Ustanawianie stabilnych kultur binarnych symbiotycznych bakterii sacharycznych z jamy ustnej

Sacharybakterie są pasożytami obligatoryjnymi, które wymagają kohodowli z odpowiednimi bakteriami gospodarza. Jako ludzki sacharybakterie saccharibacteria w jamie ustnej można łatwo wyizolować u większości osób przy użyciu znanych gatunków bakterii gospodarza. Protokół ten pozwoli każdemu badaczowi lub laboratorium na wyizolowanie własnych szczepów w kokulturze binarnej.

Technika ta wykorzystuje proste urządzenia i sprzęt obecny w większości laboratoriów mikrobiologicznych i została z powodzeniem wykorzystana do hodowli ponad 30 izolatów reprezentujących sześć gatunków sacharybakterii. Protokół ten może być przydatny do izolacji innych gatunków promieniowania obserwowanych przez kandydatów, a także bakterii saccharibacteria z różnych środowisk i innych ssaków, jeśli uda się zidentyfikować i wyizolować odpowiednich gospodarzy promieniowców. Procedurę zademonstruje Andrew Collins, były doktor habilitowany w moim laboratorium.

Na początek rozpocznij hodowle bakterii gospodarza, takich jak arachnia propionica, mając wystarczająco dużo czasu, aby mogły wzrosnąć do wczesnej fazy stacjonarnej. Aby zainicjować hodowlę, zaszczep od dwóch do pięciu mililitrów tryptycznego bulionu sojowego zawierającego 0,1% ekstraktu drożdżowego z arachnia propionica i inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie zmontuj uchwyty filtrów z wytrawionymi membranami filtracyjnymi o grubości 0,2 mikrometra.

Zawiń je w folię i sterylizuj w autoklawie, wraz z probówkami wirówkowymi i zespołami nakrętek. Sterylizuj dodatkowe materiały eksploatacyjne w przypadku przypadkowego kontaktu z niesterylnymi powierzchniami. Zbierz płytkę nazębną, zeskrobując ją wzdłuż linii dziąseł, używając sterylnego papierowego punktu, zgrabnej łyżeczki lub sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety, a następnie przenieś ją do odpowiedniego bufora, takiego jak MRD lub PBS.

Próbkę należy przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie ona gotowa do dalszego działania. Energicznie zawiesić płytkę nazębną, stosując kombinację wirowania i pipetowania za pomocą małej końcówki pipety, a następnie dodać zawieszoną próbkę płytki nazębnej do probówki zawierającej dziewięć mililitrów buforu MRD. Ostrożnie rozpakuj sterylny zespół filtra przy użyciu techniki aseptycznej.

Odkręć o ćwierć obrotu i ponownie dokręć uchwyt filtra, aby upewnić się, że gwinty są prawidłowo zazębione, a urządzenie jest prawidłowo zamknięte. Przemyć membranę, przepuszczając 10 mililitrów buforu MRD przez aparat za pomocą strzykawki. Aby nanieść próbkę na umyty filtr, należy wyjąć tłok ze strzykawki i przymocować go do aparatu filtrującego.

Umieść sterylną probówkę wirówkową pod tym aparatem filtrującym, aby złapać filtrat, a następnie wlej rozproszoną próbkę dentystyczną do strzykawki i załaduj ją do filtra. Następnie lekko dociśnij tłok, aby przepchnąć próbkę przez filtr. Przemyć membranę kolejnymi 10 mililitrami buforu MRD i zebrać przepływ w tej samej probówce, co przefiltrowana próbka.

Następnie zakryj probówkę aseptycznie i trzymaj na lodzie. Zrób znak orientacyjny na probówce i nasadce, aby określić położenie osadu komórkowego po odwirowaniu. Umieścić probówkę w wirówce wysokoobrotowej z oznaczeniem na górnej stronie i odwirować próbki o stężeniu 60 000 G przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu ostrożnie wylać supernatant, trzymając osad na górnej stronie probówki. Następnie ponownie zawieś osad w jednym do dwóch mililitrów buforu MRD, energicznie wirując. Przygotować probówki hodowlane, dodając do nich dwa mililitry odpowiedniej pożywki wzrostowej.

Następnie do każdej probówki dodać 200 mikrolitrów nocnej hodowli organizmów gospodarza i 100 do 200 mikrolitrów ponownie zawieszonej przefiltrowanej próbki. Połączone próbki należy inkubować w warunkach odpowiednich dla organizmu żywiciela. Pasażuj komórki co dwa do trzech dni, przenosząc 200 mikrolitrów kultury binarnej do dwóch mililitrów świeżej pożywki wzrostowej w nowej probówce.

Jeśli pasażowane kultury nie wykazują wzrostu przy 200 mikrolitrach niezakażonej kultury gospodarza, podczas pasażowania komórek należy zwrócić zaszczepione probówki do inkubatora. Porcjować 24 mikrolitry wzorca PCR wymieszać w 0,2 mililitrowej probówce do PCR. Na jednym mikrolitrze kultury zakażonej sacharybakteriami umieść probówkę w termocyklerze.

Ustaw program PCR zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Załaduj i uruchom produkty PCR na żelu 1%Agros. Pasmo około 600 zasad potwierdzi obecność sacharybakterii.

Aby potwierdzić czystość kultur dodatnich, należy wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie kokultury sacharybakterii w sterylnym buforze i rozprowadzić 100 mikrolitrów na płytce agarowej. Inkubować kulturę w odpowiednich warunkach wzrostu i obserwować, czy nie ma organizmów skażających. Pasmo około 600 zasad potwierdzi obecność sacharybakterii.

Wykrywanie PCR może wydawać się ujemne w początkowych kulturach infekcji ze względu na małą liczbę symbiontów sacharybakterii. Jednak po kilku przejściach powinien pojawić się silny produkt PCR, wskazujący, że doszło do stabilnej infekcji. Testowanie kilku gatunków gospodarzy za pomocą tego samego filtratu sacharybakterii zwykle ma niski wskaźnik sukcesu.

Ponieważ interakcja z gospodarzem symbiont jest bardzo specyficzna. W miarę wzrostu zainfekowanych kultur powinien pojawić się normalny mętny wzrost. W miarę utrwalania się symbiozy zakażone kultury będą wydawać się mniej mętne niż kultury niezainfekowanych organizmów gospodarza.

Zanieczyszczoną kulturę można oczyścić, zbierając zainfekowane kolonie po posiewaniu. Zainfekowane kolonie można czasami zidentyfikować po nieregularnym kształcie kolonii w porównaniu z koloniami niezainfekowanymi. Proporcja regularnych kolonii zależy od miana sacharybakterii w kulturze binarnej.

Jeśli miano jest niskie, mniej kolonii będzie wydawać się nieregularnych, co ułatwi wybranie zainfekowanych kolonii i rozpoczęcie czystej kultury binarnej. Kultury mogą nie wydawać się pozytywne dla kilku fragmentów. Więc niektórzy pacjenci będą potrzebni.

Konieczne jest również regularne sprawdzanie pod kątem zanieczyszczenia kultur binarnych, ponieważ może to zdestabilizować kulturę i doprowadzić do śmierci bakterii sacharycznych. Kultura binarna może być używana do wszelkiego rodzaju eksperymentów laboratoryjnych. DNA i RNA można ekstrahować odpowiednio do sekwencjonowania genomu i analizy transkryptomu.

Chorobotwórczość można również badać za pomocą modeli zwierzęcych.