych RNA. Innym argumentem byłoby to, że w próbkach nieznakowanych nie występuje sprzężenie J między 1H a 12C. Jednakże, ponieważ minimalna moc blokady spinowej jest definiowana przez minimalną moc użytą do rozłączenia tych dwóch spinów (~1 kHz) w oznaczonym eksperymencie, nieoznakowany eksperyment pozwala na użycie szerszego zakresu mocy blokady spinowej (SL), a tym samym dostęp do szerszej skali czasowej wymiany. Te eksperymenty off-resonansowe dostarczają kex dodatkowych informacji, takich jak populacja stanu wzbudzonego (alternatywny konformist), pES, a także bardzo cenne informacje o przesunięciu chemicznym w postaci Δω (różnica przesunięć chemicznych stanu podstawowego i stanu wzbudzonego).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> 
Rysunek 1: Przebieg pracy prezentowanego protokołu. Przygotowanie przed właściwą produkcją próbki na dużą skalę, polegające na przygotowaniu matrycy i potwierdzeniu udanej transkrypcji in vitro i rozszczepienia RNazy H. Produkcja na dużą skalę, w tym oczyszczanie HPLC, napełnianie probówki NMR i potwierdzenie fałdowania RNA. W przypadku syntezy znakowanej izotopowo tego samego dnia należy przeprowadzić nieznakowane oczyszczanie w celu optymalizacji gradientu. Charakterystyka dynamiki konformacyjnej metodą NMR za pomocą eksperymentów R1ρ. Każdy etap można przeprowadzić niezależnie, np. analizę 1H R1ρ RD można zastosować do dowolnej odpowiedniej próbki RNA wyprodukowanej inną metodą. Skróty: IVT = transkrypcja in vitro; HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; NMR = magnetyczny rezonans jądrowy; RD = dyspersja relaksacyjna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Celem tego protokołu jest dostarczenie praktycznych szczegółów i krytycznych parametrów do badania dynamiki konformacyjnej z dyspersją relaksacyjną 1H R1ρ w cząsteczkach spinki do włosów RNA. Po dostarczeniu szczegółowego protokołu projektowania, syntezy i oczyszczania docelowego RNA metodą wymiany jonowej HPLC, który można przeprowadzić przy użyciu wszystkich, niektórych lub żadnych NTP w wersjach znakowanych N 13C / 15, opisano przebieg pracy finalizacji próbki NMR i potwierdzenia wymiany konformacyjnej za pomocą spektroskopii NMR. Na koniec opisano szczegóły dotyczące konfiguracji eksperymentów 1H R1ρ RD na spektrometrze Bruker NMR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W protokole przedstawiono każdy krok konfiguracji wersji 1D dla oznaczonych próbek oraz dodatkowe komentarze i tabelę do dostosowania do konfiguracji wersji SELOPE (Tabela 2). Po protokole omówiono krytyczne etapy i alternatywne drogi przygotowania próbki i konfiguracji 1H R1ρ RD.</silna>

<table><tbody><tr><td>40% roztwór akryloamidu/bis</td><td>&nbsp; Bio-Rad</td><td>&nbsp; 161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Kompetencja 5-alfa&nbsp; E. coli</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl&</td><td>nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>AFC-3000, Zbieracz frakcji HPLC&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5702.1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A9414</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 UV</td><td>GE Healthcare</td><td>29399482</td> Wymiana ultra odśrodkowego filtra <td>LAS-4000 lub równoważnego</td></tr> modułu <tr><td>Amicon</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; </td><td></td>UFC900324</tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A3678</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A9518</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A2383</td><td></td></tr><tr><td>ATP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>645702</td><td></td></tr><tr><td>enzym restrykcyjny BamHI</td><td>NEB</td><td>&nbsp; R0136L</td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>514-1019</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>1081220005</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica dekoltu</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>CTP</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; C1506</td><td></td></tr><tr><td>CTP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>645699</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>&nbsp; System UHPLC Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNAPac PA200 22x250 Kolumna półprzygotowawcza&nbsp;</td><td>Kolumna ochronna Thermo Scientific</td><td>SP6734</td><td></td></tr><tr><td>DNAPac PA200 22x50&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SP6731</td><td></td></tr><tr><td>RNaza E.coli H</td><td>&nbsp; NEB</td><td>&nbsp; M0297L</td><td>&nbsp; lub wykonane we własnym zakresie Uniprot ref. P0A7Y4&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA&</td><td>nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; E6758</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf, wirnik: A-4-44</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95%</td><td>&nbsp; Fisher scientific</td><td>11574139</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95% denaturowany</td><td>&nbsp; VWR</td><td>85829.29</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>&nbsp; VWR</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Linijka GeneLiner 1kbp Plus</td><td>&nbsp; Fisher Naukowy</td><td>&nbsp; SM1333</td><td>Opcjonalna</td></tr><tr><td>GMP</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; G8377</td><td></td></tr><tr><td>GMP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>650684</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; G8877</td><td></td></tr><tr><td>GTP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>645680</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; H1758</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfataza nieorganiczna</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; I1643-100UN&</td><td>nbsp; lub wykonane we własnym zakresie Uniprot ref. P0A7A9</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; T4415</td><td></td></tr><tr><td>Julabo TW8 Łaźnia wodna&nbsp;</td><td>VWR</td><td>461-3117</td><td></td></tr><tr><td>kuroGEL Midi 13 Pozioma elektroforeza żelowa</td><td>VWR</td><td>700-0056</td><td>lub porównywalny</td></tr><tr><td>bulion LB (Lennox)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion z agarem (Lennox)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; L2897</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka ssRNA niskiego zasięgu&nbsp;</td><td>NEB</td><td>&nbsp; N0364S</td><td>Opcjonalna</td></tr><tr><td>pompa LPG-3400RS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5040.0036</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>&nbsp; Marker mikroRNA Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N2102S Kuchenka mikrofalowa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Samsung</td><td>&nbsp; </td><td></td>MS23F301EAW</tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy Mini-PROTEAN</td><td>&nbsp; Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>&nbsp; Maszyny-Nagel</td><td>&nbsp; 740414.10M</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pUC19 zawierający wkładkę tandemową</td><td>&nbsp; Genscript</td><td>&nbsp; Nie dotyczy</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; R2020</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Shigemi 5mm&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z529427</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka jednorazowa, końcówka Luer lock</td><td>VWR</td><td>613-2008</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S2889</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 730-1470</td><td></td></tr><tr><td>Nadchloran sodu</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>71853</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S3264</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S3139</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorowodorek spermidyny</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>85578</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Złoto</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>&nbsp; S11494</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>VWR</td><td>514-0061</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>10881767001</td><td>&nbsp; lub wykonane we własnym zakresie Uniprot ref. P00573</td></tr><tr><td>TCC-3000RS Termostat kolumnowy&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5730</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Podstawa</td><td>&nbsp; Fisher Scientific</td><td>10103203</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>U6375</td><td></td></tr><tr><td>UMP-13C9/15N2&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651370</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>UTP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; Detektor Sigma-Aldrich</td><td>645672</td><td></td></tr><tr><td>VWD-3100&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5074.0005</td><td></td></tr></tbody></table>

praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1h r 1ρ rna

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA to wysoce elastyczna biomolekuła, w której zmiany w strukturach odgrywają kluczową rolę w funkcjach, które cząsteczki RNA pełnią jako przekaźniki i modulatory komórkowe. Podczas gdy te dynamiczne stany pozostają ukryte dla większości metod strukturalnych, spektroskopia dyspersji relaksacyjnej (RD) R1ρ umożliwia badanie dynamiki konformacyjnej w reżimie mikro- i milisekundowym z rozdzielczością atomową. Wykorzystanie 1H jako obserwowanego jądra jeszcze bardziej rozszerza objęty reżim czasowy i daje bezpośredni dostęp do wiązań wodorowych i parowania zasad.
Wyzwaniem w takim badaniu jest przygotowanie próbki o wysokiej czystości i wysokiej wydajności, potencjalnie znakowanej 13C i 15N, a także przeprowadzenie eksperymentów i dopasowanie danych do wyodrębnienia populacji, kursu wymiany i struktury drugorzędowej wcześniej niewidocznego stanu. Protokół ten zapewnia kluczowe praktyczne kroki w przygotowaniu próbki, aby zapewnić przygotowanie odpowiedniej próbki RNA i konfigurację eksperymentów 1 H R1ρ zarówno z izotopowo znakowanymi, jak i nieznakowanymi próbkami RNA.

Protokół produkcji RNA ułatwia oczyszczanie poprzez generowanie transkryptów o wysokiej czystości. Rysunek 3A pokazuje wyniki kilku reakcji rozszczepienia transkryptów tandemowych, dostarczając zarówno udanych, jak i nieudanych reakcji. Tor 1 pokazuje optymalny przypadek w pełni rozszczepionego transkryptu z jedynie słabymi śladami produktów ubocznych. Tor 2a wykazuje niepełne rozszczepienie, które można rozwiązać poprzez ponowne wyżarzanie i dodanie większej ilości RNazy H (tor 2b, krok 2.1.2). Konstrukty RNA linii 1, 2a i 2b są takie same. Próbka na pasie 3 pokazuje nieudane rozszczepienie. Rozwiązywanie problemów z tą reakcją obejmowałoby sprawdzenie sekwencji prowadzącej rozszczepienie, czystości matrycy DNA i temperatur wyżarzania. Potencjalnie rozszczepienie RNazy H będzie musiało zostać przeprowadzone po T7 IVT, jak pokazano dla próbki 2.
Próbka na torze 4 pokazuje znaczną ilość produktów ubocznych rozszczepienia, które są trudne do usunięcia za pomocą wymiany jonowej HPLC. Rozwiązywanie problemów z taką próbką może obejmować (a) obniżenie temperatury, ilości RNazy H lub czasu reakcji, (b) zmniejszenie gradientu elucji i objętości iniekcji oraz próbę oddzielenia frakcji docelowych od produktów ubocznych. Więcej informacji na temat tego, jak zwiększyć rozdzielczość w oczyszczaniu HPLC metodą wymiany jonowej, zostało omówione przez Karlsson et al.31. HPLC oddziela docelowe RNA od dłuższych lub krótszych kwasów nukleinowych oraz zanieczyszczeń białkowych lub małocząsteczkowych. Rysunek 3B pokazuje optymalny wynik dla jonowymiennego oczyszczania HPLC. Gradient elucji powinien być tak dobrany, aby docelowy gatunek RNA wymywał co najmniej jedną objętość kolumny (w tym przykładzie: 35 ml) po następnym mniejszym gatunku i objętość jednej kolumny przed następnym większym gatunkiem.
Mniejsze gatunki w tej metodzie obejmują pojedyncze nukleotydy, produkty nieudane (8-12 nt), sekwencje dystansowe 3' i 5' (5-14 nt) oraz przewodnik rozszczepienia (12 nt chimeryczny kwas nukleinowy), podczas gdy dłuższe sekwencje to potencjalnie nieutwardzone powtórzenia tandemowe i plazmid. Po osiągnięciu dobrze oddzielonego piku elucji, oczyszczanie można zwiększyć do odpowiednika ~20 ml reakcji IVT na wstrzyknięcie. Prawidłowe fałdowanie próbki RNA ma kluczowe znaczenie dla eksperymentów RD i musi być potwierdzone przed każdym pomiarem. Rysunek 4 pokazuje 22-merowe RNA znakowane A przed zastosowaniem protokołu składania w kroku 2.4 (niebieski) i tę samą próbkę po osiągnięciu prawidłowego fałdowania (czerwony). Przewidywanie struktury drugorzędowej Mc-Fold (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C) proponuje przedstawioną strukturę spinki do włosów z 4 parami zasad, co daje 5 sygnałów imino.</silna>
Oba widma w <silnej klasie="xfig">Rysunek 4A potwierdza te przewidywane sygnały, aczkolwiek z nieco inną względną intensywnością, co wskazuje, że niektóre nieprawidłowo sfałdowane struktury (tutaj, dimer) mogą być problematyczne do oceny za pomocą widm 1H1D. Aromatyczne widmo 1 H,13C-HSQC (<klasa silna="xfig">Rysunek 4B), pokazuje jednak tylko 3 sygnały aromatyczne dla próbki przed protokołem składania (niebieski), ale wszystkie 4 sygnały dla próbki, która została złożona zgodnie z krokiem 2.4 (czerwony). Próbka pokazana na niebiesko prawdopodobnie utworzyła homodimer (struktura proponowana w <silna klasa="xfig">Rysunek 4D), który skutkowałby tymi samymi sygnałami imino, co spinka do włosów. Sygnał A13H2 wydaje się być poszerzony o wymianę. Wyniki te pomagają podkreślić znaczenie potwierdzania składania zarówno za pomocą eksperymentów z imino, jak i aromatycznymi odciskami palców przed każdym eksperymentem RD. Sekwencje impulsów 1H R1ρ opisane w tym protokole pozwalają na wykrycie dynamiki w pośrednim reżimie wymiany. Początkowo rejestrowana jest krzywa rezonansowa, a jeśli występuje dynamika dla określonej pozostałości, w uzyskanych wartościach R2 + REX widoczna jest dyspersja, podczas gdy krzywa ta jest płaska dla pozostałości bez wymiany.</silna></klasa></silnej>
Rysunek 5 pokazuje reprezentatywne krzywe rezonansowe uzyskane dla dwóch różnych atomów H8 w syntetycznym RNA hairpina (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A), w którym G6H8 wymienia doświadczenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C), podczas gdy A4H8 nie (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B). Ponieważ wymiana w tej próbce jest stosunkowo powolna (kEX = 292 ± 40 Hz), wykorzystano przewagę eksperymentu SELOPE w celu uzyskania niskich mocy SL, a dwie krzywe rezonansowe zarejestrowano przy użyciu wersji 1D sekwencji impulsów. Ta sama sekwencja impulsów została następnie wykorzystana do uzyskania danych off-rezonansowych dla pozostałości wykazującej dyspersję w profilu rezonansowym. <silna klasa="xfig">Rysunek 5D pokazuje uzyskane wartości R1ρ w porównaniu z przesunięciem, gdzie niewielka asymetria krzywej wskazuje już na znak Δω.</silna></silna></silna></silna>
Staje się to jeszcze bardziej widoczne na wykresie R2+REX, gdzie wkład R1 jest usunięty (Rysunek 5E). Prawa kolumna tego samego rysunku pokazuje reprezentatywne krzywe rezonansowe uzyskane dla dwóch różnych atomów H8 w nieco innej syntetycznej spince do włosów RNA z szybszą wymianą, w której G6H8 doświadcza wymiany (<silna klasa="xfig"> Rysunek 5G), podczas gdy A4H8 nie (<silna klasa="xfig">Rysunek 5F). Szybszy kurs wymiany (kEX = 43 502 ± 38 478 Hz) pozwolił na jednoczesny zapis RD wszystkich protonów aromatycznych przy użyciu wersji SELOPE 2D w celu uzyskania danych zarówno rezonansowych, jak i pozarezonansowych (dane G6H8 pokazane na rysunku 5H,I).</silna></silna>
Ogólne identyfikatory dla pozytywnych i negatywnych wyników 
Pozytywne wyniki w tandemowym rozszczepieniu IVT i RNazy H można zidentyfikować w następujący sposób: 1) Pasma docelowe jest najsilniejszym pasmem w denaturującym żelu PAGE. 2) Nie ma żadnych lub są tylko słabe pasma wokół głównego pasma. 3) Nie ma lub występują tylko słabe gatunki o większej masie cząsteczkowej. 4) Chromatogram HPLC pokazuje dobrze oddzielony pik docelowego RNA. 5) Podczas próbkowania głównego piku na denaturującym żelu PAGE pojawia się tylko jedno pasmo.
Negatywne wyniki w tandemowym rozszczepieniu IVT i RNazy H prezentują się następująco: 1) Brak lub tylko słabe pasmo główne jest widoczne na denaturującym żelu PAGE. 2) Widoczny jest wzór gatunków o dużej masie cząsteczkowej z powtórzeń tandemowych RNA. 3) Chociaż pasmo główne jest obecne, pasma o podobnym natężeniu znajdują się powyżej lub poniżej pasma głównego w ciągu ± 3 nt.
Dobrze złożoną próbkę można zidentyfikować w następujący sposób: 1) Liczba obserwowanych protonów imino odpowiada liczbie protonów imino oczekiwanej na podstawie symulacji struktury drugorzędowej (np. Mc-Fold39, Rysunek 4A). 2) Para chwiejnych zasad syn G-U w pętli UUCG (jeśli występuje) jest widoczna przy ~9,5 ppm, czasami widoczna tylko w niższej temperaturze. Dalsze pobieranie odcisków palców pętli UUCG zostało opisane przez Fürtiga i współpracowników40. 3) Aromatyczny odcisk palca zgadza się z wcześniej przypisaną próbką, która została potwierdzona pod kątem prawidłowego złożenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</silna>
Nieprawidłowo sfałdowaną lub zdegradowaną próbkę można zidentyfikować w następujący sposób: 1) Jest więcej sygnałów imino niż przewiduje symulacja struktury drugorzędowej (UWAGA: mniej sygnałów imino niekoniecznie oznacza nieprawidłowe fałdowanie, ponieważ zamykające się pary zasad często nie są widoczne, a wymiana konformacyjna poszerza linie). 2) Brak sygnałów imino. 3) Wąskie sygnały o dużej intensywności w regionie aromatycznym, wskazujące na produkty degradacji pojedynczego nukleotydu. 4) Rozbieżność między sygnałami imino lub aromatycznymi do próbki referencyjnej o potwierdzonym fałdowaniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</silna>
Atom nie wykazujący wymiany w wykrywalnej skali czasowej można zidentyfikować w następujący sposób: 1) z płaskiego profilu RD (ze względu na brak udziału REX zmieniający się w zależności od przyłożonej mocy SL) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B i <silna klasa="xfig">Rysunek 5F). 2) Należy zachować ostrożność w przypadku powolnej wymiany pośredniej, gdy kEX i Δω mają tę samą wielkość. W takim przypadku wkład rezonansowy może być bardzo mały, co można zobaczyć na <silna klasa="xfig">Rysunek 5C (w tym przypadku dopasowane parametry to kEX = 292 ± 40 Hz i Δω = 112 ± 4 Hz). W razie wątpliwości można zarejestrować niską krzywą rezonansową SL w celu weryfikacji.</silna></silna></silna>
Atom wykazujący wymianę w pośredniej skali czasowej można zidentyfikować 1) na podstawie niepłaskiego profilu dyspersji relaksacyjnej w eksperymencie RD na rezonansie (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B i <silna klasa="xfig">Rysunek 5F); 2) szersza szerokość linii w eksperymencie HSQC lub SELOPE może być również wskaźnikiem wymiany.</silna></silna>
Dobrze dobrane wartości mocy SL dla krzywych off-rezonansowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 5E,F): 1) mają znaczny udział kEX w krzywej rezonansowej (wybrane wartości mocy SL są wskazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 5C i <silna klasa="xfig">Rysunek 5G). 2) Ponieważ krzywe offrezonansowe są mierzone dla co najmniej 3 wartości mocy SL, wybrane wartości mocy SL powinny być rozłożone w obszarze krzywej rezonansowej z udziałem kEX. 3) Doprowadzić do niepłaskich krzywych R2 + REX po dopasowaniu Laguerre'a (np. <klasa silna="xfig">Rysunek 5D: Mocne SL 25, 50 i 75 Hz; <silna klasa="xfig">Rysunek 5E).  </silna></klasa></silna></silna></silna>
Źle dobrane wartości mocy SL dla krzywych off-rezonansowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 5E,F) prowadzą do płaskich krzywych R2+REX po dopasowaniu Laguerre'a. Przykład jest pokazany w Rysunek 5E, gdzie krzywa rezonansowa 100 Hz jest bardzo płaska i dlatego nie dostarcza istotnych informacji na temat Δω.</silna>
Wskazania dla artefaktów jądrowego efektu Overhausera (ROE) z obrotową ramą: 1) Δω uzyskane z krzywych rezonansowych odpowiadają przesunięciom chemicznym protonów w pobliżu przestrzennym / protonów, które wykazują pik krzyżowy z pikiem zainteresowania w widmie jądrowej spektroskopii efektu Overhausera (NOESY). (np. <silna klasa="xfig">Rysunek 5I pokazuje szerokie krzywe off-rezonansowe, zgodnie z oczekiwaniami dla wymiany szybkiej-pośredniej, ale krzywe mają również ostrzejsze cechy, np. przy -3000 Hz i +1500 Hz. Jest bardzo prawdopodobne, że są one spowodowane artefaktem ROE, a nie przesunięciem chemicznym dla tego H8 w innym konformerze). 2) Dopasowanie Laguerre'a działa, ale nie działa dobrze (daje wysokie błędy lub fizycznie niemożliwe wartości) dla rezonansu i co najmniej 3 krzywych rezonansowych, mimo że wykładniki uzyskano z eksperymentów z wysokim SINO (&gt;20) (np. kEX = 43 502 ± 38 478 Hz). Często każdy SL dobrze pasuje indywidualnie, ale dopasowanie ich do siebie daje znacznie większy błąd; Odwrotne zachowanie jest oczekiwane dla prawdziwego stanu wzbudzenia.</silna>
Wskazania dla "prawdziwej" wymiany Δω: 1) Δω uzyskane z krzywych offrezonansowych nie pasują do chemicznych przesunięć protonów w otoczeniu przestrzennym/protonów, które wykazują pik krzyżowy z pikiem będącym przedmiotem zainteresowania w widmie NOESY (np. <silna klasa="xfig">Rysunek 5E). 2) Dopasowanie Laguerre'a daje niskie błędy dla rezonansu i co najmniej 3 krzywych rezonansowych (np. <silna klasa="xfig">Rysunek 5E vs. <silna klasa="xfig">Rysunek 5I, zobacz podpis, aby zobaczyć wyniki dopasowania).</silna></silna></silna>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 3: Produkcja próbki przez tandemową reakcję rozszczepienia IVT i RNazy H. (A) Denaturacja STRONY pozytywnych i negatywnych wyników tandemowego rozszczepienia IVT i RNazy H. Wysokość drabiny odnosi się do odniesień do RNA, 12* odnosi się do chimerycznego przewodnika rozszczepienia. Tor 1: Pomyślne wygenerowanie docelowego RNA o stężeniu 20 nt. Występuje niewiele krótszych i dłuższych produktów. Tor 2a: Niepełne rozszczepienie transkryptu tandemowego. Chociaż oczyszczanie metodą HPLC jest możliwe, zmarnowano by dużo materiału. Tor 2b: Dalsze rozszczepienie RNazy H na torze 2 daje czystą próbkę gotową do wstrzyknięcia HPLC (identyczną z linią 1). Tor 4: Rozszczepienie RNazy H było w dużej mierze nieudane i nie wyprodukowano żadnego pasma docelowego. Pełnometrażowy transkrypt tandemowy jest nadal widoczny w odległości 600 nt. Tor 5: Wyprodukowano pasmo docelowe, ale obecne jest silne pasmo -1. Chociaż HPLC można wykonać, konieczne jest ostrożne usunięcie produktu ubocznego. (B) Przykład udanego wstrzyknięcia HPLC. Pik po 38 minutach zawiera czyste RNA o docelowej długości, podczas gdy dłuższe i krótsze produkty są dobrze oddzielone od docelowego RNA. Panel B został zmodyfikowany z 21. Skróty: IVT = transkrypcja in vitro; HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; nt = nukleotydy; AU = dowolne jednostki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> 
Rysunek 4: Przykład spinki do włosów RNA przed (niebieski) i po (czerwonym) etapie składania 2.4 (patrz protokół) w NMR. (A) Region Imino widma 1H-1D 22-merowego RNA znakowanego A. Oczekiwane obszary dla tożsamości par zasad sygnałów imino są oznaczone kolorem szarym poniżej. (B) Widmo 1 H,13C-HSQC rezonansów aromatycznych RNA z panelu A. Próbka po złożeniu (czerwona) pokazuje 4 sygnały zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy próbka przed złożeniem (niebieska) pokazuje tylko 3 sygnały. (C) Przewidywanie Mc-Fold 22-merowego RNA jako spinki do włosów. Po tej drugorzędowej strukturze należy spodziewać się pięciu sygnałów imino, które można znaleźć w obu próbkach w panelu A. (D) Proponowana struktura homodimeru utworzonego przez 22-merowy RNA, w wyniku czego powstaje tych samych 5 par zasad, co struktura spinki do włosów. Skróty: NMR = magnetyczny rezonans jądrowy; 1D = jednowymiarowy; HSQC = heterojądrowa pojedyncza korelacja kwantowa; ppm = części na milion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek. 5: 1H R1ρ RD reprezentatywne wyniki dla dwóch różnych konstruktów opartych na spince RNA. (A) Lewa kolumna pokazuje wyniki uzyskane na RNA z parą zasad C-G powyżej wybrzuszonego U, podczas gdy prawa kolumna pokazuje wyniki uzyskane na próbce, w której para zasad została przełączona na GC. (B) i (F) pokazują płaskie profile dyspersji uzyskane dla A4H8 dla tych dwóch konstrukcji, co wskazuje na brak wymiany konformacyjnej. (C-E) pokazują dane o rezonansie, rezonansie wyłączonym i dopasowaniu uzyskane dla G6 w konstrukcji (G-C). Dopasowanie Laguerre'a prowadzi do następującego wyniku: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) pokazują rezonans, rezonans off-rezonansowy i dopasowane dane uzyskane dla G6 w konstrukcji (G-C). Dopasowanie Laguerre'a prowadzi do następującego wyniku: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, kEX = 43,502 ± 38,478 Hz, pES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Ten rysunek został zmodyfikowany z 20. Skrót: SL = spin lock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na 13C/15N-znakowanych i nieznakowanych RNA za pomocąspektroskopii 1 H R1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Protokół ten opisuje przygotowanie próbki RNA i konfigurację NMR do pomiarów dyspersji relaksacji protonów R1rho w celu zbadania wymiany potwierdzającej w cząsteczkach RNA. Ponieważ protony są badane, metoda nie wymaga znakowania izotopowego i może bezpośrednio uzyskać dostęp do cech strukturalnych, takich jak przesunięte parowanie zasad. Pipeta jest dość modułowa w tym sensie, że dyspersję relaksacyjną R1rho można zmierzyć, nawet jeśli próbka jest wytwarzana inną metodą.Rozpocznij od przygotowania próbki plazmidu i skonfigurowania reakcji transkrypcji i rozszczepienia in vitro, jak opisano w rękopisie tekstu. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie rozcieńczyć jeden mikrolitr próbki dziesięciokrotnie w roztworze ładującym.I uruchom jeden mikrolitr na denaturującym żelu PAGE. Jeśli reakcja rozszczepienia zakończy się sukcesem, przeskaluj reakcję do żądanej objętości i uruchom ją przez noc. Następnie uruchom kolejny denaturujący żel PAGE i oceń, czy reakcja rozszczepienia została zakończona.W przypadku niepełnego rozszczepienia podgrzej roztwór reakcyjny w konwencjonalnej kuchence mikrofalowej o mocy 450 watów przez 15 sekund. Następnie powoli schładzaj roztwór do 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby ponownie zanować RNA i prowadnik rozszczepienia. I zwróć uwagę na tworzenie się nowego osadu.Dodaj więcej nieorganicznej pirofosfatazy i RNazy H.Inkubuj reakcję przez jedną do trzech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie potwierdź zakończenie reakcji rozszczepienia za pomocą denaturacji PAGE. Po zakończeniu reakcji rozszczepienia RNazy H, wygasić reakcję, dodając EDTA do końcowego stężenia 50 milimolów.I dokładnie wiruj. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona. I stężyć roztwór do objętości wstrzykiwanej do systemu HPLC w celu oczyszczenia.Przed dodaniem zagęszczonej i oczyszczonej próbki do probówki NMR należy oczyścić probówkę, przepłukując ją dużą ilością wody. Następnie odczynnik do odkażania RNazy, woda i 95% etanol. Po ostatnim spłukaniu wodą pozostaw do wyschnięcia.Przepłukać tłok wodą i użyć niestrzępiącej się chusteczki do czyszczenia odczynnikiem do odkażania RNazy i 95% etanolem. Po wysuszeniu probówki i tłoka dodać 10%D2O do próbki NMR. Użyj dużej końcówki pipety, aby przenieść próbkę RNA do probówki NMR, przepływając ją wzdłuż boku ścianki probówki.Włóż tłok do rurki, naciskając go szybkim ruchem obrotowym w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie powoli pociągnij tłok do góry, nie tworząc nowych pęcherzyków powietrza. I napraw to folią z wosku parafinowego. Utwórz nowy zestaw danych na podstawie zestawu danych HSQC aromatycznego węgla protonowego używanego na w pełni znakowanych próbkach RNA w celu przypisania RNA.Ustaw parametry ogólne i parametry specyficzne dla RD. Następnie ustaw moc blokady wirowania protonów na 1,2 kiloherca w celu przetestowania. Wygeneruj testową listę vd z tylko jednym wpisem, zerową milisekundą, ustaw TDF1 na jeden i zaktualizuj D30, aby uruchomić widmo testowe.Po skonfigurowaniu testowej listy vd zaktualizuj D30 i TDF1. I wykreśl intensywność szczytu dla różnych długości blokady wirowania. Określ długość blokady wirowania, przy której intensywność pierwotnego piku zmniejsza się do jednej trzeciej.Na podstawie wyniku przebiegów testów utwórz ostateczną listę vd, która ma być używana w eksperymencie. Wybierz liczbę skanowań tak, aby najsłabszy szczyt listy miał stosunek sygnału do szumu wynoszący co najmniej 10. Przedstawiono tutaj wyniki kilku reakcji rozszczepienia transkryptów tandemowych.W udanej reakcji wygenerowano 20-nukleotydowe docelowe RNA. Nieudane reakcje skutkowały niekompletnym i nieudanym rozszczepieniem próbki. Wstrzyknięcie HPLC próbki RNA ujawniło pik czystego docelowego RNA po 38 minutach.Natomiast dłuższe i krótsze produkty były dobrze oddzielone od szczytu zainteresowania. Analiza spinki do włosów RNA wykazała, że liczba obserwowanych protonów imino odpowiadała liczbie protonów imino oczekiwanej na podstawie symulacji struktury drugorzędowej. Widmo HSQC węgla protonowego rezonansów aromatycznych RNA wykazało cztery sygnały po złożeniu.I tylko trzy sygnały przed złożeniem. W reprezentatywnym na krzywych rezonansowych uzyskanych dla dwóch różnych atomów H8 i dwóch różnych syntetycznych spinek do włosów RNA, G6H8 doświadcza wymiany potwierdzającej. Podczas gdy A4H8 nie.W przypadku G6H8 wybrano kolorowe moce blokady wirowania i zarejestrowano dane dotyczące rezonansu. W konstrukcji CG, w której wymiana jest powolna, wartości wierszy R1rho w funkcji wykresu przesunięcia wykazywały już niewielką asymetrię krzywej, wskazując na znak różnicy przesunięcia chemicznego delta omega. Staje się to jeszcze bardziej widoczne na wykresie R2 plus REX, gdzie wkład R1 jest usuwany.Z drugiej strony, konstrukt GC doświadcza szybszej wymiany, a wykres wartości R1rho w funkcji przesunięcia przedstawia szerszą krzywą, w której ekstrakcja delta omega staje się mniej oczywista nawet na wykresie R2 plus REX. Po wyjaśnieniu dynamiki RNA stany można scharakteryzować i uwięzić. Te uwięzione stany można na przykład przetestować w testach biologicznych.Metoda ta pozwala na obserwację funkcjonalnych, istotnych przesunięć par zasad w aktywnym kompleksie miRNA mikroRNA, rearanżacji pętli w rybosomalnym RNA oraz stabilności par zasad na wybrzuszeniach pojedynczego nukleotydu.

practical-aspects-sample-preparation-setup-1h-r1-relaxation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

MALDI-TOF został użyty do scharakteryzowania fragmentów uzyskanych z reaktywności pomiędzy utlenionym RNA a egzorybonukleazą Xrn-1. Niniejszy protokół opisuje metodologię, która może być stosowana do innych procesów z udziałem RNA i/lub DNA.

Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Protokół ten opisuje wizualny test z wykorzystaniem rozdzielonych reporterów RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro.

Wizualizacja i ilościowa parowanie baz międzycząsteczkowych RNA w klastrach in vitro z wykorzystaniem raporterów RNA brokułów podzielonych

Poznaj przygotowanie próbek RNA i konfigurację eksperymentów NMR R1rho do badania wymiany konformacyjnej. Metoda umożliwia obserwację dynamiki RNA z rozdzielczością atomową bez konieczności izotopowego znakowania.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną ¹H _{R 1ρ} RNA

Przeglądaj więcej filmów