Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Ogólnym celem tego protokołu jest badanie przesiewowe ekspresji wielu konstruktów metylotransferaz białkowych argininy w produkcji na dużą skalę w celu uzyskania miligramowej ilości białka do badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych w trybie wspomaganym pożywką, efektywnym kosztowo w pokryciu platformy ekspresyjnej S, systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa. Dr Alma Seitova przedstawi następujące kroki. Rozcieńczyć wykładniczo rosnące komórki SF9 do końcowej gęstości komórek 0,4 miliona na promil w pożywce dla owadów bez surowicy i wlać do sterylnego zbiornika odczynnika.

Użyj programowalnej pipety wielokanałowej, aby wstrzyknąć 0,5 mililitra rozcieńczonych komórek SF9 do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Ta objętość wystarczy, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni roboczej studni. Jednocześnie nie rozcieńcza zbytnio mieszanki transfekcyjnej, co umożliwia jej efektywność.

Oznaczyć tylko jedną studzienkę płytki jako komórkę i użyć jej jako kontroli do porównania transfekowanej i nietransfekowanej komórki w celu oceny potencjalnych objawów infekcji. Inkubować płytki w temperaturze 27 stopni, aż będą potrzebne, około godziny, aby komórki mogły przyczepić się do płytek do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć dobrze wymieszany odczynnik do transfekcji w nieuzupełnionym zbiorniku na owady i sterylnym zbiorniku odczynnika i delikatnie mieszać przez 10 sekund.

Za pomocą 12-kanałowej pipety przenieś 102 mikrolitry rozcieńczonego odczynnika transakcyjnego do sterylnej płytki 96 MicroWell. Przenieś 10 mikrolitrów po 0,2 mikrograma na mikrolitr rekombinowanego DNA bakmidu do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki MicroWell i wymieszaj, delikatnie potrząsając, stukając w płytkę z boków. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 15 do 20 minut, aby uzyskać złożoną formację.

Za pomocą regulowanej sześciokanałowej pipety przeznaczonej do przenoszenia między płytką 96- i 24-dołkową, nałóż mieszaninę do transfekcji na komórki kroplami do odpowiednich dołków płytek transfekcyjnych i inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 27 stopni. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej na monowarstwie komórek, delikatnie kołysz płytkami w przód iw tył kilka razy w czasie inkubacji. Cztery do pięciu godzin po transfekcji dodaj 1,5 milia pożywki przeciw owadom niezawierającej surowicy.

Uzupełnij go 10% finałem inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% antybiotyku i środka przeciwgrzybiczego. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 27 stopni przez 72 do 96 godzin. Jeśli to możliwe, delikatnie kołysz płytkami transfekcyjnymi raz dziennie.

Poszukaj oznak infekcji widocznych w transfekowanych komórkach po 72 do 96 godzinach po transfekcji. Cztery do pięciu dni po transfekcji w transfekowanych komórkach powinny być widoczne oznaki infekcji w porównaniu z komórkami kontrolnymi pod mikroskopem odwróconym, a początkowe rekombinowane bakulowirusy wydzielane do pożywki do hodowli komórkowej powinny być gotowe do pobrania. Użyj programowalnego elektronicznego wielokanałowego, aby umożliwić jednoczesne zbieranie wirusów P1, infekcję świeżo wysianych komórek SF9 w infekcji komórek zawiesinowych w ich 24-dołkowych blokach 150 mikrolitrami wirusów P1.

Odkręć resztę zbiorczych zapasów wirusa P1 przez 15 minut, przykryj 24 bloki dołków kulturą zawiesinową zainfekowanych komórek SF9 za pomocą arkusza AirPore. Inkubować blok 24-dołkowy w temperaturze 27 stopni z wytrząsaniem przy 245 obr./min przez 72 do 96 godzin. Cztery dni przed planowanym czasem produkcji rozdrobnić wykładniczo rosnące komórki SF9 o końcowej gęstości komórek 2 miliony na promil do szklanej nici dentystycznej Erlenmeyera z przegrodami w pożywce owadobójczej wolnej od surowicy zawierającej 1% końcowego antybiotyku i środka przeciwgrzybiczego.

Na tym etapie zostanie wygenerowana hodowla zawiesinowa zakażonych komórek owadów i wirusów P2 w supernatancie w celu zakażenia nowych komórek w partii produkcyjnej. Dodaj odpowiednie wirusy P2 i inkubuj zakażone komórki w niższej temperaturze 25 stopni, aby spowolnić wzrost komórek, wstrząsając z prędkością 165 obr./min na wytrząsarce orbitalnej z jednym calowym uderzeniem. Cztery dni przed planowanym czasem produkcji wysiewaj dwa litry wykładniczo rosnących komórek SF9 w pożywce wolnej od surowicy owadów do gęstości komórek 1 miliona na promil, w 2,8-litrowej kolbie do wstrząsania Fernbach

Potrząsnąć kolbą w temperaturze 27 stopni z wytrząsaniem przy 150 obr./min. Naukowiec Ashley Hutchinson zademonstruje następujący protokół. Podziel cztery litry wykładniczo rosnących komórek SF9 i pożywki wolnej od surowicy owadów do końcowej gęstości komórek 4 milionów na promil do dużych pięciolitrowych butelek z odczynnikami.

Dodać 10 do 12 milicali kultury zawiesinowej komórek owadów zakażonych bakulowirusem. Inkubować zainfekowaną kulturę komórek SF9 w wytrząsarce, wytrząsając 145 obr./min w niższej temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 72 do 96 godzin. Miligramowe ilości kilku rekombinowanych białek z rodziny PRMT ulegają ekspresji w natychmiastowej produkcji bakulowirusa w komórkach SF9 są wykorzystywane do biochemicznych biofizycznych badań instruktażowych, jak widać na rycinie piątej.

W SGC struktury krystaliczne zostały rozpuszczone w zdeponowanym w banku danych białkowych dla pełnej długości lub skróconych form białek PRMT4, 6, 7 i 9 za pomocą różnych sond chemicznych i inhibitorów. Plazmidy ekspresyjne dla tych PRMT zostały zdeponowane w celu dodania kolekcji genów przez SGC i są dostępne dla społeczności naukowej. W tym filmie podkreśliliśmy kluczowe elementy udanego badania przesiewowego ekspedycji ich wielorakiego konstruktu metylotransferaz białkowych argininy w produkcji na dużą skalę w systemie ekspresji bakulowirusa.

Zastosowanie zwykłych, regulowanych i programowalnych pipet wielokanałowych sprawiło, że cały proces był szybszy niż wydajny. Zastosowanie wysokowydajnego i mniej toksycznego dla komórek odczynnika do transfekcji do generowania rekombinowanych wirusów doprowadziło do bardziej opłacalnego i tego protokołu transfekcji do obsługi komórek. Zakażenie dużej partii do produkcji białek kulturą zawiesinową bakulowirusa zakażonego w sześciu komórkach znacznie zmniejszyło pracochłonny etap intensywnej amplifikacji startera.

Jest na przykład odwirowanie tego za pomocą specjalnej hodowli zakażonych komórek. To oczywiście wyklucza dodatkowe obchodzenie się z zainfekowanymi komórkami, aby uniknąć ich ściślejszej degradacji wirusa. Utrzymanie zawiesinowej komórki hodowlanej w tej skali produkcji w naczyniu hodowlanym było dużą objętością pola, co pomogło nam przezwyciężyć ograniczenia wielkości produkcji i przyjąć platformę na dużą skalę.

Jest to bardzo przydatne dla laboratoriów, które nie mają dostępu do bioreaktorów lub mają ograniczoną przestrzeń w procesie produkcyjnym. Chociaż nasz protokół został opisany dla białek z rodziny metylotransferaz białkowych argininy, to samo podejście można zastosować do każdej innej rodziny białek wymagających platformy ekspresji w celu uzyskania wystarczającej ilości białka do biochemicznych biofizycznych badań instruktażowych.