Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT

Moje laboratorium zajmuje się badaniami nad COVID-19, a ostatnio opracowaliśmy nowatorski test, który pozwolił nam szybko i dokładnie wykryć przeciwciała SARS-CoV-2. Protokół ten określa wysokoprzepustowy test do wykrywania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta, co ma kluczowe znaczenie biorąc pod uwagę obecną pandemię. Większość obecnych testów serologicznych poświęca szybkość na rzecz czułości lub odwrotnie.

Z naszych danych wynika, że nasz test jest zarówno czuły, jak i ma szybki czas reakcji. Aby wytworzyć wystarczającą ilość bioreportera o wysokiej zawartości HiBiT-RBD, należy rozpocząć od przygotowania do hodowli komórkowej. Najpierw przygotuj kompletną zmodyfikowaną pożywkę orła firmy Dulbecco, zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny.

Następnie podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Włącz szafkę bezpieczeństwa biologicznego i użyj 70% etanolu do sterylizacji powierzchni szafki. Aby wyhodować linię komórkową, wyjmij ją z minus 80 stopni Celsjusza lub ciekłego azotu i rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wymieszaj rozmrożone komórki z co najmniej 10 mililitrami kompletnego podłoża. Odpipetować zawiesinę komórek na 15-centymetrową szalkę Petriego i zakręcić płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności od 85 do 95%.

Obserwuj komórki pod mikroskopem, aż poziom konfluencji osiągnie 80 do 90% Przy wysokim zbieganiu usuń pożywkę, umyj komórki ciepłym PBS i dodaj od trzech do pięciu mililitrów 0,25% trypsyny-EDTA, aby oderwać komórki od powierzchni. Po około pięciu minutach przyjrzyj się komórkom pod mikroskopem. Jeśli wszystkie komórki unoszą się na wodzie, dodaj co najmniej cztery mililitry pożywki i przenieś zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki.

Policz komórki za pomocą hemocytometru i dodaj milion komórek do każdego dołka sześciodołkowej płytki w celu transfekcji. Aby wykonać transfekcję plazmidu HiBiT-RBD, należy użyć jednego mikrograma plazmidu ekspresyjnego HiBiT-RBD z odpowiednim odczynnikiem do transfekcji. Inkubować przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie kroplami dodawać całkowitą objętość do każdej studzienki płytki.

Następnego dnia należy zastąpić pożywkę zawierającą mieszaninę transfekcji kompletną pożywką. Dokładnie obserwować kontrolę transfekcji 48 godzin po transfekcji. Zbierz supernatant w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj 500 mikrolitrów 1X pasywnego buforu do lizy lub PLB do komórek, a następnie inkubuj i potrząsaj płytką przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy komórek. Następnie, aby ocenić sygnał luminescencji z bioreportera za pomocą testu lucyferazy, najpierw przygotuj składniki reakcji i użyj supernatantu jako źródła bioreportera. Rozcieńczyć duży BiT i podłoże do 1X przed użyciem.

Przenieś 50 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki lub probówki do 96-dołkowej płytki i dodaj 50 mikrolitrów 1X dużego BiT do każdej studzienki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Otwórz oprogramowanie luminometru, dodaj 50 mikrolitrów substratu 1X do każdej studzienki, umieść płytkę w luminometrze i uruchom oprogramowanie.

W celu wykonania testu wykrywania przeciwciał HiBiT-RBD należy przygotować bioreporter HiBiT-RBD zgodnie z wcześniejszym opisem i połączyć 50 mikrolitrów supernatantu zawierającego HiBiT-RBD z jednym mikrogramem komercyjnego przeciwciała RBD SARS-CoV-2 w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Do roztworu dodać 20 mikrolitrów białka wiążącego immunoglobuliny lub białka G. Zwiększ całkowitą objętość do 300 mikrolitrów, dodając PBS.

Inkubować probówki na wytrząsarce probówkowej lub rotatorze przez 30 minut. Wirować przy 12 000 G przez 30 sekund. Następnie wyrzucić supernatant i przemyć PBS.

Powtórz proces trzy razy, aby usunąć wolny HiBiT-RBD. Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach PBS i przenieść je na 96-dołkową płytkę. Dodaj 50 mikrolitrów 1X dużego BiT i odczekaj pięć minut.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów substratu 1X NanoLuc. Natychmiast odczytaj sygnał luminescencji za pomocą luminometru. Przygotuj większe ilości bioreportera HiBiT-RBD do wysokoprzepustowego testu i połącz 20 mikrolitrów magnetycznego białka G z 50 mikrolitrami supernatantu HiBiT-RBD w każdym dołku 96-dołkowej płytki dla każdej próbki.

Dodaj 10 mikrolitrów próbki surowicy do każdego dołka i doprowadź całkowitą objętość do 150 mikrolitrów, dodając PBS. Inkubować przez 30 minut na shakerze w temperaturze pokojowej. Następnie umieść płytkę na podkładce magnetycznej, aby wytrącić kompleks przeciwciał Protein G.

Wylej roztwór w środkowej części każdej studzienki i dodaj PBS do mycia. Powtórz krok prania co najmniej trzy razy, aby usunąć nadmiar HiBiT-RBD. Dodaj 50 mikrolitrów 1X PBS i 50 mikrolitrów 1X dużego BiT i inkubuj przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej.

Przygotuj oprogramowanie luminometru. Następnie dodaj 50 mikrolitrów substratu 1X. Umieść płytkę w maszynie, uruchom oprogramowanie i zarejestruj sygnały.

Porównaj sygnały z próbek surowicy, próbek kontrolnych i sygnału tła z pustych studzienek. Zarejestrowano sygnały zarówno z HiBiT-RBD zawierającego lizat komórkowy, jak i supernatant transfekowanych komórek w celu oceny odpowiedniego źródła białka. Dane wykazały słabe tło w porównaniu z silnym sygnałem, gdy obie części były połączone.

Dodatek białka G pomaga w wytrącaniu przeciwciał. Test wykorzystano do porównania sygnału z komercyjnego przeciwciała neutralizującego SARS-CoV-2 z kontrolną IgG. Specyficzny sygnał przeciwciała był silny, podczas gdy przeciwciało kontrolne miało poziom zbliżony do luminescencyjnego tła.

Do szczepienia myszy zastosowano rekombinowany atenuowany onkolityczny wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej lub VSV z mutacją w pozycji 51 białka M eksprymującego egzogenne RBD. Surowica pobrana od zaszczepionych myszy wytwarzała silny sygnał w porównaniu z brakiem sygnału u myszy, którym wstrzyknięto kontrolny VSV. Protokół ten może być stosowany do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta.

Etapy płukania po inkubacji z białkiem G mają kluczowe znaczenie dla redukcji tła. Ponadto ważne jest, aby dodać podłoże tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć utraty sygnału. Dzięki kilku dodatkowym krokom optymalizacji, ten sam test może być używany do analizy próbek krwi i może być skuteczną metodą oznaczania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w próbkach krwi pacjentów.