Name: Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj automatyczne mikromodelowanie wspomagane laserem IR do kontroli kształtu komórek na powlekanych PVA szkiełkach pokrywkowych. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę ilościową lokalizacji białek bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Connaught Fund New Investigator Award dla S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (granty RGPIN-2015-05114 i RGPIN-2020-05881), University of Manchester i University of Toronto Joint Research Fund, oraz University of Toronto XSeed Program. C.T. był wspierany przez stypendium NSERC USRA.

<ol><li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li>
<li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li>
<li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li>
<li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li>
<li>Paluch, E., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration%3A+Integrating+Signals+from+Front+to+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li>
<li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li>
<li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li>
<li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+Movements%3A+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+Processing%3A+Surface%2C+Micro-%2C+and+Nanoscale+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Materials%3A+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li>
<li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li>
<li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li>
<li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li>
<li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li>
<li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li>
<li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications%3A+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217(2020).</li>
<li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization%3A+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2FOrganelle+Motility+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li>
<li>Inoué, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%3A+The+Fundamentals%22">Video Microscopy: The Fundamentals</a>. , Springer. US. (1997).</li>
<li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+%28%C2%B5P-hPST%29+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491(2017).</li>
<li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Powyższe wyniki pokazują, że opisany protokół mikrowzorcowania wspomaganego laserem IR (mikrofotowzorcowanie) zapewnia powtarzalne przylegające wzory o różnych kształtach, co umożliwia manipulowanie kształtem komórki i architekturą cytoszkieletu. Chociaż zarówno przed, jak i po debiucie mikrofotomodelowania opracowano wiele metod mikromodelowania, metoda ta ma kilka zalet. Po pierwsze, nie wymaga specjalistycznego sprzętu i pomieszczeń czystych, które zwykle znajdują się tylko w działach inżynieryjnych. W rzeczywistości,...

Kształt komórki jest kluczowym wyznacznikiem podstawowych procesów biologicznych, takich jak morfogeneza tkanek1, migracja komórek2, proliferacja komórek3, oraz ekspresja genów4. Zmiany w kształcie komórki są napędzane przez skomplikowaną równowagę między dynamicznymi rearanżacjami cytoszkieletu, które deformują błonę plazmatyczną, a czynnikami zewnętrznymi, takimi jak siły zewnętrzne wywierane na komórkę oraz geometria zrostów komórka-komórka i komórka-matryca5. Migrujące komórki mezenchymalne, na przykład, polimeryzują gęstą sieć aktynową na krawędzi natarcia, która popycha błonę plazmatyczną do przodu i tworzy szeroką lamellipodia6, podczas gdy kurczliwość aktomiozyny cofa wąską krawędź spływu komórki, aby oderwać komórkę od jej bieżącej pozycji7,8. Zakłócanie zdarzeń sygnalizacyjnych, które powodują powstawanie takich wyspecjalizowanych struktur cytoszkieletu, zaburza kształt i polaryzację oraz spowalnia migrację komórek9. Ponadto zginanie arkusza nabłonka podczas gastrulacji wymaga zwężenia wierzchołkowego opartego na aktomiozynie, które powoduje, że komórki i ich sąsiedzi stają się klinowate10. Chociaż badania te podkreślają znaczenie kształtu komórki, nieodłączna heterogeniczność kształtu komórki utrudnia wysiłki zmierzające do zidentyfikowania mechanizmów łączących morfologię z funkcjonowaniem.
W tym celu, w ciągu ostatnich trzech dekad opracowano wiele podejść do manipulowania kształtem komórki. Podejścia te osiągają swój cel poprzez ograniczanie komórki za pomocą trójwymiarowej formy lub kontrolowanie geometrii adhezji komórkowej poprzez wzorzyste osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na powierzchni przeciwporostowej, technika określana jako micropatterning11. Tutaj przyjrzymy się kilku technikom, które zyskały popularność na przestrzeni lat.
Pierwotnie zapoczątkowany jako podejście do zastosowań mikroelektronicznych, miękki druk mikrokontaktowy oparty na litografii stał się jednoznacznie kultowym ulubieńcem<klasa sup="xref">12. Płytka wzorcowa jest najpierw wytwarzana przez selektywne wystawienie obszarów podłoża krzemowego pokrytego fotorezystem na promieniowanie fotonasłoneczniejące, pozostawiając wzorzystą powierzchnię13. Elastomer, taki jak PDMS, jest następnie wylewany na płytkę wzorcową w celu wygenerowania miękkiego "stempla", który przenosi białka ECM na żądane podłoże11,14. Po wyprodukowaniu, wafel wzorcowy może być użyty do odlania wielu stempli PDMS, które dają początek wysoce powtarzalnym mikrowzorcom12. Jednak wzorów nie można łatwo dostosować ze względu na długotrwały proces fotolitografii. Proces ten wymaga również wysoce specjalistycznego sprzętu i pomieszczeń czystych, które zwykle nie są dostępne na wydziałach biologii.
Ostatnio doniesiono, że bezpośredni druk przy użyciu głębokiego UV pozwala obejść ograniczenia wynikające z tradycyjnego podejścia opartego na litografii. Głębokie światło UV jest kierowane przez fotomaskę do wybranych obszarów szklanego szkiełka nakrywkowego pokrytego glikolem polietylenowym szczepionym poli-L-lizyną. Grupy chemiczne wystawione na działanie głębokiego UV są fotokonwertowane bez użycia światłoczułych łączników, aby umożliwić wiązanie białek ECM15. Brak światłoczułych łączników sprawia, że wzorzyste szkiełka nakrywkowe pozostają stabilne w temperaturze pokojowej przez ponad siedem miesięcy15. Metoda ta pozwala uniknąć stosowania pomieszczeń czystych i sprzętu do fotolitografii oraz wymaga mniej specjalistycznego szkolenia. Jednak wymóg stosowania fotomasek nadal stanowi istotną przeszkodę dla eksperymentów, które wymagają łatwo dostępnych zmian we wzorcach.
Oprócz metod, które manipulują geometrią komórek poprzez kontrolowane osadzanie białek ECM na powierzchni 2D, inne starają się kontrolować kształt komórek poprzez zamykanie komórek w mikrostrukturach 3D. W wielu badaniach zaadaptowano opisane powyżej podejście oparte na miękkiej litografii do generowania 3D, a nie 2D, komór PDMS w celu zbadania zależnych od kształtu procesów biologicznych w zarodkach, bakteriach, drożdżach i roślinach16,17,18,19. Polimeryzacja dwufotonowa (2PP) również zyskała wiodącą rolę jako technika mikrowytwarzania, która może tworzyć złożone rusztowania hydrożelowe 3D o rozdzielczości nanometrowej20. 2PP opiera się na zasadzie adsorpcji dwufotonowej, gdzie dwa fotony dostarczane w impulsach femtosekundowych są jednocześnie absorbowane przez cząsteczkę - w tym przypadku fotoinicjator - która umożliwia lokalną polimeryzację fotopolimerów21. Technika ta jest intensywnie stosowana do drukowania rusztowań 3D, które naśladują natywne struktury ECM ludzkiej tkanki i wykazano, że indukują niskie uszkodzenia fotochemiczne komórek22.
Debiut mikrofotowzorców 10 lat temu dał naukowcom możliwość wytwarzania mikrowzorów, unikając przy tym niedostępnego i specjalistycznego sprzętu. Mikrofotowzorzec tworzy wzory w skali mikronów poprzez termiczne usuwanie wybranych obszarów alkoholu poliwinylowego (PVA) pokrytych na aktywowanych powierzchniach szklanych za pomocą lasera na podczerwień23,24. Białka ECM, które przyczepiają się tylko do powierzchni szkła znajdującego się pod spodem, a nie PVA, służą następnie jako wskazówki biochemiczne, aby umożliwić kontrolowaną dynamikę rozprzestrzeniania się i kształt komórki. Ta metoda zapewnia również doskonałą elastyczność, ponieważ wzory można łatwo zmieniać w czasie rzeczywistym. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół mikrofotomodelowania przy użyciu komercyjnego systemu obrazowania wielofotonowego. Opisany protokół jest przeznaczony do szybkiego i zautomatyzowanego wytwarzania dużych wzorów. Wykazaliśmy, że te wzorce skutecznie kontrolują kształt komórki poprzez ograniczanie geometrii zrostów komórka-ECM. Na koniec pokazujemy, że opisana technika modelowania moduluje organizację i dynamikę cytoszkieletu aktynowego.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropylo)trimetoksysilan</td><td>Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>10062-880</td><td>Polistyren, z powłoką TC, wentylowane</td></tr><tr><td>Obiektyw do zanurzania w wodzie 25X Apo LWD</td><td>Nikon</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td>Polistyren, poddany obróbce TC, wentylowany</td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td>1mg/ml roztwór dichlorowodorku</td></tr><tr><td>Albumina seryny bydlęcej</td><td>BioShop</td><td>ALB005</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Sulbecco's Salan-buffered Solanek</td><td>Żubr</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FC010</td><td>1mg/ml w pH 7,5 bufor</td></tr><tr><td>Przeciwciało fibronektyny</td><td>Mysz BD</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Wersja 1.53c</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>568nm</td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td>22 i 22 mm</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16220</td><td>25% roztwór wodny</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Caledon</td><td>6025-1-29</td><td>37% roztwór wodny</td></tr><tr><td>IR Laser</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Vision</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium &</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Sigma</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Wtórna</td><td>technologia sygnalizacji komórek</td> przeciwciał <td>4408S</td><td>Koza,</td></tr><tr><td>mikroskop wielofotonowy</td> 488nm <td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td></td></tr><tr><td>Myozyna Łańcuch lekki</td><td>Technologia sygnalizacji komórek</td> przeciwciała <td>3672S</td><td>Elementy</td></tr><tr><td>NIS</td><td>królika Nikon</td><td></td><td>Wersja 5.21.03</td></tr><tr><td>Kwas azotowy</td><td>Caledon</td><td>7525-1-29</td><td>70% roztwór wodny</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Wersja 21.2.1</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Poli(alchohol winylowy)</td><td>Aldrich</td><td>341584</td><td>MW 89000-98000, 98% hydrolizowana</td></tr><tr><td>technologia sygnalizacji komórek</td><td>przeciwciał wtórnych królika</td><td>4412S</td><td>Koza, 488nm</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td>Znany również jako wahacz analogowy</td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Aldrich</td><td>452882</td><td>w proszku</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>w proszku</td></tr><tr><td>Monobasic</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>w proszku</td></tr><tr><td>Spyder</td><td>Anaconda</td><td>4.1.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Żubr</td><td>325-042-CL</td><td>0,05% roztwór wodny z 0,53mM EDTA</td></tr></tbody></table>

kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Mikrowzorcowanie jest uznaną techniką w społeczności biologii komórki, używaną do badania powiązań między morfologią a funkcją kompartmentów komórkowych przy jednoczesnym omijaniu komplikacji wynikających z naturalnych różnic między komórkami. Aby ustandaryzować kształt komórki, komórki są albo zamykane w formach 3D, albo kontrolowane pod kątem geometrii kleju za pomocą wysp klejowych. Jednak tradycyjne techniki mikrowzoru oparte na fotolitografii i głębokim trawieniu UV w dużym stopniu zależą od pomieszczeń czystych lub specjalistycznego sprzętu. Tutaj prezentujemy technikę mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni (mikrofotomodeling) zmodyfikowaną przez Doyle'a i wsp., którą można wygodnie skonfigurować za pomocą dostępnych na rynku systemów obrazowania. W tym protokole używamy systemu obrazowania Nikon A1R MP+ do generowania mikrowzorów z mikronową precyzją za pomocą lasera na podczerwień (IR), który abluje zaprogramowane obszary na szkiełkach nakrywkowych pokrytych alkoholem poliwinylowym. Stosujemy niestandardowy skrypt, aby umożliwić zautomatyzowane wytwarzanie szablonów z wysoką wydajnością i dokładnością w systemach niewyposażonych w sprzętowy autofokus. Pokazujemy, że ten protokół mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni (mikrofotomodeling) skutkuje zdefiniowanymi wzorami, do których komórki przyczepiają się wyłącznie i przybierają pożądany kształt. Ponadto dane z dużej liczby komórek można uśrednić ze względu na standaryzację kształtu komórek. Wzorce generowane za pomocą tego protokołu, w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości i analizą ilościową, mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych o stosunkowo wysokiej przepustowości w celu identyfikacji graczy molekularnych pośredniczących w związku między formą a funkcją.

Jakość danych doświadczalnych uzyskanych za pomocą mikrowzorowania w dużej mierze zależy od jakości samych wzorów. Aby ocenić jakość wzorów generowanych powyższą metodą, zastosowano najpierw mikroskopię odbiciową w celu analizy kształtu i rozmiaru obszarów usuniętych metodą ablacji laserowej z krawędzi szkiełka podstawowego. Stwierdzono, że każdy pojedynczy wzór był bardzo podobny do maski ablacyjnej, posiadał wyraźne krawędzie oraz powierzchnię odbijającą światło w sposób jednorodny (Rycina 2B</stro...

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Mikrowzorce to potężna technika stosowana przez naukowców w celu zrozumienia powiązań między kształtem komórki a aktywnością maszyn międzykomórkowych. Chociaż kilka technik pozwala naukowcom modulować kształt komórki, techniki te często wymagają specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla niektórych laboratoriów biologicznych. Ten film przeprowadzi Cię przez kroki niezbędne do zautomatyzowania mikrowzorców w dostępnym na rynku systemie obrazowania wielofotonowego.Jedną z zalet tego protokołu jest to, że pozwala uniknąć użycia specjalistycznego sprzętu. Wzory można również łatwo zmieniać bez konieczności ponownego fabrykowania fotomasek, co jest zazwyczaj najbardziej czasochłonnym procesem w mikromodelowaniu. Nasze narzędzie do przetwarzania obrazów generuje uśrednione obrazy komórek, które odzwierciedlają reprezentatywny rozkład białek w sposób bezstronny i zautomatyzowany.Chociaż w naszych eksperymentach używamy szkiełek nakrywkowych, zautomatyzowany przepływ pracy pozwala również na tworzenie wzorów na szkiełkach i naczyniach ze szklanym dnem. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ prawidłowa konfiguracja mikroskopu ma kluczowe znaczenie dla systemu do obrazowania,

control-cell-geometry-through-infrared-laser-assisted

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Tutaj wytwarzamy 3D polimerowe mikro/nano struktury, w których zarówno kształt, jak i wyrównanie molekularne mogą być zaprojektowane z dokładnością do skali nanometrowej za pomocą bezpośredniego pisma laserowego. Indukowane światłem odkształcenia kilku typów mikrostruktur elastomerów ciekłokrystalicznych mogą być kontrolowane w skali mikroskopowej.

Siłowniki do oświetlenia o dowolnym kształcie -- Wytwarzanie i sterowanie uruchamianiem w skali mikroskopowej

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Naszym ogólnym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki wyczuwają sygnały zewnątrzkomórkowe, które prowadzą do ukierunkowanego wzrostu aksonów. W tym miejscu opisujemy metodologię indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek, używaną do wytwarzania zdefiniowanych mikrowzorów składników macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania określonych zdarzeń, które rządzą wzrostem aksonów i odnajdywaniem ścieżki.

Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Przedstawiono metodę nałożenia topografii powierzchniowej pochłaniającej światło materiałów kompozytowych polimerowych, szczególnie magnetoaktywnych elastomerów (MAE), za pomocą mikroobróbki laserowej. Ta metoda umożliwia dużą elastyczność w projektowaniu topograficznym i szybkim prototypowaniu. Przedstawiono przykład strukturyzacji powierzchni MAE, charakteryzacji oraz ich reakcji na zewnętrzne pole magnetyczne.

Mikroobróbka laserowa do projektowania topografii powierzchni polimerów

Poznaj automatyczne mikromodelowanie wspomagane laserem IR do kontroli kształtu komórek na powlekanych PVA szkiełkach pokrywkowych. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę ilościową lokalizacji białek bez specjalistycznego sprzętu.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Przeglądaj więcej filmów