Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej
20 listopada 2021
Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił in situ (DFS). BFP można wykorzystać do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywe komórki. Protokół ten przedstawia analizę stałej sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.
Ten film opisuje krok po kroku procedury dotyczące używania sondy siły biomembrany (BFP) do pomiaru stałej sprężystości molekularnej. W sondzie siłowej BFP pojawił się ostatnio na natywnej powierzchni komórki lub w analizie dynamicznej spektroskopii sił SITU. Głównym celem tej techniki jest pomiar genetyki wiązania pojedynczych cząsteczek.
Ta procedura analizy danych jest prostą, ale potężną wiadomością i dostarcza informacji mechanicznych, w szczególności siły dynamicznej i stanu zapalnego cząsteczek wyrażających błonę komórkową. Podczas cyklu eksperymentu BFP, mikrobiom sondy zakład z krwinką czerwoną i spadkiem, komórka docelowa i wiązanie molekularne receptora liganda między sondą a celem można uznać za system mózgowy połączony szeregowo. Opierając się na prawie Hooke'a, odwrotność całkowitej stałej sprężystości układu sprężyn połączonych szeregowo jest równa sumie odwrotnej stałej sprężystości każdego pojedynczego składnika, jak pokazuje równanie.
Stała sprężystości krwinek czerwonych jest obliczana na podstawie ruchu zdarzeń, który jest zależny od promienia mikropipety sondy w otworze. Czerwona krwinka, okrągły obszar kontaktu między krwinką czerwoną a spadkiem oraz ciśnienie zasysające mikropipety. Dane drogowe BFP są uzyskiwane przez domowej roboty wirtualny instrument z widokiem z lewej strony, który steruje ruchem docelowej mikropipety za pomocą translatora PAs.
Pełny cykl dotykowy PFP składa się z pięciu etapów. Zbliżenie.Uderzenie.Kontakt. Wycofaj się i odłącz. Na początku naprężenie sprawia, że pozycja Robusto APICS jest oznaczona jako X równa się 0 w kolorze czarnym.
Cel jest następnie napędzany przez kawałek lub tłumacza, aby uderzyć i ścisnąć robusto, aby spowodować negatywny ruch spadkowy. Zaznaczasz, że jest to X mniejsze od zera w czerwonej linii przerywanej. W fazie wycofywania czerwony wierzchołek busto przesuwa się z pozycji X mniejszej od zera z powrotem do pozycji X równej zeru, co jest określane jako faza ściskania.
Jeśli powstanie wiązanie między kompleksem cząsteczek receptora liganda, czerwona krwinka będzie się dalej różnić od innych dodatnich kierunków. Ten okres X większy od zera jest określany jako faza rozciągania etapu wycofywania. Etap wycofywania jest najbardziej krytyczną częścią do określenia stałej sprężystości cząsteczki wiązania.
Zbieraj dane drogowe o sile w czasie za pomocą platformy akwizycji danych BSP. Każdy eksperyment zwykle rejestruje od 50 do 200 cykli dotykowych, Otwórz oprogramowanie do analizy danych PFP. Kliknij żółtą ikonę folderu i wybierz odpowiedni plik danych wiersza, klikając je dwukrotnie.
Jesteśmy w programie. Następnie kliknij przyciski strzałek w górę i w dół, aby przełączać się między wydarzeniami. Używanie kryteriów wykluczania wartości odstających w celu odsiewania nieprawidłowych zdarzeń.
Wybierz typ danych eksportowania, który jest wymuszany do formatu czasu, i wybierz odpowiedni zakres czasu stanu. Kliknij przycisk eksportu danych wykresu. Wyeksportowane dane są domyślnie zapisywane jako plik tekstowy.
Ten plik tekstowy zawiera dwie kolumny danych. Jest to pierwsza kolumna reprezentująca czas tatusiów, a druga kolumna reprezentująca odpowiednią siłę w każdym punkcie czasowym. Wykreśl krzywą siły w funkcji czasu za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych, aby uzyskać krzywą wymuszoną w funkcji przemieszczenia.
Pomnóż wartość czasu każdego punktu danych przez ruch PSO Willow Steel. Wyzeruj pierwszy punkt danych, odejmując najmniejszą wartość przemieszczenia od każdego punktu danych. Ta transformacja pozioma nie ma wpływu na późniejsze obliczenia stałej sprężystości.
Na krzywej siły w funkcji przemieszczenia dwie odrębne grupy aktorów różniły się, jeśli można zidentyfikować nowe nachylenie siły. Każdy z nich reprezentuje fazę ściskania i fazę 10 stylów. Dopasuj linię regresji do każdej grupy danych.
Linia o bardziej stromym nachyleniu reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie sprężarki oznaczoną jako K1. A linia, która była najmniejsza u góry, reprezentuje linię w tej 10 fazie stylu oznaczoną jako K2.As wspomniałem, całkowita stała sprężystości jest odwrotnością syna szeregowej stałej sprężystości każdego składnika. Podczas fazy ściskania w trybie dudnienia do komórki wiązanie molekularne nie jest rozciągane, dlatego stała sprężystości wiązania molekularnego nie jest brana pod uwagę. Stała sprężystości komórki docelowej jest opisana jako wyświetlane równanie, gdzie K1 reprezentuje całkowitą stałą sprężystości podczas fazy sprężarki.
W fazie 10 stylów trybu beat to sell, całkowita stała sprężystości jest słońcem odwrotnej stałej sprężystości wiązania molekularnego czerwonych krwinek. I komórkę docelową, użyj wyświetlonego równania, aby obliczyć stałą sprężystości wiązania molekularnego, która K2 reprezentuje całkowitą stałą sprężystości. Czytasz fazę 10 zatrzymania.
W trybie od uderzenia do uderzenia, ponieważ deformacja B jest pomijalna, termin opisujący odwrotność stałej sprężyny komórki docelowej zbliża się do zera, dlatego całkowita stała sprężystości w fazie sprężarki jest równoważna stałej sprężystości czerwonych krwinek pokazanej jako poniższe równanie. W fazie rozciągania stałą sprężystości wiązania molekularnego można obliczyć, odejmując wpływ czerwonej krwinki pokazanej jako poniższe równanie. Zbierz stałe sprężystości położenia B całkującego boczny wiatr, kompleksu Beta 3, komórki K562 i kompleksu układu B-beta trójki całkującej Febrifugine, oblicz średnią i odchylenie standardowe wyprowadzonych stałych sprężystości w wybranej skali Newtona lub nanometrów.
Teraz powinieneś lepiej zrozumieć, jakie są wymagania dotyczące pomiaru i stałej sprężystości na podstawie danych VFD. Należy zauważyć różnice między trybem beat to cell a trybem beat to beat. Różne cząsteczki prezentujące usługę będą miały różne mechanizmy obronne przed miarą stałej sprężystości.
Podsumowując, ta procedura krok po kroku opisuje, jak przeprowadzić analizę stałej sprężystości sprężystości molekularnej przy użyciu BFP. Przewidujemy, że w przyszłości zostaną podjęte wysiłki w celu zautomatyzowania i zintegrowania akwizycji danych BFP i analizy DFS w jednym programie do odpoczynku komputera. Dzięki temu cała analiza danych operacyjnych BFP jest bardziej przyjazna dla użytkownika i bardziej wydajna.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił stosowana do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych w żywych komórkach. Niniejszy protokół opisuje analizę stałych sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych za pomocą BFP.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Dynamiczna spektroskopia siły
- Oddziaływania molekularne
- Mechanika błony komórkowej
Wstęp
- Technika BFP służy do pomiaru wiązania pojedynczych cząsteczek.
- Dostarcza ona informacji mechanicznych na temat błon komórkowych.
- Analiza opiera się na prawie Hooke'a.
- Proces ten obejmuje oddziaływania między sondami a komórkami docelowymi.
Cel badania
- Pomiar stałych sprężystości molekularnych.
- Analiza dynamiki wiązań molekularnych.
- Pogłębienie zrozumienia oddziaływań błon komórkowych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie sondy sił biomembranowych (BFP).
- Analiza dynamicznej spektroskopii sił in situ.
- Analiza danych dotyczących oddziaływań molekularnych.
- Zastosowanie prawa Hooke'a do obliczania stałej sprężystości.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar stałych sprężystości cząsteczkowej.
- Wgląd w dynamikę wiązań cząsteczkowych.
- Demonstracja skuteczności BFP w analizie żywych komórek.
- Walidacja modeli teoretycznych za pomocą danych eksperymentalnych.
Wnioski
- BFP jest potężnym narzędziem do badania oddziaływań molekularnych.
- Technika ta poszerza naszą wiedzę na temat mechaniki komórkowej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szersze badania biologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Pomiar stałych sprężystości molekularnej za pomocą spektroskopii sondy siłowej biomembrany dostarcza ilościowych informacji mechanicznych na temat oddziaływań ligand-receptor, wspierając walidację celu poprzez charakteryzację stabilności wiązań i dynamiki konformacyjnej. Podejście to umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez powiązanie mechaniki molekularnej z sygnalizacją funkcjonalną, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac przed etapem screeningu związków. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu, ujawniając zależne od siły zachowania wiązania, które korelują z fizjologicznymi szlakami mechanosensorycznymi.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie sztywności wiązania oraz sił rozerwania przy fizjologicznych prędkościach obciążania.
- Wartość operacyjna: Umożliwia bezpośrednie porównanie wariantów molekularnych lub mutantów w celu zidentyfikowania mutacji stabilizujących, które wydłużają czas życia wiązania.
- Wartość naukowa: Wyjaśnia zależne od siły zmiany konformacyjne w receptorach, wspierając walidację mechanizmów allosterycznych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza danych referencyjnych dla projektowania leków w oparciu o strukturę w celu optymalizacji ich odporności mechanicznej.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Generuje krzywe siła-przemieszczenie, które służą jako ortogonalne odczyty powinowactwa wiązania w procesie selekcji testów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiary stałej sprężystości pomiędzy powtórzeniami, wykorzystując kryteria wykluczania wartości odstających oraz dopasowanie regresyjne.
- Wartość naukowa: Rozróżnia oddziaływania specyficzne od niespecyficznych na podstawie charakterystyki nachylenia fazy rozciągania w trybie kulek-kulek.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe gromadzenie od 50 do 200 cykli kontaktu na eksperyment w celu przeprowadzenia rzetelnej analizy statystycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy stałe sprężystości molekularnej z wynikiem mechanosensywności komórkowej, dostarczając informacji o znaczeniu patofizjologicznym w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość pomiarów od systemów oczyszczonych do natywnych powierzchni komórkowych dzięki trybom koralik-komórka oraz koralik-koralik.
- Wartość naukowa: Pomiar wkładu komórki w całkowitą stałą sprężystości, co pozwala oddzielić specyficzną dla celu mechanikę molekularną od artefaktów pochodzących z sondy lub komórki.
- Wartość operacyjna: Umożliwia porównywanie mechaniki molekularnej między różnymi platformami przy użyciu standaryzowanej analizy opartej na prawie Hooke'a.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając mechaniczne fenotypowanie celów po wstępnym potwierdzeniu wiązania, a przed przesiewami na szeroką skalę, co pomaga w priorytetyzacji celów o korzystnych profilach stabilności siłowej.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotezy dotyczącej celu poprzez pomiar reakcji wiązań molekularnych na zaburzenia mechaniczne, co pozwala na wykrycie zachowań typu catch-bond lub slip-bond.
- Screening: Dostarczanie ilościowych, powtarzalnych wyników stałej sprężystości, które umożliwiają szeregowanie wariantów ligandów lub kandydatów terapeutycznych.
- Analityka: Wykorzystanie regresji liniowej danych siła-przemieszczenie w celu wyznaczenia stałych sprężystości (K1, K2) z fazy ściskania i rozciągania, co umożliwia porównanie warunków.
- Badania translacyjne: Powiązanie mechaniki molekularnej z odpowiedziami na poziomie komórkowym poprzez pomiar wkładu komórki docelowej w trybie kuleczka-komórka, co zapewnia ciągłość mechanistyczną.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Stworzenie wielokrotnego użytku nanonarzędzia do fenotypowania mechanicznego różnych układów receptor-ligand, co redukuje nakłady na ponowną walidację w kolejnych kampaniach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez dostarczenie bezpośrednich, ilościowych pomiarów elastyczności wiązania oraz kinetyki zależnej od siły.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu pozyskiwaniu danych, filtrowaniu wartości odstających oraz eksportowalnym zestawom danych siła-czas do zewnętrznej walidacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesną identyfikację mechanicznie kruchych celów, co ogranicza inwestycje w wysokoryzykowny szlaki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o parametry stabilności wiązania, uzupełniając tradycyjne dane dotyczące powinowactwa i selektywności.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie dynamicznej spektroskopii sił, manipulacji mikropipetą oraz kalibracji siły z wykorzystaniem standardów z czerwonych krwinek.
- Zależy od specjalistycznego układu BFP z translatorami piezoelektrycznymi i autorską instrumentacją wirtualną w celu precyzyjnej kontroli przemieszczenia.
- Wymaga standaryzacji kryteriów wartości odstających, wyboru zakresu czasu oraz protokołów dopasowania regresyjnego pomiędzy zespołami w różnych ośrodkach.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przejściu z trybu kulka-komórka na tryb kulka-kulka, aby wyizolować wkłady molekularne od mechaniki komórkowej.
- Jest ograniczone przez potrzebę stabilnego przywiązania molekularnego oraz funkcjonalnej ekspresji ligandów i receptorów na powierzchniach sondy lub celu w celu uniknięcia sygnałów artefaktowych.
