Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni
July 10th, 2021
Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.
Mikrowzorce to potężna technika stosowana przez naukowców w celu zrozumienia powiązań między kształtem komórki a aktywnością maszyn międzykomórkowych. Chociaż kilka technik pozwala naukowcom modulować kształt komórki, techniki te często wymagają specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla niektórych laboratoriów biologicznych. Ten film przeprowadzi Cię przez kroki niezbędne do zautomatyzowania mikrowzorców w dostępnym na rynku systemie obrazowania wielofotonowego.
Jedną z zalet tego protokołu jest to, że pozwala uniknąć użycia specjalistycznego sprzętu. Wzory można również łatwo zmieniać bez konieczności ponownego fabrykowania fotomasek, co jest zazwyczaj najbardziej czasochłonnym procesem w mikromodelowaniu. Nasze narzędzie do przetwarzania obrazów generuje uśrednione obrazy komórek, które odzwierciedlają reprezentatywny rozkład białek w sposób bezstronny i zautomatyzowany.
Chociaż w naszych eksperymentach używamy szkiełek nakrywkowych, zautomatyzowany przepływ pracy pozwala również na tworzenie wzorów na szkiełkach i naczyniach ze szklanym dnem. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ prawidłowa konfiguracja mikroskopu ma kluczowe znaczenie dla systemu do obrazowania, identyfikacji właściwej płaszczyzny ogniskowej i wzoru w sposób zautomatyzowany. Przygotuj roztwór PVA zgodnie z instrukcją.
Dodaj jedną część HCL do ośmiu części PVA. Ostrożnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać. Wlej dwa mililitry roztworu do małej szalki Petriego i zanurz czyste, wstępnie przetworzone szkiełko nakrywkowe w płynie.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut na shakerze. Ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe z roztworu. Użyj przędzarki do szkiełek nakrywkowych, aby wirować sierść przez 40 sekund.
W międzyczasie wyczyść pęsetę. Przenieś szkiełko nakrywkowe do pudełka i wysusz w temperaturze czterech stopni przez noc. Włącz oprogramowanie mikroskopu.
Najpierw ustaw linię lasera na 750 nanometrów. Następnie skonfiguruj nową konfigurację optyczną o nazwie Obraz. Jest to podstawowa konfiguracja optyczna, która pozwala nam zobrazować szkiełko nakrywkowe przez reflektory.
Pozostaw inne opcje jako domyślne i wybierz odpowiedni cel. Skonfiguruj ustawienia sprzętowe w tej konfiguracji optycznej. Ustaw laser na podczerwień jako nasz laser stymulacyjny.
Umieść rozdzielacz wiązki na ścieżce światła, aby użyć lasera IR do obrazowania. Wybierz moduł skanera Galvano i odpowiedni detektor skanowania D. Wybierz rozmiar skanowania i czas zatrzymania, które są wystarczające do uchwycenia małych elementów na szkiełku nakrywkowym.
Upewnij się, że pole Użyj lasera IR jest zaznaczone. Dostosuj moc lasera akwizycyjnego i czułość detektora, aby uzyskać jasny, ale nie nasycony obraz powierzchni szkiełka nakrywkowego. W oknie obszaru skanowania ustaw powiększenie na jeden, aby uchwycić całe pole widzenia.
Zapisz konfigurację optyczną. Teraz skonfigurujemy serię konfiguracji optycznych, które pozwolą mikroskopowi ustawić ostrość, załadować maskę ROI i generować wzory w sposób zautomatyzowany. Pierwsza konfiguracja optyczna pozwala nam na wydrukowanie znacznika fiduciary służącego do automatycznego ustawiania ostrości na aktualnym polu widzenia.
Zduplikuj konfigurację optyczną obrazu i zmień jego nazwę, Drukuj znacznik powierniczy. Ponieważ drukujemy w tym kroku, należy usunąć rozdzielacz wiązki z toru światła i zastąpić go odpowiednim lustrem dichroicznym. Wybierz najmniejszy rozmiar skanowania, aby zaoszczędzić czas.
Ponieważ na tym etapie nie jest wymagane obrazowanie, ustaw czułość detektora na zero. Zwiększ moc lasera, aby umożliwić drukowanie. W oknie obszaru skanowania ustaw powiększenie na maksimum i umieść obszar skanowania na środku pola view.
Teraz przeprowadzimy eksperyment ze stosem Z, aby uwzględnić wszelkie nierówności powierzchni PVA. Ustawia ruch w pozycji Z na względny. Wybierz odpowiednie urządzenie Z.
Następnie zduplikuj konfigurację optyczną obrazu i zmień jej nazwę na Autofokus. Wybierz najmniejszy rozmiar skanu i zmniejsz współczynnik powiększenia w oknie obszaru skanowania, tak aby pole widzenia było nieco większe niż znacznik odniesienia. Gwarantuje to, że inne drobne elementy na szkiełku nakrywkowym nie będą kolidować z autofokusem.
W menu Devices (Urządzenia) wybierz opcję Auto Focus setup (Ustawienia automatycznego ustawiania ostrości). Ustaw grubość skanowania na taką samą jak w eksperymencie Z-stack. Mikroskop przeskanuje ten zakres i znajdzie najlepszą płaszczyznę ogniskową za pomocą znacznika referencyjnego.
Następnie zduplikuj konfigurację optyczną obrazu i zmień jej nazwę na Załaduj ROI. Ustaw rozmiar skanowania identyczny z rozmiarem maski ROI, ponieważ maska zostanie załadowana na obraz wykonany za pomocą tej konfiguracji optycznej. Użyliśmy 2048 pikseli, aby osiągnąć optymalną równowagę między rozdzielczością a szybkością.
Teraz skonfigurujemy konfigurację optyczną używaną do wzoru szkiełka nakrywkowego. Zduplikuj konfigurację optyczną znacznika referencyjnego wydruku i zmień jego nazwę na Micropattern. Ustaw współczynnik powiększenia na jeden.
Zwiększ moc lasera stymulacyjnego, aby dokonać ablacji PVA. Wybierz odpowiednią prędkość skanowania. W oknie Stymulacja ND skonfiguruj eksperyment ze stymulacją ND.
Dodaj kilka faz do harmonogramu i ustaw każdą z nich na stymulację. Upewnij się, że obszar i czas trwania stymulacji są prawidłowe. W tym samym oknie włącz funkcję stage move main Z przed każdą fazą.
To z kolei uwzględnia wszelkie odchylenia w kierunku Z. Na koniec ustaw konfigurację optyczną, aby utworzyć widoczną etykietę na szkiełku nakrywkowym, która pomoże nam zlokalizować wzory. Zduplikuj wydruk znacznika powierniczego i zmień jego nazwę, Powierzchnia etykiety.
Zwiększ znacznie moc lasera i ustaw powiększenie na jeden. Przenieść szkiełko nakrywkowe pokryte PVA na uchwyt. W przypadku mikroskopu pionowego upewnij się, że powierzchnia PVA jest skierowana w dół.
Dodaj wodę do rogów, aby ustabilizować szkiełko nakrywkowe. Zamontuj uchwyt na stoliku mikroskopu. Opuść obiektyw i dolej wody pomiędzy nimi.
W oprogramowaniu mikroskopu włącz migawkę lasera IR i wykonaj automatyczne wyrównanie przed wykonaniem wzoru. Przełącz się na konfigurację optyczną obrazu. Zeskanuj pole widzenia, powoli przesuwając obiektyw bliżej szkiełka nakrywkowego.
Na początku obraz będzie wyglądał na bardzo przyciemniony. Przesuń obiektyw bliżej szkiełka nakrywkowego, aż jasność obrazu nieznacznie wzrośnie. Jest to powierzchnia szkiełka nakrywkowego, która jest skierowana w stronę obiektywu.
Kontynuuj przesuwanie obiektywu, aż jasność zmniejszy się i ponownie zwiększy. To jest powierzchnia PVA, którą będziemy modelować. Skoncentruj się na każdym małym elemencie, takim jak niedoskonałości szkiełka nakrywkowego lub kurz, i ustaw zero na dysku Z.
Przełącz się na konfigurację optyczną powierzchni etykiety. Kliknij Przechwyć. Wróć do obrazowania i skanowania.
Uszkodzenie szkła świadczy o tym, że etykieta została pomyślnie wydrukowana. Przesuń stolik o jedno lub dwa pola widzenia, aby uniknąć cząstek szkła. Zeskanuj, aby potwierdzić.
W menu urządzeń otwórz makro ruchu stołu montażowego. Ustaw zmienne M i N na żądaną liczbę pól widoków, które będą miały wzorzec. Zapisz i uruchom makro.
Po zakończeniu tworzenia wzorów przełącz się na konfigurację optyczną obrazu i zeskanuj wzory. Wysepki wzoru w każdym polu widzenia powinny mieć wyraźne obramowania i równomiernie odbijać światło. Wzory, które wydają się ciemniejsze i nierówne, sugerują niepełne usunięcie PVA.
Jest to zwykle spowodowane niewystarczającą mocą lasera lub nieprawidłową płaszczyzną ogniskowej. Jeśli moc lasera jest ustawiona zbyt wysoko, może to również spowodować powstawanie pęcherzyków PVA. Po posianiu komórek na szkiełkach nakrywkowych komórki powinny się rozprzestrzenić i przybrać kształt wzoru.
Jest to immunofluorescencyjny obraz ludzkiego fibroblastu pokrytego wzorem kuszy. Komórka wykazuje bogatą w aktynę obwódkę lamellipodiów. Grube włókna naprężeniowe brzuszne po obu stronach i włókna naprężeniowe grzbietowe połączone łukami poprzecznymi.
Łańcuch lekki miozyny znajdował się za gęstą krawędzią blaszek i wykazywał prążkowany wzór wzdłuż wiązek aktyny. Korzystając z naszego niestandardowego narzędzia do przetwarzania obrazu, wygenerowaliśmy uśredniony obraz naszych interesujących nas białek. Ten obraz pokazuje, że opisane powyżej struktury aktyny są spójne w wielu wzorcach.
Chociaż po uśrednieniu tracimy poszczególne struktury miozyny, jej lokalizacja wzdłuż wiązek aktyny jest zachowana. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie skonfigurować przepływ pracy mikro patterningu przy użyciu dostępnego na rynku systemu wielofotonowego przy minimalnym nakładzie pracy ręcznej. Ważne jest, aby zoptymalizować moc lasera dla własnego systemu, aby uniknąć generowania niekompletnych wzorów lub PVA Maksymalną wydajność można osiągnąć, dostosowując parametry w krokach autofokusa i mikrowzorów.
Oprócz badania szlaków komórkowych związanych z morfologią komórki, technika ta może być również stosowana do badań przesiewowych leków i innych zastosowań, które są wrażliwe na zmiany w kształcie komórki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzórów w celu standaryzacji kształtu komórek do badania struktur szkieletu komórkowego w komórkach ssaków. Jest przyjazny dla użytkownika i kompatybilny z dostępnymi na rynku systemami obrazowania, eliminując potrzebę specjalistycznego sprzętu.
Kluczowe komponenty badań
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania szkieletu komórkowego
- Techniki mikrowzórowania
Tło
- Mikrowzórowanie pomaga zrozumieć związek między kształtem komórki a maszynerią komórkową.
- Wiele istniejących technik wymaga specjalistycznego sprzętu, co ogranicza dostępność.
- Ten protokół pozwala na łatwą modyfikację wzorów bez konieczności ponownego wytwarzania maski fotolitograficznej.
- Zautomatyzowane narzędzia do przetwarzania obrazów zapewniają bezstronne średnie obrazy komórek.
Cel badania
- Opracowanie standaryzowanej metody badania struktur szkieletu komórkowego.
- Ułatwienie badań nad modulacja kształtu komórki bez specjalistycznego sprzętu.
- Poprawa dostępności technik mikrowzórowania w standardowych laboratoriach biologicznych.
Stosowane metody
- Zautomatyzowane mikrowzórowanie na systemie wielofotonowym obrazowania.
- Wykorzystanie dostępnych na rynku systemów obrazowania.
- Modyfikacja wzorów bez ponownego wytwarzania maski fotolitograficznej.
- Przetwarzanie obrazów w celu wygenerowania reprezentatywnych dystrybucji białek.
Główne wyniki
- Sukces w zautomatyzowaniu technik mikrowzórowania.
- Standaryzowane kształty komórek dla spójnych badań nad szkieletem komórkowym.
- Zmniejszenie czasu i zasobów potrzebnych do wytwarzania wzorów.
- Bezstronna reprezentacja dystrybucji białek w komórkach.
Wnioski
- Protokół poprawia badanie struktur szkieletu komórkowego w komórkach ssaków.
- Dostarcza praktycznego rozwiązania dla laboratoriów pozbawionych specjalistycznego sprzętu.
- Przyszłe badania mogą skorzystać na elastyczności i wydajności tej metody.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated infrared laser-assisted micropatterning enables precise control of cell geometry, directly addressing variability in cell-based assays and supporting robust quantitative analysis. By standardizing cell shape using accessible imaging platforms, this method enhances predictive confidence in early discovery and screening workflows. The approach facilitates high-throughput studies of morphology-function relationships, supporting portfolio-wide target validation and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular pathways by controlling cell morphology and reducing biological variability.
- Supports functional target validation by standardizing experimental conditions across large cell populations.
- Improves predictive confidence for pathway analysis and mechanistic de-risking in early-stage research.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible, geometry-defined cell systems for downstream compound screening and phenotypic assays.
- Facilitates assay standardization and scalability by automating pattern generation and cell seeding.
- Enables quantitative, high-throughput imaging and analysis of protein localization and cytoskeletal organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cell morphology with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing reproducible, quantitative data across experimental replicates.
- Enhances mechanistic insight into form-function relationships relevant to preclinical model selection.
Pipeline & Workflow Integration
This micropatterning protocol integrates from early discovery through screening and translational research, leveraging standard imaging systems for broad applicability.
- Discovery Biology: Standardizes cell shape to enable hypothesis testing and pathway clarification with reduced confounding variability.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible cell systems for reliable compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, averaged measurements of protein localization and morphology for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant systems by controlling cellular architecture.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reusable workflow adaptable to various substrates and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Streamlines standardization, reproducibility, and scalability of cell patterning workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing biological variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement across discovery and screening programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in imaging system configuration and laser parameter optimization.
- Depends on access to multiphoton or IR laser-equipped imaging platforms.
- Necessitates cross-team standardization of pattern design and imaging protocols.
- Adaptable to coverslips, slides, and glass-bottom dishes for diverse assay formats.
- Pattern quality is sensitive to laser power, focal plane accuracy, and substrate preparation.
