Name: Modelowanie wpływu stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Poznaj metodę modelowania wpływu stresu ścinania na komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły. Technika ta pozwala badać mechanizmy przeżycia komórek rakowych podczas przerzutów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój modelu tutaj zademonstrowanego był wspierany przez grant Departamentu Obrony W81XWH-12-1-0163, granty NIH R21 CA179981 i R21 CA196202 oraz Fundusz Badań nad Przerzutami Sato.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Uwolnij komórki z naczynia do hodowli tkankowej, gdy zlewają się w 70-90%, postępując zgodnie z zalecanymi wytycznymi dla używanej linii komórkowej.
	<ol>
		<li>Na przykład odessać pożywkę wzrostową dla komórek PC-3 i umyć 10-centymetrowe naczynie komórek 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS).</li>
		<li>Odessać PBS przed dodaniem 1 ml 0,25% trypsyny zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Po zaobserwowaniu oderwania komórek pod odwróconym mikroskopem, dodaj 5 ml pożywki DMEM:F12 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zahamowania trypsyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zawiesinę komórek w stożkowej probówce.</li>
	<li>Określ stężenie komórek i całkowitą liczbę komórek.</li>
	<li>Osad komórek przez odwirowanie (300 × g przez 3 min), odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli tkankowej bez surowicy do 5 × 105 komórek/ml. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby pożywka testowa zawierała co najmniej 1,17 mM Ca++, ponieważ wykazano, że zewnątrzkomórkowy Ca++ jest wymagany do odporności komórkowej na FSS15.</li>
</ol>
2. Ekspozycja na naprężenia ścinające płynu
<ol>
	<li>Przed wystawieniem komórek na działanie FSS należy wyciąć okrągłodenną rurkę z polistyrenu o pojemności 14 ml na linii 7 ml. Wymieszać zawiesinę komórek, umieścić 5 ml zawiesiny w wyciętej probówce i zebrać statyczne próbki kontrolne. 
	UWAGA: Objętość potrzebna do pobrania próbki statycznej zależy od zastosowanego testu żywotności (patrz krok 3).</li>
	<li>Pobrać zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 5 ml i założyć igłę 30 G 1/2". Odkręcić igłę, umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej, zabezpieczyć strzykawkę i ustawić natężenie przepływu, aby osiągnąć żądany poziom FSS. 
	UWAGA: Tabela 1 przedstawia maksymalne naprężenia ścinające ścianki dla różnych igieł i natężeń przepływu, a także minimalny poziom FSS w zależności od wielkości komórki (10, 15 i 20 μm). Przed użyciem należy sprawdzić igłę, aby upewnić się, że nie jest wygięta; W razie wątpliwości wymień igłę na nową. Integralność igły może mieć znaczący wpływ na poziom zastosowanego FSS.</li>
	<li>Uruchom pompę strzykawkową i zbierz ściętą próbkę do przeciętej rurki pod kątem około 45°, aby zmniejszyć pienienie. Pobrać próbkę w zależności od rodzaju testu żywotności lub potrzeb w zakresie dalszego testu.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjąć strzykawkę i igłę z pompy strzykawkowej i za pomocą szczypiec wyjąć igłę ze strzykawki, uważając, aby nie dotknąć igły. 
		UWAGA: Igły bez fazowania mogą być używane zamiennie z igłami ze skośnym środkiem bezpieczeństwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wciągnąć ściętą zawiesinę z powrotem do strzykawki, ostrożnie ponownie założyć igłę za pomocą szczypiec i umieścić ją z powrotem w pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Powtarzać kroki 2.3 i 2.4, aż zawiesina komórek zostanie wystawiona na działanie żądanej liczby impulsów FSS. 
	UWAGA: Aby ocenić zdolność komórek do opierania się mechanicznemu zniszczeniu w wyniku ekspozycji na FSS, zawiesina komórek jest zwykle poddawana 10 impulsom FSS. Wykazano jednak, że komórki zaczynają ulegać adaptacjom biologicznym w odpowiedzi na FSS po 2 impulsach24.</li>
</ol>
3. Pomiar żywotności
UWAGA: Żywotność można ocenić za pomocą testów enzymatycznych (lucyferaza, resazuryna i WST-1), licząc nienaruszone komórki, cytometrii przepływowej lub za pomocą testów klonogennych.
<ol>
	<li>W przypadku wszystkich pomiarów żywotności należy pobrać próbkę przed wystawieniem komórek na działanie FSS.
	<ol>
		<li>Do testów enzymatycznych należy pobrać zduplikowane podwielokrotności 100 μl i umieścić je w 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Do cytometrii przepływowej weź jedną porcję o pojemności 500 μl i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Do testu klonogennego należy pobrać 100 μl podwielokrotności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test enzymatyczny
	<ol>
		<li>Zebrać 100 μl próbek po 1, 2, 4, 6, 8 i 10 impulsach ekspozycji na FSS i umieścić je na 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Dodaj żądany substrat i postępuj zgodnie z protokołem dla zastosowanego testu:
		<ol>
			<li>W przypadku rezazuryny dodać 20 μl roztworu 0,15 mg/ml do każdej studzienki. Dodać 20 μl 0,15 mg/ml roztworu rezazuryny do studzienek zawierających 100 μl samej pożywki. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C. Zmierzyć absorbancję za pomocą czytnika płytek zdolnego do odczytu fluorescencji (wzbudzenie 579 / emisja 584).</li>
			<li>W przypadku komórek wykazujących ekspresję lucyferazy dodać 100 μl 15 mg/ml D-lucyferyny do 5 ml pożywki. Dodać 100 μl tego roztworu do każdej studzienki zawierającej komórki. Odczekaj 5 minut, a następnie odczytaj płytkę za pomocą czytnika kompatybilnego z luminescencją.</li>
			<li>W przypadku WST-1 dodać 10 μl WST-1 do każdego dołka, w tym do studzienek zawierających tylko pożywkę. Inkubować przez 4 godziny, a następnie odczytać absorbancję między 420 a 480 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Porównaj uśredniony sygnał z każdej z próbek wystawionych na działanie FSS z uśrednioną statyczną próbką kontrolną, aby uzyskać procent żywotnych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa24
	<ol>
		<li>Zbierz 500 μl próbek i umieść je w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml po 1, 2, 5 i 10 impulsach FSS.</li>
		<li>Odwirować próbki (500 × g przez 3 minuty) i odrzucić supernatanty.</li>
		<li>Zawiesić granulki w 1 ml PBS wolnego od wapnia i magnezu i odwirować próbki (300 × g przez 3 minuty).</li>
		<li>Zawiesić granulki za pomocą 500 μl buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i 0,1% azydkiem sodu) z kulkami do liczenia i barwnikami nieprzepuszczalnymi dla błony lub żywotnymi, takimi jak jodek propidyny (1,75 μg/ml).</li>
		<li>Określ żywotność, porównując stosunek żywotnych komórek, znormalizowanych do liczenia kulek, w ściętych próbkach do próbki statycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test klonogenny
	<ol>
		<li>Pobrać 100 μl próbki statycznej i dodać 900 μl pożywki wzrostowej w celu uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:10.</li>
		<li>Pobrać 100 μl próbki rozcieńczonej w stosunku 1:10 i dodać 900 μl pożywki wzrostowej, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie w stosunku 1:100.</li>
		<li>Dodać 100 μl próbki o rozcieńczeniu 1:100 do każdego z 3 dołków 6-dołkowego naczynia zawierającego 2 ml pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.4.1-3.4.3 z próbkami, które poddano 10 impulsom FSS.</li>
		<li>Pozwól komórkom rosnąć przez 7-10 dni bez zmiany pożywki i sprawdź, czy nie tworzy się kolonia. Po uformowaniu się kolonii ≥50 komórek odessać pożywkę wzrostową, przepłukać każdą studzienkę 1 ml PBS, odessać PBS i utrwalić na 5 minut przy użyciu 1 ml lodowatego 70% etanolu (EtOH). Co ważne, należy jednocześnie naprawić zarówno ścięte, jak i statyczne próbki</li>
		<li>Po utrwaleniu próbek odessać EtOH i dodać 1 do 2 ml roztworu fioletu krystalicznego (0,1% fioletu krystalicznego w 90% H2O, 10% EtOH) przez 5 minut.</li>
		<li>Spłucz nadmiarem wody i pozostaw talerz do wyschnięcia</li>
		<li>Policz kolonie (skupiska ≥50 komórek) zarówno dla próbek statycznych, jak i ścinanych. Porównaj stosunek średniej liczby kolonii ze ściętej próbki do średniej liczby kolonii z próbki statycznej, aby określić żywotność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+90%25+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+medicine%22%5BJournal%5D)">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li>
<li>Labelle, M., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+hours+of+metastasis%3A+the+importance+of+cooperative+host-tumor+cell+interactions+during+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).</li>
<li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metastatic inefficiency.</a> Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).</li>
<li>Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+number+of+tumor+metastases%3B+experiments+with+a+transplantable+mouse+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor.</a> Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+quantitative+analysis+of+distribution+and+fate+of+tumor+embolilabeled+with+125+I-5-iodo-2%27-deoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine.</a> Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).</li>
<li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+metastasis+in+lung%3A+cell+survival%2C+dormancy%2C+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li>
<li>Luzzi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+nature+of+metastatic+inefficiency%3A+dormancy+of+solitary+cells+after+successful+extravasation+and+limited+survival+of+early+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.</a> American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+circulating+tumor+cell+capture+ability+of+a+slit+filter-based+method+in+comparison+to+a+selection-free+method+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types.</a> International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031(2020).</li>
<li>Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+metastasis--integrating+intravasation%2C+circulation+and+end-organ+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+fluid+shear+stress+is+a+conserved+biophysical+property+of+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells.</a> PLoS One. 7 (12), 50973(2012).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Brass, L. F., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+physics+and+biorheology+in+the+setting+of+hemostasis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).</li>
<li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulent+blood+flow+in+the+ascending+aorta+of+humans+with+normal+and+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).</li>
<li>Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+shear+stress+and+hemodynamic+factors+in+a+model+of+coronary+artery+stenosis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis.</a> The American Journal of Physiology. 265 (5), Pt 2 1787-1796 (1993).</li>
<li>Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixing%2C+aeration+and+cell+damage%2C+30%2B+years+later%3A+what+we+learned%2C+how+it+affected+the+cell+culture+industry+and+what+we+would+like+to+know+more+about%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).</li>
<li>Vennin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trsient+tissue+priming+via+ROCK+inhibition+uncouples+pancreatic+cancer+progression%2C+sensitivity+to+chemotherapy%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.</a> Science Translational Medicine. 9 (384), 126(2017).</li>
<li>Mitchell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+reduces+circulating+tumor+cell+resistance+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).</li>
<li>Ortiz-Otero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+confer+shear+resistance+to+circulating+tumor+cells+during+prostate+cancer+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression.</a> Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).</li>
<li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA%2Factomyosin-dependent+mechano-adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li>
<li>Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tumour+cell+composition+in+tumours+composed+of+paired+mixtures+of+mammary+tumour+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines.</a> British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399(1992).</li>
<li>Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cancer+cell+mechanical+properties+after+fluid+shear+stress+exposure%3A+a+micropipette+aspiration+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Health+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study.</a> Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).</li>
<li>Gensbittel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+adaptability+of+tumor+cells+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis.</a> Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).</li>
<li>O'Leary, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+ascorbate+inhibits+pancreatic+cancer+metastases+via+a+peroxide-mediated+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17649(2020).</li>
<li>Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolysis+near+a+transversely+oscillating+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolysis near a transversely oscillating wire.</a> Science. 169 (3948), 871-873 (1970).</li>
<li>Rooney, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolysis+near+an+ultrasonically+pulsating+gas+bubble%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble.</a> Science. 169 (3948), 869-871 (1970).</li>
<li>Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+inertial+positions+and+viability+of+cells+in+suspension+under+different+in+vivo+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1711(2020).</li>
<li>Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biorheology+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">The biorheology of tumor cells.</a> Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).</li>
<li>Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+cancer+stem+cell-like+phenotype+in+MCF7+breast+cancer+cell+line+without+inducing+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition.</a> Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulatory+shear+flow+alters+the+viability+and+proliferation+of+circulating+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 27073(2016).</li>
<li>Fu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+MnSOD+promotes+survival+of+circulating+breast+cancer+cells+and+increases+their+resistance+to+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin.</a> Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival%2Fchemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li>
</ol>

MDH jest współzałożycielem, prezesem i udziałowcem SynderBio, Inc. DLM jest konsultantem SynderBio, Inc.

W pracy przedstawiono zastosowanie FSS do komórek nowotworowych w zawiesinie za pomocą strzykawki i igły. Korzystając z tego modelu, wykazano, że komórki rakowe są bardziej odporne na krótkie impulsy FSS wysokiego poziomu w porównaniu z nieprzekształconymi komórkami nabłonkowymi 15,22,24. Co więcej, ekspozycja na FSS przy użyciu tego modelu powoduje szybki wzrost sztywności komórek, aktywację RhoA i zwiększoną kurczliwość korową...

Przerzuty, czyli rozprzestrzenianie się raka poza początkowe miejsce guza, jest głównym czynnikiem powodującym śmiertelność z powodu raka1. Podczas przerzutów komórki rakowe wykorzystują układ krążenia jako autostradę do rozprzestrzeniania się do odległych miejsc w całym ciele2,3. W drodze do tych miejsc krążące komórki nowotworowe (CTC) istnieją w dynamicznym mikrośrodowisku płynu, w przeciwieństwie do ich pierwotnego guza pierwotnego3,4,5. Zaproponowano, że to płynne mikrośrodowisko jest jedną z wielu barier dla przerzutów4. Istnieje powszechna zgoda co do koncepcji nieefektywności przerzutowej, tj. że większość CTC wchodzących do krążenia albo ginie, albo nie tworzy produktywnych kolonii przerzutowych6,7,8. Jednak to, dlaczego przerzuty są nieefektywne z perspektywy pojedynczego CTC, jest mniej pewne i pozostaje aktywnym obszarem badań. CTC są odłączane od macierzy zewnątrzkomórkowej, pozbawione rozpuszczalnych czynników wzrostu i przeżycia, które mogą być obecne w guzie pierwotnym, oraz wystawione na działanie układu odpornościowego i sił hemodynamicznych w zupełnie inny sposób niż w guzie pierwotnym4. Każdy z tych czynników może przyczyniać się do słabej przeżywalności CTC, ale ich względny udział jest niejasny. W artykule podjęto próbę odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób siły hemodynamiczne wpływają na CTC.
Badanie wpływu sił hemodynamicznych na CTC jest dość trudne. Obecnie nie ma systemów inżynierii in vitro, które mogłyby odtworzyć całą dynamikę czasoprzestrzenną (od serca do naczyń włosowatych) i właściwości reologiczne ludzkiego układu naczyniowego. Co więcej, sposób, w jaki CTC doświadczają układu krążenia, nie jest do końca jasny. Dowody eksperymentalne wskazują, że większość komórek rakowych nie krąży w sposób ciągły, tak jak komórki krwi. Raczej, ze względu na ich stosunkowo duży rozmiar (10-20 μm średnicy), większość CTC zostaje uwięziona w złożach kapilarnych (6-8 μm średnicy) na różne długości czasu (od s do dni), gdzie mogą umrzeć, wynaczynić lub zostać przemieszczone do następnego złoża kapilarnego8,9,10,11. Istnieją jednak pewne dowody na to, że rozmiar CTC może być bardziej niejednorodny in vivo i że mniejsze CTC są wykrywalne12. Dlatego, w oparciu o odległość i prędkość przepływu krwi, CTC mogą swobodnie krążyć tylko przez kilka sekund między tymi okresami uwięzienia, chociaż brakuje ilościowego opisu tego zachowania13.
Ponadto, w zależności od tego, gdzie CTC dostają się do krążenia, mogą przejść przez wiele naczyń włosowatych w płucach i innych miejscach peryferyjnych oraz zarówno przez prawe, jak i lewe serce, zanim dotrą do miejsca docelowego. Po drodze CTC są narażone na różne naprężenia hemodynamiczne, w tym naprężenia ścinające płynu (FSS), siły ściskające podczas ich uwięzienia w mikrokrążeniu i potencjalnie siły trakcyjne w warunkach, w których mogą wykazywać leukocyty podobne do toczenia się po ścianach naczyń krwionośnych14. W związku z tym zarówno możliwość modelowania krążenia, jak i zrozumienie zachowania CTC, które ma być modelowane, jest ograniczone. Ze względu na tę niepewność, wszelkie wyniki z systemów modelowych in vitro powinny zostać zweryfikowane w eksperymentalnym organizmie kręgowców, a ostatecznie u pacjentów z rakiem.
Z wyżej wymienionymi zastrzeżeniami, ten artykuł demonstruje stosunkowo prosty model zastosowania FSS do komórek w zawiesinie, aby zbadać wpływ FSS na CTC, po raz pierwszy opisany w 2012 roku15. FSS wynika z tarcia przepływu krwi o ścianę naczynia, co powoduje powstanie parabolicznego gradientu prędkości w warunkach przepływu laminarnego w większych naczyniach. Komórki doświadczają wyższych poziomów FSS w pobliżu ścian naczyń i niższych poziomów w pobliżu środka naczynia krwionośnego. Lepkość płynu, natężenie przepływu i wymiary przewodu, przez który następuje przepływ, wpływają na FSS, zgodnie z równaniem Hagena-Poiseuille'a. Dotyczy to przepływów krwi zachowujących się jak płyny newtonowskie, ale nie dotyczy mikrokrążenia. Fizjologiczny FSS waha się nad kilkoma rzędami wielkości, przy czym najniższe poziomy występują w układzie limfatycznym (<1 dyn/cm2), a najwyższe w regionach wokół zastawek serca i blaszek miażdżycowych (>500 dyn/cm2)5. Średnie naprężenie ścinające ściany w tętnicach wynosi 10-70 dyn/cm2 i 1-6 dyn/cm2 w żyłach16,17.
W sercu komórki mogą być narażone na turbulentne przepływy wokół płatków zastawek, gdzie mogą wystąpić bardzo wysokie, ale bardzo krótkotrwałe FSS18,19. Chociaż dziedzina bioprzetwarzania od dawna bada wpływ FSS na komórki ssaków w zawiesinie, informacje te mogą mieć ograniczoną wartość dla zrozumienia wpływu FSS na CTC, ponieważ generalnie koncentrują się na znacznie niższych poziomach FSS stosowanych przez długi czas20. Jak opisano poniżej, za pomocą strzykawki i igły można nakładać stosunkowo wysoki (dziesiątki do tysięcy dyn/cm2) FSS przez stosunkowo krótki czas (milisekundy) do zawiesiny komórek. Od czasu początkowego opisu tego modelu15, inni wykorzystali go do badania wpływu FSS na komórki rakowe21,22,23. Wiele "impulsów" FSS można zastosować do zawiesin komórek w krótkim czasie, aby ułatwić dalsze analizy eksperymentalne. Na przykład model ten można wykorzystać do pomiaru zdolności komórek do opierania się mechanicznemu zniszczeniu przez FSS poprzez pomiar żywotności ogniw w funkcji liczby zastosowanych impulsów. Alternatywnie, wpływ ekspozycji na FSS na biologię komórek nowotworowych można zbadać, zbierając komórki do różnych dalszych analiz. Co ważne, część zawiesiny komórek jest zarezerwowana jako kontrola statyczna w celu porównania skutków FSS z tymi, które mogą być związane z oderwaniem komórek i czasem przebywania w zawieszeniu.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>14 ml probówki z okrągłym dnem</td><td>Falcon - Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>30 G Igła 1/2" BD</td><td></td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 mL strzykawka</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płyta dolna</td><td>Costar - Detektor</td> bioluminescencji Corning <td>3915</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AMI</td><td>AMI HTX</td><td></td></tr><tr><td>BSA, frakcja V</td><td>Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>miano komórek Niebieski</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>krystaliczny fiolet</td><td>Sigma</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>GoldBio</td><td>D-LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> Czytnik płytek <td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>BioTek</td><td></td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-3005</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie wpływu stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Podczas przerzutów, komórki rakowe z tkanek litych, w tym nabłonka, uzyskują dostęp do krążenia limfatycznego i krwiopochodnego, gdzie są narażone na obciążenia mechaniczne spowodowane przepływem hemodynamicznym. Jednym z tych naprężeń, których doświadczają krążące komórki nowotworowe (CTC), jest naprężenie ścinające płynu (FSS). Podczas gdy komórki rakowe mogą doświadczać niskiego poziomu FSS w guzie z powodu przepływu śródmiąższowego, CTC są narażone, bez przyłączenia macierzy zewnątrzkomórkowej, na znacznie wyższe poziomy FSS. Fizjologicznie FSS waha się ponad 3-4 rzędy wielkości, przy czym niskie poziomy występują w układzie limfatycznym (<1 dyn/cm2), a najwyższe poziomy występują krótko, gdy komórki przechodzą przez serce i wokół zastawek serca (>500 dyn/cm2). Istnieje kilka modeli in vitro zaprojektowanych do modelowania różnych zakresów fizjologicznych naprężeń ścinających w różnych ramach czasowych. W artykule opisano model do badania konsekwencji krótkich (milisekundowych) impulsów FSS wysokiego poziomu na biologię komórek nowotworowych przy użyciu prostego systemu strzykawki i igły.

Wcześniej wykazano, że zwiększona odporność na destrukcję mechaniczną indukowaną przez FSS jest fenotypem konserwowanym w wielu liniach komórek rakowych oraz w komórkach nowotworowych świeżo wyizolowanych z guzów w porównaniu z nieprzekształconymi komórkami nabłonkowymi15,24. W niniejszej pracy przetestowano dodatkowe linie komórek rakowych pochodzące z różnych tkanek (Tabela 2), aby wykazać, że większość tych komórek wykazuje żywotność ≥ 20% po ...

Tutaj demonstrujemy metodę przykładania naprężeń ścinających płyn do komórek rakowych w zawiesinie, aby modelować wpływ stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe.

Modelowanie wpływu stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Protokół ten wystawia komórki rakowe w zawiesinie na krótkie impulsy naprężenia ścinającego płyn, aby naśladować pewne aspekty tego, jak przerzutowe komórki rakowe są narażone na siły hemodynamiczne, gdy znajdują się w układzie krążenia. Jest to stosunkowo prosta technika polegająca na stosowaniu krótkich impulsów naprężeń ścinających płynu o wysokim poziomie. Próbując tego protokołu, należy uważać na niezakorkowane igły i nie zginać ich, ponieważ zmieni to przyłożone naprężenie ścinające.Ta procedura może powodować powstawanie aerozoli, dlatego należy stosować odpowiednie środki bezpieczeństwa. Aby rozpocząć, uwolnij od 70 do 90% zlewających się komórek PC3 z naczynia do hodowli tkankowej, zasysając pożywkę wzrostową i myjąc 10-centymetrową naczynie pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu. Następnie odessaj PBS i dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny.Po trypsynizacji obserwuj oderwanie się komórek pod odwróconym mikroskopem. Aby zahamować trypsynę, dodaj pięć mililitrów pożywki DMEM/F12 zawierającej 10% FBS. Następnie umieść zawiesinę komórek w stożkowej probówce i określ stężenie komórek oraz całkowitą liczbę komórek.Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez trzy min

modeling-effects-hemodynamic-stress-on-circulating-tumor-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Źródło: Lim, M., et al. Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej. J. Vis. Exp. (2022)W tym filmie znieczulona mysz przechodzi zabieg chirurgiczny, w którym komórki rakowe są wstrzykiwane do wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), aby ułatwić celowe dostarczanie do mózgu. Procedura polega na precyzyjnym zszywaniu i manipulowaniu tętnicami szyjnymi w celu skierowania wstrzykniętych komórek w kierunku tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), co z...

Modelowanie przerzutów guza mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Przerzuty do mózgu są przyczyną ciężkiej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z rakiem. Większość mysich modeli przerzutów do mózgu jest skomplikowana przez przerzuty ogólnoustrojowe, mylące analizę śmiertelności i wyników interwencji terapeutycznej. Przedstawiono tutaj protokół wewnętrznego wstrzykiwania komórek rakowych do tętnicy szyjnej, który wytwarza spójne guzy wewnątrzczaszkowe z minimalnymi guzami ogólnoustrojowymi.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Artykuł opisuje protokół do symulacji przejściowych profili temperatury i sprzężonej czasoprzestrzennej zmienności ciśnienia płynu śródmiąższowego po ogrzewaniu dostarczanym przez dipolarny system hipertermii o częstotliwości radiowej. Protokół może być wykorzystany do oceny odpowiedzi parametrów biofizycznych charakteryzujących mikrośrodowisko guza na techniki hipertermii interwencyjnej.

Podejście do modelowania obliczeniowego w celu zbadania wpływu hipertermii na mikrośrodowisko guza

Poznaj metodę modelowania wpływu stresu ścinania na komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły. Technika ta pozwala badać mechanizmy przeżycia komórek rakowych podczas przerzutów.

Modelowanie wpływu stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły

Przeglądaj więcej filmów