Name: Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj dwukolorową analizę cytometryczną ograniczenia SAMHD1 wobec HIV-1 w komórkach U937. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę aktywności restrykcyjnej białka i charakteryzację jego wariantów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Francis Crick Institute, który otrzymuje swoje główne fundusze od Cancer Research UK (FC001042 i FC001162), UK Medical Research Council (FC001042 i FC001162) oraz Wellcome Trust Trust (FC001042 i FC001162) oraz przez Wellcome Trust Investigator Award dla JPS (108012/Z/15/Z). Prace na Uniwersytecie Cambridge były współfinansowane przez NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) oraz UK Medical Research Council (MR/S009752/1). Ta ostatnia nagroda, finansowana przez Wielką Brytanię, jest częścią programu EDCTP2 wspieranego przez Unię Europejską.

<ol><li>Sundström, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+%28U-937%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li>
<li>Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+transient+assay+for+studying+the+genetic+determinants+of+Fv1+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).</li>
<li>Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trim5alpha+protein+restricts+both+HIV-1+and+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).</li>
<li>Arnold, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-dependent+regulation+of+SAMHD1+oligomerisation+couples+catalysis+and+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction.</a> PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194(2015).</li>
<li>Groom, H. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+xenotropic+murine+leukaemia+virus-related+virus+in+UK+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome.</a> Retrovirology. 7, 10(2010).</li>
<li>Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+entry+mediated+by+receptor+priming+and+low+pH+triggering+of+an+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein.</a> Cell. 103 (4), 679-689 (2000).</li>
<li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foamy+virus+capsids+require+the+cognate+envelope+protein+for+particle+export%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export.</a> Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Bainbridge, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+the+mouse+eye+using+an+HIV-based+lentiviral+vector%3B+efficient+long-term+transduction+of+corneal+endothelium+and+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium.</a> Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).</li>
<li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+interferon-stimulated+genes+with+antiretroviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity.</a> Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculating+HIV-1+infectious+titre+using+a+virtual+TCID50+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method.</a> Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).</li>
<li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+enhances+nucleoside-analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824(2017).</li>
<li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+specifically+affects+the+antiviral+potency+of+thymidine+analog+HIV+reverse+transcriptase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).</li>
<li>Huber, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+has+differential+impact+on+the+efficacies+of+HIV+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).</li>
<li>Amie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+%28dNTP%29+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li>
<li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li>
</ol>

Na potrzeby otwartego dostępu autorzy zastosowali publiczną licencję praw autorskich CC BY do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia. Wyrażone poglądy są poglądami autora (autorów), a niekoniecznie poglądami NIHR lub Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej.

Jak omówiono w powyższych uwagach, krytyczne aspekty protokołu koncentrują się na utrzymaniu prawidłowego fenotypu komórki do produkcji VLP i stworzeniu odpowiedniego środowiska do obserwacji ograniczenia SAMHD1. Po pierwsze, dokładna analiza restrykcji za pomocą dwukolorowej cytometrii przepływowej polega na osiągnięciu odpowiednich proporcji transdukowanych i zakażonych komórek, tak aby w każdym obszarze wykresu znajdowała się wystarczająca liczba komórek do analizy. W związku z tym badacz powinien dążyć do osiągnięcia MOI mniejszego niż 1 (patrz Protokół). Wskaźniki transdukcji i infekcji, które są zbyt wysokie lub zbyt niskie, prowadzą do problemów z analizą z powodu braku niezakażonych lub podwójnie zainfekowanych komórek. Podobnie, podobna szybkość transdukcji dla wektorów SAMHD1, które mają być porównywane, jest kluczem do umożliwienia zastosowania tej samej macierzy kompensacji i bramkowania w całym eksperymencie, zwiększając zaufanie do późniejszej analizy.
Po drugie, wiek użytych komórek U937 jest kluczowym czynnikiem decydującym o tym, czy skutecznie się różnicują. Skuteczne różnicowanie można monitorować poprzez obserwację przylegania, zmniejszone zakwaszenie pożywek w czasie po różnicowaniu oraz odpowiednie ograniczenie przez kontrolę pozytywną typu dzikiego w teście. Różnicowanie do 5 dni zakończyło się sukcesem.
Jedną z kluczowych zalet tego testu jest jego elastyczność. Różne zmodyfikowane wersje SAMHD1 (domeny, aminokwasy, sekwencje gatunków) mogą być testowane poprzez prostą mutagenezę wektora ukierunkowaną na miejsce lub klonowanie. Równie dobrze można badać warianty wirusa testera. Test był używany wcześniej w celu wykazania, że mutanty odwrotnej transkryptazy HIV-1 o zmniejszonej zdolności do wiązania dNTP są bardziej wrażliwe na ograniczenie SAMHD1. Tę samą zasadę można zastosować do testowania ograniczeń innych wirusów przez SAMHD1. Co więcej, różne warunki różnicowania lub sztuczna manipulacja wewnątrzkomórkowymi stężeniami dNTP mogą być wykorzystane do dalszego badania interakcji między warunkami wewnątrzkomórkowymi a aktywnością SAMHD1, co jest obszarem aktywnych badań w laboratorium Bishopa. Opisano również interakcję SAMHD1 z różnymi nukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy, a wpływ SAMHD1 pokazano za pomocą tego testu zmodyfikowanego do stosowania w komórkach pierwotnych 12,13,14,15.
Adaptacja protokołu do stosowania w komórkach pierwotnych pozwala przezwyciężyć ograniczenia związane z badaniem fenotypów metabolicznych w przekształconych komórkach. Istniejący format pozwala jednak na zastosowanie wygodnego i mniej wymagającego technicznie protokołu do analizy wysokoprzepustowej, zwłaszcza przy użyciu cytometru przepływowego z próbnikiem o wysokiej przepustowości. Podczas dostosowywania protokołu należy wziąć pod uwagę podatność komórek nieindukowanych wewnętrznie na efekty postronne (np. sygnalizację immunologiczną).
Podobnie jak w przypadku wielu aspektów biologii komórki, ważne jest, aby takie testy były stosowane jako część holistycznego podejścia do zrozumienia danego zjawiska. Równoległe stosowanie testów biochemicznych dla aktywności SAMHD116, kwantyfikacja wewnątrzkomórkowych pul dNTP oraz obserwacja zmutowanych fenotypów SAMHD1 u ludzi, ex vivo i w modelach zwierzęcych (przeprowadzane przez laboratoria na całym świecie, niektóre opisane w tym wydaniu) są kluczowe dla rozwijającego się zrozumienia tego złożonego białka.

Sterylne białko 1 zawierające domenę α-motif/histydyno-asparaginianu (SAMHD1) utrudnia replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) w komórkach spoczynkowych linii szpikowej. SAMHD1 blokuje replikację poprzez swoją aktywność enzymatyczną jako trifosfohydrolaza dNTP, co powoduje obniżenie poziomu wewnątrzkomórkowych dNTP. W rezultacie HIV-1 nie może skutecznie przeprowadzić procesu odwrotnej transkrypcji. W ciągu kilku lat od tej początkowej obserwacji poczyniono znaczne postępy, szczególnie w odniesieniu do udziału określonych domen i aminokwasów w aktywności przeciwwirusowej SAMHD1. Spostrzeżenia te zostały uzyskane przy użyciu testów biochemicznych, a także systemów komórkowych naśladujących fizjologicznie istotne spokojne środowisko szpikowe. Komórki U9371 są szeroko stosowane jako wygodny system komórek szpikowych do analizy aktywności SAMHD1. Wynika to z braku endogennej ekspresji SAMHD1, co uważa się za spowodowane niskim poziomem RNA w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję SAMHD1 (obszar trwających badań). W tym przypadku protokół opisuje przejściową transdukcję komórek U937 z cząstkami wirusopodobnymi współeksprymującymi SAMHD1 i reporterem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w celu zbadania mechanizmu ograniczenia SAMHD1 HIV-1. Takie przejściowe testy dwukolorowej cytometrii przepływowej w celu zbadania ograniczeń retrowirusowych zostały po raz pierwszy opracowane w laboratorium Stoye2 i od tego czasu zostały zaadaptowane do badania innych czynników restrykcyjnych, w tym białek motywu trójdzielnego (TRIM)3. Zainspirowani tymi testami, laboratorium Bishop opracowało dwukolorowy test do analizy ograniczenia SAMHD1 w komórkach U937.
Przebieg eksperymentu jest pokazany w Rysunek 1. Do transdukcji komórek U937 wykorzystuje się cząstki podobne do wirusa białaczki mysiej (MLV) zawierające bi-cistroniczną wiadomość kodującą SAMHD1 wraz z YFP wyrażonym przez IRES. Komórki są następnie traktowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wywołania różnicowania do fenotypu w stanie spoczynku. Komórki są następnie zakażane cząstkami podobnymi do wirusa HIV-1 wykazującymi ekspresję białka czerwonej fluorescencji (RFP). Po 48 godzinach komórki są pobierane i analizowane za pomocą dwukolorowej cytometrii przepływowej. Test ten jest również stosowany z YFP i białkiem zielonej fluorescencji (GFP), co wymaga mniej standardowych kombinacji filtrów do analizy cytometrii przepływowej. Zastosowanie HIV-RFP pozwala na prostszą kompensację, a tym samym test jest łatwiej dostępny dla mniej doświadczonych użytkowników cytometrii przepływowej i osiągalny w przypadku większości cytometrów.
Podczas analizy, proporcja komórek zakażonych wirusem HIV jest porównywana między komórkami wykazującymi ekspresję SAMHD1 a komórkami pozbawionymi SAMHD1 w tej samej studzience komórek. Zapewnia to wewnętrzną kontrolę w probówce do cytometrii studziennej/przepływowej, co jest kluczową cechą. Porównanie poziomów infekcji w komórkach transdukowanych i nietransdukowanych ujawnia współczynnik restrykcji. Współczynnik 1,0 wskazuje, że transdukowany czynnik nie ma wpływu na zakaźność. Ekspresja SAMHD1 typu dzikiego prowadzi do pięciokrotnego zmniejszenia zakażenia wirusem HIV w tym teście, co odpowiada współczynnikowi restrykcji wynoszącemu 0,2. Chociaż efekt ten jest niewielki w porównaniu z bardziej klasycznymi czynnikami restrykcyjnymi, takimi jak TRIM5, efekt ten jest jednak powtarzalny i pozwala na klasyfikację zmodyfikowanych ekspresorów SAMHD1 na te, które ograniczają się w sposób równoważny do białka typu dzikiego, te, które nie ograniczają się i te o pośrednim fenotypie.
Ten test został z powodzeniem wykorzystany do scharakteryzowania fenotypów restrykcyjnych domeny SAMHD1 i mutantów aminokwasów poprzez transdukcję z wirusami kodującymi zmutowane sekwencje SAMHD1. Na przykład katalityczne podstawienia miejscowe HD206-7AA nie są w stanie ograniczyć w tym teście. Równie dobrze można określić podatność różnych wirusów testowych. Na przykład mutanty odwrotnej transkryptazy HIV-1 są bardziej podatne na ograniczenia za pośrednictwem SAMHD1 (np. 151V4). Protokół ten przedstawia szczegóły produkcji cząstek wirusopodobnych (VLP), transdukcji U937 za pomocą wektorów ekspresyjnych SAMHD1, zakażenia wirusem HIV przenoszącym fluorescencyjny reporter i późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W tym artykule omówiono, jakich danych można się spodziewać i jak uniknąć nieoptymalnych wyników. Na koniec przedstawiono alternatywne zastosowania testu, a także zbadano różne warianty SAMHD1 w celu dokładniejszego zrozumienia zależności między SAMHD1, poziomami dNTP i infekcją wirusową. Biorąc pod uwagę rolę SAMHD1 w centrum metabolizmu komórkowego, z dodatkowymi powiązaniami z rakiem, jest to nadal obszar intensywnego zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m Filtry strzykawkowe</td><td>Sartorius</td><td>FCT122</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynia</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>preparaty wirusa można zwiększyć poprzez transfekcję na płytkach/kolbach o większej pojemności - patrz wskazówki dotyczące odczynników do transfekcji</td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Greiner</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa analizator komórek</td><td>BD Bioscience</td><td>649225</td><td>można stosować alternatywne analizatory, o ile mogą odczytywać fluorescencję RFP i YFP</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>ATCC zaleca, aby zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zostało zmodyfikowane tak, aby zawierało 4 mM L-glutaminy, 4500 mg/L glukozy, 1 mM pirogronianu sodu i 1500 mg/L wodorowęglanu sodu.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP-231-100</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>BD Bioscience</td> <td>-</td> <td>alternatywne oprogramowanie analityczne może być używane</td></tr> mikroskop <tr><td>świetlny</td> <td>-</td><td></td> <td>dowolny mikroskop światła jasnego pola</td></tr><tr><td>p8.91</td> <td>-</td><td></td> <td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td></tr> <tr><td>paraformaldehyd (4 % w PBS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61889</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octan (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>pKB4</td><td></td>-<td></td><td>-Mysia białaczka Ekspresor wirusa GagPol (PMID: 23035841)</td></tr><tr><td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td> <td>-</td><td></td> <td>MLV pakuje plazmid kodujący sekwencję ludzką typu dzikiego. Szczegóły i procedury klonowania Arnold i in., 2015 (Ref 1).</td></tr><tr><td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP</td> <td>-</td><td></td> <td>Jak wyżej, koduje substytucje aminokwasów w kluczowych miejscach aktywnych reszt</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td> <td>Inne oprogramowanie do prezentacji danych są również odpowiednie</td></tr><tr><td>pVSV-G</td><td>-</td><td>-</td><td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternatywnie: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>rurki z nakrętką</td><td>StarLab</td><td>E1415-2231</td><td></td></tr><tr><td>SCRPSY</td> <td>-</td><td></td> <td>HIV pakowanie kodowania plazmidów RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td></tr> <tr><td>stripettes 10 ml</td><td>Corning</td><td>10084450</td><td></td></tr><tr><td>stripettes 5 ml</td><td>Corning</td><td>10420201</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Trypsin również będą odpowiednie</td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>ThermoFisher</td><td>R0531</td><td>dobrze sprawdzą się również alternatywne odczynniki do transfekcji</td></tr><tr><td>Ogniwa U937</td><td>ATCC</td><td>CRL-1593.2</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ograniczenia samhd1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych u937

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterylne białko 1 zawierające domenę α-motif/histydyny-asparaginianu (SAMHD1) hamuje replikację HIV-1 w spoczynkowych komórkach szpikowych. Komórki U937 są szeroko stosowane jako wygodny system komórkowy do analizy aktywności SAMHD1 ze względu na niski poziom ekspresji RNA SAMHD1, co prowadzi do niewykrywalnej endogennej ekspresji białka. Opierając się na podobnych testach opracowanych w laboratorium Stoye w celu scharakteryzowania innych retrowirusowych czynników restrykcyjnych, laboratorium Bishop opracowało dwukolorowy test restrykcyjny do analizy SAMHD1 w komórkach U937. Cząstki podobne do wirusa białaczki mysiej wyrażające SAMHD1, wraz z YFP wyrażonym przez IRES, są wykorzystywane do transdukcji komórek U937. Komórki są następnie traktowane octanem mirystynianu forbolu w celu wywołania różnicowania do fenotypu w stanie spoczynku. Po różnicowaniu komórki są zakażone cząstkami podobnymi do wirusa HIV-1 wykazującymi ekspresję fluorescencyjnego reportera. Po 48 godzinach komórki są pobierane i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Odsetek komórek zakażonych wirusem HIV w populacji wykazującej ekspresję SAMHD1 porównano z odsetkiem komórek kontroli wewnętrznej pozbawionych SAMHD1. To porównanie ujawnia współczynnik ograniczeń. Ekspresja SAMHD1 prowadzi do pięciokrotnego zmniejszenia zakażenia wirusem HIV, co odpowiada współczynnikowi restrykcji wynoszącemu 0,2. Niedawne zastąpienie pierwotnego GFP RFP genem reporterowym zakażenia wirusem HIV ułatwiło analizę metodą cytometrii przepływowej.
Ten test został z powodzeniem wykorzystany do scharakteryzowania wpływu podstawień aminokwasów na ograniczenie SAMHD1 poprzez transdukcję z wirusami kodującymi zmienione białka SAMHD1, pochodzące z mutagenezy wektora ekspresyjnego skierowanej do miejsca. Na przykład, katalityczne podstawienia miejsc HD206-7AA wykazują fenotyp restrykcyjny równy 1, co wskazuje na utratę aktywności restrykcyjnej. Równie dobrze można określić podatność różnych wirusów testowych. Test można dalej dostosowywać w celu uwzględnienia wpływu statusu różnicowania, statusu metabolicznego i modyfikatorów SAMHD1, aby lepiej zrozumieć związek między SAMHD1, stanem metabolicznym komórki i restrykcją wirusa.

Wyniki powyższej analizy powinny wykazać stosunek restrykcji wynoszący 0,25 lub mniej dla pozytywnej kontroli SAMHD1 typu dzikiego oraz 1,0 dla kontroli negatywnej. Jeśli te dwie kontrole jakości są poprawne, należy ocenić istotność statystyczną wyników. Warianty SAMHD1, które nie wykazują istotnej różnicy w stosunku do typu dzikiego, niosą zatem substytucje, które nie wpływają na restrykcję SAMHD1 w tym kontekście. Te, które różnią się istotnie od typu dzikiego, wykazują upośledzoną restrykcję. Jeśli nie różnią się one istotnie od kontroli negatywnej, oznacza to brak zdolności do restrykcji w tym kontekście (Rycina 4, panele lewe).
Jeśli wartość restrykcji dla SAMHD1 typu dzikiego jest większa niż 0,3, wyniki dla wirusów testowych mogą być wskazujące, ale nie mogą być uznane za wiarygodne. Nieefektywna restrykcja białka typu dzikiego może wynikać z użycia komórek U937 zbyt wcześnie po regeneracji z rekonstrukcji (w ciągu 2 tygodni) lub gdy są one zbyt stare (&gt;2-3 miesiące). Parametry te mogą wymagać empirycznego ustalenia dla danej partii komórek. Zazwyczaj im niższy numer pasażu, tym bardziej niezawodnie komórki ulegają różnicowaniu, a co za tym idzie, zapewniają odpowiednie środowisko dla restrykcji SAMHD1. Nieodpowiedni poziom infekcji w przypadku SAMHD1-YFP lub HIV-RFP może również prowadzić do trudności zarówno w kompensacji, jak i w późniejszym określeniu współczynnika restrykcji. Przykład przedstawiono na prawych panelach Rysunku 4.
Jeśli kontrola negatywna odbiega od wartości 1,0 (wykracza poza zakres 0,9-1,2), może to wskazywać na problem z analizą; na wynik badania może wpływać proporcja zakażonych komórek, strategia bramkowania lub stan zdrowotny komórek. Należy odnieść się do powyższych UWAG.
<img alt="Produkcja i analiza VLP; schemat cytometrii przepływowej; proces infekcji HIV; wykres analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający protokół. VLP, cząstki wirusopodobne, PMA, octan mirystianu forbolu. Ponumerowane etapy odpowiadają etapom w protokole. Rysunek wykonany przy użyciu BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wektorów do edycji genów; promotory CMV IE, geny gagpol, montaż wektora PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat plazmidów retrowirusowych. (A) Wektory pakujące (B) Wektory transferowe (C) Ekspresor otoczki VSV-G. Przedstawiono kluczowe elementy kodujące i regulacyjne. Szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów. CMV IE: promotor wczesny CMV (cytomegalovirus immediate-early), BGH: hormon wzrostu bydlęcego (bovine growth hormone), pA: polyA, RRE: element odpowiedzi Rev (Rev Response Element), CMV-LTR: kompozytowy promotor CMV-HIV-1 LTR, Psi: sygnał pakowania HIV-1, cPPT/CTS: centralny trakt polipurynowy/centralna sekwencja terminacji (central polypurine tract/central termination sequence), SV40: wirus wakulizujący małp 40 (simian vacuolating virus 40). Rycina wykonana przy użyciu BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza danych z cytometrii przepływowej; kompensacja fluorescencji; wykresy kropkowe; kanały YFP i RFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Strategia bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. (A) Kontrole kompensacji: panel lewy przedstawia bramkowanie FSC-A/SSC-A na nienaruszonych komórkach dla kontroli nietransdukowanej i niezainfekowanej. Panele środkowy i prawy przedstawiają zrzuty ekranu z kontroli kompensacji dla pojedynczych barwników YFP (środek) i RFP (prawo), gdzie dane niekompensowane zaznaczono kolorem czarnym, a skompensowane kolorem niebieskim. (B) Odpowiadająca im macierz kompensacyjna oraz wykresy dla powyższych kontroli kompensacji. (C) Strategia bramkowania. Detrytus jest eliminowany poprzez analizę wszystkich komórek za pomocą FSC-A/SSC-A (panel lewy). Dublety są wykluczane poprzez bramkowanie wysokości FSC względem powierzchni (panel środkowy). Panel prawy przedstawia przykład restrykcji HIV-1 przez SAMHD1 typu dzikiego. Osie pokazują skompensowaną fluorescencję laserów niebieskiego i żółtego, odpowiadającą odpowiednio komórkom pozytywnym dla YFP (SAMHD1) i RFP (HIV). Bramki kwadrantowe zostały wyznaczone poprzez porównanie kontroli negatywnych i jednobarwnych dla RFP i YFP. Liczby wskazują procent populacji macierzystej. Wartości kompensacji dla YFP względem GFP będą znacznie wyższe, ale możliwe do rozróżnienia przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza restrykcji HIV metodą cytometrii przepływowej, wykres punktowy i wykres słupkowy, SAMHD1, porównanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Oczekiwane wyniki: dane idealne w porównaniu z nieoptymalnymi. (A) Reprezentatywne wykresy YFP/RFP dla danych optymalnych (lewo) i nieoptymalnych (prawo). Liczby wskazują procent populacji rodzicielskiej. Na prawym panelu zakażenie HIV jest zbyt niskie, co powoduje trudności z kompensacją i bramkowaniem. Współczynnik restrykcji jest wyższy od oczekiwanego i wynosi 0,5. (B>) Wykresy współczynnika restrykcji dla wariantów SAMHD1 w stosunku do typu dzikiego (WT, czerwony) lub kontroli negatywnej (HD206-7AA, czarny) wygenerowane przy użyciu oprogramowania statystycznego. Każdy punkt reprezentuje wartość z powtórzenia. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe. Sparowane testy t pomiędzy każdą grupą były istotne we wszystkich przypadkach, z wyjątkiem wskazanych. Lewo: Dane idealne – WT wykazuje oczekiwaną restrykcję na poziomie około 0,2, kontrola negatywna wykazuje 1,0. Wariant R372D (szary) różni się istotnie od WT, ale nie różni się istotnie od kontroli negatywnej, a zatem utracił zdolność do restrykcji. Prawo: Dane nieoptymalne. Tutaj kontrola negatywna zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami, ale we wszystkich sześciu powtórzeniach WT wykazuje współczynnik restrykcji jedynie 0,5 ze względu na niski poziom zakażenia. Niska wariancja wewnątrz grup sprawia, że R143H wykazuje fenotyp pośredni, statystycznie różny od WT i kontroli negatywnej, natomiast G209S nie wykazuje restrykcji; jednak badanie to powinno zostać powtórzone z użyciem świeżych komórek, ponieważ kontrola pozytywna nie dała oczekiwanego współczynnika restrykcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisana tutaj jest sprawdzona metoda określania stopnia ograniczenia HIV-1 przez komórkowe białko hamujące SAMHD1. Ludzkie komórki linii szpikowej U937 są transdukowane wektorem ekspresyjnym SAMHD1 współwyrażającym YFP, różnicowane, a następnie prowokowane HIV-RFP. Poziom restrykcji określa się za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Wraz z rosnącym zainteresowaniem rolą czynników komórkowych w zakażeniu wirusem HIV makrofagów, opracowaliśmy elastyczny system analizy, szczególnie dla SAM HG one, który nie ulega ekspresji w komórkach U937. Główną zaletą systemu jest jego elastyczność. Po skonfigurowaniu może być używany do analizy różnych białek, komórek lub docelowych wirusów.Ważne jest, aby utrzymać zdrowie komórek, a także czuć się komfortowo z wielokolorową cytometrią przepływową. Włącz cytometr i komputer na 10 minut przed rozpoczęciem analizy. Upewnij się, że odpady są puste, a zbiornik osłony jest pełny.Następnie zaloguj się i otwórz oprogramowanie do analizy. Po przesunięciu ramienia zdejmij rurkę wodną. Ustaw natężenie przepływu na wysokie i naciśnij przycisk prime.Poczekaj, aż światło zgaśnie i powtórz ten proces jeszcze trzy razy. Umieść rurkę wodną z powrotem i pracuj z dużym natężeniem przepływu przez trzy minuty. Następnie ustaw natężenie przepływu na niskie i naciśnij przycisk czuwania do momentu przejęcia.Wybierz eksperyment, nowy eksperyment i naciśnij OK, aby wybrać pusty eksperyment, kliknij prawym przyciskiem myszy eksperyment i dodaj nową próbkę. Naciśnij OK, aby wygasić panel. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić nazwę na odpowiednią nazwę i otwórz próbkę, klikając znak plus, aby odsłonić nową probówkę.Kliknij dwukrotnie rurkę, aby zobaczyć ustawienia cytometru w inspektorze. W menu parametrów usuń niepotrzebne fluorochromy z wyjątkiem niebieskiego lasera 53030 i żółtego lasera 61020. W arkuszu utwórz wykres punktowy obszaru rozproszenia do przodu i bocznego obszaru punktowego, histogram YFP, histogram RFP i wykres punktowy zapytania ofertowego i YFP, klikając odpowiednią ikonę i zmieniając osie, klikając etykietę osi.Załaduj niezainfekowany, nietransdukowany układ sterowania i naciśnij przycisk run na maszynie. Następnie naciśnij przycisk Zdobądź na pulpicie nawigacyjnym pobierania. Dostosuj napięcie rozproszenia do przodu i bocznego na desce rozdzielczej, aby ustawić komórki w lewym dolnym kwadrancie.Omiń tę populację i oznacz ją jako P jeden. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pozostałe działki i wybierz opcję Pokaż P jeden, aby usunąć zanieczyszczenia z późniejszej analizy. Dostosuj napięcia RFP i YFP w dół, tak aby szczyt znajdował się po lewej stronie histogramu.Załaduj kontrolkę pojedynczego koloru dla YFP i naciśnij pobierz. Dostosuj napięcie YFP na desce rozdzielczej tak, aby najwięcej komórek fluorescencyjnych znajdowało się w zasięgu detektora. Następnie powtórz to samo dla formantu zapytania ofertowego.Wybierz eksperyment. Przejdź do ustawień wynagrodzenia i wybierz opcję utwórz kontrolki wynagrodzenia i w porządku, aby przełączyć się na normalny arkusz, a następnie wybierz niepoplamiony normalny arkusz. Naciśnij w biegu i zdobądź nieskalaną kontrolę.Narysuj bramkę P wokół nienaruszonych komórek i zapisz. Wyjmij rurkę i przełącz maszynę w tryb czuwania. Kliknij prawym przyciskiem myszy P jeden.Kliknij Zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji i przełącz się na normalny arkusz RFP. Naciśnij bieg i nagraj jednokolorową kontrolkę RFP, a oprogramowanie automatycznie bramkuje dodatnie komórki. Przełącz maszynę w tryb czuwania i powtórz to samo dla sterowania YFP.Wybierz eksperyment, przejdź do ustawień wynagrodzenia, wybierz oblicz wynagrodzenie, a następnie kliknij link i zapisz. Przełącz się na globalny arkusz roboczy i wróć do probówki z próbką. Pobrać komórki transdukowane dzikim typem SAM HD, jeden zakażony wirusem HIV RFP i sprawdzić, czy w rogach kwadrantów można zobaczyć cztery odrębne populacje ustawione pionowo i poziomo dla YFP i RFP.Wyjmij rurkę i naciśnij przycisk czuwania. Ponownie załaduj nietransdukowaną, niezainfekowaną próbkę i naciśnij przycisk uruchom. Na pulpicie nawigacyjnym akwizycji ustaw bramkę zatrzymującą na P jeden, a zdarzenia na rejestrowanie 30 000 zdarzeń.Naciśnij przycisk nagrywania. Powtórz to samo dla innych próbek i kontroli, naciskając następną probówkę między każdą probówką. Zmień nazwy próbek podczas uruchamiania lub po jastrzębiu i wyeksportuj dane jako pliki FCS z kropką.Otwórz oprogramowanie i przeciągnij wszystkie pliki FCS na pulpit nawigacyjny. Wybierz elementy sterujące kompensacją i przeciągnij je do podfolderu wynagrodzenia. Kliknij dwukrotnie na nietransdukowaną, niezainfekowaną probówkę, aby otworzyć plik i do przodu rozproszyć wykres kontra rozproszyć bok.Wybierz narzędzie wielokąta i bramę na nienaruszonej populacji komórek z wyłączeniem zanieczyszczeń w lewym dolnym rogu i nazwij ją komórkami. Przesuń etykietę tak, aby nie zasłaniała komórek. Przeciągnij tę bramkę do całej populacji probówek na pasku wszystkich próbek.Przewiń całą populację za pomocą poziomych przycisków strzałek, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie dla każdej rury. Kliknij dwukrotnie komórki i dostosuj osie do wysokości w stosunku do obszaru. Wybierz pojedynczą dużą populację za pomocą prostokątnej bramki, aby wykluczyć dublety i umożliwić oprogramowaniu zasugerowanie automatycznego nazwania jej pojedynczą komórką.Następnie przeciągnij tę bramkę do wszystkich populacji komórek i sprawdź, czy bramkowanie jest odpowiednie dla wszystkich próbek. Należy wybrać populację pojedynczych komórek dla niezakażonej, nietransdukowanej próbki. Zmień oś Y na skompensowany niebieski laser dla YFP i oś X na skompensowany żółty laser dla zapytania ofertowego.Wybierz narzędzie do bramkowania kwadrantów i kliknij w prawym górnym rogu ujemnej populacji komórek. Zastosuj to wstępne bramkowanie do wszystkich populacji pojedynczych komórek, przeciągając na bramkę nadrzędną na pasku wszystkich próbek. Jeśli bramki kwadrantów nie rozdzielają populacji w zadowalający sposób, należy je przebramować za pomocą narzędzia wielokątów.Przewiń do dzikiego typu SAM HD tylko jedna próbka, aby sprawdzić prawidłowe bramkowanie między nietransdukowanymi komórkami YFP ujemnymi i YFP dodatnimi. Widok konturu służy do odróżniania komórek ujemnych od przyciemnionych komórek YFP. Użyj najlepszego podziału między ujemnym i dodatnim YFP, który jest ważny dla wszystkich próbek, i przewiń próbki, aby sprawdzić bramkowanie w odniesieniu do dodatniego YFP.Przewiń do nietransdukowanej próbki zakażonej wirusem HIV RFP i sprawdź, czy bramkowanie między niezakażonym ujemnym RFP a zakażonym dodatnim RFP jest poprawne. W razie potrzeby użyj widoku konturu i przewiń pozostałe próbki, aby sprawdzić, czy bramkowanie jest prawidłowe dla wszystkich próbek. Każda próbka wymaga czterech kwadrantów.Q1 YFP pozytywne, Q2 podwójnie pozytywne, Q3 RFP pozytywne i Q4 podwójnie ujemne. Otwórz edytor tabel i przeciągnij cztery bramki kwadrantowe na pulpit nawigacyjny. Wybierz plik i excel z listy rozwijanej.Wybierz miejsce docelowe pliku i kliknij utwórz tabelę. Zapisz wygenerowany arkusz kalkulacyjny zgodnie z lokalnymi konwencjami nazewnictwa plików. Kliknij ikonę edytora układu, aby wyeksportować reprezentacje działek i strategii bramkowania.Wybierz każdą populację i przeciągnij ją do edytora z wymaganymi osiami, etykietami i odstępami. Aby utworzyć układ z tymi samymi wykresami wyświetlanymi dla wszystkich próbek w sekcji wsadu, wprowadź jeden z nich w kolumnie i naciśnij przycisk Utwórz raport wsadowy. W menu pliku wybierz opcję Skaluj do szerokości i unikaj podziałów stron.Następnie zapisz w wymaganym formacie pliku. W wyeksportowanym arkuszu kalkulacyjnym wygeneruj kolumny zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, aby uśrednić dane repliki dla każdego konstruktu SAM HD one i obliczyć wartości współczynnika restrykcji.Reprezentatywne wykresy YFP i RFP zostały wygenerowane dla danych optymalnych i nieoptymalnych. Nieoptymalny wykres danych wskazuje, że zakażenie wirusem HIV było zbyt niskie i stwarzało trudności z kompensacją i bramkowaniem. Współczynnik restrykcji wyniósł 0,5, czyli więcej niż oczekiwany współczynnik wynoszący 0,3.Wykresy współczynnika restrykcji dla wariantów SAM HD one w odniesieniu do typu dzikiego i kontroli ujemnej zostały wygenerowane dla danych optymalnych i nieoptymalnych. W danych optymalnych, typ dziki wykazał oczekiwane ograniczenie około 0,2, a kontrola ujemna HD 206 do siedmiu AA miała współczynnik restrykcji 1,0. Wariant R372D istotnie różnił się od typu dzikiego, ale nie różnił się istotnie od kontroli negatywnej i utracił zdolność do ograniczania.W danych nieoptymalnych kontrola ujemna zachowywała się zgodnie z oczekiwaniami, ale typ dziki wykazywał współczynnik restrykcji wynoszący 0,5 ze względu na niski wskaźnik infekcji. R143D wykazywał fenotyp pośredni statystycznie różniący się od typu dzikiego i kontroli negatywnej. Wariant G209S znacznie różnił się od typu dzikiego, ale nie różnił się znacząco od kontroli negatywnej, a zatem utracił zdolność do ograniczania.Ważne jest, aby mieć dużo komórek kontrolnych, szczególnie jeśli dopiero zaczynasz przygodę z cytometrią przepływową. Podążając za tym lub równolegle, można przeprowadzić analizę biochemiczną tych samych mutantów, aby stworzyć całościowy obraz.

analysis-samhd1-restriction-flow-cytometry-human-myeloid-u937

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Poznaj dwukolorową analizę cytometryczną ograniczenia SAMHD1 wobec HIV-1 w komórkach U937. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę aktywności restrykcyjnej białka i charakteryzację jego wariantów.

Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937

Przeglądaj więcej filmów