Name: Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę produkcji rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa. Technika ta umożliwia uzyskanie miligramowych ilości białek do badań biochemicznych i strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dalii Barsyte-Lovejoy za poświęcenie czasu na dostarczenie cennych informacji zwrotnych i krytycznych komentarzy na temat manuskryptu oraz wszystkim naszym kolegom z SGC, którzy pracowali nad rodziną białek PRMT wyrażonych przez System Wektorów Ekspresyjnych Bakulowirusa.
SGC jest zarejestrowaną organizacją charytatywną (numer 1097737), która otrzymuje fundusze od AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada za pośrednictwem Ontario Genomics Institute [OGI-196], UE i EFPIA poprzez Wspólne Przedsięwzięcie Inicjatywy Leków Innowacyjnych 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (aka EMD w Kanadzie i USA), Pfizer, Takeda i Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol><li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation%2C+functions+and+relevance+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li>
<li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+RGG%2FRG+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li>
<li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+Who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+kinetic+data%3A+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li>
<li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li>
<li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization%3A+The+SGC+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li>
<li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics%3A+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135(2008).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-insect+cell+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li>
<li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Invitrogen%2C+Bac-to-Bac+Baculovirus+expression+system%22">Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system</a>. , Invitrogen Life Technologies. Carlsbad. (2010).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li>
<li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Protein+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li>
<li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cell+culture+in+reagent+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Jedna z zalet BEVS w komórkach owadów koncentruje się na zdolności maszynerii modyfikacji potranslacyjnej do umożliwienia bardziej złożonych modyfikacji, takich jak fosforylacja, mirystoylacja i glikozylacja. Wraz z wysoce wydajnym fałdowaniem białek ssaków, modyfikacje te ułatwiają uzyskanie dużych ilości zmodyfikowanych i pofałdowanych białek, odpowiednich do fizjologicznie istotnych dalszych eksperymentów16.
W tym miejscu opisaliśmy szczegółowe protokoły BEVS, kładąc nacisk na kluczowe elementy dla skutecznego badania przesiewowego ekspresji wielu konstruktów białek PRMT i produkcji białek PRMT na dużą skalę na platformie ekspresji bakulowirusa: 1) Zastosowanie regularnych, regulowanych i programowalnych pipet wielokanałowych do przenoszenia materiału biologicznego między 24- a 96-dołkowymi płytkami i blokami do hodowli komórkowych na etapach generowania DNA bakimida i wirusa; zbiór rekombinowanych wirusów, amplifikacja objętości rekombinowanych wirusów i przygotowanie bloków przesiewowych ekspresji białek. 2) Wysokowydajne i ekonomiczne odczynniki do transfekcji do wytwarzania rekombinowanych wirusów. 3) Hodowla zawiesinowa komórek owadów zakażonych bakulowirusem (SCBIIC) do produkcji białka na dużą skalę. 4) Wykorzystanie kolb do wstrząsów Fernbach o dużej objętości 2,8 l w celu utrzymania kultury zawiesiny Sf9 oraz kolb do wstrząsania Tunair o pojemności 2,5 l i butelek z odczynnikami o pojemności 5 l do produkcji białka na dużą skalę.
Szczególne względy i uzasadnienie dla etapów transformacji i transfekcji. Chociaż komercyjny protokół zaleca użycie 100 μl kompetentnych komórek do jednej transformacji14, wydajność transformacji komercyjnych komórek kompetentnych DH10Bac E. coli wynosi aż 1 x 108 jtk/ μg DNA, więc używamy tylko 4 μl. To wystarczy, aby każdy transformant otrzymał izolowane białe rekombinowane kolonie do izolacji bakmidowego DNA. Przylegające komórki Sf9 w 24-dołkowej płytce transfekcyjnej wysiewano z gęstością komórek 2 x 105 / ml w 0,5 ml pożywki dla owadów bez surowicy. Ta objętość wystarczy, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni roboczej studni. Jednocześnie nie rozcieńcza zbytnio mieszanki transfekcyjnej, co zwiększa wydajność transfekcji. Odczynniki do transfekcji są nietoksyczne dla komórek Sf9, a wymiana pożywki nie jest konieczna. Zamiast zmiany pożywki, dodatkowe 1,5 ml pożywki zawierającej 10% (v/v) FBS jest dodawane do płytki transfekcyjnej w ciągu 4-5 godzin po transfekcji, aby ułatwić wzrost komórek. Skuteczność transfekcji obu odczynników do transfekcji jest wysoka. Mimo to, w przypadku X-tremeGene 9, oznaki infekcji w transfekowanych komórkach (Figura 2) pojawiają się 10-12 godzin wcześniej niż w przypadku odczynnika JetPrime, więc wybieramy między tymi odczynnikami w zależności od harmonogramu pracy kolejnych kroków w protokołach, co zapewnia pewną elastyczność w całym procesie.
Badanie przesiewowe ekspresji białka można przeprowadzić z wirusami P2, jeśli ilość początkowych rekombinowanych wirusów, pobranych z płytki transfekcyjnej i oznaczonych jako P1, jest czynnikiem ograniczającym, który można wykorzystać do badania przesiewowego ekspresji białka.
Zagadnienia dotyczące przechodzenia z małych do dużych ilości kultur. Historycznie uważano, że optymalny wzrost komórek wymaga dużej przestrzeni powietrznej w kulturze zawiesinowej w utrzymaniu komórek Sf9 i zwiększaniu produkcji. Jednak w 2014 r. doniesiono, że duża przestrzeń powietrzna w naczyniach hodowlanych jest mniej krytyczna, niż wcześniej sądzono17. Naczynie hodowlane ustawione przy użyciu odpowiednio dostosowanej prędkości wytrząsania do wyrzutu orbitalnego platformy wytrząsającej zapewni wystarczający transfer tlenu nawet w kulturze zawiesinowej o dużej objętości poprzez tworzenie i utrzymywanie małych pęcherzyków powietrza przez dłuższy czas. Dzięki takiemu podejściu, dostępne na rynku komórki owadów mogą być hodowane z większą prędkością wytrząsania w normalnym zakresie czasu podwajania komórek bez poświęcania wysokiej żywotności komórek.
Tak więc 6 lat temu zaczęliśmy zwiększać objętość kultury zawiesinowej w kolbie do wytrząsania podczas konserwacji komórek i wprowadziliśmy inny typ naczynia hodowlanego do produkcji białek, jednocześnie dostosowując i monitorując warunki wytrząsania (ryc. 6). Aby ustalić optymalne warunki w tych naczyniach hodowlanych, monitorowaliśmy parametry hodowli komórek Sf9, takie jak czas podwajania komórek wraz z żywotnością komórek, rozmiarem i kształtem, stanem agregacji i podatnością na infekcję komórek.
Na przykład, w celu utrzymania komórek Sf9, w kolbach do wytrząsania Fernbacha o pojemności 2,8 l, hodujemy 2 l zamiast 0,8 l komórek zawiesinowych Sf9 wytrząsając z prędkością 150 obr./min w temperaturze 27 °C, a żywotność komórek w większości przypadków jest bliska 99%, z równomiernie ukształtowanymi zdrowymi dzielącymi się komórkami. W celu zwiększenia skali produkcji infekujemy 4 l komórek w 5-litrowych butelkach z odczynnikami, wstrząsając z dużą prędkością do 145 obr./min w obniżonej temperaturze 25 °C. Najczęściej używane inkubatory z wbudowaną platformą wytrząsającą mogą pomieścić 6 x 2,8 l kolby do wytrząsania lub 6 x 5 l butelki z odczynnikiem lub 10 x 2,5 l kolby do wytrząsania Tunair. Tak więc pojemność jednej platformy wytrząsającej, jeśli napełnimy kolby i butelki z odczynnikami Fernbacha do 1/3 w porównaniu z dużą objętością napełnienia naczyń wynosi 4,8 l w porównaniu z 12 litrami przy użyciu 2,8 l kolb Fernbacha i 10 l w porównaniu z 24 litrami przy użyciu 5 litrowych butelek z odczynnikami (rysunek 6). Utrzymanie hodowli w komórkach zawiesinowych i zwiększenie skali produkcji w naczyniach hodowlanych o dużej objętości napełnienia pomogły nam przezwyciężyć ograniczenia wielkości produkcji i przyjąć platformę na dużą skalę. W związku z tym jest to bardzo przydatne dla laboratoriów, które nie mają dostępu do bioreaktorów i/lub mają ograniczoną przestrzeń w rurociągach produkcyjnych.
Protokół ten można łatwo dostosować do produkcji i oczyszczania konstruktów białkowych o różnych znacznikach powinowactwa poprzez wykorzystanie odpowiednich żywic i modyfikację oczyszczających, jak opisano w artykule opublikowanym przez SGC6 dla białek o pełnej długości znakowanych flagą PRMT4, 7, 9 oraz kompleksu PRMT5-MEP50 znakowanego Hisem i PRMT6. Chociaż opisujemy protokół BEVS dla rodziny białek PRMT, to samo podejście można zastosować do każdej innej rodziny białek.

Białko metylotransferazy argininy (PRMT) metylują reszty argininy w monometylowy lub symetryczny/asymetryczny sposób dimetylowy. Powtarzające się sekwencje RG/RGG/GRG są wysoce preferowane przez większość PRMT i można je znaleźć w szerokiej gamie białek1,2. Białka metylowane argininy, takie jak histony lub czynniki transkrypcyjne i czynniki splicingowe, regulują transkrypcję, splicing i strukturę chromatyny3,4. Rosnąca wiedza na temat różnorodnej regulacji wykorzystania substratów i kofaktorów, obrotu i kinetyki PRMT, a także generowania selektywnych inhibitorów, rzuciły mechanistyczne światło na te enzymy i ich kompleksy5,6. Jednak nie wszyscy członkowie rodziny PRMT są badani w takim samym stopniu; Na przykład dopiero niedawno odkryto, że PRMT9 należy do rodziny PRMT1. Badania struktury i funkcji enzymów tych białek wymagają wystarczających, często miligramowych, ilości rekombinowanego białka, aby były dostępne.
System ekspresji prokariotycznej Escherichia coli (E. coli) jest zazwyczaj pierwszym wyborem do badania przesiewowego ekspresji przy użyciu wielu konstruktów dla danego białka7,8,9. Jednak ekspresja oparta na E. coli nie zawsze prowadzi do wystarczających ilości białek PRMT w ich aktywnych formach, jak zauważyliśmy w szczególności w przypadku PRMT5 i PRMT7 (patrz poniżej). W ten sposób PRMT, które nie uległy ekspresji w E. coli lub musiały być wytwarzane przez eukariotyczną maszynerię ekspresyjną, zostały sklonowane do wektorów odpowiednich do badania przesiewowego ekspresji w alternatywnym systemie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS). Podczas gdy próbki PRMT1, PRMT3 i PRMT8 z ekspresją E. coli są szeroko wykorzystywane do testów in vitro i krystalografii, inne PRMT, takie jak PRMT5, który wymaga partnera wiążącego MEP50 w swojej podwójnej domenie metylotransferazy, oraz PRMT, takie jak PRMT7 i 9, wymagają ekspresji komórek owadów w celu uzyskania wystarczających ilości aktywnego białka. Ogólnie rzecz biorąc, standaryzowane średnioprzepustowe testy metylotransferazy dla PRMT4, 5, 6, 7 i 9 wykorzystywały BEVS w komórkach owadów6. System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to wszechstronna platforma do produkcji rekombinowanych białek wymagających eukariotycznej maszynerii ekspresji, która umożliwia modyfikacje potranslacyjne niezbędne do badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych10,11,12. Od czasu pierwszego doniesienia o użyciu bakulowirusów w 1983 roku do ekspresji białek dostępnych jest kilka BEVSów, które są dostępne na rynku13. Większość z tych protokołów wykorzystuje różne strategie przenoszenia plazmidu ekspresyjnego do komórek owadów. Należą do nich Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK itp. Nasz protokół opiera się na najczęściej używanym systemie w BEVS, systemie Bac-to-Bac14, który jest przeznaczony do przenoszenia genu/cDNA kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania (POI, tutaj PRMT) do genomu bakulowirusa utrzymywanego w wyspecjalizowanym szczepie E. coli poprzez transpozycję specyficzną dla miejsca15.
Krótko mówiąc, wektor transferu plazmidu zawierający interesujący nas gen został przekształcony w kompetentne komórki DH10Bac E. coli, aby wytworzyć rekombinowane wirusowe bakimidowe DNA. Adherentne komórki Sf9 zostały następnie przetransfekowane bakcydalnym DNA. Cztery do pięciu dni po transfekcji początkowe rekombinowane bakulowirusy wydzielane do pożywki komórkowej zostały odzyskane i oznaczone jako wirus P1. Stada bakulowirusa P1 wykorzystano następnie do amplifikacji wirusa (tj. generowania stad bakulowirusa P2) i badania przesiewowego ekspresji białka. Na podstawie wyników badań przesiewowych ekspresji zidentyfikowano wirusy P2 w celu uzyskania najlepszego konstruktu ekspresji białka i wykorzystano je do wytworzenia kultur zawiesinowych komórek owadów zakażonych bakulowirusem (SCBIIS) do produkcji białka na dużą skalę. W tym miejscu opisujemy nasze szczegółowe protokoły i opisujemy uzasadnienie naszych wyborów odczynników i naczyń hodowlanych, aby wesprzeć naszą strategię opracowania bardziej efektywnej czasowo, ekonomicznie i skalowalnej metodologii w celu uzyskania wystarczających ilości pożądanych białek rekombinowanych.

<table><tbody><tr><td>2.8L Nalgene&nbsp; Kolba hodowlana Fernbach, poliwęglan,</td> <td>Nalgene</td><td>29171-854</td><td>Do konserwacji na dużą skalę kultury zawiesinowej komórek Sf9</td></tr><tr><td>24-dołkowe bloki RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td>Do inkubacji&nbsp; 4ml zawiesiny&nbsp; Ogniwa Sf9&nbsp; dla białka&nbsp; badanie przesiewowe ekspresji</td></tr><tr><td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td><td>Biorad</td><td>5671095</td><td>Do analizy SDS-PAGe oczyszczonych białek</td></tr><tr><td>50ml Zbiornik odczynnika</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229290</td><td>&nbsp; Zbiornik używany do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji&nbsp; i zawiesina komórek Sf9</td></tr><tr><td>96-dołkowa mata nasadkowa, do stosowania z studzienką kwadratową, 2 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>381080</td><td>Służy do pokrycia 96-dołkowej płytki</td></tr><tr><td>PCR blokowej 96-dołkowej</td><td>Eppendorf</td><td>30129300</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Do palet selekcyjnych LB-agar</td></tr><tr><td>Arkusze taśmy Airpore Qiagen</td><td></td><td>19571</td><td>Do pokrycia 24 bloków dołków do badania przesiewowego</td></tr> <tr><td>ekspresji białekWirówka Allega X-15R</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>antybiotykowy antybiotyk przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>Bacmid DNA</td><td>wewnętrzna</td><td>pozycja poza katalogiem</td><td>Bacmid DNA do produkcji bakulowirusa</td></tr><tr><td>Bluo-Gal, 1g</td><td>Thermo Fisher</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>Beckman JLA 8.1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, 24-dołkowe, z pokrywka, płaskie dno, sterylne</td><td>Eppendorf</td><td>30722116</td><td>Tissue&nbsp; płytka poddana hodowli</td></tr><tr><td>Roztwór do ponownego zawieszania komórek 0,5&nbsp; L</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKCRS500</td><td>do ekstrakcji DNA Bacmid</td></tr><tr><td>Komórka&nbsp; Roztwór do lizy 0,5&nbsp; L</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKCLS500</td><td>do ekstrakcji DNA Bacmid</td></tr><tr><td>CELLSTAR&nbsp; Płytki do hodowli tkankowych, 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td>Do mieszanki transfekcyjnej</td></tr><tr><td>ClipTip 1250, ponowne ładowanie filtra, sterylne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94420818</td><td>Końcówki do&nbsp; programowalnych i regulowanych pipet wielokanałowych</td></tr><tr><td>dNTP Mix (25 mM każda)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1121</td><td></td></tr><tr><td>E1-ClipTip&nbsp; Elektronicznie regulowana rozstaw końcówek Wielokanałowa pipeta korektora, 15 do 1250 &mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672090BT</td><td>Programowalna i regulowana pipeta wielokanałowa</td></tr><tr><td>E4&nbsp; Pipeta 6-kanałowa XLS o regulowanym rozstawie kół, 20-300 &mu; L</td><td>Ranin</td><td>LTS EA6-300XLS</td><td>Regulowana pipeta wielokanałowa Ranin</td></tr><tr><td>Mikropłytka filtracyjna, 96-dołkowa, polipropylenowa, z 25 &mikro; m membrana polietylenowa o ultra wysokiej masie cząsteczkowej</td><td>Agilent</td><td>201005-100</td><td>Do oczyszczania białek w badaniach przesiewowych ekspresji</td></tr><tr><td>Zestaw kolb z pełną przegrodą Tunair, 2.5L</td><td>IBI Scientific</td><td>SS-6003C</td><td>Do produkcji białek na dużą skalę w hodowli zawiesinowej komórek SF9</td></tr><tr><td>Gentamycyna 10x10ml</td><td>BioShop</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Biocenter</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>I-Max Pożywka dla owadów z L-glutaminą, 1 l</td><td>Bisent Biocenter</td><td>301-045-LL</td><td>Pożywka do wzrostu komórek owadów bez surowicy</td></tr><tr><td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td><td>Expedeon Protein Solutions</td><td>ISB1L-1L</td><td>Do barwienia żelu białkowego (SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Iptg, Ultra Pure, Bez dioksanu, Min 99.5%</td><td>BioShop</td><td>IPT001.100</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji JetPRIME&nbsp; Dostarczane z&nbsp; jetPRIME buffer</td><td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td><td>114-01</td><td>Do transfekcji komórek Sf9 w celu wytworzenia</td></tr><tr><td>monosiarczanu kanamycyny</td> bakulowirusa <td>BioShop</td><td>KAN201.100</td><td></td></tr><tr><td>Lb Rosół (Lennox), proszek mikrobiologiczny Gro&</td><td>Sigma</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Masterblock 96 studnia głębinowa 2,4 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780285-FD</td><td>Stosowany w procedurach przesiewowych transformacji i ekspresji</td></tr><tr><td>Maksymalna wydajność Kompetentne komórki DH10Bac, 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>10361012</td><td>Kompetentne komórki do generowania bakcydowego DNA</td></tr><tr><td>Pipeta 12-kanałowa mLINE, regulowana 30 - 300 uL</td><td>Sartorius</td><td>Sartorius 725240</td><td>12-kanałowa </td></tr><tr><td>Roztwór do neutralizacji pipet, 0,5&nbsp; L</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKNS0500</td><td>Do ekstrakcji DNA bakimidów</td></tr><tr><td>Nowy Brunszwik&nbsp; Innova 44R, 120V, orbita 2,5 cm (1 in)</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td>Inkubator z wytrząsarką do inkubacji zawiesiny komórek Sf9</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>LS15140122</td><td></td></tr><tr><td>PYREX&nbsp; Delong Shaker Kolba Erlenmeyera z przegrodami, Corning&nbsp; 500ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-500</td><td>Do&nbsp; hodowli zawiesinowej komórek Sf9</td></tr><tr><td>PYREX Delong Shaker Kolba Erlenmeyera z przegrodami, Corning&nbsp; 125ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-125</td><td>Do hodowli zawiesinowej komórek Sf9</td></tr><tr><td>PYREX Delong Shaker Kolba Erlenmeyera z przegrodami, Corning&nbsp; 250ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-250</td><td>Do hodowli zawiesinowej komórek</td></tr> <tr><td>Sf9Czerwony&nbsp; Nukleinowy&nbsp; Kwas&nbsp; Barwienie&nbsp; Roztwór</td><td>Froggabio</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A, 0,9&nbsp; mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKPMRN30</td><td>Do buforu zawiesinowego do ekstrakcji DNA bakimidów</td></tr><tr><td>Roll & Kuliste szklane koraliki do uprawy</td><td>MP Biomedicals</td><td>115000550</td><td>dla&nbsp; rozprzestrzeniania komórek bakteryjnych na powierzchni płytki agarowej.</td></tr><tr><td>RT-LTS-A-300&mu; L-768/8 (końcówki)</td><td>Ranin</td><td>30389253</td><td>Końcówki do pipety wielokanałowej ranin</td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>surowica, hodowla komórkowa, płodowa surowica bydlęca (fbs), hyklon, scharakteryzowany kanadyjski</td><td>cytivalifesciences</td><td>SH3039602</td><td>Oprócz surowicy wolny medim dla&nbsp; transfekowanych komórek</td></tr><tr><td>Komórki Sf9</td><td>Thermo Fisher</td><td>12659017</td><td>Owad komórki</td></tr><tr><td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td><td>Cytiva (dawniej GE Healthcare Life Sciences)</td><td>SH3027802</td><td>Pożywka do wzrostu komórek owadów bez surowicy</td></tr><tr><td>Podkładka taśmowa</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>Podkładka taśmowa</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq z buforem ThermoPol - 2,000 jednostek</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina Hcl</td><td>BioShop</td><td>TET701.10</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4% Rozwiązanie</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>dla&nbsp; ocena żywotności komórek</td></tr><tr><td>VITLAB&nbsp; Butelki z odczynnikami, PP z nakrętkami, PP, BrandTech, 5L</td><td>VITLAB</td><td>V100889</td><td>Do produkcji białek na dużą skalę w hodowli zawiesinowej komórek Sf9</td></tr><tr><td>VWR&nbsp; Cyfrowy mini inkubator</td><td>VWR</td><td>10055-006</td><td>Inkubator do przylegających komórek Sf9</td></tr><tr><td>VWR&nbsp; Wytrząsarka do mikropłytek inkubacyjnych</td><td>VWR</td><td>97043-606</td><td>Inkubator do hodowli zawiesinowej komórek Sf9 w blokach 24-dołkowych</td></tr><tr><td>VWR Szalki Petriego VWR</td><td></td><td>CA73370-037</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGene 9 DNA&nbsp; Odczynnik do transfekcji&nbsp; 1,0 M</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>do transfekcji komórek Sf9 w celu wytworzenia rekombinowanego bakulowirusa</td></tr></tbody></table>

produkcja rekombinowanych białek prmt przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Białko metylotransferazy argininy (PRMT) metylują reszty argininy na szerokiej gamie białek, które odgrywają rolę w wielu procesach komórkowych. PRMT mogą mono- lub dimetylanować grupy guanidynowe argininy symetrycznie lub asymetrycznie. Enzymologia tych białek to złożony i intensywnie badany obszar, który wymaga miligramowych ilości wysokiej jakości rekombinowanego białka. System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) wykorzystujący wirusa wielonukleopolihedronowego Autographa californica (AcMNPV) i komórki owadów Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) został wykorzystany do badania przesiewowego ekspresji i produkcji wielu PRMT, w tym PRMT 1, 2 i 4 do 9. Aby jednocześnie przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem ekspresji wielu konstruktów tych białek, w tym domen i skróconych fragmentów, a także białek o pełnej długości, zastosowaliśmy skalowalne metody wykorzystujące regulowane i programowalne pipety wielokanałowe, połączone z 24- i 96-dołkowymi płytkami i blokami. Ogólnie rzecz biorąc, te dostosowania metody umożliwiły generowanie na dużą skalę bakimidowego DNA, rekombinowanych wirusów i badań przesiewowych ekspresji białek. Wykorzystanie naczyń hodowlanych z dużą objętością zawiesiny komórek Sf9 pomogło przezwyciężyć ograniczenia przestrzenne w procesie produkcyjnym w przypadku produkcji białek na dużą skalę w jednej partii. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły wydajnej i opłacalnej ekspresji funkcjonalnych PRMT do badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych.

Przegląd protokołu BEVS przedstawiono na Rysunku 1. Wiele konstruktów ekspresyjnych PRMT, w tym pełnowymiarowe, domeny oraz fragmenty ucięte, zostało opracowanych w Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) zgodnie z wewnętrznymi strategiami w celu zwiększenia skuteczności identyfikacji rozpuszczalnych i stabilnych białek o stosunkowo wysokim poziomie ekspresji7,9. Zainteresowanym czytelnikom zaleca się zapoznanie z definicjami SGC i metodologią projektowania „fragmentu” jako segmentu sekwencji genu włączonego do klonu ekspresyjnego, „domeny” jako domeny strukturalnej z adnotacją PFAM oraz „konstruktu” jako fragmentu sklonowanego w wektorze ekspresyjnym; wszystkie te pojęcia zostały szczegółowo opisane w wcześniejszej publikacji7. Konstrukty ekspresyjne PRMT przedstawione w niniejszym protokole służą do produkcji białek z tagiem polihistydynowym sklonowanych do wektora pFBOH-MHL, który jest pochodną wektora pFastBac1. Na Rysunku 4 przedstawiamy analizę SDS-PAGE rozpuszczalnych konstruktów z tagiem His dla PRMT1, 2, 4-9, oczyszczonych z osadów zebranych po produkcji w 4 mL komórek Sf9 (krok 3.1.4). Pełnowymiarowe (FL) PRMT1 i PRMT9 nie są przedstawione na tym żelu, ponieważ FL PRMT1 był produkowany w E. coli, a FL PRMT9 produkowany metodą BEVS był oczyszczany za pomocą tagu Flag6. Ucięte konstrukty PRMT1, FL PRMT4 oraz wszystkie konstrukty PRMT8 wykazują stosunkowo wysoką wydajność, jednak eluatuy białkowe zawierają frakcje współoczyszczonych zanieczyszczeń. Konstrukty te wymagają dalszej optymalizacji protokołów oczyszczania. W związku z tym niezbędne są dodatkowe podejścia w celu poprawy czystości tych białek przy produkcji na większą skalę, takie jak zmniejszenie ilości kulek niklowych na etapie inkubacji z klarownym lizatem; zwiększenie stężenia imidazolu w buforach piorących; odcięcie tagu His za pomocą proteazy TEV, a następnie nałożenie na żywicę powinowactwa do Ni; oraz dodatkowe etapy oczyszczania, takie jak chromatografia wykluczaniaC rozmiarowego i wymiany jonowej. Konstrukty PRMT2 wykazują znacznie niższą wydajność w porównaniu z innymi białkami, a białko pełnowymiarowe PRMT2 towarzyszy silny prążek zanieczyszczenia. Produkcja na większą skalę i dwa etapy oczyszczania, takie jak IMAC i wykluczanie rozmiarowe, potwierdziły niski poziom ekspresji dla tego konstruktu oraz stałą obecność współoczyszczonego zanieczyszczenia dla białka FL. Czyste białka uzyskano dla kompleksu PRMT5, produkowanego i oczyszczanego wraz z jego obligatoryjnym partnerem wiążącym, MEP50. Ucięty konstrukt PRMT9 ma prawie dwu- lub trzykrotnie niższy poziom ekspresji, bliski 1,5 mg/L, w porównaniu do innych PRMT. Niemniej jednak rekombinowane zapasy wirusowe tego konstruktu zostały wykorzystane do produkcji na większą skalę, uzyskano kryształy dyfrakcyjne i rozwiązano strukturę tego białka wraz z PRMT4, 6 i 7 (Rysunek 5).
W celu zwiększenia skali produkcji do zainfekowania hodowli zawiesinowej komórek owadów Sf9 wykorzystano odpowiednie wirusy P2. Etap ten pozwala na uzyskanie 50/100/200 mL zainfekowanych komórek baculowirusami, zawierających komórki zainfekowane oraz wirusy P3 w supernatancie. Do wielkoskalowej produkcji białka 2 L komórek Sf9 hodowano w kolbach Fernbacha o pojemności 2,8 L przy 150 rpm i 27 °C (Rysunek 6). W dniu produkcji 2 L komórek Sf9 (żywotność komórek &gt; 97%) w kolbach Tunair o pojemności 2,5 L lub 4 L w butelkach na odczynniki o pojemności 5 L rozcieńczono do gęstości komórkowej 4 x 106/mL. Komórki te zainfekowano bezpośrednio 10-12 mL/L hodowlą zawiesinową zainfekowanych baculowirusami komórek owadów i inkubowano w obniżonej temperaturze 25 °C przy 145 rpm. Bezpośrednia infekcja partii produkcyjnej hodowlą zawiesinową zainfekowanych baculowirusami komórek owadów znacząco zredukowała żmudne i czasochłonne etapy amplifikacji objętości wirusa, eliminując dodatkową manipulację zainfekowanymi komórkami, a także zapobiegła spadkowi miana i degradacji wirusa. Utrzymanie hodowli komórek SF9 oraz produkcja w większej skali odbywały się w naczyniach hodowlanych o wysokiej objętości napełnienia, aby umożliwić wielkoskalową produkcję białka w ramach jednej partii (Rysunek 6).
Pełnowymiarowe białka PRMT 4, 5 (w kompleksie z MEP50), 6, 7 i 9 wytworzone przy użyciu platformy produkcyjnej opartej na baculowirusach zostały wykorzystane do charakterystyki kinetycznej oraz przesiewu związków hamujących w SGC6. Struktury krystaliczne pełnowymiarowych lub skróconych form białek PRMT 4, 6, 7 i 9 z różnymi sondami chemicznymi i inhibitorami zostały rozwiązane i zdeponowane w Protein Data Bank (PDB). Plazmidy ekspresyjne dla tych PRMT zostały zdeponowane w repozytorium plazmidów Addgene (Addgene jest partnerem dystrybucyjnym SGC, https://www.addgene.org/) i są dostępne dla społeczności badawczej (Rysunek 5).
<img alt="Schemat procesu ekspresji PRMT; od konstruktów genowych do produkcji białka; obejmuje analizę SDS-PAGE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd etapów procesu ekspresji baculowirusowej <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zdjęcia mikroskopowe porównania kultur komórkowych, ilustrujące morfologię komórek w różnych warunkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Komórki Sf9 zainfekowane baculowirusem i niezainfekowane. Objawami infekcji są zmiany strukturalne w komórkach owada, takie jak wzrost średnicy komórki o 25-50%, powiększone jądra komórkowe, jednolity zaokrąglony kształt, utrata zdolności do proliferacji i przyleganie do powierzchni naczynia hodowlanego, a także spadek żywotności komórek. Biały pasek skali 200 µm. Przedstawione tutaj objawy infekcji są takie same dla komórek transfekowanych przy użyciu obu odczynników do transfekcji, JetPrime i X-tremeGene 9. Pokazany konkretny przykład dotyczy odczynnika do transfekcji JetPrime. (A) Niezainfekowane komórki Sf9 jako kontrola. (B) Komórki Sf9 zainfekowane baculowirusem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ oczyszczania: zestaw płytki filtrującej z 96 dołkami z żywicą Ni-NTA, schemat metody pipetowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zestaw płytki wiążącej do szybkiego oczyszczania testowych białek ekspresyjnych. Szczegóły znajdują się w tekście, kroki 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy białek; poziomy ekspresji białek; warianty PRMT; ścieżki żelu z markerami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki przesiewowe ekspresji białek. Wyniki przesiewowe ekspresji białek w procesie produkcji białek za pośrednictwem bakulowirusów w 4 mL hodowli zawiesinowej Sf9 zainfekowanej odpowiednimi rekombinowanymi wirusami P1 dla różnych PRMT oraz kompleksu PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żel SDS-PAGE z prążkami białek; tabela konstruktów plazmidowych; analiza wielkości białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Podsumowanie konstruktów ekspresyjnych dla PRMT4, 6, 7 i 9 wykorzystanych do badań struktury krystalicznej w Structural Genomics Consortium w Toronto (SGC). Struktury krystaliczne zostały rozwiązane i zdeponowane w Protein Data Bank (PDB) dla pełnych lub skróconych form białek PRMT 4, 6, 7 i 9 z różnymi sondami chemicznymi i inhibitorami. Plazmidy ekspresyjne dla tych PRMT zostały zdeponowane w repozytorium plazmidów Addgene i są dostępne dla społeczności badawczej (Addgene jest partnerem dystrybucyjnym SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Hodowla komórek Sf9 i produkcja białek z wykorzystaniem kolb Fernbacha Nalgene oraz zestawu kolb wytrząsowych Tunair." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Utrzymanie hodowli komórek owadzie Sf9 i produkcja białek w różnych naczyniach hodowlanych: (A) Kolba Fernbacha o pojemności 2,8 L do utrzymania komórek i produkcji białek. Zastosowanie 72% objętości wypełnienia zwiększa wydajność 2,5-krotnie na jednej platformie wytrząsowej. (B) Kolby wytrząsowe Tunair (na zdjęciu przedstawiono tylko 9 z 10 kolb) oraz butelki na odczynniki przy 80% objętości wypełnienia drastycznie zwiększają wydajność produkcyjną platformy wytrząsowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Ogólnym celem tego protokołu jest badanie przesiewowe ekspresji wielu konstruktów metylotransferaz białkowych argininy w produkcji na dużą skalę w celu uzyskania miligramowej ilości białka do badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych w trybie wspomaganym pożywką, efektywnym kosztowo w pokryciu platformy ekspresyjnej S, systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa. Dr Alma Seitova przedstawi następujące kroki. Rozcieńczyć wykładniczo rosnące komórki SF9 do końcowej gęstości komórek 0,4 miliona na promil w pożywce dla owadów bez surowicy i wlać do sterylnego zbiornika odczynnika.Użyj programowalnej pipety wielokanałowej, aby wstrzyknąć 0,5 mililitra rozcieńczonych komórek SF9 do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Ta objętość wystarczy, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni roboczej studni. Jednocześnie nie rozcieńcza zbytnio mieszanki transfekcyjnej, co umożliwia jej efektywność.Oznaczyć tylko jedną studzienkę płytki jako komórkę i użyć jej jako kontroli do porównania transfekowanej i nietransfekowanej komórki w celu oceny potencjalnych objawów infekcji. Inkubować płytki w temperaturze 27 stopni, aż będą potrzebne, około godziny, aby komórki mogły przyczepić się do płytek do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć dobrze wymieszany odczynnik do transfekcji w nieuzupełnionym zbiorniku na owady i sterylnym zbiorniku odczynnika i delikatnie mieszać przez 10 sekund.Za pomocą 12-kanałowej pipety przenieś 102 mikrolitry rozcieńczonego odczynnika transakcyjnego do sterylnej płytki 96 MicroWell. Przenieś 10 mikrolitrów po 0,2 mikrograma na mikrolitr rekombinowanego DNA bakmidu do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki MicroWell i wymieszaj, delikatnie potrząsając, stukając w płytkę z boków. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 15 do 20 minut, aby uzyskać złożoną formację.Za pomocą regulowanej sześciokanałowej pipety przeznaczonej do przenoszenia między płytką 96- i 24-dołkową, nałóż mieszaninę do transfekcji na komórki kroplami do odpowiednich dołków płytek transfekcyjnych i inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 27 stopni. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej na monowarstwie komórek, delikatnie kołysz płytkami w przód iw tył kilka razy w czasie inkubacji. Cztery do pięciu godzin po transfekcji dodaj 1,5 milia pożywki przeciw owadom niezawierającej surowicy.Uzupełnij go 10% finałem inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% antybiotyku i środka przeciwgrzybiczego. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 27 stopni przez 72 do 96 godzin. Jeśli to możliwe, delikatnie kołysz płytkami transfekcyjnymi raz dziennie.Poszukaj oznak infekcji widocznych w transfekowanych komórkach po 72 do 96 godzinach po transfekcji. Cztery do pięciu dni po transfekcji w transfekowanych komórkach powinny być widoczne oznaki infekcji w porównaniu z komórkami kontrolnymi pod mikroskopem odwróconym, a początkowe rekombinowane bakulowirusy wydzielane do pożywki do hodowli komórkowej powinny być gotowe do pobrania. Użyj programowalnego elektronicznego wielokanałowego, aby umożliwić jednoczesne zbieranie wirusów P1, infekcję świeżo wysianych komórek SF9 w infekcji komórek zawiesinowych w ich 24-dołkowych blokach 150 mikrolitrami wirusów P1.Odkręć resztę zbiorczych zapasów wirusa P1 przez 15 minut, przykryj 24 bloki dołków kulturą zawiesinową zainfekowanych komórek SF9 za pomocą arkusza AirPore. Inkubować blok 24-dołkowy w temperaturze 27 stopni z wytrząsaniem przy 245 obr./min przez 72 do 96 godzin. Cztery dni przed planowanym czasem produkcji rozdrobnić wykładniczo rosnące komórki SF9 o końcowej gęstości komórek 2 miliony na promil do szklanej nici dentystycznej Erlenmeyera z przegrodami w pożywce owadobójczej wolnej od surowicy zawierającej 1% końcowego antybiotyku i środka przeciwgrzybiczego.Na tym etapie zostanie wygenerowana hodowla zawiesinowa zakażonych komórek owadów i wirusów P2 w supernatancie w celu zakażenia nowych komórek w partii produkcyjnej. Dodaj odpowiednie wirusy P2 i inkubuj zakażone komórki w niższej temperaturze 25 stopni, aby spowolnić wzrost komórek, wstrząsając z prędkością 165 obr./min na wytrząsarce orbitalnej z jednym calowym uderzeniem. Cztery dni przed planowanym czasem produkcji wysiewaj dwa litry wykładniczo rosnących komórek SF9 w pożywce wolnej od surowicy owadów do gęstości komórek 1 miliona na promil, w 2,8-litrowej kolbie do wstrząsania Fernbach.Potrząsnąć kolbą w temperaturze 27 stopni z wytrząsaniem przy 150 obr./min. Naukowiec Ashley Hutchinson zademonstruje następujący protokół. Podziel cztery litry wykładniczo rosnących komórek SF9 i pożywki wolnej od surowicy owadów do końcowej gęstości komórek 4 milionów na promil do dużych pięciolitrowych butelek z odczynnikami.Dodać 10 do 12 milicali kultury zawiesinowej komórek owadów zakażonych bakulowirusem. Inkubować zainfekowaną kulturę komórek SF9 w wytrząsarce, wytrząsając 145 obr./min w niższej temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 72 do 96 godzin. Miligramowe ilości kilku rekombinowanych białek z rodziny PRMT ulegają ekspresji w natychmiastowej produkcji bakulowirusa w komórkach SF9 są wykorzystywane do biochemicznych biofizycznych badań instruktażowych, jak widać na rycinie piątej.W SGC struktury krystaliczne zostały rozpuszczone w zdeponowanym w banku danych białkowych dla pełnej długości lub skróconych form białek PRMT4, 6, 7 i 9 za pomocą różnych sond chemicznych i inhibitorów. Plazmidy ekspresyjne dla tych PRMT zostały zdeponowane w celu dodania kolekcji genów przez SGC i są dostępne dla społeczności naukowej. W tym filmie podkreśliliśmy kluczowe elementy udanego badania przesiewowego ekspedycji ich wielorakiego konstruktu metylotransferaz białkowych argininy w produkcji na dużą skalę w systemie ekspresji bakulowirusa.Zastosowanie zwykłych, regulowanych i programowalnych pipet wielokanałowych sprawiło, że cały proces był szybszy niż wydajny. Zastosowanie wysokowydajnego i mniej toksycznego dla komórek odczynnika do transfekcji do generowania rekombinowanych wirusów doprowadziło do bardziej opłacalnego i tego protokołu transfekcji do obsługi komórek. Zakażenie dużej partii do produkcji białek kulturą zawiesinową bakulowirusa zakażonego w sześciu komórkach znacznie zmniejszyło pracochłonny etap intensywnej amplifikacji startera.Jest na przykład odwirowanie tego za pomocą specjalnej hodowli zakażonych komórek. To oczywiście wyklucza dodatkowe obchodzenie się z zainfekowanymi komórkami, aby uniknąć ich ściślejszej degradacji wirusa. Utrzymanie zawiesinowej komórki hodowlanej w tej skali produkcji w naczyniu hodowlanym było dużą objętością pola, co pomogło nam przezwyciężyć ograniczenia wielkości produkcji i przyjąć platformę na dużą skalę.Jest to bardzo przydatne dla laboratoriów, które nie mają dostępu do bioreaktorów lub mają ograniczoną przestrzeń w procesie produkcyjnym. Chociaż nasz protokół został opisany dla białek z rodziny metylotransferaz białkowych argininy, to samo podejście można zastosować do każdej innej rodziny białek wymagających platformy ekspresji w celu uzyskania wystarczającej ilości białka do biochemicznych biofizycznych badań instruktażowych.

production-recombinant-prmt-proteins-using-baculovirus-expression

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda przygotowania komórek owadzie i zakażania ich bakulowirusem w celu produkcji rekombinowanego białka mCD1d oraz generowania tetramerów mCD1d.

Metoda produkcji rekombinowanego białka mCD1d w komórkach owadzych.

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

W tym protokole, bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidu bakulowirusa do komórek Sf9 i amplifikowany w kulturze zawiesinowej bez surowicy. Supernatant jest oczyszczany przez chromatografię powinowactwa heparyny i dalej zagęszczany przez ultrawirowanie. Protokół ten jest przydatny do produkcji i oczyszczania bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Poznaj metodę produkcji rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa. Technika ta umożliwia uzyskanie miligramowych ilości białek do badań biochemicznych i strukturalnych.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Przeglądaj więcej filmów