Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

Metoda ta pozwala nam scharakteryzować, które leki chemioterapeutyczne są hydrolizowane przez SAMHD1 i mogą być stosowane jako test przesiewowy do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tego enzymu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, niedroga i dostarcza ogromnej ilości informacji o tym, jak różne małe cząsteczki oddziałują z tym enzymem. Procedurę zademonstruje Miriam, doktor habilitowany z grupy.

Na początek należy przygotować kompletny bufor reakcyjny SAMHD1, dodając Tween-20 i TCEP do końcowych stężeń odpowiednio 0,005% i 0,3 milimola. Przygotować roztwór zatrzymujący EDTA, dodając EDTA do końcowego stężenia 7,9 milimola w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1. Przygotuj zieleń malachitową lub roztwór roboczy MG, mieszając 10 części roztworu podstawowego MG z 2,5 częściami 7% molibdenianu amonu i 0,2 części 11% Tween-20.

Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć badane związki w odpowiednim rozpuszczalniku o stężeniu 100-krotności stężenia końcowego na przezroczystej 96-dołkowej płytce polipropylenowej z okrągłym dnem. następnie rozcieńczyć te związki do 25-krotności stężenia końcowego za pomocą pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1, aby utrzymać końcowe stężenie rozpuszczalnika poniżej 1% Przenieść pięć mikrolitrów rozcieńczonego składnika do odpowiednich dołków na przezroczystej 384-dołkowej płaskodennej płytce testowej i powtórzyć procedurę z rozpuszczalnikiem Tylko próbki kontrolne. W przypadku przygotowania głównej mieszanki enzymatycznej należy rozcieńczyć rekombinowane ludzkie białko SAMHD1 i rekombinowaną pirofosfatazę w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do czterokrotności pożądanego stężenia końcowego.

Przygotować aktywator lub substrat dGTP, rozcieńczając roztwór w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do osiągnięcia stężenia 50 mikromolowych. Do studzienek zawierających rozcieńczenia związków i kontrolę tylko rozpuszczalnika należy dozować pięć mikrolitrów głównej mieszanki pirofosfatazy SAMHD1, a do studzienek bez kontroli enzymów dodać pięć mikrolitrów pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1. Następnie dozować 10 mikrolitrów roztworu dGDP do wszystkich studzienek, aby rozpocząć reakcję i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Aby zatrzymać reakcję, dodaj 20 mikrolitrów roztworu zatrzymującego EDTA. Po dodaniu 10 mikrolitrów roztworu roboczego MG do wszystkich studzienek, wymieszać zawartość za pomocą orbitalnej wytrząsarki mikrodołkowej i odwirować płytkę przy 1000 x g przez jedną minutę. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej i odczytać absorpcję przy 630 nanometrach w czytniku płytek mikrodołkowych.

Obliczyć odchylenie standardowe studzienek kontroli dodatniej, a następnie obliczyć średnią. Podobnie w przypadku studzienek kontroli ujemnej należy obliczyć odchylenie standardowe, a następnie obliczyć średnią. Oblicz współczynnik Z jest wskaźnikiem jakości testu.

Znormalizować każdą wartość absorbancji do średnich wartości kontroli dodatnich i ujemnych. Ustawienie kontroli pozytywnej jako aktywności 100% SAMHD1 i kontroli negatywnej jako aktywności 0% SAMHD1. Wykres Aktywność SAMHD1 jest funkcją stężenia związku i pasuje do czteroparametrowej krzywej odpowiedzi na dawkę o zmiennym nachyleniu, co pozwala na określenie połowy maksymalnego stężenia hamującego związku.

Rozcieńczyć analogi nukleotydów i kompletny bufor reakcyjny SAMHD1 do czterokrotności stężenia końcowego i przenieść pięć mikrolitrów do odpowiednich dołków na 384-dołkowej płytce testowej. Aby przygotować główną mieszankę enzymu SAMHD1 lub pirofosfatazy, należy rozcieńczyć rekombinowane ludzkie białko SAMHD1 i pirofosfatazę Escherichia coli w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do dwukrotności pożądanego stężenia końcowego. Przygotować tylko roztwór pirofosfatazy, rozcieńczając rekombinowaną pirofosfatazę Escherichia coli do dwukrotności pożądanego stężenia końcowego w pełnym buforze reakcyjnym SAMHD1.

Podobnie należy przygotować aktywatory GTP i dGTP alfa S, rozcieńczając materiał podstawowy w kompletnym buforze reakcyjnym SAMHD1 do czterokrotności stężenia końcowego. Dozować pięć mikrolitrów aktywatora, GDP lub dGTP alpha S lub pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1 do odpowiednich studzienek 384-dołkowej płytki testowej zawierającej analogi nukleotydów. Rozpocznij reakcję od dozowania 10 mikrolitrów głównej mieszaniny pirofosfatazy SAMHD1, samej pirofosfatazy lub pełnego buforu reakcyjnego SAMHD1 do odpowiednich studzienek i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po zatrzymaniu reakcji za pomocą roztworu zatrzymującego EDTA, dodaj 10 mikrolitrów roztworu roboczego MG do wszystkich studzienek. Po wymieszaniu zawartości odwirować płytkę o sile 1000 x g przez jedną minutę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zmierz absorbancję przy 630 nanometrach.

Obliczyć średnie wartości absorbancji dla studzienek reakcyjnych tylko z pirofosfatazą, które będą wartością tła. Następnie odejmij wartość tła od odpowiednich studzienek w reakcjach SAMHD1 lub pirofosfatazy. Na koniec wykreślić skorygowane wartości absorbancji dla każdego analogu nukleotydu z warunkami buforu GTP i dGTP alfa S.

W niniejszym badaniu absorbent zwiększał się wraz ze wzrostem stężenia fosforanu sodu po inkubacji z odczynnikiem malachitowym i osiągnął nasycenie przy stężeniu 0,25 milimolowym. Liniowy zakres detekcji fosforanu jest widoczny od 0,004 do 0,03 milimola. Zilustrowano wymagania dotyczące składników testowych w celu osiągnięcia mierzalnej aktywności SAMHD1.

Ani sam SAMHD1, ani pirofosfataza nie są w stanie wytworzyć fosforanu organicznego w obecności dGTP. Jednak, gdy wszystkie składniki testu były obecne, zaobserwowano wzrost sygnału. Krzywe odpowiedzi na dawkę uzyskane dla związków inhibitora SAMHD1 wykazały, że zwiększenie stężeń skutecznie hamuje aktywność SAMHD1.

Hydroksymocznik nie hamuje aktywności SAMHD1 in vitro, na co wskazywała niezmieniona aktywność SAMHD1 przy zwiększaniu dawek hydroksymocznika. Wiązanie dGTP z obydwoma miejscami allosterycznymi aktywuje SAMHD1, umożliwiając późniejszą hydrolizę tego nukleotydu, podczas gdy pozostałe trzy kanoniczne dNTP najpierw wymagają aktywacji GTP pierwszego miejsca allosterycznego, zanim będą mogły związać drugie miejsce allosteryczne, a następnie są hydrolizowane w miejscu katalitycznym. W przypadku analogów nukleotydów trifosforan klofarabiny jest allosterycznym aktywatorem drugiego miejsca i substratem, ponieważ aktywność obserwuje się w obecności GTP.

Podczas gdy trifosforan cytarabiny jest w stanie zająć miejsce katalityczne tylko wtedy, gdy dGTP alfa S jest wymagany do obserwacji aktywności. Nie zaobserwowano żadnej aktywności gemcytabiny trifosforanu. Po zidentyfikowaniu małych cząsteczek hamujących SAMHD1 w tym teście za pomocą podejść fizycznych, takich jak testy przesunięcia termicznego, można je wykorzystać do zbadania zaangażowania celu.

Przedstawiona tutaj metoda pomogła nam zrozumieć, które z leków przeciwnowotworowych mogą być hydrolizowane przez SAMHD1 i ustalić ten enzym jako potencjalny cel terapeutyczny w celu przezwyciężenia oporności na leki.