Name: Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj analizę molekularnej stałej sprężystości za pomocą sondy siły biomembranowej (BFP) na żywych komórkach. Ta metoda spektroskopii sił dynamicznych dostarcza mechanicznych informacji o wiązaniach pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Guillaume'owi Troadecowi za pomocną dyskusję, Zihao Wangowi za konsultacje sprzętowe, oraz Sydney Manufacturing Hub, Greggowi Suaningowi i Simonowi Ringerowi za wsparcie naszego startupu laboratoryjnego. Praca ta była wspierana przez Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) oraz The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Arnold Ju jest członkiem DECRA Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (DE190100609).

1. Uzyskanie zdarzeń DFS nadających się do analizy
<ol>
	<li>Uruchom eksperyment w oprogramowaniu (np. LabVIEW VI) w celu sterowania BFP i ustawienia parametrów (Rycina S1A).</li>
	<li>Obserwuj powtarzalne kontakty koralika-sondy z koralikiem-celem lub komórką w oprogramowaniu BFP Monitor (Rycina S1B).</li>
	<li>Przetestuj i osiągnij częstotliwość adhezji ≤ 20% w ciągu pierwszych 50 kontaktów poprzez dostrojenie siły uderzenia i czasu kontaktu, co zapewnia, że ≥ 89% zdarzeń adhezji DFS jest zapośredniczonych przez pojedyncze wiązania12,13,14. 
	UWAGA: Dla każdej pary koralik-komórka/koralik wykonujemy 200 powtórnych cykli kontaktu. Aby uzyskać dane o jakości nadającej się do publikacji, zazwyczaj analizujemy n ≥ 3 par koralik-koralik lub koralik-komórka.
	<ol>
		<li>Zapisz dane w formie siły w funkcji czasu (Force vs. Time) w folderze wskazanym przez użytkownika po zakończeniu każdej pary, zgodnie z poleceniem oprogramowania do sterowania BFP i ustawiania parametrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz surowe dane siły w funkcji czasu dla zdarzeń wiązania, jak pokazano na Rycini 2A, korzystając z platformy akwizycyjnej BFP (Rycina S1C).
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych BFP. Kliknij żółtą ikonę folderu i wybierz odpowiedni plik z surowymi danymi, klikając go dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom program, a następnie klikaj przyciski góra i dół, aby przełączać się między zdarzeniami. Użyj kryteriów wykluczania wartości odstających (Rycina S2), aby odrzucić nieprawidłowe zdarzenia. Wybierz format eksportu danych jako Force vs. Time i kliknij przycisk Export Plots Data.</li>
</ol>
2. Przekształcenie krzywej siły w funkcji czasu w krzywą siły w funkcji przemieszczenia
<ol>
	<li>Wyeksportuj segment danych odpowiadający etapowi cofania (Retract) do arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2A, prostokątne zaznaczenie), który jest istotny dla analizy stałej sprężystości.</li>
	<li>Wykreśl krzywą zależności siły od czasu za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych. Aby uzyskać krzywą zależności siły od przemieszczenia, przekształć wartości czasu (Rysunek 2A, oś x) w wartości całkowitego przemieszczenia (Δxtot), mnożąc wartości czasu przez prędkość ruchu piezoelektryka (tj. 4,000 nm/s zgodnie z ustawieniami).</li>
	<li>Wyzeruj pierwszy punkt danych, odejmując najmniejszą wartość przemieszczenia od każdej uzyskanej wartości przemieszczenia. Ta transformacja pozioma nie wpływa na nachylenia wstępujące etapu cofania ani na późniejsze obliczenie stałej sprężystości.</li>
	<li>Należy zauważyć, że BFP jest traktowany jako szeregowy układ sprężyn, w którym Δxtot (Tabela 1) jest sumą odkształceń RBC, ΔxRBC (Tabela 1), wiązania molekularnego, Δxmol (Tabela 1) oraz komórki docelowej, Δxcell (Tabela 1), zgodnie z Równaniem 2: 
	<img alt="Równanie całkowitego przemieszczenia, Δx_tot, przedstawiające komponenty komórki krwi, molekularne i komórkowe." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> (Eq. 2)</li>
	<li>Wykreśl krzywą zależności siły (F) od przemieszczenia (Δxtot), jak pokazano na Rysunku 2B.</li>
</ol>
3. Analiza stałej sprężystości w trybie koralik-komórka
<ol>
	<li>Na krzywej siły w funkcji przemieszczenia (Force vs. Displacement) można zidentyfikować dwa odrębne nachylenia, z których każde może reprezentować fazę ściskania i fazę rozciągania. Dopasuj linię regresji do każdej grupy danych (Rycina 2B), gdzie większe nachylenie dopasowania liniowego reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie ściskania (Rycina 2B, kolor czerwony), oznaczoną jako k1 (Tabela 1); natomiast mniejsze nachylenie dopasowania liniowego reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie rozciągania (Rycina 2B, kolor niebieski), oznaczoną jako k2 (Tabela 1).</li>
	<li>Dla sprężyn połączonych szeregowo zgodnie z opisem w kroku 2.2, wyraź odwrotność całkowitej stałej sprężystości, ktot (Tabela 1), jako sumę odwrotności stałych sprężystości RBC, kRBC (Tabela 1), wiązania molekularnego, kmol (Tabela 1) oraz komórki docelowej, kcell (Tabela 1). Podczas fazy ściskania w trybie Bead-Cell wiązanie molekularne nie jest rozciągane, w związku z czym nie uwzględnia się kmol. Odwrotność ktot w tym scenariuszu (1/k1) jest wyrażona jako 
	<img alt="Schemat równania równowagi w biochemii; 1/k1=1/kRBC+1/kcell; analiza kinetyki enzymatycznej." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"> (Równ. 3). 
	W danych przykładu wartość kRBC jest określona wcześniej (domyślnie 0.25 pN/nm). Wartość kcell można wyprowadzić z Równ. 3, wykorzystując otrzymane wartości k1 oraz kRBC (Rycina 3B).</li>
	<li>Podczas fazy rozciągania powstaje adhezja między parą ligand-receptor. Wyraź odwrotność ktot w tym scenariuszu (1/k2) jako 
	<img alt="Równanie dla stałych szybkości kinetyki reakcji; formuła analizy szybkości chemicznych." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4"> (Równ. 4) 
	gdzie k2 (Tabela 1) reprezentuje całkowitą stałą sprężystości podczas fazy rozciągania.</li>
	<li>Wyprowadź wartość kmol poprzez odjęcie 1/k1 od 1/k2 (porównaj Równ. 3 i Równ. 4).</li>
</ol>
4. Analiza stałej sprężystości w trybie koralik-koralik
<ol>
	<li>Dopasuj linię regresji do danych z fazy ściskania, aby wyznaczyć k1 (podobnie jak na Rysunku 2B, kolor czerwony). Należy zauważyć, że w trybie Bead-Bead komórka docelowa zostaje zastąpiona szklaną kuleczką pokrytą interesującym nas receptorem (Rysunek 1C). Ponieważ odkształcenie kuleczki jest pomijalne, składnik 1/kcell może zostać odpowiednio usunięty z równania 3 oraz równania 4. Odwrotność ktot dla fazy ściskania (1/k1) może być wyrażona jako: 
	<img alt="Równanie kinetyki chemicznej, 1/k1 = 1/kRBC; wzór dla analizy szybkości reakcji." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 5"> (Równ. 5)</li>
	<li>Dopasuj linię regresji do danych z fazy rozciągania, aby wyznaczyć k2 (podobnie jak na Rysunku 2B, kolor niebieski). Odwrotność ktot dla fazy rozciągania (1/k2) może być wyrażona jako: 
	<img alt="Równanie matematyczne dla stałej szybkości reakcji; odwrotne szybkości w badaniu kinetyki chemicznej." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 6"> (Równ. 6)</li>
	<li>Wyznacz kmol poprzez odjęcie 1/k1 od 1/k2 (porównaj Równ. 5 i Równ. 6).</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe%3A+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).</li>
<li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li>
<li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li>
<li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li>
<li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580(1995).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+regulated+conformational+change+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Force regulated conformational change of integrin αVβ3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+force+spectroscopy+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447(2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów do zgłoszenia w odniesieniu do niniejszego badania.

Podsumowując, dostarczyliśmy szczegółowy protokół analizy danych do wstępnego przetwarzania surowych danych DFS i wyprowadzania molekularnych stałych sprężystości w trybach analizy BFP Bead-Bead i Bead-Cell. Przedstawiono modele biomechaniczne i równania niezbędne do wyznaczenia molekularnych i komórkowych stałych sprężystości. Chociaż badane są różne integryny, mol k mierzony w trybie Bead-Bead i Bead-Cell ma znaczne różnice w zakresie (Rysunek 3A w porównaniu z <strong ...

Jako technika DFS na żywych komórkach, BFP przekształca ludzką czerwoną krwinkę (erytrocyt; Rycina 1) w ultraczuły i dostosowywalny przetwornik siły o odpowiednim zakresie stałej sprężystości wynoszącym 0,1–3 pN/nm1,2,3. Aby badać interakcję ligand-receptor, BFP umożliwia pomiary DFS z rozdzielczością siły wynoszącą ~1 pN (10-12 N), rozdzielczością przestrzenną ~3 nm (10-9 m) oraz rozdzielczością czasową ~0,5 ms (10-3 s)4,5. Konfiguracja eksperymentalna składa się z dwóch przeciwnie ustawionych mikropipet, nazywanych odpowiednio Sondującym i Celowym. Mikropipeta Sondująca aspiruje czerwoną krwinkę, a na jej wierzchołku przyklejona jest kulka za pomocą interakcji biotyna-streptawidyna. Kula pokryta jest ligandem, który jest przedmiotem zainteresowania (Rycina 1A). Mikropipeta Celowa aspiruje albo komórkę, albo kulkę niosącą receptor będący przedmiotem zainteresowania, co odpowiada odpowiednio trybom Kulka-Komórka (Rycina 1B) i Kulka-Kulka (Rycina 1C)5.
Konstrukcję BFP, jego montaż oraz protokoły eksperymentalne DFS szczegółowo opisano wcześniej1,6. Krótko mówiąc, cykl dotyku BFP składa się z 5 etapów: Podejście, Uderzenie, Kontakt, Odsunięcie i Dysocjacja (Rycina 1D). Poziomą pozycję wierzchołka czerwonej krwinki oznacza się jako ΔxRBC. Na początku odkształcenie czerwonej krwinki (przy zerowej sile) ΔxRBC wynosi 0 (Tabela 1). Następnie Cel jest przesuwany za pomocą piezoprzetwornika, aby uderzyć w kulę sondy i się od niej odsunąć (Rycina 1D). Sonda czerwonej krwinki jest najpierw ściskana przez Cel, powodując ujemne odkształcenie czerwonej krwinki ΔxRBC &lt; 0. W przypadku zdarzenia wiązania, etap Odsunięcia przechodzi od fazy ściskania do fazy rozciągania, z dodatnim odkształceniem czerwonej krwinki ΔxRBC &gt; 0 (Rycina 2C i D). Zgodnie z prawem Hooke’a, siłę nośną BFP można zmierzyć jako F = kRBC × ΔxRBC, gdzie kRBC (Tabela 1) to stała sprężystości czerwonej krwinki w BFP. Po zerwaniu wiązania i zakończeniu jednego cyklu dotyku, kulka sondy wraca do pozycji zerowej siły, przy czym ΔxRBC = 0 (Rycina 1D).
Aby wyznaczyć kRBC, mierzymy i rejestrujemy promienie wewnętrznego otworu mikropipety sondy (Rp), erytrocytu (R0) oraz kołowego obszaru kontaktu (Rc) między erytrocytem a kulką sondy (Rycina 1A). Następnie wartość kRBC oblicza się zgodnie z modelem Evansa (równanie 1)7,8 za pomocą programu LabVIEW działającego jako wirtualny instrument (VI) do obsługi BFP (Rycina S1A)8,9.
<img alt="równanie kRBC ilustrujące zależność między ciśnieniem a promieniem; wzór fizyczny, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> (równ. 1)
Po ustaleniu BFP i uzyskaniu surowych danych DFS, przedstawiamy sposób analizy stałej sprężystości pary ligand-receptor lub komórek. Surowe dane DFS dotyczące oddziaływania glikozylowanego białka Thy-1 i komórek K562 wyrażających integrinę α5β1 (Thy-1-α5β1; Rysunki 3A i 3B)10 oraz oddziaływania fibrynogenu i powlekanych integriną αIIbβ3 kulek (FGN-αIIbβ3; Rysunek 3C)11,12 zostały wykorzystane odpowiednio do zademonstrowania trybów analizy Bead-Cell i Bead-Bead.
Przygotowanie eksperymentu z wykorzystaniem BFP 
Aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące przygotowania eksperymentu BFP i sprzętu, prosimy o zapoznanie się z wcześniej opublikowanymi protokołami3. W skrócie, ludzkie krwinki czerwone zostały biotynylowane za pomocą Biotyn-PEG3500-NHS w buforze węglanowo-biwęglanowym. Badane białka zostały kowalencyjnie sprzężone z kuleczkami z borokrzemianu sodu za pomocą MAL-PEG3500-NHS w buforze fosforanowym. Aby przyłączyć do biotynylowanych krwinek czerwonych, kuleczka sondy jest również pokrywana streptawidyną (SA) przy użyciu MAL-SA. Zobacz Tabelę materiałów oraz Tabelę 2.
Aby złożyć BFP (Rycina 1, lewa strona), trzecią mikropipetę zwaną „Helper” wykorzystuje się do dostarczenia kulki sondy i przyłączenia jej do wierzchołka erytrocytu1,3. Oddziaływanie kowalencyjne między pokrytą SA kulką sondy a biotynylowanym erytrocytem jest znacznie silniejsze niż badane wiązanie ligand-receptor. W związku z tym etap dysocjacji można interpretować jako zerwanie wiązania ligand-receptor, a nie odłączenie kulki sondy od erytrocytu.

<table><tbody><tr><td>3-Mercaptopropylotrimethoxysilane (MPTMS)</td><td>Uct, Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funkcjonalizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Przygotowanie buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Akwizycja danych BFP VI</td><td>Kontrola i ustawianie parametrów BFP</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BFP analiza danych surowych BFP</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Biotynylacja</td></tr> <tr><td>RBCKoraliki ze szkła borokrzemianowego</td><td>Distrilab Particle Technology, Holandia</td><td>9002</td><td>Funkcjonalizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Ligand Funkcjonalizacja Kamera</td></tr><tr><td>VI</td><td>LabVIEW</td><td></td><td>Monitorowanie BFP</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Tyrode' s przygotowanie</td></tr><tr><td>buforu Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode' s preparat buforowy</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Funkcjonalizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tyrode' s przygotowanie buforowe</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy; Tyrode" s przygotowanie buforowe</td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tyrode' s preparat buforowy</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4&bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparat buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Streptawidyna-Maleimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funkcjonalizacja kulek szklanych</td></tr></tbody></table>

analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

Sonda siły biomembranowej (BFP) pojawiła się ostatnio jako nanonarzędzie do natywnej spektroskopii dynamicznej siły (DFS) na powierzchni komórki lub in situ, które może mierzyć kinetykę wiązania pojedynczych cząsteczek, oceniać właściwości mechaniczne oddziaływań ligand-receptor, wizualizować dynamiczne zmiany konformacyjne białek i bardziej ekscytująco wyjaśniać mechanizmy mechanosensingu komórek za pośrednictwem receptorów. Ostatnio BFP został wykorzystany do pomiaru stałej sprężystości wiązań molekularnych. Protokół ten opisuje krok po kroku procedurę przeprowadzania analizy DFS stałej sprężystości sprężystości molekularnej. W szczególności omówiono dwa tryby pracy BFP, a mianowicie tryby Bead-Cell i Bead-Bead. Protokół ten koncentruje się na wyprowadzeniu stałych sprężystości wiązania molekularnego i komórki na podstawie surowych danych DFS.

W niniejszej pracy zaprezentowano protokół analizy stałej sprężystości BFP. W trybie analizy Bead-Cell przeanalizowano kmol wiązania molekularnego pomiędzy glikozylowanym białkiem Thy-1 naniesionym na koralik sondy (Probe bead) a integryną α5β1 eksprymowaną na komórce docelowej K562 (Thy-1-integrin α5β1; Rysunek 3A)10. Wartość kcell została również wyznaczona w trybie Bead-Cell (komór...

Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił in situ (DFS). BFP można wykorzystać do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywe komórki. Protokół ten przedstawia analizę stałej sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.

Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Ten film opisuje krok po kroku procedury dotyczące używania sondy siły biomembrany (BFP) do pomiaru stałej sprężystości molekularnej. W sondzie siłowej BFP pojawił się ostatnio na natywnej powierzchni komórki lub w analizie dynamicznej spektroskopii sił SITU. Głównym celem tej techniki jest pomiar genetyki wiązania pojedynczych cząsteczek.Ta procedura analizy danych jest prostą, ale potężną wiadomością i dostarcza informacji mechanicznych, w szczególności siły dynamicznej i stanu zapalnego cząsteczek wyrażających błonę komórkową. Podczas cyklu eksperymentu BFP, mikrobiom sondy zakład z krwinką czerwoną i spadkiem, komórka docelowa i wiązanie molekularne receptora liganda między sondą a celem można uznać za system mózgowy połączony szeregowo. Opierając się na prawie Hooke'a, odwrotność całkowitej stałej sprężystości układu sprężyn połączonych szeregowo jest równa sumie odwrotnej stałej sprężystości każdego pojedynczego składnika, jak pokazuje równanie.Stała sprężystości krwinek czerwonych jest obliczana na podstawie ruchu zdarzeń, który jest zależny od promienia mikropipety sondy w otworze. Czerwona krwinka, okrągły obszar kontaktu między krwinką czerwoną a spadkiem oraz ciśnienie zasysające mikropipety. Dane drogowe BFP są uzyskiwane przez domowej roboty wirtualny instrument z widokiem z lewej strony, który steruje ruchem docelowej mikropipety za pomocą translatora PAs.Pełny cykl dotykowy PFP składa się z pięciu etapów. Zbliżenie.Uderzenie.Kontakt. Wycofaj się i odłącz. Na początku naprężenie sprawia, że pozycja Robusto APICS jest oznaczona jako X równa się 0 w kolorze czarnym.Cel jest następnie napędzany przez kawałek lub tłumacza, aby uderzyć i ścisnąć robusto, aby spowodować negatywny ruch spadkowy. Zaznaczasz, że jest to X mniejsze od zera w czerwonej linii przerywanej. W fazie wycofywania czerwony wierzchołek busto przesuwa się z pozycji X mniejszej od zera z powrotem do pozycji X równej zeru, co jest określane jako faza ściskania.Jeśli powstanie wiązanie między kompleksem cząsteczek receptora liganda, czerwona krwinka będzie się dalej różnić od innych dodatnich kierunków. Ten okres X większy od zera jest określany jako faza rozciągania etapu wycofywania. Etap wycofywania jest najbardziej krytyczną częścią do określenia stałej sprężystości cząsteczki wiązania.Zbieraj dane drogowe o sile w czasie za pomocą platformy akwizycji danych BSP. Każdy eksperyment zwykle rejestruje od 50 do 200 cykli dotykowych, Otwórz oprogramowanie do analizy danych PFP. Kliknij żółtą ikonę folderu i wybierz odpowiedni plik danych wiersza, klikając je dwukrotnie.Jesteśmy w programie. Następnie kliknij przyciski strzałek w górę i w dół, aby przełączać się między wydarzeniami. Używanie kryteriów wykluczania wartości odstających w celu odsiewania nieprawidłowych zdarzeń.Wybierz typ danych eksportowania, który jest wymuszany do formatu czasu, i wybierz odpowiedni zakres czasu stanu. Kliknij przycisk eksportu danych wykresu. Wyeksportowane dane są domyślnie zapisywane jako plik tekstowy.Ten plik tekstowy zawiera dwie kolumny danych. Jest to pierwsza kolumna reprezentująca czas tatusiów, a druga kolumna reprezentująca odpowiednią siłę w każdym punkcie czasowym. Wykreśl krzywą siły w funkcji czasu za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych, aby uzyskać krzywą wymuszoną w funkcji przemieszczenia.Pomnóż wartość czasu każdego punktu danych przez ruch PSO Willow Steel. Wyzeruj pierwszy punkt danych, odejmując najmniejszą wartość przemieszczenia od każdego punktu danych. Ta transformacja pozioma nie ma wpływu na późniejsze obliczenia stałej sprężystości.Na krzywej siły w funkcji przemieszczenia dwie odrębne grupy aktorów różniły się, jeśli można zidentyfikować nowe nachylenie siły. Każdy z nich reprezentuje fazę ściskania i fazę 10 stylów. Dopasuj linię regresji do każdej grupy danych.Linia o bardziej stromym nachyleniu reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie sprężarki oznaczoną jako K1. A linia, która była najmniejsza u góry, reprezentuje linię w tej 10 fazie stylu oznaczoną jako K2.As wspomniałem, całkowita stała sprężystości jest odwrotnością syna szeregowej stałej sprężystości każdego składnika. Podczas fazy ściskania w trybie dudnienia do komórki wiązanie molekularne nie jest rozciągane, dlatego stała sprężystości wiązania molekularnego nie jest brana pod uwagę. Stała sprężystości komórki docelowej jest opisana jako wyświetlane równanie, gdzie K1 reprezentuje całkowitą stałą sprężystości podczas fazy sprężarki.W fazie 10 stylów trybu beat to sell, całkowita stała sprężystości jest słońcem odwrotnej stałej sprężystości wiązania molekularnego czerwonych krwinek. I komórkę docelową, użyj wyświetlonego równania, aby obliczyć stałą sprężystości wiązania molekularnego, która K2 reprezentuje całkowitą stałą sprężystości. Czytasz fazę 10 zatrzymania.W trybie od uderzenia do uderzenia, ponieważ deformacja B jest pomijalna, termin opisujący odwrotność stałej sprężyny komórki docelowej zbliża się do zera, dlatego całkowita stała sprężystości w fazie sprężarki jest równoważna stałej sprężystości czerwonych krwinek pokazanej jako poniższe równanie. W fazie rozciągania stałą sprężystości wiązania molekularnego można obliczyć, odejmując wpływ czerwonej krwinki pokazanej jako poniższe równanie. Zbierz stałe sprężystości położenia B całkującego boczny wiatr, kompleksu Beta 3, komórki K562 i kompleksu układu B-beta trójki całkującej Febrifugine, oblicz średnią i odchylenie standardowe wyprowadzonych stałych sprężystości w wybranej skali Newtona lub nanometrów.Teraz powinieneś lepiej zrozumieć, jakie są wymagania dotyczące pomiaru i stałej sprężystości na podstawie danych VFD. Należy zauważyć różnice między trybem beat to cell a trybem beat to beat. Różne cząsteczki prezentujące usługę będą miały różne mechanizmy obronne przed miarą stałej sprężystości.Podsumowując, ta procedura krok po kroku opisuje, jak przeprowadzić analizę stałej sprężystości sprężystości molekularnej przy użyciu BFP. Przewidujemy, że w przyszłości zostaną podjęte wysiłki w celu zautomatyzowania i zintegrowania akwizycji danych BFP i analizy DFS w jednym programie do odpoczynku komputera. Dzięki temu cała analiza danych operacyjnych BFP jest bardziej przyjazna dla użytkownika i bardziej wydajna.

molecular-spring-constant-analysis-biomembrane-force-probe

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

W tym filmie sondy siły biomembranowej (BFP) są używane do pomiaru sił między receptorami i ligandami. Technika ta może wykrywać interakcje poprzez monitorowanie ciśnienia potrzebnego do zerwania wiązań między pMHC sprzężonym na kulkach sondy a TCR na komórkach docelowych.

Sonda wymuszająca biomembranę do ilościowego określania interakcji receptor-ligand

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru siły oddziaływań między dobrze zdefiniowaną powierzchnią nieorganiczną a peptydami lub aminokwasami za pomocą pomiarów spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Informacje uzyskane z pomiaru są ważne dla lepszego zrozumienia interakcji peptyd-materiał nieorganiczny.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Poznaj analizę molekularnej stałej sprężystości za pomocą sondy siły biomembranowej (BFP) na żywych komórkach. Ta metoda spektroskopii sił dynamicznych dostarcza mechanicznych informacji o wiązaniach pojedynczych cząsteczek.

Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej

Przeglądaj więcej filmów