Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937

Wraz z rosnącym zainteresowaniem rolą czynników komórkowych w zakażeniu wirusem HIV makrofagów, opracowaliśmy elastyczny system analizy, szczególnie dla SAM HG one, który nie ulega ekspresji w komórkach U937. Główną zaletą systemu jest jego elastyczność. Po skonfigurowaniu może być używany do analizy różnych białek, komórek lub docelowych wirusów.

Ważne jest, aby utrzymać zdrowie komórek, a także czuć się komfortowo z wielokolorową cytometrią przepływową. Włącz cytometr i komputer na 10 minut przed rozpoczęciem analizy. Upewnij się, że odpady są puste, a zbiornik osłony jest pełny.

Następnie zaloguj się i otwórz oprogramowanie do analizy. Po przesunięciu ramienia zdejmij rurkę wodną. Ustaw natężenie przepływu na wysokie i naciśnij przycisk prime.

Poczekaj, aż światło zgaśnie i powtórz ten proces jeszcze trzy razy. Umieść rurkę wodną z powrotem i pracuj z dużym natężeniem przepływu przez trzy minuty. Następnie ustaw natężenie przepływu na niskie i naciśnij przycisk czuwania do momentu przejęcia.

Wybierz eksperyment, nowy eksperyment i naciśnij OK, aby wybrać pusty eksperyment, kliknij prawym przyciskiem myszy eksperyment i dodaj nową próbkę. Naciśnij OK, aby wygasić panel. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić nazwę na odpowiednią nazwę i otwórz próbkę, klikając znak plus, aby odsłonić nową probówkę.

Kliknij dwukrotnie rurkę, aby zobaczyć ustawienia cytometru w inspektorze. W menu parametrów usuń niepotrzebne fluorochromy z wyjątkiem niebieskiego lasera 53030 i żółtego lasera 61020. W arkuszu utwórz wykres punktowy obszaru rozproszenia do przodu i bocznego obszaru punktowego, histogram YFP, histogram RFP i wykres punktowy zapytania ofertowego i YFP, klikając odpowiednią ikonę i zmieniając osie, klikając etykietę osi.

Załaduj niezainfekowany, nietransdukowany układ sterowania i naciśnij przycisk run na maszynie. Następnie naciśnij przycisk Zdobądź na pulpicie nawigacyjnym pobierania. Dostosuj napięcie rozproszenia do przodu i bocznego na desce rozdzielczej, aby ustawić komórki w lewym dolnym kwadrancie.

Omiń tę populację i oznacz ją jako P jeden. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pozostałe działki i wybierz opcję Pokaż P jeden, aby usunąć zanieczyszczenia z późniejszej analizy. Dostosuj napięcia RFP i YFP w dół, tak aby szczyt znajdował się po lewej stronie histogramu.

Załaduj kontrolkę pojedynczego koloru dla YFP i naciśnij pobierz. Dostosuj napięcie YFP na desce rozdzielczej tak, aby najwięcej komórek fluorescencyjnych znajdowało się w zasięgu detektora. Następnie powtórz to samo dla formantu zapytania ofertowego.

Wybierz eksperyment. Przejdź do ustawień wynagrodzenia i wybierz opcję utwórz kontrolki wynagrodzenia i w porządku, aby przełączyć się na normalny arkusz, a następnie wybierz niepoplamiony normalny arkusz. Naciśnij w biegu i zdobądź nieskalaną kontrolę.

Narysuj bramkę P wokół nienaruszonych komórek i zapisz. Wyjmij rurkę i przełącz maszynę w tryb czuwania. Kliknij prawym przyciskiem myszy P jeden.

Kliknij Zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji i przełącz się na normalny arkusz RFP. Naciśnij bieg i nagraj jednokolorową kontrolkę RFP, a oprogramowanie automatycznie bramkuje dodatnie komórki. Przełącz maszynę w tryb czuwania i powtórz to samo dla sterowania YFP.

Wybierz eksperyment, przejdź do ustawień wynagrodzenia, wybierz oblicz wynagrodzenie, a następnie kliknij link i zapisz. Przełącz się na globalny arkusz roboczy i wróć do probówki z próbką. Pobrać komórki transdukowane dzikim typem SAM HD, jeden zakażony wirusem HIV RFP i sprawdzić, czy w rogach kwadrantów można zobaczyć cztery odrębne populacje ustawione pionowo i poziomo dla YFP i RFP.

Wyjmij rurkę i naciśnij przycisk czuwania. Ponownie załaduj nietransdukowaną, niezainfekowaną próbkę i naciśnij przycisk uruchom. Na pulpicie nawigacyjnym akwizycji ustaw bramkę zatrzymującą na P jeden, a zdarzenia na rejestrowanie 30 000 zdarzeń.

Naciśnij przycisk nagrywania. Powtórz to samo dla innych próbek i kontroli, naciskając następną probówkę między każdą probówką. Zmień nazwy próbek podczas uruchamiania lub po jastrzębiu i wyeksportuj dane jako pliki FCS z kropką.

Otwórz oprogramowanie i przeciągnij wszystkie pliki FCS na pulpit nawigacyjny. Wybierz elementy sterujące kompensacją i przeciągnij je do podfolderu wynagrodzenia. Kliknij dwukrotnie na nietransdukowaną, niezainfekowaną probówkę, aby otworzyć plik i do przodu rozproszyć wykres kontra rozproszyć bok

Wybierz narzędzie wielokąta i bramę na nienaruszonej populacji komórek z wyłączeniem zanieczyszczeń w lewym dolnym rogu i nazwij ją komórkami. Przesuń etykietę tak, aby nie zasłaniała komórek. Przeciągnij tę bramkę do całej populacji probówek na pasku wszystkich próbek.

Przewiń całą populację za pomocą poziomych przycisków strzałek, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie dla każdej rury. Kliknij dwukrotnie komórki i dostosuj osie do wysokości w stosunku do obszaru. Wybierz pojedynczą dużą populację za pomocą prostokątnej bramki, aby wykluczyć dublety i umożliwić oprogramowaniu zasugerowanie automatycznego nazwania jej pojedynczą komórką.

Następnie przeciągnij tę bramkę do wszystkich populacji komórek i sprawdź, czy bramkowanie jest odpowiednie dla wszystkich próbek. Należy wybrać populację pojedynczych komórek dla niezakażonej, nietransdukowanej próbki. Zmień oś Y na skompensowany niebieski laser dla YFP i oś X na skompensowany żółty laser dla zapytania ofertowego.

Wybierz narzędzie do bramkowania kwadrantów i kliknij w prawym górnym rogu ujemnej populacji komórek. Zastosuj to wstępne bramkowanie do wszystkich populacji pojedynczych komórek, przeciągając na bramkę nadrzędną na pasku wszystkich próbek. Jeśli bramki kwadrantów nie rozdzielają populacji w zadowalający sposób, należy je przebramować za pomocą narzędzia wielokątów.

Przewiń do dzikiego typu SAM HD tylko jedna próbka, aby sprawdzić prawidłowe bramkowanie między nietransdukowanymi komórkami YFP ujemnymi i YFP dodatnimi. Widok konturu służy do odróżniania komórek ujemnych od przyciemnionych komórek YFP. Użyj najlepszego podziału między ujemnym i dodatnim YFP, który jest ważny dla wszystkich próbek, i przewiń próbki, aby sprawdzić bramkowanie w odniesieniu do dodatniego YFP.

Przewiń do nietransdukowanej próbki zakażonej wirusem HIV RFP i sprawdź, czy bramkowanie między niezakażonym ujemnym RFP a zakażonym dodatnim RFP jest poprawne. W razie potrzeby użyj widoku konturu i przewiń pozostałe próbki, aby sprawdzić, czy bramkowanie jest prawidłowe dla wszystkich próbek. Każda próbka wymaga czterech kwadrantów.

Q1 YFP pozytywne, Q2 podwójnie pozytywne, Q3 RFP pozytywne i Q4 podwójnie ujemne. Otwórz edytor tabel i przeciągnij cztery bramki kwadrantowe na pulpit nawigacyjny. Wybierz plik i excel z listy rozwijanej.

Wybierz miejsce docelowe pliku i kliknij utwórz tabelę. Zapisz wygenerowany arkusz kalkulacyjny zgodnie z lokalnymi konwencjami nazewnictwa plików. Kliknij ikonę edytora układu, aby wyeksportować reprezentacje działek i strategii bramkowania.

Wybierz każdą populację i przeciągnij ją do edytora z wymaganymi osiami, etykietami i odstępami. Aby utworzyć układ z tymi samymi wykresami wyświetlanymi dla wszystkich próbek w sekcji wsadu, wprowadź jeden z nich w kolumnie i naciśnij przycisk Utwórz raport wsadowy. W menu pliku wybierz opcję Skaluj do szerokości i unikaj podziałów stron.

Następnie zapisz w wymaganym formacie pliku. W wyeksportowanym arkuszu kalkulacyjnym wygeneruj kolumny zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, aby uśrednić dane repliki dla każdego konstruktu SAM HD one i obliczyć wartości współczynnika restrykcji.

Reprezentatywne wykresy YFP i RFP zostały wygenerowane dla danych optymalnych i nieoptymalnych. Nieoptymalny wykres danych wskazuje, że zakażenie wirusem HIV było zbyt niskie i stwarzało trudności z kompensacją i bramkowaniem. Współczynnik restrykcji wyniósł 0,5, czyli więcej niż oczekiwany współczynnik wynoszący 0,3.

Wykresy współczynnika restrykcji dla wariantów SAM HD one w odniesieniu do typu dzikiego i kontroli ujemnej zostały wygenerowane dla danych optymalnych i nieoptymalnych. W danych optymalnych, typ dziki wykazał oczekiwane ograniczenie około 0,2, a kontrola ujemna HD 206 do siedmiu AA miała współczynnik restrykcji 1,0. Wariant R372D istotnie różnił się od typu dzikiego, ale nie różnił się istotnie od kontroli negatywnej i utracił zdolność do ograniczania.

W danych nieoptymalnych kontrola ujemna zachowywała się zgodnie z oczekiwaniami, ale typ dziki wykazywał współczynnik restrykcji wynoszący 0,5 ze względu na niski wskaźnik infekcji. R143D wykazywał fenotyp pośredni statystycznie różniący się od typu dzikiego i kontroli negatywnej. Wariant G209S znacznie różnił się od typu dzikiego, ale nie różnił się znacząco od kontroli negatywnej, a zatem utracił zdolność do ograniczania.

Ważne jest, aby mieć dużo komórek kontrolnych, szczególnie jeśli dopiero zaczynasz przygodę z cytometrią przepływową. Podążając za tym lub równolegle, można przeprowadzić analizę biochemiczną tych samych mutantów, aby stworzyć całościowy obraz.