Modelowanie wpływu stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły

Protokół ten wystawia komórki rakowe w zawiesinie na krótkie impulsy naprężenia ścinającego płyn, aby naśladować pewne aspekty tego, jak przerzutowe komórki rakowe są narażone na siły hemodynamiczne, gdy znajdują się w układzie krążenia. Jest to stosunkowo prosta technika polegająca na stosowaniu krótkich impulsów naprężeń ścinających płynu o wysokim poziomie. Próbując tego protokołu, należy uważać na niezakorkowane igły i nie zginać ich, ponieważ zmieni to przyłożone naprężenie ścinające.

Ta procedura może powodować powstawanie aerozoli, dlatego należy stosować odpowiednie środki bezpieczeństwa. Aby rozpocząć, uwolnij od 70 do 90% zlewających się komórek PC3 z naczynia do hodowli tkankowej, zasysając pożywkę wzrostową i myjąc 10-centymetrową naczynie pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu. Następnie odessaj PBS i dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny.

Po trypsynizacji obserwuj oderwanie się komórek pod odwróconym mikroskopem. Aby zahamować trypsynę, dodaj pięć mililitrów pożywki DMEM/F12 zawierającej 10% FBS. Następnie umieść zawiesinę komórek w stożkowej probówce i określ stężenie komórek oraz całkowitą liczbę komórek.

Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez trzy minuty, następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli tkankowych bez surowicy. Wytnij wokół dna 14-mililitrowej rurki polistyrenowej na linii siedmiu mililitrów i umieść zawiesinę mieszanych komórek w przeciętej rurce. Oddzielnie pobrać statyczne próbki kontrolne komórek przed wystawieniem na naprężenia ścinające płynu w celu wykorzystania do przeprowadzenia testów.

Aby wystawić pozostałą próbkę zawiesiny komórkowej na naprężenia ścinające płynu, należy pobrać zawiesinę komórek do pięciomililitrowej strzykawki i przymocować igłę o rozmiarze 30 i pół cala. Umieścić i zabezpieczyć strzykawkę za pomocą niezakorkowanej igły na pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu, aby osiągnąć pożądany poziom naprężeń ścinających płyn. Uruchom pompę strzykawkową i zbierz ściętą próbkę do przeciętej rurki pod kątem około 45 stopni, aby zmniejszyć pienienie.

Ostrożnie wyjąć strzykawkę z pompy strzykawkowej i użyć szczypiec do wyjęcia igły, uważając, aby jej nie dotknąć. Powtarzaj procedurę, aż zawiesina komórek zostanie wystawiona na działanie pożądanej liczby impulsów naprężenia ścinającego płynu. Wykonaj testy żywotności na próbkach statycznych przed wystawieniem komórek na naprężenia ścinające płynu.

W przypadku testów enzymatycznych przenieść 100 mikrolitrów podwielokrotności z próbek statycznych w dwóch egzemplarzach na płytkę 96-dołkową. Następnie zbierz 100 mikrolitrów próbek po wystawieniu na działanie naprężeń ścinających płynu i umieść je na 96-dołkowej płytce. Dodać 20 mikrolitrów 0,15 miligrama na mililitr roztworu resazuryny do każdej studzienki na próbkę i do studzienek zawierających 100 mikrolitrów samej pożywki.

Inkubować płytki studzienkowe w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie zmierzyć fluorescencję i absorbancję za pomocą czytnika płytek i uzyskać procent żywych komórek, porównując średni sygnał z każdej z próbek narażonych na naprężenie ścinające płynu ze średnią ze statyczną próbką kontrolną. Podobnie, należy pobrać podwielokrotności z próbek statycznych w celu przeprowadzenia cytometrii przepływowej i testów klonogennych, jak opisano w manuskrypcie tekstu. W analizie reprezentatywnej oceniono żywotność komórek nabłonka raka sutka z biopsji syngenicznej za pomocą konwersji resazuryny po wystawieniu komórek na działanie szeregu impulsów naprężeń ścinających płyn

Mimo że każda linia komórkowa wykazywała różne profile odporności, nie było znaczącej różnicy w żywotności po 10 impulsach ekspozycji na naprężenia ścinające płynu. Dodatkowe linie komórek rakowych o różnym pochodzeniu tkankowym wykazały żywotność ponad 20% po 10 impulsach naprężenia ścinającego płyn, z wyjątkiem komórek MIA PaCa-2, które wykazały żywotność mniejszą niż 10% ze względu na wrażliwość na mechaniczne zniszczenie spowodowane naprężeniem ścinającym płynu. Podczas pobierania próbki statycznej przed zastosowaniem naprężeń ścinających płynów należy upewnić się, że zawiesina komórek jest jednorodnie wymieszana.

Ostrożnie wyjmij igłę szczypcami i nie zginaj ani nie dotykaj igły. Oprócz pomiaru żywotności komórek można ocenić zmiany w ekspresji genów, sygnalizacji komórkowej, proliferacji i migracji. Wykorzystując to jako model narażenia na naprężenia ścinające płynu, można badać zarówno to, w jaki sposób komórki rakowe opierają się zniszczeniu przez naprężenie ścinające płynu, jak i oceniać wpływ naprężenia ścinającego płynu na biologię komórek rakowych.

Technika ta została wykorzystana przez nasze laboratorium i inne do zbadania wpływu naprężeń ścinających płyn na krążące komórki nowotworowe. Badania te wykazały, że naprężenie ścinające płyn szybko zmienia właściwości mechaniczne komórek rakowych, co przyczynia się do odporności komórek rakowych na zniszczenie przez naprężenie ścinające płynu.