Name: Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 w surowicy pacjentów za pomocą bioreportera HiBiT-RBD. Ta technika łączy wysoką czułość z szybkim czasem odpowiedzi w testach serologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy i dziękujemy za pomoc techniczną Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin i Christiano Tanese De Souza. Dziękujemy również Minie Ghahremani za projekt graficzny. Chcielibyśmy również podziękować wszystkim osobom, które wzięły udział i oddały swoje próbki krwi do tego badania. DWC jest częściowo wspierany przez Wydział i Wydział Medycyny Uniwersytetu w Ottawie.

UWAGA: Opisany poniżej protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi etycznymi zgodnie z kodem protokołu 20200371-01H.
1. Produkcja i ocena bioreportera HiBiT-RBD
<ol>
	<li>Wyprodukowanie wystarczającej ilości bioreportera HiBiT-RBD
	<ol>
		<li>Przygotuj się do hodowli komórkowej
		<ol>
			<li>Przygotuj kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny. Następnie ogrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Włącz komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i użyj 70% v/v etanolu do sterylizacji powierzchni szafki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hoduj linię komórkową.
		<ol>
			<li>Wyjmij linię komórkową z -80 °C lub ciekłego azotu i rozmroź ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
			UWAGA: Odpowiednia linia komórkowa jest łatwa do utrzymania w hodowli, ma wysoką wydajność transfekcji i nadaje się do produkcji białek egzogennych. Do tego protokołu wykorzystano ludzką nerkę embrionalną, komórki HEK293.</li>
			<li>Wymieszać rozmrożone komórki z co najmniej 10 ml kompletnej pożywki, odpipetować zawiesinę komórek na 10 cm szalkę Petriego i zakręcić płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki w naczyniu. Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 85-95%.</li>
			<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem, aż poziom konfluencji osiągnie 80-90%. Przy dużej konfluencji usuń pożywkę, umyj komórki ciepłym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) i dodaj 1 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminowego, aby oderwać komórki od powierzchni. 
			UWAGA: Ogniwa HEK293 można dość łatwo odłączyć. Dlatego etap mycia powinien być wykonywany bardzo delikatnie, aby zapobiec przypadkowemu oderwaniu i utracie komórek.</li>
			<li>Po około 5 minutach przyjrzyj się komórkom pod mikroskopem. Jeśli wszystkie komórki unoszą się na wodzie, dodać co najmniej 4 ml pożywki i przenieść zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dodaj 1 × 106 komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki do transfekcji. 
			UWAGA: Po 24 godzinach komórki powinny być zlewane w 80% lub więcej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfekcja plazmidu HiBiT-RBD
		<ol>
			<li>Użyć 1 μg plazmidu ekspresyjnego HiBiT-RBD z odpowiednim odczynnikiem do transfekcji. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać całkowitą objętość do każdego dołka płytki, kroplami. 
			UWAGA: Postępuj zgodnie z protokołem transfekcji producenta. W tym przypadku mieszaninę (określoną ilość) odczynnika do transfekcji z DMEM dodano do rozcieńczonego plazmidu (1 μg) w DMEM (patrz Tabela materiałów). Użyj markera zawierającego plazmid (np. białko zielonej fluorescencji [GFP]) jako kontrolę w celu monitorowania skuteczności transfekcji.</li>
			<li>Następnego dnia należy zastąpić pożywkę zawierającą mieszaninę transfekcji kompletną pożywką. Dokładnie obserwować kontrolę transfekcji 48 godzin po transfekcji. 
			UWAGA: Jeśli transfekcja była pozytywna i skuteczna (ponad 80% GFP-dodatnich), komórki powinny być gotowe do pobrania bioreportera HiBiT-RBD. Konstrukt zawiera również His-tag, który może być użyty do uzyskania oczyszczonego białka zamiast całkowitego supernatantu.</li>
			<li>Zebrać supernatant w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml. Dodaj 500 μl 1x pasywnego buforu do lizy (PLB) do komórek; Inkubować i wstrząsać płytką przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy komórek. 
			UWAGA: Supernatant i roztwór lizatu można przechowywać w temperaturze -20 °C z niewielką utratą integralności przez co najmniej 6 miesięcy. Według Azad et al.22, reporter jest stabilny w szerokim zakresie pH (4-12) i temperatury (4-42 °C).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena sygnału luminescencyjnego z bioreportera za pomocą testu lucyferazy
	<ol>
		<li>Przygotowanie składników reakcji
		<ol>
			<li>Użyj supernatantu jako źródła bioreportera. 
			UWAGA: Zarówno supernatant, jak i lizat zawierają bioreporter HiBiT-RBD i mogą być używane do testu. Jednakże supernatant jest zalecany jako źródło z przyczyn wyjaśnionych w poniższych uwagach.</li>
			<li>Rozcieńczyć LgBiT i substrat do 1x przed użyciem (stężenie wyjściowe wynosi 100x). 
			UWAGA: Szczegółowe informacje na temat LgBiT można znaleźć w Tabeli Materiałów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Test lucyferazy
		<ol>
			<li>Przenieść 50 μl supernatantu z każdej studzienki lub probówki do płytki 96-dołkowej i dodać 50 μl 1x LgBiT do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Otwórz oprogramowanie luminometru, dodaj 50 μl 1x substratu (furimazyny) do każdej studzienki, umieść płytkę w luminometrze i uruchom oprogramowanie. 
			UWAGA: Dodaj substrat bezpośrednio przed odczytaniem płytki, aby zapobiec zużyciu substratu przez aktywne enzymy przed pomiarem sygnału.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie przeciwciał anty-RBD za pomocą szybkiego i czułego testu
<ol>
	<li>Test wykrywania przeciwciał HiBiT-RBD
	<ol>
		<li>Przygotować bioreporter HiBiT-RBD zgodnie z opisem w sekcji 1.1 protokołu. 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie supernatantu do następującego testu, ponieważ jest on łatwiejszy do zebrania i zawiera dojrzałą glikozylowaną wersję białka. Co więcej, lizat zawiera kilka innych białek, które mogą zakłócać interakcję HiBiT-RBD-przeciwciało.</li>
		<li>Połączyć 50 μl supernatantu zawierającego HiBiT-RBD z 1 μg komercyjnego przeciwciała SARS-CoV-2-RBD w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Do roztworu dodać 20 μl białka wiążącego immunoglobuliny (białka G). Zwiększyć całkowitą objętość do 300 μl, dodając PBS. 
		UWAGA: Całkowitą objętość mieszaniny można zmniejszyć do 150 μL. Nie zaleca się zmniejszania objętości całkowitych, ponieważ może to spowodować nieodpowiednie wymieszanie przeciwciał z bioreporterem.</li>
		<li>Inkubować probówkę (probówki) na wytrząsarce probówkowej lub rotatorze przez 30 minut. Wirować przy 12 000 × g przez 30 s, odrzucić supernatant i przemyć PBS. Powtórz proces trzy razy, aby usunąć wolny HiBiT-RBD. Zawiesić ponownie w 50 μl PBS i przenieść na płytkę 96-dołkową.</li>
		<li>Dodaj 50 μL 1x LgBiT i odczekaj 5 minut. Następnie dodaj 50 μl 1x substratu NanoLuc. Natychmiast odczytaj sygnał luminescencyjny za pomocą luminometru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wysokoprzepustowe wykrywanie przeciwciał specyficznych dla SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta
<ol>
	<li>Przygotować większe ilości bioreportera HiBiT-RBD do testu wysokoprzepustowego, postępując zgodnie z sekcją 1.1 protokołu.</li>
	<li>Połączyć 20 μl białka magnetycznego G z 50 μl supernatantu HiBiT-RBD w studzience z 96-dołkową płytką dla każdej próbki. Dodać 10 μl próbki surowicy do każdego dołka i zwiększyć całkowitą objętość do 150 μl, dodając PBS. 
	UWAGA: Należy stosować zarówno nieswoiste przeciwciała IgG (kontrola ujemna), jak i neutralizujące przeciwciało SARS-CoV-2 (kontrola pozytywna) przy stężeniu 1 μg/ml, jak opisano w kroku 2.1.2. Co więcej, próbki surowicy od zaszczepionych myszy można również ocenić pod kątem przeciwciał. W tym teście próbki surowicy zostały pobrane z Ottawa Hospital General Campus zgodnie z zatwierdzoną procedurą i za świadomą zgodą osób.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut na shakerze w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę na podkładce magnetycznej, aby wytrącić kompleks przeciwciał białkowych. 
	UWAGA: Specyficzna struktura myjki magnetycznej spowoduje wytrącenie kompleksu na bocznych ściankach każdej studzienki.</li>
	<li>Wylej roztwór w środkowej części każdej studzienki i dodaj PBS do mycia. Powtórz krok prania co najmniej trzy razy, aby usunąć nadmiar HiBiT-RBD. Dodać 50 μl 1x PBS i 50 μL 1x LgBiT. Inkubować przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj oprogramowanie luminometru, a następnie dodaj 50 μl 1x podłoża. Umieść płytkę w maszynie, uruchom oprogramowanie i nagraj sygnały. Porównaj sygnały z próbek surowicy, próbek kontrolnych i tła (puste studzienki).</li>
</ol>

<ol><li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+coronavirus+2019+%28COVID-19%29+pandemic+outbreak%3A+A+comprehensive+review+of+the+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Vacunas%22%5BJournal%5D)">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li>
<li>Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021).</li>
<li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe%3A+a+temporal+playbook%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514(2020).</li>
<li>World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021).</li>
<li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li>
<li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design%3A+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215(2020).</li>
<li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li>
<li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li>
<li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li>
<li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li>
<li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19%3A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516(2020).</li>
<li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021).</li>
<li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+bioluminescent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li>
<li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li>
<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27(2016).</li>
<li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP%2FTAZ-TEAD+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596(2019).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+S1+NanoBiT%3A+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).</li>
<li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li>
<li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Rosnąca liczba osób zakażonych wirusem SARS-CoV-2 oraz nieustanne wysiłki na rzecz globalnych szczepień wymagają czułych i szybkich testów serologicznych, które można wykorzystać w badaniach serologicznych na dużą skalę. Ostatnie badania pokazują, że do opracowania takich testów można wykorzystać rozszczepione bioreportery oparte na nanolucyferazie. Niedawno opracowaliśmy HiBiT-RBD bioreporter, aby zaprojektować test, który można wykorzystać do szybkiego i niezawodnego wykrywania przeciwciał specyficznych dla SARS-CoV-2 ...

Niedawne pojawienie się nowego koronawirusa, SARS-CoV21, spowodowało ponad 2 800 000 ofiar śmiertelnych i 128 milionów infekcji na dzień 30 marca 2021roku2. Ze względu na brak wiarygodnej i ugruntowanej procedury leczenia klinicznych SARS-CoV-2 podjęto wiele wysiłków w celu ograniczenia dalszej transmisji wirusa, a co ważniejsze, opracowania skutecznego i solidnego leczenia lub szczepionki3. Do tej pory w badaniach zgłoszonych przez Światową Organizację Zdrowia jest ponad 50 kandydatów na szczepionkę przeciwko COVID-19 class<="xref">4. Wykrycie przeciwciał przeciwko SARS-CoV-2 ma ogromne znaczenie dla określenia długoterminowej stabilności odpowiedzi humoralnej po podaniu szczepionki, a także u ozdrowieńców z COVID-195. Niektóre badania wykazały, że istnieje możliwość, że ozdrowieńcy z SARS-CoV-2 tracą większość przeciwciał wiążących RBD po 1 roku5,6,7,8,9. Konieczne są dalsze badania, aby lepiej zrozumieć trwałą odporność, a bardziej czułe platformy wykrywania przeciwciał mogą pomóc w dalszych pracach. Interesującym i wartym uwagi obszarem badań są również doniesienia o utrzymującej się odporności po łagodnych infekcjach SARS-CoV-2, które sugerują długotrwałą odpowiedź przeciwciał. Szybka i dokładna metoda wykrywania jest niezbędna do monitorowania przeciwciał w surowicach poszczególnych osób, aby uzyskać więcej informacji na temat odporności w populacji.
Podobnie jak inne koronawirusy, SARS-CoV-2 wykorzystuje wystającą glikoproteinę kolca do wiązania się z enzymem konwertującym angiotensynę-2 (ACE2) w celu zainicjowania kaskady zdarzeń, które prowadzą do fuzji błony wirusowej i komórkowej6,7. Kilka badań dowiodło niedawno, że RBD białka Spike odgrywa kluczową rolę w wywoływaniu silnej i swoistej odpowiedzi przeciwciał przeciwko SARS-CoV28,9,10,11. W szczególności korelacje zaobserwowane przez Premkumara i wsp. między mianem przeciwciała wiążącego RBD a siłą neutralizacji SARS-CoV-2 w osoczu pacjentów są zgodne z tym, że RBD jest immunogennym przedziałem struktury wirusa9. Mając to na uwadze, wiele testów diagnostycznych dostępnych do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 jest czasochłonnych i kosztownych, wymaga długotrwałej procedury inkubacji i płukania (test immunoenzymatyczny [ELISA]) lub brakuje im czułości i dokładności (test immunologiczny przepływu bocznego [LFIA])12. W związku z tym ilościowa i szybka komplementarna metoda serologiczna wykrywania przeciwciał pochodzących z COVID-19 o wysokiej czułości, szybkiej odpowiedzi i stosunkowo niskich kosztach zaspokoiłaby potrzebę wiarygodnego testu serologicznego do nadzoru epidemiologicznego nad SARS-CoV-2.
Podsumowując, ograniczenia obecnych testów serologicznych skłoniły do zbadania bioluminescencyjnego systemu raportowania jako potencjalnego czynnika diagnostycznego w przyszłych badaniach serologicznych. Bioluminescencja to naturalnie występująca reakcja enzym/substrat, z emisją światła. Lucyferazy Nanoluc jest najmniejszym (19 kDa), ale najjaśniejszym systemem w porównaniu do lucyferazy Renilla i świetlika (odpowiednio 36 kDa i 61 kDa)13,14. Co więcej, Nanoluc ma najwyższy stosunek sygnału do szumu i stabilność spośród wcześniej wymienionych systemów. Wysoka intensywność sygnału Nanoluc wspiera detekcję nawet bardzo małych ilości fuzji reporterowych15. Technologia binarna Nanoluc (NanoBiT) to podzielona wersja systemu Nanoluc, która składa się z dwóch segmentów: małego BiT (11 aminokwasów; SmBiT) i duży BiT (LgBiT) o stosunkowo niskim powinowactwie oddziaływań (KD = 190 μM ), tworząc kompleks luminescencyjny16. NanoBiT jest szeroko stosowany w różnych badaniach obejmujących identyfikację interakcji białko-białko15,17,18,19 i komórkowych szlaków sygnałowych11,20,21.
Niedawno wprowadzono inny mały peptyd o wyraźnie wyższym powinowactwie do LgBiT (KD = 0,7 nM), a mianowicie system HiBiT Nano-Glo, w miejsce SmBiT. Wysokie powinowactwo i silny sygnał testu Nano-Glo "dodaj-wymieszaj-odczyt" sprawia, że HiBiT jest odpowiednim, ilościowym, luminescencyjnym znacznikiem peptydowym. W tym podejściu znacznik HiBiT jest dołączany do białka docelowego poprzez opracowanie konstruktu narzucającego minimalną interferencję strukturalną. Fuzja białka HiBiT aktywnie wiązałaby się z odpowiednikiem LgBiT, wytwarzając wysoce aktywny enzym lucyferazy do generowania wykrywalnej bioluminescencji w obecności odczynników detekcyjnych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Podobnie opracowaliśmy system oparty na HiBiT Nano-Glo do łatwego pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy osób ozdrowieńców SARS-CoV-2, a ostatnio opracowaliśmy RBD SARS-CoV-2 znakowany HiBiT. W artykule opisano protokół wytwarzania bioreportera HiBiT-RBD przy użyciu standardowych procedur i sprzętu laboratoryjnego oraz pokazano, w jaki sposób ten bioreporter może być wykorzystany w szybkim i skutecznym teście do wykrywania przeciwciał RBD skierowanych przeciwko SARS-CoV-2.

<table><tbody><tr><td>5x Pasywny bufor do lizy</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Bio-Plex Ręczna myjka magnetyczna</td><td>Bio-Rad</td><td>171020100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ml</td><td></td></tr><tr><td>System testowy lucyferazy Dual-Glo</td> Zestaw <td>Promega</td><td>E2940</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid HiBiT-RBD</td><td></td><td></td><td>gacggatcgggagatcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgttgg aggtcgctgggtggcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgcttcgcgatgccagatatacgc gttgacattgattattgactagatgactagttatagt aatcaattacggggtcatgccatgccatcaa atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatgctattaccatggtgatgcggtt ggcagtacatcaatgggcgt ggcagtacatcaatgggcgtgggtg actcacggatttccaagtctccaccccatg acgtcaatggggaccaatc aacgggactttccaatgtcgtccatcac ctaactagagaacccactgcttactggctctcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTCTCTCTCTCTCTCTCTC TGGTGACtctggct agcggcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAGGACC ACGACGGTGACTACAGGACCA CGACATCGACTACAGGACACAGGACAC GACGACAAGggcagcggctctccca gcagcggaggcgggcacaaatctgtg cccatcggcggcaaatctgtg cccattcgggggaggtaacgccaccagac ttgccagcgtgtatgcctggaaccaagaga atctctaattgcgtgggactatagcgtgctgcttgt gctatggcgtgtccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtacggccgactttttgt gatcaggggggatgaggcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcccctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggac cggctgtacagaaattccatcatsc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtgctgtgctg cacgacctgcaaccgtggacc gaggggggccacatgctgctgcatc atcaccatcatcatcaccgatag cggccgctcaccaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagagccatctgttgtccgtg ccttgacctctcacccac tgtcctcctaaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgggg ggtggggtgg ggattggggggaccgaaggaa agaaccaggggggctctctagggggtatcccca cgcgccctctagcggcattaagcgcggcg ggtgtggtgctacgcgcctac acttgccagcgctagcgcctcctttcg ctttcttcgccacgtgccccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctctt tccccctcta gggttccgattgggcttha gggttccgatttagtgctttacggcaccgaccgacc ccaaaaaacttgattagggt gtgggccatcgccatgcccgtgtct cttgt cttgtctctcgtt***TcratrattGCTTTTTTGGtrattGCTCTCT atttaacatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtggaaagtccccc caggctccccagcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggcccaggggcaggcaagg atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccccccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccccc ccctaactccgcccagttccccattctcccc ccatgggactatttatgcagaggc cgaggcccttttatgcagaggc cgagggcctctgccatgcaggacgagggtc. cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccgggcttgggcttggctattcgtctatgcatccatgct gatgccgccgttccgtgcagggg cgcccggttgtcaagaccgacctgtccgggg tgccctgaatgaactgcaggacgaggggcg cggctatcgtggacgacggggcgtgt tgcgcagctgtgccatggctggcgtggcgtg. cggccatgctgcaatggcaatgaactgcatgccatggcggcg cggctatcgtgcgtgc tgcccatccatggccatgccatgcgccggcgcggg cgggcatggcatgcgcg agcgagcacgtactcggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccgaactgttcgccaaccgccagggcccgg ggctcaaggcgcgcatgcgcggggagg atctcgtcgtgacccatgcatggcctgcttg ccgaatatcatggtggaatgggctttt ctggattcatcgactgtgggt ggcgggt ggcgggctatcaggacatagcgttggctgctgaagggctctgcgcgggcgcggcgcgtgc ttctatcgccttcgtgackackcgackcggackcggackackggcackcggccgaatgggcctggctgg. tccaccgccccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccggggggcggggatga tcctccagcgcggggaggcggagggggaggggagt tcttcccccaccaccaccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaaagcaatagcatcacaa atttcaaataaagcatttcactgcatt ctagttgtggtccaactcatgtatgtataccatcatgtataccatgtcgacccgaccttctc ctgtgtgaaatcatggtcatagctctc ctgtgtgaaattgtccaaattccac aacatacgagccggaagcataa gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcgggcgtgctcactgactgactc gctgcgcctcggtcggcggcggt atcagctcactcaaaggtggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaggaaagaa catgtgagcaaggggagagcaaggggag gaaccgtagggggcgtgcgttt tccataggctccgcctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaaaatcgaccatcacaaatcgaccatcaaaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctctcgtgcctgccgcctctgcccgt tttctcccttcgggaagcggcgctcat agctcacgctctgtaggtatcagtggtggtgtagtag: gtcgttcgctccaagctgggctgtgcacgaaa ccccccgtgcgggaccgcacgaa ccccccgtgccgtcttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcaggccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagtgtggtgtaact acggctacactagaagggtggggtaact acggctacactagaagaagaacagattttatc tgcgctgaagaccagttcgga aagagttggtggcaaaca ccaccgctgggggtgca ctcaagatcctttgattttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaggatct tcacctagatccttttaaatgaaatgaagtt ttaaatcaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacacagttactaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccgtcgtgtagataactac gatacggctccccagtg ctgcaatgatgatggccatcccagtg ctgcaatgataccgcaccacc ggctccagatttattatcaataaaccaggggagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattttt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgccatggtggtgg cttcattcagagctcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaag cggttagctccttcgtgtggatcgttgtccagaagtaagttgggcagtccaagtaagttgggcagtgttatccatgtt tatggcagcactcatcatgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgctctcgcgtgackacka gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttttcaccaggcgtcttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatcttcctttttcaat attattgaagcatcatcttcctttttcaat attattgaagcattattattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaagggcgca catttccccgaagtgccacctggtc</td></tr><tr><td>LgBiT</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td></td></tr><tr><td>penicylina Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Pierce Protein G Kulki magnetyczne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88848</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet Odczynnik do transfekcji DNA in vitro</td><td>Signagen</td><td>SL100688.5</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało neutralizujące kolce, mysz Mab</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>96-dołkowy czytnik płytek</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2520056</td><td>0,25%</td></tr></tbody></table>

wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor sars-cov-2 za pomocą bioreportera opartego na hibit

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Pojawienie się pandemii COVID-19 zwiększyło zapotrzebowanie na lepsze metody wykrywania serologicznego w celu określenia epidemiologicznego wpływu koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Rosnąca liczba zakażeń SARS-CoV-2 rodzi potrzebę lepszych testów wykrywania przeciwciał. Obecne metody wykrywania przeciwciał obniżają czułość ze względu na szybkość lub są czułe, ale czasochłonne. Duża część przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 jest ukierunkowana na domenę wiążącą receptor (RBD), jeden z głównych przedziałów immunogennych SARS-CoV-2. Niedawno zaprojektowaliśmy i opracowaliśmy wysoce czuły, znakowany bioluminescencyjnie RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2. Poniższy tekst opisuje procedurę wytwarzania kompleksu HiBiT-RBD oraz szybki test do oceny obecności przeciwciał ukierunkowanych na RBD za pomocą tego narzędzia. Ze względu na trwałość produktu białkowego HiBiT-RBD w szerokim zakresie temperatur oraz krótszą procedurę eksperymentalną, którą można zakończyć w ciągu 1 godziny, protokół można uznać za bardziej efektywną alternatywę do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta.

Sygnały zarówno z lizatu komórkowego zawierającego HiBit-RBD, jak i z supernatantu przetransfekowanych komórek zostały zarejestrowane (Rycina 2), aby ocenić odpowiednie źródło białka. HiBiT-RBD oraz LgBit były stosowane osobno jako kontrole; dane wykazały niskie tło w porównaniu do silnego sygnału uzyskanego po połączeniu obu części. Zatem oddziaływanie HiBiT-RBD z LgBiT jest niezbędne do wytworzenia aktywnego enzymu odpowiedzialnego za trawienie substratu i aktywność bioluminescencyjną (<st...

Opisany protokół opisuje procedurę wytwarzania kompleksu białkowego HiBiT wiążącego receptor domeny oraz jego zastosowanie do szybkiego i czułego wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2.

Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Moje laboratorium zajmuje się badaniami nad COVID-19, a ostatnio opracowaliśmy nowatorski test, który pozwolił nam szybko i dokładnie wykryć przeciwciała SARS-CoV-2. Protokół ten określa wysokoprzepustowy test do wykrywania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta, co ma kluczowe znaczenie biorąc pod uwagę obecną pandemię. Większość obecnych testów serologicznych poświęca szybkość na rzecz czułości lub odwrotnie.Z naszych danych wynika, że nasz test jest zarówno czuły, jak i ma szybki czas reakcji. Aby wytworzyć wystarczającą ilość bioreportera o wysokiej zawartości HiBiT-RBD, należy rozpocząć od przygotowania do hodowli komórkowej. Najpierw przygotuj kompletną zmodyfikowaną pożywkę orła firmy Dulbecco, zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny.Następnie podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Włącz szafkę bezpieczeństwa biologicznego i użyj 70% etanolu do sterylizacji powierzchni szafki. Aby wyhodować linię komórkową, wyjmij ją z minus 80 stopni Celsjusza lub ciekłego azotu i rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wymieszaj rozmrożone komórki z co najmniej 10 mililitrami kompletnego podłoża. Odpipetować zawiesinę komórek na 15-centymetrową szalkę Petriego i zakręcić płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności od 85 do 95%.Obserwuj komórki pod mikroskopem, aż poziom konfluencji osiągnie 80 do 90% Przy wysokim zbieganiu usuń pożywkę, umyj komórki ciepłym PBS i dodaj od trzech do pięciu mililitrów 0,25% trypsyny-EDTA, aby oderwać komórki od powierzchni. Po około pięciu minutach przyjrzyj się komórkom pod mikroskopem. Jeśli wszystkie komórki unoszą się na wodzie, dodaj co najmniej cztery mililitry pożywki i przenieś zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki.Policz komórki za pomocą hemocytometru i dodaj milion komórek do każdego dołka sześciodołkowej płytki w celu transfekcji. Aby wykonać transfekcję plazmidu HiBiT-RBD, należy użyć jednego mikrograma plazmidu ekspresyjnego HiBiT-RBD z odpowiednim odczynnikiem do transfekcji. Inkubować przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie kroplami dodawać całkowitą objętość do każdej studzienki płytki.Następnego dnia należy zastąpić pożywkę zawierającą mieszaninę transfekcji kompletną pożywką. Dokładnie obserwować kontrolę transfekcji 48 godzin po transfekcji. Zbierz supernatant w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj 500 mikrolitrów 1X pasywnego buforu do lizy lub PLB do komórek, a następnie inkubuj i potrząsaj płytką przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy komórek. Następnie, aby ocenić sygnał luminescencji z bioreportera za pomocą testu lucyferazy, najpierw przygotuj składniki reakcji i użyj supernatantu jako źródła bioreportera. Rozcieńczyć duży BiT i podłoże do 1X przed użyciem.Przenieś 50 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki lub probówki do 96-dołkowej płytki i dodaj 50 mikrolitrów 1X dużego BiT do każdej studzienki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Otwórz oprogramowanie luminometru, dodaj 50 mikrolitrów substratu 1X do każdej studzienki, umieść płytkę w luminometrze i uruchom oprogramowanie.W celu wykonania testu wykrywania przeciwciał HiBiT-RBD należy przygotować bioreporter HiBiT-RBD zgodnie z wcześniejszym opisem i połączyć 50 mikrolitrów supernatantu zawierającego HiBiT-RBD z jednym mikrogramem komercyjnego przeciwciała RBD SARS-CoV-2 w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Do roztworu dodać 20 mikrolitrów białka wiążącego immunoglobuliny lub białka G. Zwiększ całkowitą objętość do 300 mikrolitrów, dodając PBS.Inkubować probówki na wytrząsarce probówkowej lub rotatorze przez 30 minut. Wirować przy 12 000 G przez 30 sekund. Następnie wyrzucić supernatant i przemyć PBS.Powtórz proces trzy razy, aby usunąć wolny HiBiT-RBD. Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach PBS i przenieść je na 96-dołkową płytkę. Dodaj 50 mikrolitrów 1X dużego BiT i odczekaj pięć minut.Następnie dodaj 50 mikrolitrów substratu 1X NanoLuc. Natychmiast odczytaj sygnał luminescencji za pomocą luminometru. Przygotuj większe ilości bioreportera HiBiT-RBD do wysokoprzepustowego testu i połącz 20 mikrolitrów magnetycznego białka G z 50 mikrolitrami supernatantu HiBiT-RBD w każdym dołku 96-dołkowej płytki dla każdej próbki.Dodaj 10 mikrolitrów próbki surowicy do każdego dołka i doprowadź całkowitą objętość do 150 mikrolitrów, dodając PBS. Inkubować przez 30 minut na shakerze w temperaturze pokojowej. Następnie umieść płytkę na podkładce magnetycznej, aby wytrącić kompleks przeciwciał Protein G.Wylej roztwór w środkowej części każdej studzienki i dodaj PBS do mycia. Powtórz krok prania co najmniej trzy razy, aby usunąć nadmiar HiBiT-RBD. Dodaj 50 mikrolitrów 1X PBS i 50 mikrolitrów 1X dużego BiT i inkubuj przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej.Przygotuj oprogramowanie luminometru. Następnie dodaj 50 mikrolitrów substratu 1X. Umieść płytkę w maszynie, uruchom oprogramowanie i zarejestruj sygnały.Porównaj sygnały z próbek surowicy, próbek kontrolnych i sygnału tła z pustych studzienek. Zarejestrowano sygnały zarówno z HiBiT-RBD zawierającego lizat komórkowy, jak i supernatant transfekowanych komórek w celu oceny odpowiedniego źródła białka. Dane wykazały słabe tło w porównaniu z silnym sygnałem, gdy obie części były połączone.Dodatek białka G pomaga w wytrącaniu przeciwciał. Test wykorzystano do porównania sygnału z komercyjnego przeciwciała neutralizującego SARS-CoV-2 z kontrolną IgG. Specyficzny sygnał przeciwciała był silny, podczas gdy przeciwciało kontrolne miało poziom zbliżony do luminescencyjnego tła.Do szczepienia myszy zastosowano rekombinowany atenuowany onkolityczny wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej lub VSV z mutacją w pozycji 51 białka M eksprymującego egzogenne RBD. Surowica pobrana od zaszczepionych myszy wytwarzała silny sygnał w porównaniu z brakiem sygnału u myszy, którym wstrzyknięto kontrolny VSV. Protokół ten może być stosowany do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta.Etapy płukania po inkubacji z białkiem G mają kluczowe znaczenie dla redukcji tła. Ponadto ważne jest, aby dodać podłoże tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć utraty sygnału. Dzięki kilku dodatkowym krokom optymalizacji, ten sam test może być używany do analizy próbek krwi i może być skuteczną metodą oznaczania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w próbkach krwi pacjentów.

detection-sars-cov-2-receptor-binding-domain-antibody-using-hibit

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

W tym filmie pokazujemy test oparty na systemie bioreporterowym HiBit-RBD do wykrywania przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2. System ten celuje w domenę RBD wirusa za pomocą bioluminescencyjnego systemu reporterowego zawierającego HiBiT połączony z domeną RBD.

Test bioreporterowy: czuła technika wykorzystująca bioluminescencyjny system reporterowy do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Ten artykuł opisuje wygodną metodę monitorowania dynamicznych zmian w mianach przeciwciał dla dwóch izotypów immunoglobulin jednocześnie (IgA, IgM lub IgG) wynikających z odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Ten "Multianalitowy panel odpowiedzi immunologicznej Covid-19" wykorzystuje trzy pośrednie testy immunologiczne zbudowane na kodowanych mikrosferach, które są odczytywane za pomocą przepływowego czytnika multipleksowego z funkcją "dwukanałową".

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Poznaj metodę wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 w surowicy pacjentów za pomocą bioreportera HiBiT-RBD. Ta technika łączy wysoką czułość z szybkim czasem odpowiedzi w testach serologicznych.

Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT

Przeglądaj więcej filmów