Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Według naszej wiedzy jest to pierwszy przykład protokołu multipleksowania opartego na koralikach, który wykorzystuje dwa sygnały reporterowe do jednoczesnego pomiaru dwóch wyników na analit. Technika ta pozwala użytkownikowi na jednoczesny pomiar IgM i IgG specyficznych dla antygenu, przy mniejszej próbce i krótszym czasie oczekiwania na wyniki. Chociaż ta metoda podwójnego reportera jest specyficzna dla izotypowania przeciwciał, można ją dostosować do pomiaru innych par analitów, takich jak modyfikacje potranslacyjne lub wolne i związane formy leków.

Naszą procedurę demonstruje dziś dr Steve Angeloni, starszy naukowiec ds. zastosowań terenowych w Luminex Corporation. Aby rozpocząć test serologiczny z podwójnym reporterem IgG i IgM, przygotuj wymagane mieszanki kulek multipleksowych z poszczególnych koralików par i kontroluj zapasy kulek w stężeniu od jednego razy 10 do sześciu kulek na mililitr. Następnie rozcieńczyć próbki surowicy 100-krotnie, dodając 10 mikrolitrów surowicy do 990 mikrolitrów buforu PBS-TBN, a następnie rozcieńczyć próbki kolejne dziesięć razy, dodając 20 mikrolitrów rozcieńczenia 1:100 do 180 mikrolitrów PBS-TBN.

Gdy mieszanki perełkowe i próbki surowicy są gotowe, dodaj 50 mikrolitrów mieszanek kulkowych multipleksowych do przypisanych dołków 96-dołkowej, niewiążącej płytki mikromiareczkowej, a następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonych próbek surowicy do odpowiednich studzienek. Po dodaniu wszystkich próbek przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem z mikropłytką i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce do płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie oddziel kulki od mieszaniny reakcyjnej, umieszczając płytkę na magnetycznym separatorze płytkowym na dwie minuty.

Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową. Następnie ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant ze studzienek. Trzymając talerz na magnesie, osusz płytkę na chłonnym papierze.

Aby umyć studzienki reakcyjne, wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 mikrolitrów PBS-TBN do każdej studzienki. Przykryj płytkę świeżym uszczelnieniem foliowym i inkubuj na rozgrzanym wytrząsarce przez dwie minuty, a następnie umieść ją z powrotem na płycie magnetycznej na kolejne dwie minuty. Trzymając płytkę na magnesie, odwróć płytkę, aby wyrzucić supernatant i osusz płytkę na chłonnym papierze.

Po drugim płukaniu PBS-TBN wyjmij płytkę z magnesu i dodaj 100 mikrolitrów świeżej mieszanki odczynników detekcyjnych do każdej studzienki. Po pokryciu płytki foliowym uszczelnieniem z mikropłytki, należy umieścić ją na rozgrzanej wytrząsarce płyt na 15 minut, a następnie na magnetycznym separatorze płytkowym na dwie minuty. Gdy płytka znajduje się na magnesie, wyrzuć mieszaninę odczynników wykrywających, odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady i osuszając ją na chłonnym papierze.

Przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN dwukrotnie, jak pokazano wcześniej, a następnie wyjąć płytkę z magnesu. Dodaj 100 mikrolitrów PBS-TBN do każdego dołka, a następnie przykryj płytkę folią uszczelniającą i wstrząsaj przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zdejmij uszczelkę foliową i przystąp do odczytu 50 mikrolitrów próbki z każdej studzienki w analizatorze przepływu.

Aby odczytać blachę, wybierz menu rozwijane w lewym górnym rogu, przejdź do opcji Konfiguracja blachy, załaduj poprzednio skonfigurowaną blachę i wybierz opcję Uruchom blachę. Wysuń nośnik płyty, wybierając ikonę Wysuń, a następnie załaduj płytę na nośnik płyty i wybierz ikonę Wsuń, aby schować nośnik płyty. Gdy plate carrier wsunie się do analizatora, wybierz ikonę Uruchom, aby rozpocząć odczyt płytki.

W przypadku testu neutralizacji z podwójnym reporterem dodać 50 mikrolitrów mieszanek kulkowych multipleksowych do przypisanych dołków 96-dołkowej niewiążącej płytki mikromiareczkowej, a następnie dodać 25 mikrolitrów po dwa mikrogramy na mililitr ACE2 do każdego dołka i przykryć płytkę uszczelką foliową. Po dwuminutowej inkubacji na rozgrzanym wytrząsarce płytkowej dodać 25 mikrolitrów rozcieńczeń surowicy w skali 1:500 do wyznaczonych dołków. Po dodaniu wszystkich próbek należy przeprowadzić etapy inkubacji, mycia, wykrywania i analizy, jak wykazano wcześniej dla testu serologicznego.

Test anty-IgM sprzężony z barwnikiem reporterowym DyLight 405 przy użyciu próbek surowicy w ciągu pięciu do 60 dni od wystąpienia objawów i próbki surowicy paskowej IgG nie dał wysokiego sygnału dla antygenu kolca. W przypadku próbek o wysokiej intensywności średniej fluorescencji IgM najwyższe sygnały zaobserwowano dla domeny wiążącej receptor i antygenów nukleokapsydu. Podczas gdy miano IgM powinno być podwyższone w niektórych próbkach, obserwowane poziomy intensywności średniej fluorescencji nie przekraczały 140 jednostek MFI.

Co więcej, kulka kontrolna dla IgM nie miała znaczącego zakresu dynamiki dla mediany intensywności fluorescencji przy użyciu DyLight 405 sprzężonego z anty-IgM w porównaniu z fikoerytryną znakowaną anty-IgM w tym samym stężeniu. W przypadku wykrywania IgG, sprzęgany z jaskrawym fioletem miał wyższe sygnały o medianie intensywności fluorescencji niż koniugat streptawidyny z fluorforem Super Bright 436. Jednak intensywność sygnału dla sprzęgania z jaskrawym fioletem różniła się w zależności od miareczkowania ACE2.

Ta fluktuacja sygnału przez sprzęg jaskrawego fioletu w stężeniach ACE2 zakłócała również określanie procentowego hamowania przez ACE2 w całym zakresie mian IgG. W przypadku wykrywania IgM, fikoerytryna anty-IgM wykazywała wyższe sygnały niż te generowane przez anty-ludzką IgM DyLight 549. Podczas określania procentowego hamowania wiązania IgM przez ACE2 wystąpiła niewielka, ale nieistotna różnica między dwoma odczynnikami do wykrywania IgM.

Tak więc jednym z najważniejszych kroków w tej procedurze jest przygotowanie mieszanki koralików multipleksowych z indywidualnych zapasów koralików i upewnienie się, że robisz to poprawnie. Tak więc procedura ta może być również stosowana do pomiaru skuteczności szczepionek i monitorowania odpowiedzi immunologicznej na inne patogeny.