Name: Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę multipleksowego testu neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem opartą na kulkach. Technika umożliwia jednoczesne pomiary przeciwciał przy mniejszej objętości próbki i krótszym czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten raport został sfinansowany przez Luminex Corporation (Austin, TX). Autorzy dziękują dr Matthew Silvermanowi (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, Floryda) za pomoc w redakcji naukowej.

<ol><li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).</li>
<li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li>
<li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li>
<li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li>
<li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+P+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).</li>
<li>Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020).</li>
<li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020).</li>
<li>Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).</li>
<li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus%2C+diphtheria%2C+and+Haemophilus+influenzae+Type+b%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li>
</ol>

Stephen Angeloni i Sherry Dunbar są pracownikami firmy Luminex Corporation, która produkuje niektóre z odczynników i przyrządów użytych w tym badaniu. Publikacja tego artykułu w otwartym dostępie była sponsorowana przez Luminex Corporation

Badanie to rozszerzyło funkcjonalność multipleksowego testu mikrosfery fluorescencyjnej 3Flex, który jakościowo ocenia odpowiedź IgG na zakażenie SARS-CoV-21. Podczas gdy wiele testów serologicznych na COVID-19 wykrywa pojedynczy antygen, ten test jednocześnie ocenia antygeny S, RBD i Nc oraz obejmuje wewnętrzną kontrolę izotypuprzeciwciał 7. Ponadto ACE2 jest używany jako wskaźnik do wykrywania miana przeciwciał neutralizujących przeciwko SARS-CoV-2.
Testy wieloantygenowe mogą być szczególnie przydatne w przyszłości do rozróżniania odpowiedzi immunologicznych między osobami zakażonymi i zaszczepionymi. W przypadku SARS-CoV-2, jeśli oceniane są tylko przeciwciała S i RBD, niemożliwe byłoby określenie, czy było to spowodowane przebytą infekcją, czy odpowiedzią przeciwciał poszczepiennych. Żadna z obecnie stosowanych szczepionek nie jest ukierunkowana na antygen Nc, więc oceniając antygeny S/RBD i Nc, możliwe jest odróżnienie przebytej infekcji wirusowej (Nc- i S/RBD-dodatniej) od odpowiedzi na szczepienie (tylko S/RBD-dodatnia; Nc-ujemne).
W obecnym badaniu testy serologiczne i neutralizacyjne 3Flex (sekcje 5 i 6) przeniesiono do nowego przyrządu do podwójnej analizy przepływu reporterowego (sekcje 7 i 8). Typowe protokoły testów immunologicznych dla testów multipleksowych opartych na kulkach są podobne do standardowych protokołów ELISA, po zastosowaniu porównywalnych etapów inkubacji próbki, inkubacji przeciwciał/reportera wykrywania i analizy wyników8. Wcześniejsze badania wykazały również, w jaki sposób standardowe testy ELISA można przenieść na platformę multipleksowania opartą na koralikach9.
Protokoły testowe można było bezproblemowo przenieść z poprzedniego przyrządu z pojedynczym reporterem do nowego systemu z podwójnym reporterem, jak pokazują wyniki uzyskane dla próbek testowych i kontroli (Rysunek 4 i Rysunek 5). W teście serologicznym wszystkie dodatnie próbki surowicy wykazywały charakterystyczny spadek sygnału reagujący na dawkę, odpowiadający zarówno większemu rozcieńczeniu próbki, jak i niższemu stężeniu przeciwciał wykrywających, podczas gdy sygnały dla próbek ujemnych pozostały na poziomach tła. Podobnie, w teście neutralizacji, malejące sygnały dla S i RBD, ale nie Nc, odpowiadały rosnącym stężeniom konkurenta ACE2, podczas gdy surowica pozbawiona IgG była znacznie mniej dotknięta dodatkiem ACE2. Wstępna inkubacja kulek z ACE2 przez 2 minuty przed dodaniem próbki surowicy (jak opisano w punktach 6 i 8) porównano również z łączeniem kulek z ACE2 i surowicą w tym samym czasie i dała niewielką różnicę w wynikach (dane nie pokazane). Ponieważ jednak wyniki uzyskane za pomocą kulek i etapu wstępnej inkubacji ACE2 były bardziej spójne, była to ostateczna procedura przyjęta do protokołu testu neutralizacji (sekcje 6 i 8).
Ponieważ system podwójnego reportera zawiera drugi fluorescencyjny kanał reporterowy, oba testy zostały przekształcone w testy izotypiczne, aby jednocześnie mierzyć odpowiedzi IgG i IgM. Funkcja podwójnego reportera analizatora przepływu umożliwia zbieranie sygnałów fluorescencyjnych z dwóch odczynników do wykrywania reporterów dla każdego analitu w multipleksie dla każdej próbki, skutecznie podwajając dane generowane dla próbki w teście. W celu opracowania i optymalizacji protokołów podwójnego testu reporterowego, kilka dostępnych na rynku barwników reporterowych i przeciwciał wykrywających oceniono dla nowego kanału RP2 (Figura 7 i Figura 8) w celu określenia najlepszej dostępnej opcji (opcji). Przeciwciało anty-IgM sprzężone z barwnikiem reporterowym DL 405 nie działało dobrze w kanale RP2 (Figura 7), więc anty-IgG biotyny z SASB oceniano następnie pod kątem wykrycia w kanale RP2 (Figura 8). Trzy kombinacje odczynników detekcyjnych RP1 i RP2 porównano w teście podwójnej neutralizacji reporterowej (tabela 1 i ryc. 9) w celu określenia najlepszych kombinacji do jednoczesnego wykrywania przeciwciał neutralizujących IgG i IgM. Chociaż wystąpiły istotne różnice w intensywności sygnału między kanałem RP1 wykorzystującym PE-anty IgM a kanałem RP2 wykorzystującym anty-IgM DL 549, nie było istotnej różnicy w pomiarze procentowego hamowania wiązania przez ACE2.
Uznaje się kilka ograniczeń obecnej metody i niniejszego badania. Po pierwsze, próbki testowane i wykorzystywane do opracowywania i optymalizacji metody ograniczały się do zestawów 8-11 próbek. Więcej próbek zostanie przetestowanych w rozszerzonych badaniach, aby sprawdzić, czy metoda jest w pełni zoptymalizowana. Po drugie, przetestowano ograniczoną liczbę fluoroforów reporterowych i par reporterowych. Dalsze testy wszystkich dostępnych reporterów we wszystkich możliwych kombinacjach określą, które odczynniki mogą być z powodzeniem stosowane w tej metodzie. Przeciwciało anty-IgG sprzężone z biotyną różniło się od przeciwciała anty-IgG sprzężonego z reporterem BV 421. Tak więc, chociaż istniała zmienność intensywności sygnału dla anty-IgG BV 421, mogła ona wynikać ze specyficzności przeciwciała i nie była związana z barwnikiem reporterowym. Testowanie innych dostępnych przeciwciał sprzężonych z BV 421 może zidentyfikować inne przeciwciało, które dobrze działałoby w kanale RP2. Przyszłe badania będą również oceniać połączenie PE anty-IgM z anty-ludzką IgG BV 421 w celu wykrywania odpowiednio w RP1 i RP2. Wreszcie, nawet przy możliwości podwójnego reporterowania instrumentu, testy są ograniczone do dwóch izotypów (dwóch parametrów) na reakcję. Jeśli mają być mierzone dodatkowe izotypy lub pożądane jest pełne izotypowanie, wówczas dodatkowe reakcje przy użyciu tych samych dwóch kanałów reporterowych musiałyby być prowadzone w oddzielnych studzienkach.
Technologia multipleksowania oparta na kulkach pozwala na szybkie i elastyczne projektowanie testów z łatwą implementacją do rutynowych procesów laboratoryjnych 3,4,10. Badanie to wykazało łatwość przeniesienia wcześniej opisanych testów serologicznych i neutralizacyjnych 3Flex dla SARS-CoV-2 do systemu analizy przepływu do pomiaru IgG za pomocą jednego reportera lub z niewielką modyfikacją, jednocześnie mierząc zarówno odpowiedzi IgG, jak i IgM za pomocą dwóch reporterów. Opcja podwójnego reportera ma wyraźną przewagę nad platformami z pojedynczym reporterem, ponieważ może dostarczyć dwa razy więcej danych na próbkę, wykorzystując połowę objętości próbki i połowę liczby studzienek reakcyjnych. Dzięki odpowiednim barwnikom reporterowym i przeciwciałom detekcyjnym, testy izotypowania można łatwo opracować i przeprowadzić na urządzeniu do analizy przepływu z podwójnym reporterem.

Pandemia COVID-19 uwypukliła znaczenie możliwości szybkiego opracowania i wdrożenia szybkich, wysokowydajnych i wydajnych testów serologicznych, które mogą być wykorzystywane do diagnozowania i nadzoru nad nowymi patogenami, takimi jak SARS-CoV-2. Multipleksowe testy serologiczne mogą być niezwykle przydatne w czasie pandemii, ponieważ mogą jednocześnie analizować przeciwciała przeciwko wielu antygenom, co zapewnia szeroki zakres patogenów i kontrolę zmienności organizmu i odpowiedzi gospodarza na infekcję. Niedawno poinformowano o opracowaniu multipleksowego testu fluorescencyjnego opartego na kulkach, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), który może wykrywać przeciwciała przeciwko białku kolca (S), domenie wiążącej receptor (RBD) enzymu konwertującego angiotensynę angiotensynę (ACE2) i nukleokapsydu (Nc) SARS-CoV-21. Wykazano, że 3Flex ma porównywalną wydajność do referencyjnego testu IgG SARS-CoV-2 dla surowicy uzyskanej po ≥21 dniach od wystąpienia objawów, ale miał wyższą czułość w przypadku próbek pobranych w ≤5 dniu od wystąpienia objawów. Dodatkowo wykazano hamowanie wiązania przeciwciał dla antygenów S i RBD przy użyciu rozpuszczalnego ACE2 w formacie testu neutralizacji. Technologia oparta na koralikach multipleksowych została szeroko przyjęta jako sprawdzona technologia wielopoziomowych testów serologicznych i ma wyraźne zalety w badaniach przesiewowych na dużą skalę, w tym krótki czas uzyskania wyników, wymagania dotyczące małych próbek i zmniejszony nakład pracy2,3,4.
Niedawno udostępniono nowe narzędzie do analizy przepływu, które zapewnia taką samą zdolność do obsługi i przepustowości jak system zademonstrowany w poprzedniej pracy1, ale z dodatkową korzyścią w postaci dwóch kanałów reporterskich. Możliwość pomiaru dwóch fluorescencyjnych sygnałów reporterowych w jednej reakcji pozwala na ocenę dwóch wyników dla każdego analitu dla każdej próbki i jest idealna do zastosowań izotypowych, które zazwyczaj muszą być wykonywane w oddzielnych studniach reakcyjnych5. Funkcja podwójnego reportera zapewnia dwukrotnie więcej danych dla każdej próbki w o połowę mniejszej liczbie studzienek reakcyjnych przy połowie wymagań dotyczących objętości próbki, a tym samym ma wyraźną przewagę nad systemami z pojedynczym reporterem. Badanie to szczegółowo opisuje standardowy protokół testu serologicznego i opisuje adaptację do testu neutralizacji. Ponadto w niniejszym raporcie opisano konwersję testu z pojedynczym reporterem na test serologiczny z podwójnym reporterem, a następnie test z podwójną neutralizacją reporterową, w celu jednoczesnego pomiaru przeciwciał neutralizujących zarówno izotypów IgG, jak i IgM przeciwko antygenom SARS-CoV-2 S, RBD i Nc. Wizualny przegląd protokołu testu znajduje się w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>ACE2 (człowiek) (rec.)</td><td>AdipoGen Life Sciences</td><td>AG-40B-0192-3050</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP (długi dystans) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&gamma; fragment specyficzny dla fragmentu</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-065-098</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>MilliporeSigma</td><td>A7888</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Branson 1800 Środek czyszczący/dźwiękowy do kąpieli wodnej</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystiren NBS Microplate</td><td>Corning</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-well Microplate Aluminiowa taśma uszczelniająca, niesterylna</td><td>Corning</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&mu; &nbsp; specyficzny fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-475-043</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Kozia anty-ludzka IgM Fc5&mu; specyficzna</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-506-129</td><td>Wycofane, ale dostępne u wielu dostawców</td></tr><tr><td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Sprzężony</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek inkubacyjnych Fisherbrand</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-217-757</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kozioł anty-króliczą IgG (H+L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P-2771MP</td><td></td></tr><tr><td>Luminex Magnetyczny separator płytowy</td><td>Luminex Corporation</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki MagPlex</td><td>Luminex Corporation</td><td>MC100XX-ID</td><td></td></tr><tr><td>PE AffiniPure F(ab')2 Koza Anty-Ludzka IgM Fc5&mu; specyficzne</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-116-129</td><td></td></tr><tr><td>Milipory</td><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanemSigma</td><td>P3813</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>białkowe nukleokapsydu Sigma-Aldrich SARS</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56683</td><td>Niesprzężone, królik, poliklonalne, białko G oczyszczone</td></tr><tr><td>przeciwciało białkowe nukleokapsydu SARS</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56049</td><td>Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko A oczyszczone</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko białku kolca SARS</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56047</td><td>Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko G oczyszczone</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko białku kolca SARS</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56048</td><td>Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko G oczyszczone Przeciwciało</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1, Królik MAb</td><td>SinoBiological</td><td>40150-R007</td><td></td></tr><tr><td>Miliporek</td> <td>azydku soduSigma</td><td>S2002</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Streptawidyna, koniugat R-fikoerytryny (SAPE)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S21388</td><td>najwyższej jakości</td></tr><tr><td>rewolwer / rotator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9416</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>xMAP Zestaw</td> <td>do badania przeciwciałLuminex Corporation</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td><td>Luminex Corporation</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr></tbody></table>

szybki, multipleksowy test neutralizacji igg i igm sars-cov-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Pandemia COVID-19 uwypukliła potrzebę szybkich, wysokoprzepustowych metod do czułego i specyficznego wykrywania serologicznego infekcji nowymi patogenami, takimi jak SARS-CoV-2. Multipleksowe testy serologiczne mogą być szczególnie przydatne, ponieważ mogą jednocześnie analizować przeciwciała przeciwko wielu antygenom, co optymalizuje pokrycie patogenów i kontroluje zmienność organizmu i indywidualną odpowiedź gospodarza. Tutaj opisujemy test oparty na mikrosferach fluorescencyjnych SARS-CoV-2 IgG 3-plex, który może wykryć zarówno przeciwciała IgM, jak i IgG przeciwko trzem głównym antygenom SARS-CoV-2 - białku kolca (S), domenie wiążącej receptor (RBD) enzymu konwertującego angiotensynę (ACE2) i nukleokapsydu (Nc). Wykazano, że test ma porównywalną wydajność do testu referencyjnego SARS-CoV-2 na IgG w surowicy uzyskanej po ≥21 dniach od wystąpienia objawów, ale miał wyższą czułość w przypadku próbek pobranych w ≤5 dniu od wystąpienia objawów. Ponadto, stosując rozpuszczalny ACE2 w formacie testu neutralizacji, wykazano hamowanie wiązania przeciwciał dla S i RBD.

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Według naszej wiedzy jest to pierwszy przykład protokołu multipleksowania opartego na koralikach, który wykorzystuje dwa sygnały reporterowe do jednoczesnego pomiaru dwóch wyników na analit. Technika ta pozwala użytkownikowi na jednoczesny pomiar IgM i IgG specyficznych dla antygenu, przy mniejszej próbce i krótszym czasie oczekiwania na wyniki. Chociaż ta metoda podwójnego reportera jest specyficzna dla izotypowania przeciwciał, można ją dostosować do pomiaru innych par analitów, takich jak modyfikacje potranslacyjne lub wolne i związane formy leków.Naszą procedurę demonstruje dziś dr Steve Angeloni, starszy naukowiec ds. zastosowań terenowych w Luminex Corporation. Aby rozpocząć test serologiczny z podwójnym reporterem IgG i IgM, przygotuj wymagane mieszanki kulek multipleksowych z poszczególnych koralików par i kontroluj zapasy kulek w stężeniu od jednego razy 10 do sześciu kulek na mililitr. Następnie rozcieńczyć próbki surowicy 100-krotnie, dodając 10 mikrolitrów surowicy do 990 mikrolitrów buforu PBS-TBN, a następnie rozcieńczyć próbki kolejne dziesięć razy, dodając 20 mikrolitrów rozcieńczenia 1:100 do 180 mikrolitrów PBS-TBN.Gdy mieszanki perełkowe i próbki surowicy są gotowe, dodaj 50 mikrolitrów mieszanek kulkowych multipleksowych do przypisanych dołków 96-dołkowej, niewiążącej płytki mikromiareczkowej, a następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonych próbek surowicy do odpowiednich studzienek. Po dodaniu wszystkich próbek przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem z mikropłytką i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce do płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie oddziel kulki od mieszaniny reakcyjnej, umieszczając płytkę na magnetycznym separatorze płytkowym na dwie minuty.Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową. Następnie ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant ze studzienek. Trzymając talerz na magnesie, osusz płytkę na chłonnym papierze.Aby umyć studzienki reakcyjne, wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 mikrolitrów PBS-TBN do każdej studzienki. Przykryj płytkę świeżym uszczelnieniem foliowym i inkubuj na rozgrzanym wytrząsarce przez dwie minuty, a następnie umieść ją z powrotem na płycie magnetycznej na kolejne dwie minuty. Trzymając płytkę na magnesie, odwróć płytkę, aby wyrzucić supernatant i osusz płytkę na chłonnym papierze.Po drugim płukaniu PBS-TBN wyjmij płytkę z magnesu i dodaj 100 mikrolitrów świeżej mieszanki odczynników detekcyjnych do każdej studzienki. Po pokryciu płytki foliowym uszczelnieniem z mikropłytki, należy umieścić ją na rozgrzanej wytrząsarce płyt na 15 minut, a następnie na magnetycznym separatorze płytkowym na dwie minuty. Gdy płytka znajduje się na magnesie, wyrzuć mieszaninę odczynników wykrywających, odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady i osuszając ją na chłonnym papierze.Przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN dwukrotnie, jak pokazano wcześniej, a następnie wyjąć płytkę z magnesu. Dodaj 100 mikrolitrów PBS-TBN do każdego dołka, a następnie przykryj płytkę folią uszczelniającą i wstrząsaj przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zdejmij uszczelkę foliową i przystąp do odczytu 50 mikrolitrów próbki z każdej studzienki w analizatorze przepływu.Aby odczytać blachę, wybierz menu rozwijane w lewym górnym rogu, przejdź do opcji Konfiguracja blachy, załaduj poprzednio skonfigurowaną blachę i wybierz opcję Uruchom blachę. Wysuń nośnik płyty, wybierając ikonę Wysuń, a następnie załaduj płytę na nośnik płyty i wybierz ikonę Wsuń, aby schować nośnik płyty. Gdy plate carrier wsunie się do analizatora, wybierz ikonę Uruchom, aby rozpocząć odczyt płytki.W przypadku testu neutralizacji z podwójnym reporterem dodać 50 mikrolitrów mieszanek kulkowych multipleksowych do przypisanych dołków 96-dołkowej niewiążącej płytki mikromiareczkowej, a następnie dodać 25 mikrolitrów po dwa mikrogramy na mililitr ACE2 do każdego dołka i przykryć płytkę uszczelką foliową. Po dwuminutowej inkubacji na rozgrzanym wytrząsarce płytkowej dodać 25 mikrolitrów rozcieńczeń surowicy w skali 1:500 do wyznaczonych dołków. Po dodaniu wszystkich próbek należy przeprowadzić etapy inkubacji, mycia, wykrywania i analizy, jak wykazano wcześniej dla testu serologicznego.Test anty-IgM sprzężony z barwnikiem reporterowym DyLight 405 przy użyciu próbek surowicy w ciągu pięciu do 60 dni od wystąpienia objawów i próbki surowicy paskowej IgG nie dał wysokiego sygnału dla antygenu kolca. W przypadku próbek o wysokiej intensywności średniej fluorescencji IgM najwyższe sygnały zaobserwowano dla domeny wiążącej receptor i antygenów nukleokapsydu. Podczas gdy miano IgM powinno być podwyższone w niektórych próbkach, obserwowane poziomy intensywności średniej fluorescencji nie przekraczały 140 jednostek MFI.Co więcej, kulka kontrolna dla IgM nie miała znaczącego zakresu dynamiki dla mediany intensywności fluorescencji przy użyciu DyLight 405 sprzężonego z anty-IgM w porównaniu z fikoerytryną znakowaną anty-IgM w tym samym stężeniu. W przypadku wykrywania IgG, sprzęgany z jaskrawym fioletem miał wyższe sygnały o medianie intensywności fluorescencji niż koniugat streptawidyny z fluorforem Super Bright 436. Jednak intensywność sygnału dla sprzęgania z jaskrawym fioletem różniła się w zależności od miareczkowania ACE2.Ta fluktuacja sygnału przez sprzęg jaskrawego fioletu w stężeniach ACE2 zakłócała również określanie procentowego hamowania przez ACE2 w całym zakresie mian IgG. W przypadku wykrywania IgM, fikoerytryna anty-IgM wykazywała wyższe sygnały niż te generowane przez anty-ludzką IgM DyLight 549. Podczas określania procentowego hamowania wiązania IgM przez ACE2 wystąpiła niewielka, ale nieistotna różnica między dwoma odczynnikami do wykrywania IgM.Tak więc jednym z najważniejszych kroków w tej procedurze jest przygotowanie mieszanki koralików multipleksowych z indywidualnych zapasów koralików i upewnienie się, że robisz to poprawnie. Tak więc procedura ta może być również stosowana do pomiaru skuteczności szczepionek i monitorowania odpowiedzi immunologicznej na inne patogeny.

a-rapid-multiplex-dual-reporter-igg-igm-sars-cov-2-neutralization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

W tym filmie pokazujemy test oparty na systemie bioreporterowym HiBit-RBD do wykrywania przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2. System ten celuje w domenę RBD wirusa za pomocą bioluminescencyjnego systemu reporterowego zawierającego HiBiT połączony z domeną RBD.

Test bioreporterowy: czuła technika wykorzystująca bioluminescencyjny system reporterowy do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2

Ten film demonstruje technikę multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie wykrywa przeciwciała przeciwko wielu patogenom środowiskowym w ludzkiej ślinie. Kulki fluorescencyjne sprzężono z antygenami różnych patogenów, które wychwycono za pomocą przeciwciał w próbce ludzkiej śliny. Po znakowaniu przeciwciał za pomocą reportera fluorescencyjnego, kulki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny obecności w ślinie różnych przeciwciał...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do identyfikacji przeciwciał specyficznych dla patogenu w ślinie

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Ten artykuł opisuje wygodną metodę monitorowania dynamicznych zmian w mianach przeciwciał dla dwóch izotypów immunoglobulin jednocześnie (IgA, IgM lub IgG) wynikających z odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Ten "Multianalitowy panel odpowiedzi immunologicznej Covid-19" wykorzystuje trzy pośrednie testy immunologiczne zbudowane na kodowanych mikrosferach, które są odczytywane za pomocą przepływowego czytnika multipleksowego z funkcją "dwukanałową".

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Multipleksowe fluorescencyjne testy immunologiczne stają się źródłem informacji do badań serologicznych. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na złożoność i czasochłonne procesy sprzężenia kulki z analizą koralików. Raport ten przedstawia półautomatyczny, powtarzalny protokół multipleksowego mikrokulkowego sprzężenia kulek, który jest porównywalny ze standardową metodą, a jednocześnie znacznie skraca czas oczekiwania na uzyskanie rezultatów.

Multipleksowy test serologiczny do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy

Poznaj metodę multipleksowego testu neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem opartą na kulkach. Technika umożliwia jednoczesne pomiary przeciwciał przy mniejszej objętości próbki i krótszym czasie.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach (Wideo) | JoVE Journal

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Przeglądaj więcej filmów