Name: Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1. Ta metoda umożliwia identyfikację inhibitorów i charakteryzację substratów w badaniach biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Thomasowi Lundbäckowi i członkom laboratorium Thomasa Helledaya za rady i wsparcie. Część tych prac została ułatwiona przez Zakład Badań nad Białkami w Karolinska Institutet/SciLifeLab (http://ki.se/psf), a my dziękujemy Narodowemu Instytutowi Raka (NCI), Wydziałowi Leczenia i Diagnostyki Nowotworów (DCTD) oraz Programowi Terapii Rozwojowej (DTP) (http://dtp.cancer.gov) za dostarczenie związku. Finansowanie zostało zapewnione dzięki grantom przyznanym S.G.R. przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (2018-02114), Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), Szwedzki Fundusz Walki z Rakiem Dziecięcym (PR2019-0014) oraz Karolinska Institutet.

Schematyczny przegląd poniższych metod jest przedstawiony w Rysunek 1, a szczegółowa lista materiałów i odczynników jest dostępna w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie testowych.
<ol>
	<li>Przygotowanie zapasowych. 
	UWAGA: Ponieważ test jest wrażliwy na wykrywanie fosforanów, co może być powszechne, należy trzykrotnie spłukać szklane naczynia wodą ultraczystą lub podwójnie destylowaną, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wszystkie mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej (RT).
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l roztworu podstawowego buforu reakcyjnego (RB) SAMHD1 (25 mM octanu trisu pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2) rozpuszczając 4,5 g octanu tris, 2,3 g NaCl i 0,2 g MgCl2 w około 800 ml wody przed dostosowaniem do pH 8 i końcowej objętości.</li>
		<li>Przygotować 5 ml 0,1 M roztworu podstawowego TCEP, rozcieńczając 1 ml 0,5 M TCEP w 4 ml wody.</li>
		<li>Przygotować 50 ml 11% roztworu podstawowego Tween-20, rozcieńczając 5 ml 100% Tween-20 w 44,5 ml wody. 
		UWAGA: Tween-20 jest wrażliwy na światło.</li>
		<li>Przygotuj 50 ml 0,5 M roztworu zatrzymującego EDTA, rozpuszczając 9,3 g EDTA w około 40 ml wody przed dostosowaniem do pH 8 i końcowej objętości.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy zieleni malachitowej (MG) (3,2 mM zieleni malachitowej wH2SO4), powoli dodając 60 ml stężonego kwasu siarkowego do 300 ml wody w brązowej szklanej butelce. Schłodzić roztwór do temperatury suchej i rozpuścić 0,44 g zieleni malachitowej. 
		ostrożność: Reakcja kwasu siarkowego z wodą jest egzotermiczna, więc butelka może się nagrzewać, powodując wzrost ciśnienia; Upewnij się, że to ciśnienie jest często uwalniane. 
		UWAGA: Otrzymany pomarańczowy roztwór jest wrażliwy na światło (stąd brązowa butelka) i stabilny przez co najmniej 1 rok w temperaturze pokojowej. Osad może tworzyć się z czasem, upewnij się, że używany jest tylko supernatant.</li>
		<li>Przygotować 50 ml 7% roztworu podstawowego molibdenianu amonu, rozpuszczając 3,75 g molibdenianu amonu w 50 ml wody. 
		UWAGA: Osad może tworzyć się z czasem, upewnij się, że używany jest tylko supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kompletnych do oznaczania 
	UWAGA: Należy to zrobić w dniu eksperymentu
	<ol>
		<li>Przygotuj kompletny SAMHD1 RB (25 mM Tris-Acetate pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20). Użyj wcześniej przygotowanych zapasów 11% Tween-20 i 0,1 M TCEP, aby dodać te składniki w końcowym stężeniu 0,005% dla Tween-20 i 0,3 mM dla TCEP do zapasów SAMHD1 RB.</li>
		<li>Przygotować roztwór zatrzymujący EDTA (25 mM octan trisu pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20, 7,9 mM EDTA). Aby ukończyć SAMHD1 RB, użyj 0,5 M roztworu podstawowego EDTA, aby dodać EDTA do końcowego stężenia 7,9 mM.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy MG (2,5 mM zieleni malachitowej, 1,4% molibdenianu amonu, 0,18% Tween-20) mieszając 10 części roztworu podstawowego MG z 2,5 częściami 7% molibdenianu amonu i 0,2 części 11% Tween-20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test inhibicji SAMHD1 i oznaczanie związku IC50
UWAGA: Końcowe warunki testu są pokazane w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Przygotowanie związków na płytce do oznaczania 
	UWAGA: Związki o małej masie cząsteczkowej są zwykle rozpuszczane w 100% DMSO, a analogi nukleotydów w wodzie. Stężenie wyjściowe waha się od 10 do 100 mM i zależy od siły działania i rozpuszczalności związków, a także tolerancji DMSO testu. Sprawdź, czy końcowe stężenie DMSO w reakcji nie przekracza 1%, aby upewnić się, że ten rozpuszczalnik nie ma wpływu na aktywność enzymów. Dobrą praktyką jest zbadanie tolerancji testu na rozpuszczalnik przed rozpoczęciem doświadczenia.
	<ol>
		<li>Przygotować seryjnie rozcieńczone związki testowe o 100-krotnym stężeniu końcowym w odpowiednim rozpuszczalniku (np. 100% DMSO dla małych cząsteczek lub woda dla analogów nukleotydów) na przezroczystej, okrągłodennej 96-dołkowej płytce polipropylenowej za pomocą wielokanałowej pipety lub zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy. 
		UWAGA: W zależności od stabilności związku, płytki rozcieńczające mogą być przygotowane z wyprzedzeniem, szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 °C. Poczekaj, aż płytki zrównoważą się do RT przed kontynuowaniem protokołu.</li>
		<li>Używając kompletnego SAMHD1 RB, rozcieńczyć związki do 25-krotnego stężenia końcowego (aby utrzymać końcowe stężenie rozpuszczalnika poniżej 1%) i przenieść 5 μl do odpowiednich studzienek na przezroczystej, 384-dołkowej, płaskodennej płytce testowej. Powtórzyć procedurę z próbkami kontrolnymi zawierającymi tylko rozpuszczalnik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie składników reakcji 
	UWAGA: Należy to zrobić w dniu testu. Rekombinowane podwielokrotności ludzkiej pirofosfatazy SAMHD1 i E. coli (PPazy) są przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C, rozcieńczone odpowiednio w stężeniu 9,1 mg/ml i 23,0 mg/ml w buforze do przechowywania (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glicerolu, 2 mM TCEP). Po rozmrożeniu podwielokrotności są przechowywane przez krótki czas w temperaturze -20 °C.
	<ol>
		<li>Przygotować główną mieszankę enzymów (SAMHD1/PPazy) poprzez rozcieńczenie rekombinowanego ludzkiego białka SAMHD1 i rekombinowanej PPazy w pełnym SAMHD1 RB do 4x pożądanego stężenia końcowego, a więc 1,4 μM SAMHD1 i 50 U/ml PPazy.</li>
		<li>Przygotować aktywator/substrat dGTP, rozcieńczając materiał dGTP (zwykle 10 lub 100 mM w wodzie) w pełnym SAMHD1 RB do 2x końcowego stężenia, a więc 50 μM dGTP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test<br />
	UWAGA: Wszystkie składniki testu powinny być zrównoważone z RT. Dodawanie cieczy można wykonać za pomocą pipety wielokanałowej lub dozownika płynu z odczynnikiem luzem.
	<ol>
		<li>Na 384-dołkową płytkę testową zawierającą rozcieńczenia związków i kontrole zawierające tylko rozpuszczalnik, dozować 5 μl głównej mieszanki SAMHD1/PPazy. Do braku studzienek kontroli enzymów należy dozować 5 μl kompletnego SAMHD1 RB. Wstępnie inkubować enzymy i związki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Do wszystkich studzienek należy dozować 10 μl 2x roztworu dGTP, aby rozpocząć reakcję.</li>
		<li>Inkubować reakcję przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dozując 20 μl roztworu zatrzymującego EDTA do wszystkich studzienek. 
		UWAGA: W razie potrzeby eksperyment można w tym miejscu wstrzymać.</li>
		<li>Dodać 10 μl MG roztworu roboczego do wszystkich studzienek. 
		ostrożność: Roztwór roboczy MG zawiera kwas siarkowy.</li>
		<li>Zapewnić wymieszanie zawartości studzienki za pomocą orbitalnej wytrząsarki mikrodołkowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odczytaj absorpcję przy długości fali 630 nm w czytniku płytek mikrodołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja i analiza danych
	<ol>
		<li>Obliczyć średnią i odchylenie standardowe studzienek kontroli dodatniej i ujemnej (dodatnia, pełna reakcja z rozpuszczalnikiem; ujemna, dGTP sama z rozpuszczalnikiem). Oblicz współczynnik Z37 jako wskaźnik jakości testu.</li>
		<li>Znormalizować każdą wartość absorbancji do średnich wartości kontroli dodatniej i ujemnej, ustawiając kontrolę dodatnią na 100% aktywność SAMHD1, a kontrolę ujemną na 0% aktywność SAMHD1.</li>
		<li>Wykreślić aktywność SAMHD1 (%) w funkcji stężenia związku i dopasować czteroparametrową krzywą nachylenia dawka-odpowiedź, co pozwala na określenie IC50 związku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Aktywator SAMHD1 i ekran podłoża
UWAGA: Końcowe warunki testu są pokazane w Tabeli 2. Rekombinowane podwielokrotności SAMHD1 i PPazy są przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C, rozcieńczone odpowiednio w stężeniu 9,1 mg/ml i 23,0 mg/ml w buforze do przechowywania (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glicerolu, 2 mM TCEP) w temperaturze -80 °C. Po rozmrożeniu podwielokrotności są przechowywane przez krótki czas w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Przygotowanie analogów nukleotydów na płytce testowej
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć analogi nukleotydów (zwykle 10 lub 100 mM w wodzie) do 4x końcowego stężenia w kompletnym SAMHD1 RB, w naszym przypadku analogu nukleotydu 800 μM, i przenieść 5 μL do odpowiednich studzienek 384-dołkowej płytki testowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie składników reakcji 
	UWAGA: Należy to zrobić w dniu testu
	<ol>
		<li>Przygotować główną mieszankę enzymów (SAMHD1/PPazy) poprzez rozcieńczenie rekombinowanego ludzkiego białka SAMHD1 i rekombinowanej PPazy E. coli w pełnym SAMHD1 RB do 2x pożądanego stężenia końcowego, a więc 0,7 μM SAMHD1 i 25 U/ml PPazy.</li>
		<li>Przygotować roztwór samej PPazy, rozcieńczając rekombinowaną PPazę E. coli w pełnym SAMHD1 RB do 2x pożądanego stężenia końcowego, a więc 25 U/ml PPazy.</li>
		<li>Przygotować aktywatory GTP (AS1) i dGTPαS (AS1 i AS2) rozcieńczające (zwykle 10 lub 100 mM w wodzie) w pełnym SAMHD1 RB do 4-krotnego stężenia końcowego, a więc 50 μM GTP lub dGTPαS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test<br />
	UWAGA: Wszystkie składniki testu powinny być zrównoważone z RT. Dodawanie cieczy można wykonać za pomocą pipety wielokanałowej lub dozownika płynu z odczynnikiem luzem.
	<ol>
		<li>Do 384-dołkowej płytki testowej zawierającej analogi nukleotydów dozować 5 μl aktywatora (GTP lub dGTPαS) lub pełnego SAMHD1 RB do odpowiednich studzienek.</li>
		<li>Rozpocznij reakcję od dozowania 10 μl głównej mieszanki SAMHD1/PPazy, samej PPazy lub całego SAMHD1 RB do odpowiednich studzienek.</li>
		<li>Inkubować reakcję przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dozując 20 μl roztworu zatrzymującego EDTA do wszystkich studzienek. 
		UWAGA: W razie potrzeby eksperyment można w tym miejscu wstrzymać.</li>
		<li>Dodać 10 μl MG roztworu roboczego do wszystkich studzienek. 
		ostrożność: Roztwór roboczy MG zawiera kwas siarkowy.</li>
		<li>Zapewnić wymieszanie zawartości studzienki za pomocą orbitalnej wytrząsarki mikrodołkowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odczytaj absorpcję przy długości fali 630 nm w czytniku płytek mikrodołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja i analiza danych
	<ol>
		<li>Obliczyć średnie wartości absorbancji dla studzienek reakcyjnych tylko dla PPazy (kontrola ujemna lub sygnał tła). 
		UWAGA: Jako pozytywna kontrola aktywatora allosterycznego SAMHD1 i substratu, dGTP może być zawarty w płytce. W takim przypadku można użyć tego warunku do obliczenia współczynnika Z jako wskaźnika jakości testu.</li>
		<li>Odejmij wartość tła od odpowiednich studzienek w reakcjach SAMHD1/PPase.</li>
		<li>Wykreślić skorygowane wartości absorbancji dla każdego analogu nukleotydu z warunkami buforu, GTP i dGTPαS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Franzolin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deoxynucleotide+triphosphohydrolase+SAMHD1+is+a+major+regulator+of+DNA+precursor+pools+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The deoxynucleotide triphosphohydrolase SAMHD1 is a major regulator of DNA precursor pools in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14272-14277 (2013).</li>
<li>Coggins, S. A., Mahboubi, B., Schinazi, R. F., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+functions+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 functions and human diseases.</a> Viruses. 12 (4), 382(2020).</li>
<li>Goldstone, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+restriction+factor+SAMHD1+is+a+deoxynucleoside+triphosphate+triphosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase.</a> Nature. 480 (7377), 379-382 (2011).</li>
<li>Powell, R. D., Holland, P. J., Hollis, T., Perrino, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aicardi-Goutieres+syndrome+gene+and+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1+is+a+dGTP-regulated+deoxynucleotide+triphosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (51), 43596-43600 (2011).</li>
<li>Morris, E. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+Allostery+and+catalysis+in+the+anti-viral+protein+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The missing link: Allostery and catalysis in the anti-viral protein SAMHD1.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1013-1027 (2019).</li>
<li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2015).</li>
<li>Herold, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SAMHD1+with+the+Vpx+protein+to+improve+cytarabine+therapy+for+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting SAMHD1 with the Vpx protein to improve cytarabine therapy for hematological malignancies.</a> Nature Medicine. 23 (2), 256-263 (2017).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+a+biomarker+for+cytarabine+response+and+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia.</a> Nature Medicine. 23 (2), 250-255 (2017).</li>
<li>Hollenbaugh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+and+inhibitors+of+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Substrates and inhibitors of SAMHD1.</a> PloS One. 12 (1), 0169052(2017).</li>
<li>Knecht, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+cancer+drug+interactions+with+the+catalytic+and+allosteric+sites+of+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The structural basis for cancer drug interactions with the catalytic and allosteric sites of SAMHD1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10022-10031 (2018).</li>
<li>Oellerich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inactivation+of+hypomethylating+agents+by+SAMHD1+provides+a+rationale+for+therapeutic+stratification+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Selective inactivation of hypomethylating agents by SAMHD1 provides a rationale for therapeutic stratification in AML.</a> Nature Communications. 10 (1), 3475(2019).</li>
<li>Herold, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+protects+cancer+cells+from+various+nucleoside-based+antimetabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 protects cancer cells from various nucleoside-based antimetabolites.</a> Cell Cycle. 16 (11), 1029-1038 (2017).</li>
<li>Rothenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+a+key+regulator+of+the+lineage-specific+response+of+acute+lymphoblastic+leukaemias+to+nelarabine%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is a key regulator of the lineage-specific response of acute lymphoblastic leukaemias to nelarabine.</a> Communications Biology. 3 (1), 324(2020).</li>
<li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+enhances+nucleoside-+analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 enhances nucleoside- analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824(2017).</li>
<li>Castellví, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+modulation+of+SAMHD1+activity+by+CDK4%2F6+inhibitors+improves+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pharmacological modulation of SAMHD1 activity by CDK4/6 inhibitors improves anticancer therapy.</a> Cancers. 12 (3), 713-719 (2020).</li>
<li>Rassidakis, G. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+expression+of+SAMHD1+in+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29+blasts+correlates+with+improved+outcome+upon+consolidation+chemotherapy+with+high-dose+cytarabine-based+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">Low-level expression of SAMHD1 in acute myeloid leukemia (AML) blasts correlates with improved outcome upon consolidation chemotherapy with high-dose cytarabine-based regimens.</a> Blood Cancer Journal. 8 (11), 98(2018).</li>
<li>Rudd, S. G., Schaller, T., Herold, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+a+barrier+to+antimetabolite-based+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is a barrier to antimetabolite-based cancer therapies.</a> Molecular & Cellular Oncology. 4 (2), 1287554(2017).</li>
<li>Rudd, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotide+reductase+inhibitors+suppress+SAMHD1+ara-CTPase+activity+enhancing+cytarabine+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotide reductase inhibitors suppress SAMHD1 ara-CTPase activity enhancing cytarabine efficacy.</a> EMBO Molecular Medicine. 41, 10419(2020).</li>
<li>Seamon, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+SAMHD1+dNTPase+by+tetramer+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of SAMHD1 dNTPase by tetramer destabilization.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (28), 9822-9825 (2014).</li>
<li>Seamon, K. J., Stivers, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+enzyme-coupled+assay+for+SAMHD1+dNTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput enzyme-coupled assay for SAMHD1 dNTPase.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (6), 801-809 (2015).</li>
<li>Mauney, C. H., Perrino, F. W., Hollis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+inhibitors+of+the+dNTP+triphosphohydrolase+SAMHD1+using+a+novel+and+direct+high-throughput+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of inhibitors of the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1 using a novel and direct high-throughput assay.</a> Biochemistry. 57 (47), 6624-6636 (2018).</li>
<li>Morris, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+SAMHD1+inhibitor+complexes+reveal+the+mechanism+of+water-mediated+dNTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of SAMHD1 inhibitor complexes reveal the mechanism of water-mediated dNTP hydrolysis.</a> Nature Communications. 11 (1), 3165(2020).</li>
<li>Hansen, E. C., Seamon, K. J., Cravens, S. L., Stivers, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+activator+and+dNTP+substrates+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1+generate+a+long-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GTP activator and dNTP substrates of HIV-1 restriction factor SAMHD1 generate a long-lived activated state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (18), 1843-1851 (2014).</li>
<li>Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+malachite+green+procedure+for+orthophosphate+determination+and+its+use+in+alkaline+phosphatase-based+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay.</a> Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).</li>
<li>Hyun, M., Bohr, V. A., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+the+WRN-1+RecQ+helicase+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of the WRN-1 RecQ helicase of Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 47 (28), 7583-7593 (2008).</li>
<li>Lin, H. -H., Huang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+flavonol+inhibition+of+DnaB+helicase%3A+real-time+monitoring%2C+structural+modeling%2C+and+proposed+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of flavonol inhibition of DnaB helicase: real-time monitoring, structural modeling, and proposed mechanism.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012 (4), 735368(2012).</li>
<li>Yang, M., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+measurement+of+DNA+replicative+helicase+from+Bacillus+stearothermophilus+by+malachite+green+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">ATPase activity measurement of DNA replicative helicase from Bacillus stearothermophilus by malachite green method.</a> Analytical Biochemistry. 509, 46-49 (2016).</li>
<li>Allard, B., Cousineau, I., Spring, K., Stagg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+CD73+enzymatic+activity+using+luminescence-based+and+colorimetric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of CD73 enzymatic activity using luminescence-based and colorimetric assays.</a> Methods in Enzymology. 629, 269-289 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+sulfonyl+piperazine+LpxH+inhibitors+analyzed+by+an+LpxE-coupled+malachite+green+assay%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of sulfonyl piperazine LpxH inhibitors analyzed by an LpxE-coupled malachite green assay.</a> ACS Infectious Diseases. 5 (4), 641-651 (2019).</li>
<li>Carreras-Puigvert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structural%2C+biochemical+and+biological+profiling+of+the+human+NUDIX+hydrolase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structural, biochemical and biological profiling of the human NUDIX hydrolase family.</a> Nature Communications. 8 (1), 1541(2017).</li>
<li>Valerie, N. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUDT15+hydrolyzes+6-thio-deoxyGTP+to+mediate+the+anticancer+efficacy+of+6-thioguanine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NUDT15 hydrolyzes 6-thio-deoxyGTP to mediate the anticancer efficacy of 6-thioguanine.</a> Cancer Research. 76 (18), 5501-5511 (2016).</li>
<li>Carter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NUDT22+Is+a+UDP-glucose%2Fgalactose+hydrolase+exhibiting+a+unique+structural+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Human NUDT22 Is a UDP-glucose/galactose hydrolase exhibiting a unique structural fold.</a> Structure. 26 (2), 295-303 (2018).</li>
<li>Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTH1+inhibition+eradicates+cancer+by+preventing+sanitation+of+the+dNTP+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool.</a> Nature. 508 (7495), 215-221 (2014).</li>
<li>Page, B. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+NUDT5+inhibitors+block+hormone+signaling+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted NUDT5 inhibitors block hormone signaling in breast cancer cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 250(2018).</li>
<li>Zhang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+chemical+probe+against+NUDT15%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a chemical probe against NUDT15.</a> Nature Chemical Biology. 16 (10), 1120-1128 (2020).</li>
<li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+druggability+assessment+of+the+NUDIX+hydrolase+protein+family+as+a+workflow+for+target+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In silico druggability assessment of the NUDIX hydrolase protein family as a workflow for target prioritization.</a> Frontiers in Chemistry. 8, 443(2020).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67(1999).</li>
<li>Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+malachite+green+procedure+for+orthophosphate+determination+and+its+use+in+alkaline+phosphatase-based+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay.</a> Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).</li>
<li>Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+guidance+manual%5BTitle%5D)+AND+%22Eli+Lilly+%26+Company+and+the+National+Center+for+Advancing+Translational+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assay guidance manual.</a> Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+enzymology+in+drug+discovery%3A+a+fresh+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).</li>
<li>Tsesmetzis, N., Paulin, C. B. J., Rudd, S. G., Herold, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleobase+and+nucleoside+analogues%3A+resistance+and+re-sensitisation+at+the+level+of+pharmacokinetics%2C+pharmacodynamics+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Nucleobase and nucleoside analogues: resistance and re-sensitisation at the level of pharmacokinetics, pharmacodynamics and metabolism.</a> Cancers. 10 (7), 240(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj test aktywności sprzężonej z enzymami jest testem kolorymetrycznym o wysokiej przepustowości, umożliwiającym pośredni pomiar hydrolizy dNTP przez SAMHD1. Metoda ta wykorzystuje zdolność nieorganicznej PPazy z E. coli, która po włączeniu do mieszaniny reakcyjnej w nadmiarze przekształca każdy nieorganiczny trifosforan wygenerowany przez SAMHD1 w trzy pojedyncze wolne fosforany, które można określić ilościowo za pomocą prostego i ekonomicznego odczynnika zieleni malachitowej. Dostarczamy ten test w formacie płytki mikrodołkowej 384, która jest idealna do badań przesiewowych bibliotek związków i pokazujemy zastosowanie i wszechstronność tej techniki w identyfikacji i charakterystyce inhibitorów, aktywatorów i substratów SAMHD1.
Podobnie jak w przypadku wszystkich biochemicznych testów przesiewowych in vitro , istnieje szereg krytycznych etapów i ważnych kwestii, a wiele z nich zostało szczegółowo omówionych w ogólnodostępnym Podręczniku wytycznych dotyczących testów39. Integralność oczyszczonych rekombinowanych enzymów, zarówno SAMHD1, jak i sprzężonego enzymu nieorganicznej PPazy, jest niezwykle ważna i powinna zostać potwierdzona przed ustaleniem testu. W związku z tym każde nowe oczyszczanie tych enzymów powinno podlegać pewnemu poziomowi testów seriowych, ponieważ zmienność między partiami może wprowadzać niespójności w wynikach. Idealnie byłoby, gdyby zastosowanie ortogonalnego testu bezpośredniego, takiego jak HPLC, który umożliwia wykrycie zarówno substratu, jak i produktu reakcji, było stosowane w celu sprawdzenia aktywności trifosfohydrolazy dNTP w stosowanym rekombinowanym SAMHD1.
Jeśli chodzi o ograniczenia tego testu, zasadniczą zasadą jest to, że mierzy on aktywność dNTPazy SAMHD1 w sposób pośredni, wykorzystując aktywność nieorganicznej PPazy, co ma szereg implikacji. Ważne jest, aby potwierdzić, że PPaza ma niewielką lub żadną aktywność w stosunku do nukleotydów użytych w teście, a także, że zidentyfikowane małe cząsteczki hamujące nie wykazują żadnej aktywności w stosunku do PPazy. Tak więc, jeśli chodzi o badania przesiewowe, ważnym czynnikiem może być przeciwdziałanie PPazie. Obecność PPazy w reakcji sprawia również, że kluczowe znaczenie ma użycie testu ortogonalnego w celu potwierdzenia wyników. Jeśli chodzi o testy aktywności bezpośredniej, do tej pory zgłoszono wiele z nich, w tym TLC 9,20,23 i HPLC 9,21, które dokładnie wykrywają wyczerpanie substratu i tworzenie produktu. Ponadto test b4NPP21, który jest również wysokoprzepustowy, może być wykorzystany do testowania potencjalnych inhibitorów; Nie jest to jednak idealne rozwiązanie do testowania substratów lub aktywatorów allosterycznych. Testy biofizyczne, takie jak różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF), które wcześniej opisywaliśmy w przypadku SAMHD118, mogą być również szczególnie skuteczne w identyfikacji i charakterystyce ligandów. Innym ograniczeniem testu, w szczególności pokazanym w konfiguracji do identyfikacji substratów i aktywatorów, jest użycie niehydrolizowanego analogu dGTP dGTPαS jako aktywatora AS1 i AS2. Chociaż pozwala to na aktywację SAMHD1 bez obserwowalnej aktywności w teście, dGTPαS jest konkurencyjnym inhibitorem SAMHD1, a zatem zastosowanie wysokich stężeń spowoduje dezaktywację enzymu. Wraz z postępem w zrozumieniu SAMHD1, przyszłe badania mogą wykorzystywać cząsteczki, które zajmują wyłącznie każde miejsce SAMHD1, negując w ten sposób ten potencjalny problem.
Jak wykazaliśmy tutaj, metoda ta jest wszechstronna i może być stosowana do rozwiązywania wielu pytań biochemicznych. Opisaliśmy dwie wersje tego testu, jedną do identyfikacji regulatorów allosterycznych i substratów SAMHD1, a drugą do charakterystyki inhibitorów, ale można dokonać dalszych adaptacji. Jeśli chodzi o potencjalne inhibitory, test ten, oparty na płytce mikrodołkowej, dobrze nadaje się do dalszych badań nad mechanizmem działania39,40. Podobnie, w celu dalszej charakterystyki substratów i regulatorów allosterycznych, technika ta może być wykorzystana do określenia parametrów kinetycznych katalizy, tak jak to zrobiliśmy dla aktywnego metabolitu cytarabiny i klofarabiny7. Jednak jedną wadą jest to, że opisany tutaj test sprzężony z enzymami jest testem końcowym, a więc, chociaż dobrze nadaje się do badań przesiewowych, test ciągły byłby lepiej odpowiedni dla niektórych badań mechanistycznych. Arnold i in. opisali ciągły test sprzężony z enzymami, który wykorzystuje bioczujnik MDCC-PBP6, który opiera się na użyciu peryplazmatycznego białka wiążącego fosforan (PBP) znakowanego fluoroforem maleimidu kumaryny (MDCC), który może wiązać się z wolną grupą fosforanową. MDCC-PBP jest bardzo czuły i umożliwia ilościowe określanie bardzo niskich stężeń fosforanów, przy czym czas reakcji czujnika mieści się w skali od milisekundy do sekundy.
SAMHD1 pełni szereg ważnych funkcji w zdrowiu i chorobie człowieka2 , z których wiele można powiązać z jego centralną rolą w utrzymaniu wewnątrzkomórkowego poziomu dNTP1. Tak więc identyfikacja wysokiej jakości sondy chemicznej w kierunku aktywności dNTPazy SAMHD1 byłaby potężnym narzędziem w definiowaniu tych powiązań, a opisany tutaj test sprzężony z enzymami może być łatwo wykorzystany do identyfikacji takich sond. Ponadto, ponieważ leki na bazie nukleozydów, z których wiele jest modulowanych przez SAMHD1, stanowią zróżnicowaną i ważną grupę terapeutyczną41; Sondy chemiczne mogą być dalej rozwijane w celu opracowania leków ukierunkowanych na SAMHD1 w warunkach klinicznych, w celu zwiększenia skuteczności tych terapii. Kluczowe znaczenie ma również zrozumienie pełnego zakresu interakcji tych związków na bazie nukleozydów z SAMHD1, na które pytanie można odpowiedzieć również za pomocą tego testu sprzężonego z enzymami. Podsumowując, sprzężony z enzymami test aktywności SAMHD1, opisany tutaj, jest tanim, wszechstronnym i wysokoprzepustowym testem, który można wykorzystać do pogłębienia naszego zrozumienia tego ważnego enzymu.

Sterylny motyw alfa i białko 1 (SAMHD1) zawierające domenę histydyny i asparaginianu jest centralnym regulatorem homeostazy nukleotydów w komórkach ssaków1 pełni wiele ról w ludzkim zdrowiu i chorobie2. Enzym ten jest zdolny do hydrolizy trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP) do ich pokrewnych cząsteczek deoksynukleozydów i nieorganicznych trifosforanów3,4, przy czym aktywność ta jest allosterycznie regulowana przez obfitość (d)NTP (przejrzane w reference5). Każdy monomer SAMHD1 zawiera dwa miejsca allosteryczne (AS1 i AS2) i jedno miejsce katalityczne, a tworzenie aktywnego enzymu wymaga uporządkowanego złożenia homotetrameru po związaniu (d)NTP. Dimeryzacja monomerów SAMHD1 jest najpierw wyzwalana przez wiązanie trifosforanu guaniny (GTP lub dGTP) z AS1, a następnie tetrameryzacja jest osiągana, gdy dodatkowa cząsteczka dNTP wiąże się z AS2, umożliwiając dostęp substratu do miejsca katalitycznego, a następnie hydrolizę.
Substraty SAMHD1 obejmują cztery kanoniczne dNTPs3,4 wraz z niektórymi nukleotydami modyfikowanymi zasadami i cukrem, w tym metabolity trifosforanowe kilku leków na bazie nukleozydów stosowanych w leczeniu infekcji wirusowych i raka, z których kilka może również służyć jako aktywatory allosteryczne6,7,8,9,10,11. W konsekwencji SAMHD1 moduluje skuteczność wielu z tych związków w modelach chorób7,8,9,10,11,12,13,14,15, a ponadto w przypadku analogu deoksycytydyny cytarabiny (ara-C), który od dziesięcioleci pozostaje standardową terapią ostrej białaczki szpikowej (AML), faktycznie decyduje o skuteczności leczenia w tej chorobie7,8,16. SAMHD1 jest zatem potencjalnym biomarkerem i celem terapeutycznym w celu poprawy skuteczności terapii opartych na nukleozydach17, w związku z czym my i inni staraliśmy się zidentyfikować strategie dezaktywacji SAMHD1 w komórkach. Zaproponowaliśmy użycie białka wirusowego X (Vpx) jako inhibitora biologicznego do ukierunkowania SAMHD1 na degradację wewnątrz komórek rakowych7, jednak podejście to ma szereg ograniczeń (omówionych w reference12), a ostatnio również opisaliśmy pośrednie podejście do tłumienia aktywności SAMHD1 poprzez hamowanie reduktazy rybonukleotydowej, które wykazaliśmy w różnych modelach AML18. Wiele badań miało na celu zidentyfikowanie małych cząsteczek zdolnych do bezpośredniego hamowania SAMHD1 i do tej pory zgłoszono kilka takich cząsteczek, jednak udokumentowano tylko hamowanie in vitro6,9,19,20,21,22. W związku z tym brak małych cząsteczek, które silnie hamują aktywność SAMHD1 w komórkach, w połączeniu ze złożonymi mechanizmami katalizy SAMHD1 w terapiach opartych na nukleozydach, podkreśla potrzebę dalszych badań. W związku z tym solidne i idealnie wysokoprzepustowe metody badania interakcji małych cząsteczek z SAMHD1 są idealne do identyfikacji substratów, regulatorów allosterycznych i inhibitorów tego klinicznie istotnego enzymu.
Dostępnych jest kilka metodologii, które bezpośrednio mierzą aktywność dNTPazy SAMHD1, takich jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC)9,20,23 oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)9,21, ale nie są one łatwo podatne na konfiguracje o wysokiej przepływności. Jednym z wyjątków jest test opisany przez Mauneya i wsp., który wykorzystuje zdolność SAMHD1 do hydrolizy fosforanu bis (4-nitrofenylu) (b4NPP) do p-nitrofenolu i fosforanu p-nitrofenylu, gdy Mn2+ jest używany jako kation aktywujący, co skutkuje zmianą kolorymetryczną, którą można łatwo zmierzyć na płytce mikrodołkowej21. Test ten został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów SAMHD1, ale należy zauważyć, że hydroliza zachodzi przy braku aktywatorów (d) NTP i w obecności prawdopodobnego niefizjologicznego kationu aktywującego, przy czym oba te zastrzeżenia są ważnymi zastrzeżeniami do rozważenia. Sprawia to również, że test ten ma mniejsze zastosowanie do badania i identyfikacji regulatorów allosterycznych SAMHD1.
W tym kontekście, podejście sprzężone z enzymem w połączeniu z odczynnikiem malachitowym zielonym, jak szczegółowo opisano w tym raporcie, może być wszechstronną metodą pośredniego pomiaru aktywności dNTPazy SAMHD1 i, ponadto, badania wpływu różnych małych cząsteczek na nią. Test zieleni malachitowej jest solidną i niezawodną techniką kolorymetryczną do wykrywania wolnego fosforanu nieorganicznego (Pi), opartą na tworzeniu kompleksu kwasu molibdofosforowego, który prowadzi do zmiany kolorymetrycznej mierzonej przy 620 nm24. Ponieważ hydroliza SAMHD1 uwalnia grupę trifosforanową z substratów nukleotydowych, konieczne jest sprzężenie tej reakcji z aktywnością (piro)fosfatazy, która wytworzy wolny nieorganiczny fosforan, przed dodaniem odczynnika zieleni malachitowej. Test zieleni malachitowej jest czuły i opłacalny i jest szeroko stosowany do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów i substratów enzymów, które uwalniają nieorganiczne grupy fosforanowe w swoich reakcjach lub w obecności enzymu sprzęgającego. Jest szeroko stosowany w charakterystyce aktywności ATPazy helikaz25,26,27, lub w badaniu aktywności enzymatycznej CD73, która pośredniczy w degradacji AMP do adenozyny i fosforanu nieorganicznego28. Dodatkowo, po sprzężeniu, został wykorzystany do odkrycia antybiotyków ukierunkowanych na pirofosfatazę UDP-2,3-diacyloglukozaminy LpxH, niezbędny enzym w większości patogenów Gram-ujemnych29. Jeśli chodzi o badania nad rakiem, podejście sprzężone z enzymami zostało szeroko wdrożone w odniesieniu do hydrolaz NUDIX, rodziny enzymów metabolizujących nukleotydy, zarówno w charakterystyce substratów30,31,32 jak i w identyfikacji i rozwoju leków i sond chemicznych33,34,35,36.
Jeśli chodzi o dNTPase SAMHD1, to podejście zostało wykorzystane w kilku raportach. Wykorzystując egzopolifosfatazę Ppx1 z Saccharomyces cerevisiae jako enzym sprzęgający, test ten został wykorzystany do przetestowania kilku analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów lub inhibitorów SAMHD1 i doprowadził do identyfikacji metabolitu trifosforanowego leku przeciwbiałaczkowego klofarabiny jako aktywatora i substratu6. Dodatkowo, z nieorganiczną pirofosfatazą z Escherichia coli jako enzymem sprzęgającym, został on wykorzystany w badaniach przesiewowych biblioteki klinicznie zatwierdzonych związków przeciwko SAMHD1 w celu identyfikacji inhibitorów20. W naszych badaniach wykorzystaliśmy to podejście, aby pokazać, że ara-CTP, aktywny metabolit ara-C, jest substratem SAMHD1, ale nie aktywatorem allosterycznym7, a następnie użyliśmy tego testu, aby pokazać, że kilka małych cząsteczek, które mogą uwrażliwiać modele AML na ara-C w sposób zależny od SAMHD1, w rzeczywistości nie hamują bezpośrednio SAMHD118. W tym raporcie szczegółowo omówimy tę wszechstronną metodę i zademonstrujemy jej przydatność, w konfiguracji o wysokiej przepustowości, do identyfikacji inhibitorów, aktywatorów i substratów SAMHD1.

<table><tbody><tr><td>2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforan (dATP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1001</td><td>Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1</td></tr> 2<tr><td>'-deoksycytydyno-5'-trifosforan (dCTP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1002</td><td>Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1</td></tr> 2<tr><td>'-deoksyguanozyno-5'-(alfa;-tio)-trifosforan (dGTP&alpha; S)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-424</td><td>Niehydrolizowalny analog dGTP do testu aktywatora/substratu SAMHD1</td></tr><tr><td>2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforan (dGTP)</td> <td>GE Healthcare</td><td>27-1870-04</td><td>Aktywator allosteryczny i substrat SAMHD1 stosowany w teście inhibicji i teście aktywator/substrat</td></tr><tr><td>2'-Deoksytymidyno-5'-[(&alfa;,&beta;)-imido]trifosforan (dTMPNPP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-907-1</td><td>Związek testowany w teście hamowania SAMHD1</td></tr><tr><td>2'-deoksytymidyno-5'-trifosforan (dTTP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1004</td><td>Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1</td></tr><tr><td>2'Deoksyguanozyna mohohydrat (dGuo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0901</td><td>Związek testowany w teście hamowania SAMHD1</td></tr><tr><td>384 dobrze czysty płaskie dno&nbsp; mikropłytka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>262160</td><td>Płytka testowa</td></tr><tr><td>96 dobrze przezroczysta polipropylen w kształcie litery U&nbsp; mikropłytka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267245</td><td>Płytka do rozcieńczania związków</td></tr><tr><td>Tetrahydrat heptamolibdenianu amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td>Odczynnik wymagany do odczynnika roboczego malachit</td></tr><tr><td>green ara-Cytidine-5'-trifosforan (ara-CTP)</td><td>Jena biologia</td><td>NU-1170</td><td>Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1</td></tr><tr><td>Klofarabina-5'-trifosforan (Cl-F-ara-ATP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-874</td><td>Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1</td></tr><tr><td>Sulfoxide dimetylu (DMSO)</td><td>VWR</td><td>23486.297</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodian (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>EDTA stop składnik roztworu</td></tr><tr><td>Gemcytabina-5'-trifosforan (dF-dCTP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1607</td><td>Związek testowany w teście aktywator/substrat SAMHD1</td></tr><tr><td>GraphPad</td><td>Prism Oprogramowanie GraphPad</td><td>Prism 8</td><td>Analiza i wizualizacja danych</td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5&prime;-trifosforanu guanozyny (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>Aktywator allosteryczny do testu aktywatora/substratu SAMHD1</td></tr><tr><td>Nieorganiczna pirofosfataza E. coli&nbsp; (PPaza)</td><td>Generowane w domu przy użyciu Protein Science Facility, Karolinska</td> Institutet-Recombinant <td></td><td>PPase białko, hydrolizuje nieorganiczny trifosforan i pirofosforan do ortofosforanu, dzięki czemu może tworzyć kompleks z zielonym malachitem</td></tr><tr><td>His-tagged ludzki SAMHD1</td><td>Wygenerowany w domu przy użyciu Protein Science Facility, Karolinska Institutet-Recombinant</td><td></td> <td>SAMHD1, hydrolizuje dNTP do odpowiadającego mu nukleozydu i nieorganicznego</td></tr> <tr><td>trifosforanuHydroksymocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8627</td><td>Związek testowany w teście hamowania SAMHD1</td></tr><tr><td>Lomofungin</td><td>National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP)</td><td>NSC106995</td><td>Związek testowany w teście hamowania SAMHD1</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>bufor reakcyjny SAMHD1 składnik</td></tr><tr><td>Zieleń malachitowa Chlorowodorek karbinolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213020</td><td>Zielony malachit składnik wyjściowy</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Hidex</td><td>Hidex Sense Czytnik mikropłytek</td><td>Akwizycja danych, absorpcja odczytana przy długości fali 630 nm</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td>SAMHD1 składnik buforowy reakcyjny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>Składnik bufora reakcyjnego SAMHD1</td></tr><tr><td>Fosforan sodu (Na3PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>Wymagany dla krzywej wzorcowej fosforanu</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy 95-97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84720</td><td>Zielony składnik masowy malachitu</td></tr><tr><td>Sól tris-octanowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1258</td><td>Składnik bufora reakcyjnego SAMHD1</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Składnik buforu reakcyjnego SAMHD1</td></tr><tr><td>Tween-20</td> Bufor reakcyjny <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>SAMHD1 i składnik odczynnika roboczego w kolorze zieleni malachitowej</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dntpazą samhd1

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterylny motyw alfa i białko zawierające domenę HD 1 (SAMHD1) jest kluczowym regulatorem wewnątrzkomórkowych pul trifosforanu deoksynukleozydu (dNTP), ponieważ enzym ten może hydrolizować dNTP do odpowiadających im nukleozydów i nieorganicznych trifosforanów. Ze względu na jego kluczową rolę w metabolizmie nukleotydów, jego związek z kilkoma patologiami oraz jego rolę w oporności na terapię, obecnie prowadzone są intensywne badania w celu lepszego zrozumienia zarówno regulacji, jak i funkcji komórkowej tego enzymu. Z tego powodu niezbędne jest opracowanie prostych i niedrogich, wysokoprzepustowych metod badania interakcji małych cząsteczek z SAMHD1, takich jak regulatory allosteryczne, substraty lub inhibitory. W tym celu test zieleni malachitowej sprzężony z enzymami jest prostym i solidnym testem kolorymetrycznym, który można zastosować w formacie płytki 384-dołkowej, umożliwiając pośredni pomiar aktywności SAMHD1. Ponieważ SAMHD1 uwalnia grupę trifosforanową z substratów nukleotydowych, możemy sprzęgnąć aktywność pirofosfatazy z tą reakcją, wytwarzając w ten sposób nieorganiczny fosforan, który można określić ilościowo za pomocą odczynnika zieleni malachitowej poprzez utworzenie zielonego kompleksu fosfomolibdenianu malachitu. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie tej metodologii do scharakteryzowania znanych inhibitorów SAMHD1 i rozszyfrowania mechanizmów zaangażowanych w katalizę SAMHD1 niekanonicznych substratów i regulację przez aktywatory allosteryczne, czego przykładem są leki przeciwnowotworowe na bazie nukleozydów. Tak więc test zieleni malachitowej sprzężony z enzymami jest potężnym narzędziem do badania SAMHD1, a ponadto może być również wykorzystany w badaniu kilku enzymów, które uwalniają formy fosforanów.

Protokół przedstawiony na Rysunku 1 opisuje podstawowy schemat wykorzystania testu z malachitem zielonym sprzężonego z enzymem w celu zbadania oddziaływania małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1; można go dostosować na wiele sposobów, aby odpowiedzieć na różne pytania biochemiczne. W reprezentatywnych wynikach omówionych w poniższych akapitach przedstawiamy przykłady zastosowania tego testu do określenia właściwości hamujących małych cząsteczek wobec SAMHD1 oraz do sprawdzenia, czy różne analogi nukleotydów są substratami i/lub aktywatorami tego enzymu.
Wyniki przedstawione na Rysunku 2 ilustrują kilka kluczowych zasad tego testu. Odczynnik z zielenią malachitową umożliwia kolorymetryczne wykrywanie fosforanu nieorganicznego poprzez tworzenie kompleksu fosfomolibdanu z zielenią malachitową, w związku z czym podejście to można zastosować do badania reakcji enzymatycznych, których produktem jest fosforan. Aby zademonstrować czułość tej metody w wykrywaniu wolnego fosforanu nieorganicznego, na Rysunku 2A przedstawiono wartości absorbancji uzyskane przy zwiększających się stężeniach Na3PO4 po 20 min inkubacji z odczynnikiem z zielenią malachitową. Podczas gdy sygnał osiąga nasycenie przy 0,25 mM Na3PO4, liniowy zakres detekcji fosforanu jest widoczny od 0,004 do 0,03 mM (Rysunek 2A, prawy panel), co jest zgodne z innymi badaniami, w których zgłoszono liniowy zakres fosforanu do 10-20 μM przy użyciu testu z zielenią malachitową38.
SAMHD1 jest dNTPazą, która podczas hydrolizy cząsteczki dNTP uwalnia nieorganiczny trifosforan, w związku z czym do wygenerowania wolnego fosforanu nieorganicznego w celu jego detekcji za pomocą zieleni malachitowej wymagany jest enzym sprzęgający. Wykazano, że nieorganiczna pirofosfataza (PPase) z E. coli jest użyteczna w tym celu, zarówno w odniesieniu do SAMHD17,20, jak i innych enzymów metabolizujących nukleotydy30,33,35. Ponadto SAMHD1 wykazuje aktywność dNTPazy jako homotetramer, co wymaga aktywacji allosterycznej przez (d)NTP, a konkretnie przez trifosforan guanozyny (GTP lub dGTP) w miejscu AS1 oraz dowolne dNTP w miejscu AS2. Następnie centrum katalityczne staje się dostępne dla wiązania substratu i zachodzi reakcja enzymatyczna. Ponieważ dGTP spełnia wymagania dotyczące wiązania w miejscach AS1 i AS2 oraz stanowi substrat, zastosowanie tego nukleotydu w teście inhibicji znacznie upraszcza przebieg pracy. Rycina 2B ilustruje wymóg obecności poszczególnych składników testu w celu uzyskania mierzalnej aktywności SAMHD1, objawiającej się wzrostem absorbancji przy 630 nm. Ani sam SAMHD1, ani sama PPase nie są w stanie generować fosforanu nieorganicznego w obecności dGTP, co jest zgodne z udokumentowaną aktywnością tych enzymów. Jednakże w warunkach, w których obecne są wszystkie składniki testu (SAMHD1, PPase oraz aktywator/substrat dGTP), obserwujemy wzrost sygnału. Współczynnik Z factor37 dla przedstawionego tutaj przykładu (przyjmując brak enzymów + dGTP jako kontrolę negatywną oraz SAMHD1/PPase + dGTP jako kontrolę pozytywną) wyniósł 0,74, co wskazuje na wysoką powtarzalność i wiarygodność testu.
Jedną z potencjalnych aplikacji testu aktywności SAMHD1 sprzężonego z enzymem jest identyfikacja inhibitorów za pomocą wysokoprzepustowego przesiewania (HTS). W związku z tym, w niniejszym raporcie walidujemy wykrywanie inhibicji SAMHD1 w tym teście, wykorzystując zróżnicowany zestaw związków opisanych już w literaturze. Seamon i wsp. ocenili zależne od dawki hamowanie SAMHD1 przez kanoniczne nukleozydy, stosując test podobny do zaprezentowanego tutaj, i stwierdzili, żet dejoksyguanozyna (dGuo) była jedynym kanonicznym nukleozydem zdolnym do znaczącego hamowania SAMHD1, z wartością IC50 wynoszącą 488 µM20. HTS leków zatwierdzonych przez FDA, przeprowadzony z użyciem bezpośredniego testu b4NPP, ujawnił kilka związków hamujących aktywność SAMHD1 w stężeniach mikromolarnych, spośród których lomofungina była cząsteczką najsilniej hamującą aktywność dNTPazy SAMHD1 in vitro, wykazując IC50 na poziomie 20,1 µM przy oznaczeniu w obecności dGTP jako substratu21. Dodatkowo, cztery analogi α,β-imido-dNTP zostały zidentyfikowane jako konkurencyjne inhibitory SAMHD1 przy użyciu sensora MDCC-PBP oraz testu aktywności SAMHD1 sprzężonej z Ppx, co wykazało, że stałe inhibicji analogów dNMPNPP mieściły się w zakresie niskich wartości mikromolarnych / wysokich nanomolarnych6,22. Zatem, aby wykazać, że test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymem może być wykorzystany do identyfikacji inhibitorów SAMHD1, do walidacji techniki użyto dGuo, lomofunginy oraz 2'-dejoksytymidyną-5'-[(α,β)-imido]trifosforanu (dTMPNPP). Rycina 3A przedstawia krzywe odpowiedź-dawka uzyskane dla tych związków, pokazując, że rosnące stężenia skutecznie hamują aktywność SAMHD1. Średnie wartości IC50 uzyskane dla tych cząsteczek z trzech niezależnych eksperymentów (± odchylenie standardowe) wynosiły odpowiednio: dGuo = 361,9 ± 72,8 µM, lomofungina = 6,78 ± 3,9 µM oraz dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 µM. Jako przykład wyniku negatywnego określono również wpływ hydroksymocznika (HU) na aktywność SAMHD1. HU jest inhibitorem reduktazy rybonukleotydowej i choć ogranicza aktywność ara-CTPazy SAMHD1 w różnych modelach AML, wykazano, że działanie HU na SAMHD1 jest pośrednie i opiera się na zaburzaniu regulacji allosterycznej SAMHD118. Krzywa odpowiedź-dawka dla HU przedstawiona jest na Rycinie 3B; nie zaobserwowano zmian w aktywności SAMHD1 przy zwiększaniu dawek HU, co dowodzi, że HU nie hamuje aktywności SAMHD1 in vitro.
Innym zastosowaniem enzymatycznego testu aktywności SAMHD1 z reakcją sprzężoną jest badanie, czy nukleotydy i ich analogi są substratami i/lub allosterycznymi aktywatorami tego enzymu, co zilustrowano na Rycynie 4. W tym eksperymencie przetestowano kanoniczne nukleotydy, a także aktywne metabolity kilku przeciwnowotworowych analogów nukleozydów, takich jak cytarabina (ara-CTP), clofarabina (Cl-F-ara-ATP) i gemcytabina (dF-dCTP), jako substraty i aktywatory SAMHD1. Ze względu na złożoną regulację allosteryczną SAMHD1, reakcję przeprowadzono w obecności GTP jako aktywatora AS1 lub niehydrolyzowalnego analogu dGTP, 2'-deoksyguanozyno-5'-(α-tio)-trifosforanu (dGTPαS), który może zajmować miejsca AS1 i AS2. Aktywność SAMHD1 w obecności badanego analogu nukleotydu i GTP wskazuje, że nukleotyd jest w stanie wiązać się z wtórnym miejscem allosterycznym oraz miejscem katalitycznym (tj. jest aktywatorem AS2 i substratem), natomiast aktywność SAMHD1 z analogiem nukleotydu i dGTPαS wskazuje, że nukleotyd może zajmować jedynie miejsce katalityczne (tj. jest tylko substratem). Jeśli nukleotyd jest w stanie wiązać się zarówno z miejscami allosterycznymi AS1 i AS2, jak i z miejscem katalitycznym, SAMHD1 będzie aktywny w obecności samego nukleotydu, co pokazano w przypadku dGTP. Wyniki wykazują, że wszystkie kanoniczne dNTP są w stanie wiązać się z miejscem AS2 oraz miejscem katalitycznym. W przypadku analogów nukleotydów, trifosforan clofarabiny jest aktywatorem AS2 i substratem, podczas gdy trifosforan cytarabiny jest w stanie zająć jedynie miejsce katalityczne. Z drugiej strony, nie zaobserwowano aktywności w przypadku trifosforanu gemcytabiny, co sugeruje, że w badanych warunkach trifosforan gemcytabiny nie jest w stanie działać jako efektor allosteryczny ani substrat. Chociaż wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi przewidywaniami9, późniejsze badania krystalograficzne i kinetyczne10 ujawniły, że trifosforan gemcytabiny jest w stanie wiązać się z kieszenią katalityczną SAMHD1 i że rzeczywiście jest substratem tego enzymu. Jednak w tym drugim badaniu10 autorzy wykazali, że szybkość hydrolizy jest znacznie niższa w porównaniu z innymi raportowanymi substratami, takimi jak trifosforan cytarabiny, co wyjaśnia, dlaczego nie byliśmy w stanie zaobserwować tego zjawiska przy zastosowaniu tego układu przesiewowego.
Podsumowując, te reprezentatywne wyniki potwierdzają przydatność testu aktywności SAMHD1 sprzężonego z enzymem jako niezawodnej techniki identyfikacji i charakterystyki inhibitorów, regulatorów allosterycznych oraz substratów SAMHD1. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich podejść eksperymentalnych, metoda ta ma swoje ograniczenia, dlatego w celu dalszej walidacji wyników należy stosować testy ortogonalne (np. z wykorzystaniem innej technologii analitycznej).
<img alt="Schemat testu inhibicji z użyciem SAMHD1, PPase; obejmuje reakcję z zielenią malachitową i analizę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu opisanego w niniejszym artykule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy absortancji w zależności od NaPO4 i SAMHD1/dGTP; wpływ fosforanu na wydajność reakcji DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza aktywności SAMHD1 z zastosowaniem sprzężenia enzymatycznego. (A) Krzywa wzorcowa Na3PO4 w teście z zielenią malachitową. Rozcieńczenia seryjne (2-krotne) Na3PO4 przygotowano w zakresie od 1 mM do 0,004 mM w trzech powtórzeniach i inkubowano z odczynnikiem zieleni malachitowej przez 20 min. Surowe wartości absorbancji w pełnym zakresie badanych stężeń przedstawiono na panelu lewym, a zakres liniowy na panelu prawym. Przedstawiono wyniki reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. (B) Walidacja analizy aktywności z zastosowaniem sprzężenia enzymatycznego. SAMHD1 (0,35 µM) i/lub PPase (12,5 U/mL) w obecności lub przy braku aktywatora/substratu dGTP (25 µM) inkubowano przez 20 min w analizie aktywności ze sprzężeniem enzymatycznym. Przedstawiono czwórki z reprezentatywnego z dwóch niezależnych eksperymentów z naniesionymi surowymi wartościami absorbancji; słupki i słupki błędów wskazują średnią i SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe dawka-odpowiedź, aktywność w funkcji stężenia związku, wykres eksperymentalny dla analizy aktywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ocena związków pod kątem hamowania SAMHD1 w sprzężonym enzymatycznie teście aktywności. Odpowiedź na dawkę lomofunginy (0,78-100 µM), 2'-deoksytymidyny-5'-[(α,β)-imido]trifosforanu (dTMPNPP, 0,01-100 µM) i deoksyguanozyny (dGuo, 10-1 500 µM) (A) lub hydroksymocznika (HU) (0,78-100 µM) (B) w sprzężonym enzymatycznie teście aktywności SAMHD1 z dGTP (25 µM) jako aktywatorem/substratem. Przedstawiono procent aktywności względem kontroli reakcji z poszczególnych powtórzeń (DMSO + SAMHD1/PPase + dGTP = 100% aktywności, DMSO + dGTP = 0% aktywności), ukazując reprezentatywny wynik z trzech eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres słupkowy absorpcji nukleotydów przy A&lt;sub&gt;630&lt;/sub&gt;; porównanie dGTP, GTP, buforu; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ocena analogów nukleotydowych jako allosterycznych aktywatorów i substratów SAMHD1 w teście aktywności sprzężonej z enzymem. Przetestowano kanoniczne nukleotydy oraz wybrane metabolity trifosforanowe leków przeciwnowotworowych: cytarabiny (ara-CTP), klofarabiny (Cl-F-ara-ATP) i gemcytabiny (dF-dCTP) w stężeniu 200 µM w teście aktywności SAMHD1 sprzężonej z enzymem, w obecności lub braku GTP lub niehydrolizowalnego analogu dGTP – dGTPαS (12,5 µM). Przedstawiono znormalizowane wartości absorbancji z poszczególnych powtórzeń eksperymentalnych; zaznaczono średnią i SD. Wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów, zaadaptowane z naszego poprzedniego badania7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Objętość dozowana (µL)</td>
			<td>Końcowa objętość reakcji (µL)</td>
			<td>Odmiarkowane stężenie</td>
			<td>Krotność rozcieńczenia w reakcji</td>
			<td>Stężenie końcowe w reakcji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>5</td>
			<td rowspan="3">20</td>
			<td>0,4 mM</td>
			<td>4</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>mieszanina SAMHD1+PPase</td>
			<td>5</td>
			<td>1.4 µM SAMHD1, 50 U/mL PPaza</td>
			<td>4</td>
			<td>0.35 µM SAMHD1, 12,5 U/ml Ppase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>dGTP</td>
			<td>10</td>
			<td>50  µM</td>
			<td>2</td>
			<td>25 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="6">Inkubacja przez 20 minut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>roztwór EDTA</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>7,9 mM</td>
			<td>2</td>
			<td>3,95 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>odczynnik MG</td>
			<td>10</td>
			<td>50</td>
			<td>2,5 mM zieleni malachitowej, 64,4 mM molibdanu amonu, 0,18% Tween-20</td>
			<td>5</td>
			<td>0,5 mM zieleni malachitowej, 12,9 mM molibdanu amonu, 0,036% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="6">Inkubacja przez 20 minut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="6">Odczyt przy 630 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie końcowych warunków w teście sprzęganym enzymatycznie do przesiewania inhibitorów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Krok</td>
			<td >Odczynnik</td>
			<td >Objętość dodana (µL)</td>
			<td >Końcowa objętość reakcji (µL)</td>
			<td >Stężenie dodanego odczynnika</td>
			<td >Krotność rozcieńczenia w reakcji</td>
			<td >Końcowe stężenie w reakcji</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1</td>
			<td >Regulator allosteryczny</td>
			<td >5</td>
			<td rowspan="3">20</td>
			<td >800 µM</td>
			<td >4</td>
			<td >200 µM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td>
			<td >GTP lub dGTPαS</td>
			<td >5</td>
			<td >50 µM</td>
			<td >4</td>
			<td >12.5 µM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td>
			<td >SAMHD1 i/lub PPaza</td>
			<td >10</td>
			<td >0.7 µM SAMHD1, 25 U/mL PPaza</td>
			<td >2</td>
			<td >0.35 µM SAMHD1, 12.5 U/mL PPaza</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >4</td>
			<td colspan="6">Inkubacja przez 20 minut</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >5</td>
			<td >Roztwór EDTA</td>
			<td >20</td>
			<td >40</td>
			<td >7.9 mM</td>
			<td >2</td>
			<td >3.95 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >6</td>
			<td >Odczynnik MG</td>
			<td >10</td>
			<td >50</td>
			<td >2.5 mM Malachite green, 64.4 mM molibdan amonu, 0.18% Tween-20</td>
			<td >5</td>
			<td >0.5 mM Malachite green, 12.9 mM molibdan amonu, 0.036% Tween-20</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >7</td>
			<td colspan="6">Inkubacja przez 20 minut</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >8</td>
			<td colspan="6">Pomiar przy 630 nm</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Podsumowanie końcowych warunków w teście sprzężonym enzymatycznie do przesiewania regulatorów allosterycznych

SAMHD1 to trifosfohydrolaza deoksynukleozydowo-trifosforanowa, odgrywająca kluczową rolę w ludzkim zdrowiu i chorobie. Tutaj przedstawiamy wszechstronny test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymami, zastosowany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, który pozwala na ocenę małych cząsteczek i analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów i inhibitorów SAMHD1.

Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Metoda ta pozwala nam scharakteryzować, które leki chemioterapeutyczne są hydrolizowane przez SAMHD1 i mogą być stosowane jako test przesiewowy do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tego enzymu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, niedroga i dostarcza ogromnej ilości informacji o tym, jak różne małe cząsteczki oddziałują z tym enzymem. Procedurę zademonstruje Miriam, doktor habilitowany z grupy.Na początek należy przygotować kompletny bufor reakcyjny SAMHD1, dodając Tween-20 i TCEP do końcowych stężeń odpowiednio 0,005% i 0,3 milimola. Przygotować roztwór zatrzymujący EDTA, dodając EDTA do końcowego stężenia 7,9 milimola w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1. Przygotuj zieleń malachitową lub roztwór roboczy MG, mieszając 10 części roztworu podstawowego MG z 2,5 częściami 7% molibdenianu amonu i 0,2 części 11% Tween-20.Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć badane związki w odpowiednim rozpuszczalniku o stężeniu 100-krotności stężenia końcowego na przezroczystej 96-dołkowej płytce polipropylenowej z okrągłym dnem. następnie rozcieńczyć te związki do 25-krotności stężenia końcowego za pomocą pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1, aby utrzymać końcowe stężenie rozpuszczalnika poniżej 1% Przenieść pięć mikrolitrów rozcieńczonego składnika do odpowiednich dołków na przezroczystej 384-dołkowej płaskodennej płytce testowej i powtórzyć procedurę z rozpuszczalnikiem Tylko próbki kontrolne. W przypadku przygotowania głównej mieszanki enzymatycznej należy rozcieńczyć rekombinowane ludzkie białko SAMHD1 i rekombinowaną pirofosfatazę w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do czterokrotności pożądanego stężenia końcowego.Przygotować aktywator lub substrat dGTP, rozcieńczając roztwór w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do osiągnięcia stężenia 50 mikromolowych. Do studzienek zawierających rozcieńczenia związków i kontrolę tylko rozpuszczalnika należy dozować pięć mikrolitrów głównej mieszanki pirofosfatazy SAMHD1, a do studzienek bez kontroli enzymów dodać pięć mikrolitrów pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1. Następnie dozować 10 mikrolitrów roztworu dGDP do wszystkich studzienek, aby rozpocząć reakcję i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Aby zatrzymać reakcję, dodaj 20 mikrolitrów roztworu zatrzymującego EDTA. Po dodaniu 10 mikrolitrów roztworu roboczego MG do wszystkich studzienek, wymieszać zawartość za pomocą orbitalnej wytrząsarki mikrodołkowej i odwirować płytkę przy 1000 x g przez jedną minutę. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej i odczytać absorpcję przy 630 nanometrach w czytniku płytek mikrodołkowych.Obliczyć odchylenie standardowe studzienek kontroli dodatniej, a następnie obliczyć średnią. Podobnie w przypadku studzienek kontroli ujemnej należy obliczyć odchylenie standardowe, a następnie obliczyć średnią. Oblicz współczynnik Z jest wskaźnikiem jakości testu.Znormalizować każdą wartość absorbancji do średnich wartości kontroli dodatnich i ujemnych. Ustawienie kontroli pozytywnej jako aktywności 100% SAMHD1 i kontroli negatywnej jako aktywności 0% SAMHD1. Wykres Aktywność SAMHD1 jest funkcją stężenia związku i pasuje do czteroparametrowej krzywej odpowiedzi na dawkę o zmiennym nachyleniu, co pozwala na określenie połowy maksymalnego stężenia hamującego związku.Rozcieńczyć analogi nukleotydów i kompletny bufor reakcyjny SAMHD1 do czterokrotności stężenia końcowego i przenieść pięć mikrolitrów do odpowiednich dołków na 384-dołkowej płytce testowej. Aby przygotować główną mieszankę enzymu SAMHD1 lub pirofosfatazy, należy rozcieńczyć rekombinowane ludzkie białko SAMHD1 i pirofosfatazę Escherichia coli w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do dwukrotności pożądanego stężenia końcowego. Przygotować tylko roztwór pirofosfatazy, rozcieńczając rekombinowaną pirofosfatazę Escherichia coli do dwukrotności pożądanego stężenia końcowego w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1.Podobnie należy przygotować aktywatory GTP i dGTP alfa S, rozcieńczając materiał podstawowy w kompletnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do czterokrotności stężenia końcowego. Dozować pięć mikrolitrów aktywatora, GDP lub dGTP alpha S lub pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1 do odpowiednich studzienek 384-dołkowej płytki testowej zawierającej analogi nukleotydów. Rozpocznij reakcję od dozowania 10 mikrolitrów głównej mieszaniny pirofosfatazy SAMHD1, samej pirofosfatazy lub pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1 do odpowiednich studzienek i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po zatrzymaniu reakcji za pomocą roztworu zatrzymującego EDTA, dodaj 10 mikrolitrów roztworu roboczego MG do wszystkich studzienek. Po wymieszaniu zawartości odwirować płytkę o sile 1000 x g przez jedną minutę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zmierz absorbancję przy 630 nanometrach.Obliczyć średnie wartości absorbancji dla studzienek reakcyjnych tylko z pirofosfatazą, które będą wartością tła. Następnie odejmij wartość tła od odpowiednich studzienek w reakcjach SAMHD1 lub pirofosfatazy. Na koniec wykreślić skorygowane wartości absorbancji dla każdego analogu nukleotydu z warunkami buforu GTP i dGTP alfa S.W niniejszym badaniu absorbent zwiększał się wraz ze wzrostem stężenia fosforanu sodu po inkubacji z odczynnikiem malachitowym i osiągnął nasycenie przy stężeniu 0,25 milimolowym. Liniowy zakres detekcji fosforanu jest widoczny od 0,004 do 0,03 milimola. Zilustrowano wymagania dotyczące składników testowych w celu osiągnięcia mierzalnej aktywności SAMHD1.Ani sam SAMHD1, ani pirofosfataza nie są w stanie wytworzyć fosforanu organicznego w obecności dGTP. Jednak, gdy wszystkie składniki testu były obecne, zaobserwowano wzrost sygnału. Krzywe odpowiedzi na dawkę uzyskane dla związków inhibitora SAMHD1 wykazały, że zwiększenie stężeń skutecznie hamuje aktywność SAMHD1.Hydroksymocznik nie hamuje aktywności SAMHD1 in vitro, na co wskazywała niezmieniona aktywność SAMHD1 przy zwiększaniu dawek hydroksymocznika. Wiązanie dGTP z obydwoma miejscami allosterycznymi aktywuje SAMHD1, umożliwiając późniejszą hydrolizę tego nukleotydu, podczas gdy pozostałe trzy kanoniczne dNTP najpierw wymagają aktywacji GTP pierwszego miejsca allosterycznego, zanim będą mogły związać drugie miejsce allosteryczne, a następnie są hydrolizowane w miejscu katalitycznym. W przypadku analogów nukleotydów trifosforan klofarabiny jest allosterycznym aktywatorem drugiego miejsca i substratem, ponieważ aktywność obserwuje się w obecności GTP.Podczas gdy trifosforan cytarabiny jest w stanie zająć miejsce katalityczne tylko wtedy, gdy dGTP alfa S jest wymagany do obserwacji aktywności. Nie zaobserwowano żadnej aktywności gemcytabiny trifosforanu. Po zidentyfikowaniu małych cząsteczek hamujących SAMHD1 w tym teście za pomocą podejść fizycznych, takich jak testy przesunięcia termicznego, można je wykorzystać do zbadania zaangażowania celu.Przedstawiona tutaj metoda pomogła nam zrozumieć, które z leków przeciwnowotworowych mogą być hydrolizowane przez SAMHD1 i ustalić ten enzym jako potencjalny cel terapeutyczny w celu przezwyciężenia oporności na leki.

a-high-throughput-enzyme-coupled-activity-assay-to-probe-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Opisana tutaj jest sprawdzona metoda określania stopnia ograniczenia HIV-1 przez komórkowe białko hamujące SAMHD1. Ludzkie komórki linii szpikowej U937 są transdukowane wektorem ekspresyjnym SAMHD1 współwyrażającym YFP, różnicowane, a następnie prowokowane HIV-RFP. Poziom restrykcji określa się za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Poznaj wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1. Ta metoda umożliwia identyfikację inhibitorów i charakteryzację substratów w badaniach biochemicznych.

Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

Przeglądaj więcej filmów