Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej
November 20th, 2021
Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił in situ (DFS). BFP można wykorzystać do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywe komórki. Protokół ten przedstawia analizę stałej sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.
Ten film opisuje krok po kroku procedury dotyczące używania sondy siły biomembrany (BFP) do pomiaru stałej sprężystości molekularnej. W sondzie siłowej BFP pojawił się ostatnio na natywnej powierzchni komórki lub w analizie dynamicznej spektroskopii sił SITU. Głównym celem tej techniki jest pomiar genetyki wiązania pojedynczych cząsteczek.
Ta procedura analizy danych jest prostą, ale potężną wiadomością i dostarcza informacji mechanicznych, w szczególności siły dynamicznej i stanu zapalnego cząsteczek wyrażających błonę komórkową. Podczas cyklu eksperymentu BFP, mikrobiom sondy zakład z krwinką czerwoną i spadkiem, komórka docelowa i wiązanie molekularne receptora liganda między sondą a celem można uznać za system mózgowy połączony szeregowo. Opierając się na prawie Hooke'a, odwrotność całkowitej stałej sprężystości układu sprężyn połączonych szeregowo jest równa sumie odwrotnej stałej sprężystości każdego pojedynczego składnika, jak pokazuje równanie.
Stała sprężystości krwinek czerwonych jest obliczana na podstawie ruchu zdarzeń, który jest zależny od promienia mikropipety sondy w otworze. Czerwona krwinka, okrągły obszar kontaktu między krwinką czerwoną a spadkiem oraz ciśnienie zasysające mikropipety. Dane drogowe BFP są uzyskiwane przez domowej roboty wirtualny instrument z widokiem z lewej strony, który steruje ruchem docelowej mikropipety za pomocą translatora PAs.
Pełny cykl dotykowy PFP składa się z pięciu etapów. Zbliżenie.Uderzenie.Kontakt. Wycofaj się i odłącz. Na początku naprężenie sprawia, że pozycja Robusto APICS jest oznaczona jako X równa się 0 w kolorze czarnym.
Cel jest następnie napędzany przez kawałek lub tłumacza, aby uderzyć i ścisnąć robusto, aby spowodować negatywny ruch spadkowy. Zaznaczasz, że jest to X mniejsze od zera w czerwonej linii przerywanej. W fazie wycofywania czerwony wierzchołek busto przesuwa się z pozycji X mniejszej od zera z powrotem do pozycji X równej zeru, co jest określane jako faza ściskania.
Jeśli powstanie wiązanie między kompleksem cząsteczek receptora liganda, czerwona krwinka będzie się dalej różnić od innych dodatnich kierunków. Ten okres X większy od zera jest określany jako faza rozciągania etapu wycofywania. Etap wycofywania jest najbardziej krytyczną częścią do określenia stałej sprężystości cząsteczki wiązania.
Zbieraj dane drogowe o sile w czasie za pomocą platformy akwizycji danych BSP. Każdy eksperyment zwykle rejestruje od 50 do 200 cykli dotykowych, Otwórz oprogramowanie do analizy danych PFP. Kliknij żółtą ikonę folderu i wybierz odpowiedni plik danych wiersza, klikając je dwukrotnie.
Jesteśmy w programie. Następnie kliknij przyciski strzałek w górę i w dół, aby przełączać się między wydarzeniami. Używanie kryteriów wykluczania wartości odstających w celu odsiewania nieprawidłowych zdarzeń.
Wybierz typ danych eksportowania, który jest wymuszany do formatu czasu, i wybierz odpowiedni zakres czasu stanu. Kliknij przycisk eksportu danych wykresu. Wyeksportowane dane są domyślnie zapisywane jako plik tekstowy.
Ten plik tekstowy zawiera dwie kolumny danych. Jest to pierwsza kolumna reprezentująca czas tatusiów, a druga kolumna reprezentująca odpowiednią siłę w każdym punkcie czasowym. Wykreśl krzywą siły w funkcji czasu za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych, aby uzyskać krzywą wymuszoną w funkcji przemieszczenia.
Pomnóż wartość czasu każdego punktu danych przez ruch PSO Willow Steel. Wyzeruj pierwszy punkt danych, odejmując najmniejszą wartość przemieszczenia od każdego punktu danych. Ta transformacja pozioma nie ma wpływu na późniejsze obliczenia stałej sprężystości.
Na krzywej siły w funkcji przemieszczenia dwie odrębne grupy aktorów różniły się, jeśli można zidentyfikować nowe nachylenie siły. Każdy z nich reprezentuje fazę ściskania i fazę 10 stylów. Dopasuj linię regresji do każdej grupy danych.
Linia o bardziej stromym nachyleniu reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie sprężarki oznaczoną jako K1. A linia, która była najmniejsza u góry, reprezentuje linię w tej 10 fazie stylu oznaczoną jako K2.As wspomniałem, całkowita stała sprężystości jest odwrotnością syna szeregowej stałej sprężystości każdego składnika. Podczas fazy ściskania w trybie dudnienia do komórki wiązanie molekularne nie jest rozciągane, dlatego stała sprężystości wiązania molekularnego nie jest brana pod uwagę. Stała sprężystości komórki docelowej jest opisana jako wyświetlane równanie, gdzie K1 reprezentuje całkowitą stałą sprężystości podczas fazy sprężarki.
W fazie 10 stylów trybu beat to sell, całkowita stała sprężystości jest słońcem odwrotnej stałej sprężystości wiązania molekularnego czerwonych krwinek. I komórkę docelową, użyj wyświetlonego równania, aby obliczyć stałą sprężystości wiązania molekularnego, która K2 reprezentuje całkowitą stałą sprężystości. Czytasz fazę 10 zatrzymania.
W trybie od uderzenia do uderzenia, ponieważ deformacja B jest pomijalna, termin opisujący odwrotność stałej sprężyny komórki docelowej zbliża się do zera, dlatego całkowita stała sprężystości w fazie sprężarki jest równoważna stałej sprężystości czerwonych krwinek pokazanej jako poniższe równanie. W fazie rozciągania stałą sprężystości wiązania molekularnego można obliczyć, odejmując wpływ czerwonej krwinki pokazanej jako poniższe równanie. Zbierz stałe sprężystości położenia B całkującego boczny wiatr, kompleksu Beta 3, komórki K562 i kompleksu układu B-beta trójki całkującej Febrifugine, oblicz średnią i odchylenie standardowe wyprowadzonych stałych sprężystości w wybranej skali Newtona lub nanometrów.
Teraz powinieneś lepiej zrozumieć, jakie są wymagania dotyczące pomiaru i stałej sprężystości na podstawie danych VFD. Należy zauważyć różnice między trybem beat to cell a trybem beat to beat. Różne cząsteczki prezentujące usługę będą miały różne mechanizmy obronne przed miarą stałej sprężystości.
Podsumowując, ta procedura krok po kroku opisuje, jak przeprowadzić analizę stałej sprężystości sprężystości molekularnej przy użyciu BFP. Przewidujemy, że w przyszłości zostaną podjęte wysiłki w celu zautomatyzowania i zintegrowania akwizycji danych BFP i analizy DFS w jednym programie do odpoczynku komputera. Dzięki temu cała analiza danych operacyjnych BFP jest bardziej przyjazna dla użytkownika i bardziej wydajna.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Biomembrane Force Probe (BFP) to dynamiczna technika spektroskopii sił służąca do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywych komórkach. Niniejszy protokół opisuje analizę stałych sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Dynamiczna spektroskopia sił
- Oddziaływania molekularne
- Mechanika błony komórkowej
Tło
- Technika BFP pomiara pojedyncze wiązania molekularne.
- Dostarcza informacji mechanicznych o błonach komórkowych.
- Analiza opiera się na prawie Hooke'a.
- Obejmuję interakcje między sondami a komórkami docelowymi.
Cel badania
- Pomiary stałych sprężystości molekularnych.
- Analiza dynamiki wiązań molekularnych.
- Zgłębianie rozumienia oddziaływań błony komórkowej.
Stosowane metody
- Zastosowanie Biomembrane Force Probe (BFP).
- Analiza dynamicznej spektroskopii sił in situ.
- Analiza danych odnośnie oddziaływań molekularnych.
- Zastosowanie prawa Hooke'a do obliczenia stałej sprężystości.
Główne wyniki
- Sukcesywne pomiary stałych sprężystości molekularnych.
- Wgląd w dynamikę wiązań molekularnych.
- Demonstracja skuteczności BFP w analizie żywych komórek.
- Walidacja modeli teoretycznych poprzez dane eksperymentalne.
Wnioski
- BFP jest potężnym narzędziem do badania oddziaływań molekularnych.
- Technika zwiększa nasze zrozumienie mechaniki komórkowej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szersze badania biologiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Measuring molecular spring constants via biomembrane force probe spectroscopy provides quantitative mechanical insights into ligand-receptor interactions, supporting target validation by characterizing bond stability and conformational dynamics. This approach enables mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular mechanics to functional signaling, informing go/no-go decisions before compound screening. The method enhances predictive confidence in target selection by revealing force-dependent binding behaviors that correlate with physiological mechanosensing pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying bond stiffness and rupture forces under physiological loading rates.
- Operational Value: Enables direct comparison of molecular variants or mutants to identify stabilizing mutations that prolong bond lifetime.
- Scientific Value: Clarifies force-dependent conformational changes in receptors, supporting allosteric mechanism validation.
- Operational Value: Provides benchmark data for structure-guided design of therapeutics with optimized mechanical resilience.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-displacement curves that serve as orthogonal readouts for binding affinity in assay triage.
- Operational Value: Standardizes spring constant measurements across replicates using outlier exclusion criteria and regression fitting.
- Scientific Value: Distinguishes specific from nonspecific interactions based on tensile phase slope characteristics in bead-bead mode.
- Operational Value: Enables high-throughput collection of 50-200 touch cycles per experiment for robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular spring constants to cellular mechanosensing outputs, informing pathophysiological relevance in disease models.
- Operational Value: Supports continuity from purified systems to native cell surfaces via bead-cell and bead-bead modes.
- Scientific Value: Measures cell contribution to total spring constant, deconvolving target-specific molecular mechanics from probe or cell artifacts.
- Operational Value: Facilitates cross-platform comparison of molecular mechanics using standardized Hooke's law-based analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanical phenotyping of targets after initial binding confirmation but before large-scale screening, helping prioritize targets with favorable force-stability profiles.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring how molecular bonds respond to mechanical perturbation, revealing catch-bond or slip-bond behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spring constant outputs that enable rank-ordering of ligand variants or therapeutic candidates.
- Analytics: Employs linear regression on force-displacement data to derive spring constants (K1, K2) from compressive and tensile phases, enabling condition comparison.
- Translational Research: Links molecular mechanics to cell-scale responses by measuring target cell contribution in bead-cell mode, supporting mechanistic continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nanotool for mechanical phenotyping across diverse receptor-ligand systems, reducing revalidation effort in follow-up campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, quantitative measures of bond elasticity and force-dependent kinetics.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized data acquisition, outlier filtering, and exportable force-time datasets for external validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying mechanically fragile targets early, reducing investment in high-risk pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on bond stability metrics, complementing traditional affinity and selectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dynamic force spectroscopy, micropipette manipulation, and force calibration using red blood cell standards.
- Depends on custom-built BFP setup with piezoelectric translators and homemade virtual instrumentation for precise displacement control.
- Necessitates cross-team standardization of outlier criteria, time-range selection, and regression fitting protocols across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-cell to bead-bead mode to isolate molecular contributions from cellular mechanics.
- Limited by the need for stable molecular tethering and functional ligand-receptor expression on probe or target surfaces to avoid artifactual signals.
