Name: Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy. Technika ta zapewnia żywotne komórki do badań elektrofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) oraz Pekińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (nr 7192051). Wkład autora: Bai i Liu zaprojektowali i wymyślili projekt. Wen i Ruan udzielili cennych rad dotyczących eksperymentów. Wu i Linling Li przeprowadzili prace eksperymentalne i odegrali kluczową rolę w pozyskiwaniu, analizie i interpretacji danych. Li brał udział w montażu aparatury Langendorffa. Peng, Zhang, Wang i Yang uczestniczyli w przygotowaniu odczynników i roztworów przed eksperymentem. Wu napisał ten artykuł.

Dorosłe samce myszy C57BL/6 o wadze 20-30 g, w wieku 8-10 tygodni zostały zakupione w Centrum Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie, Chiny. Wszystkie procedury doświadczalne zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych zaproponowanym przez Instytut Zasobów Zwierzęcych i opublikowanym przez Narodowe Instytuty Zdrowia. Do pozyskiwania i analizy danych wykorzystano Excel i Origin 8.5. Dane przedstawiono jako średnie ± SD, do oceny statystycznej zastosowano test t Studenta, a P < 0,05 uznano za statystycznie istotne.
1. Przygotowanie roztworu i aparatu do perfuzji
<ol>
	<li>Zmontuj aparat Langendorffa o stałym przepływie (dostępny na rynku lub własnej produkcji). Rysunek 1 przedstawia prosty schemat.</li>
	<li>Przygotować roztwory zgodnie z odczynnikami podanymi w Tabeli 1 i Tabeli 2.</li>
	<li>Włącz łaźnię z krążącą wodą i wyreguluj odpowiednią temperaturę wejściową (42,7 °C w naszym laboratorium), aby upewnić się, że odpływ systemu cyrkulacji perfuzyjnej z kaniuli osiągnie 37 °C.</li>
	<li>Oczyść system perfuzyjny, cyrkulując wodę dejonizowaną. Jeśli wymagany jest stan sterylny, przepuść 75% etanolu przez system perfuzyjny przez 15 minut, a następnie wodę dejonizowaną (co najmniej 10 cykli, aby uniknąć wpływu toksyczności alkoholu na serce).</li>
	<li>Zmierz czas i objętość dla jednego cyklu systemu cyrkulacji perfuzacji, aby określić, ile mililitrów natlenionego roztworu Tyrode'a należy załadować w następnym kroku perfuzji.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w żądany sposób.</li>
	<li>Ustawić natężenie przepływu systemu perfuzyjnego na 4 ml/min.</li>
	<li>Przygotować dwie czyste szalki Petriego o średnicy 35 mm – jedną zawierającą roztwór Tyrode'a (szalka Petriego 1), drugą zawierającą roztwór 1 (szalka Petriego 2).</li>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną roztworem 1 i stalową igłą kaniulową o sile 20 G z wycięciem w miejscu, w którym odległość wynosi 1 mm od końcówki. Przygotuj luźny węzeł z szwem 3-0 do trzonu kaniuli. Wyreguluj pole widzenia mikroskopu stereoskopowego i upewnij się, że końcówka kaniuli znajduje się poniżej powierzchni cieczy szalki Petriego 2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Podawać heparynę (stężenie 1,000 j.m./ml; 0,2 ml/mysz) dootrzewnowo myszom, aby uniknąć zakrzepów krwi. Po 10 minutach znieczulij myszy pentobarbitalem sodu (50 mg / kg, wstrzyknięcie dożylne) i upewnij się, że myszy przestaną reagować na szczypanie ogona/palca. Zwichnięcie szyjki macicy należy wykonać 20 minut po podaniu heparyny.</li>
	<li>Przenieś myszy na platformę chirurgiczną, unieruchom myszy w pozycji leżącej, wysterylizuj klatkę piersiową 75% etanolem i osusz ją gazą lub serwetką.</li>
</ol>
3. Wycięcie serca i kaniulacja aorty
<ol>
	<li>Podnieś skórę mieczykowatej za pomocą kleszczy tkankowych i wykonaj niewielkie boczne nacięcie przez skórę nożyczkami do tkanek. Wykonaj rozwarstwienie między skórą a powięzią i rozszerz nacięcie skóry w kształcie litery V w kierunku pach po obu stronach.
	<ol>
		<li>Kontynuuj ten sam ślad nacięcia przez klatkę piersiową, a następnie odchyl klatkę piersiową w górę, zaciskając mostek kleszczami tkankowymi, aby całkowicie odsłonić serce i płuca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oderwij osierdzie za pomocą zakrzywionych kleszczy. Rozerwij grasicę w obie strony za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczy, jeśli zakrywa duże naczynia. Delikatnie pociągnij podstawę serca w kierunku ogona za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż zobaczysz naczynie krwionośne w kształcie litery "Y" (aortę i jej tętnice rozgałęzione).</li>
	<li>Aby zarezerwować różne długości aorty do kaniulacji i porównania, należy przeciąć aortę na lewej tętnicy szyjnej wspólnej (zielona linia w <silna klasa = "xfig">Ryc. 2) i przeciąć tętnicę ramienno-głowową w tym samym czasie u niektórych myszy. Transekt na aorcie wstępującej u innych myszy (linia w <silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, ten krok można również wykonać pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Wyciąć serce i natychmiast zanurzyć w szalce Petriego 1, aby umyć i wypompować pozostałą krew.</li>
	<li>Przenieś serce na szalkę Petriego 2 i w razie potrzeby przytnij nadmiar tkanki za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki. Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, wykonaj ten krok pod mikroskopem stereoskopowym, aby uniknąć błędnego przecięcia aorty lub innych struktur serca.</li>
	<li>Wcisnąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza przed kaniulacją aorty. Wykonaj kaniulację aorty wstecznej za pomocą dwóch prostych kleszczy wiążących (gładkich szczęk) pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że cały proces kaniulacji znajduje się pod powierzchnią cieczy.</li>
	<li>Unikaj penetracji zastawek aortalnych i dostosuj głębokość odpowiednio do aorty wstępującej (myszy, przez którą aorta została przecięta w lewej tętnicy szyjnej wspólnej) i korzenia aorty (myszy, u której aorta została przecięta przez aortę wstępującą). 
	UWAGA: Głębokość kaniulacji aorty (określana po prostu jako głębokość) jest tutaj definiowana jako pozycja, w której końcówka kaniuli znajduje się w aorcie lub w której aorta jest podwiązana.</li>
	<li>Podwiązać aortę za pomocą szwu 3-0 przed węzłem do wcięcia kaniuli. Delikatnie docisnąć zawartość strzykawki, aby wypłukać resztki krwi. 
	UWAGA: Krew opuści tętnice wieńcowe i wypłynie z żył grzbietowych, jeśli głębokość zostanie prawidłowo ustawiona. Serce i przydatki przedsionkowe rozszerzą się i staną się blade.</li>
	<li>Wyjmij i podłącz kaniulę do aparatu Langendorffa. Jeszcze raz należy uważać, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do serca. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że czas od torakotomii do początkowej perfuzji nie powinien przekraczać 5 minut.</li>
</ol>
4. Perfuzja serca
<ol>
	<li>Najpierw zalej i perflej natleniony roztwór Tyrode'a przez około 10 s (objętość cieczy trwająca 10 s w systemie używanym w tym protokole wynosi około 0,7 ml), jeśli w przedsionkach znajduje się resztkowa krew, a następnie zmień na roztwór 1. Jednak wystarczy wykonać perfuzję z roztworem 1, jeśli w przedsionkach nie ma resztkowej krwi. Płucz serce przez około 2 minuty.</li>
	<li>Przejdź do rozwiązania 3. Odessać około 2,5 ml roztworu 3 za pomocą sterylnej pipety polietylenowej jednorazowego użytku i podgrzać ją w łaźni wodnej do późniejszego użycia, a pozostałą część użyć do perfuzji przez około 11-12 minut. Wyrzuć roztwór 3 perfundowany w ciągu pierwszych 2 minut. Resztę należy zawrócić do zbiorników perfuzatu za pomocą pompy perystaltycznej w celu ponownego użycia do czasu zakończenia trawienia.</li>
	<li>Zakończ trawienie, gdy serce stanie się spuchnięte i stanie się lekko blade i wiotkie (gąbczasta tekstura) lub pojawi się odcisk, jeśli mięsień sercowy zostanie delikatnie ściśnięty za pomocą ząbkowanych kleszczy.</li>
</ol>
5. Izolacja komórek i reintrodukcja wapnia
<ol>
	<li>Usuń komory i przedsionki za pomocą kleszczy i umieść je na różnych szalkach Petriego. Dodaj podgrzany roztwór 3 do szalek Petriego.</li>
	<li>Rozetrzyj tkankę do mętnej tekstury za pomocą kleszczy i delikatnie pipetuj tkankę, aby uzyskać równomierne trawienie. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przenieś mętną, strawioną tkankę za pomocą pipety do roztworu 4, aby zatrzymać pozostałą aktywność enzymu, a następnie wirować przez 20 s w temperaturze 192×g. Usunąć supernatant i dodać roztwór 5 do osadu komórkowego i pipety, aby równomiernie rozproszyć komórki.</li>
	<li>Ponownie wprowadzaj wapń stopniowo, aby uniknąć paradoksu wapnia i przeciążenia wapniem. Stopniowo dodawać w sumie 50 μL 100 mM/L CaCl2 (w odstępach co 5 μL, odpowiednio 10 μL, 15 μL i 20 μL) do zawiesiny komórek.</li>
</ol>
6. Przechowywanie komórek
<ol>
	<li>W celu badania zacisku krosowego przechowuj komórki w roztworze Tyrode'a. W przypadku innych badań komórkowych należy przechowywać komórki w roztworze 6.</li>
	<li>Aby zapewnić dokładność wyników badań nad ostrą czynnością (np. iskry Ca2+, fale Ca2+, uwolnienie Ca2+, wyciek Ca2+ i zapisy patch clamp), zakończ tego rodzaju eksperymenty funkcjonalne w ciągu najbliższych 6 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+framingham+heart+study+and+the+epidemiology+of+cardiovascular+diseases%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective.</a> Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).</li>
<li>Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+models%3A+cardiovascular+system+studies+and+technological+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).</li>
<li>Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+recordings+at+the+single+channel+level+in+adult+mammalian+isolated+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).</li>
<li>Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks+and+excitation-contraction+coupling+in+phospholamban-deficient+mouse+ventricular+myocyte%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte.</a> The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).</li>
<li>Chou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+dynamics+and+anisotropic+reentry+in+isolated+canine+pulmonary+veins+and+left+atrium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium.</a> Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).</li>
<li>Brittsan, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+SR+Ca2%2B-ATPase+inhibition+causes+adaptive+changes+in+cellular+Ca2%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport.</a> Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).</li>
<li>Mohler, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ankyrin-B+mutation+causes+type+4+long-QT+cardiac+arrhythmia+and+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death.</a> Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).</li>
<li>Paigen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miracle+enough%3A+the+power+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">A miracle enough: the power of mice.</a> Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial-specific+gene+delivery+using+an+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector.</a> Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).</li>
<li>Dobrev, D., Wehrens, X. H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of cardiac arrhythmias.</a> Circulation Research. 123 (3), 332-334 (2018).</li>
<li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).</li>
<li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357(2014).</li>
<li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289(2013).</li>
<li>Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+physiological+analysis+of+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109(2014).</li>
<li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation%3A+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li>
<li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145(2013).</li>
<li>Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tubular+membrane+networks+in+cardiac+myocytes+from+atria+and+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823(2014).</li>
<li>Plačkić, J., Kockskämper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).</li>
<li>Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+profile+and+pathophysiology+of+atrial+fibrillation%3A+relationships+among+clinical+features%2C+epidemiology%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms.</a> Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Na%2FCa+exchange+function+in+rabbit%2C+mouse+and+man%3A+what%27s+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).</li>
<li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((With+or+without+Langendorff%3A+a+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li>
<li>Fernández, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+arteries+of+the+C57BL%2F6+mouse+strains%3A+implications+for+comparison+with+mutant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models.</a> Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li>
<li>Schlüter, K. D., Schreiber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+ventricular+cardiomyocytes%3A+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).</li>
<li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butanedione+monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Hall, A. R., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+inhibition+by+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29%3A+implications+for+culturing+isolated+mouse+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes.</a> Physiological Reports. 4 (1), 12606(2016).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3-butanedione+monoxime+unmasks+Ca+%282%2B%29-induced+NADH+formation+and+inhibits+electron+transport+in+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na+%28%2B%29%2FCa+%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+current+in+single+myocardial+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium current in single myocardial mouse cells.</a> European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).</li>
<li>Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+activating+sustained+K%2B+current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+%22KB+medium%22%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+promotes+atrial+fibrillation+by+inducing+structural+remodeling+and+calcium+dysregulation+in+the+atrium%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium.</a> Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pojedynczy CM jest cennym i niezbędnym narzędziem w badaniach funkcji i chorób serca na poziomie komórkowym20. W związku z tym izolacja żywotnych CM od serc jest początkowym i najważniejszym krokiem. Jakość komórek jest jednym z istotnych wyznaczników przeprowadzania udanych eksperymentów, zwłaszcza w eksperymentach optycznych i elektrofizjologicznych. W porównaniu z CM innych zwierząt, CM gryzoni są bardziej podatne na niedokrwienie i niedotlenienie ze względu na wyższe stężenie wewnątrzkomórkowych jonów sodu, co sprzyja napływowi wapnia przez wymiennik Na+/Ca2+ 21. Co więcej, liczba AM jest znacznie mniejsza niż w przypadku maszyn wirtualnych; W związku z tym skuteczna izolacja jest niezwykle trudna do osiągnięcia. Metoda Langendorffa doskonale nadaje się do izolowania maszyn wirtualnych myszy22, ale wskaźnik sukcesu w izolowaniu AM jest niski i dostępnych jest niewiele raportów. Właściwa głębokość kaniulacji aorty jest również istotnym czynnikiem w uzyskaniu idealnych VM, oprócz temperatury, aktywności enzymów, PH i jakości wody używanej do przygotowania buforu. Zasada działania metody Langendorffa opiera się na wstecznej perfuzji serca. Po perfuzji zastawka aortalna jest zamknięta; W ten sposób perfuzat jest wtłaczany do tętnic wieńcowych, dostarczając roztwór enzymu przez gałęzie naczyń, a tkanka mięśnia sercowego jest równomiernie trawiona. Aby osiągnąć tego rodzaju wzorzec krążenia, aorta musi zachować wystarczającą długość do kaniulacji i podwiązania, a końcówka kaniuli nie może przenikać przez zastawki aortalne ani blokować ujścia CA. Dlatego uzasadnione jest spekulowanie, że głębokość kaniulacji aorty jest również związana z perfuzją przedsionków, co w podobny sposób wpływa na skuteczność trawienia przedsionków i wydajność AM. Przedstawiony tutaj protokół potwierdził hipotezę, a kluczowe kroki w celu optymalizacji wydajności komórek wraz z sugestiami opisano poniżej.
W kroku 1.9, aby lepiej zabezpieczyć aortę, zalecana jest kaniula 20 G z wcięciem (lub rowkiem obwodowym) od miejsca, w którym odległość wynosi 1 mm do końcówki. Na podstawie naszych doświadczeń stwierdzono, że rozmiar kaniuli, który jest nieco większy niż średnica aorty, zapobiega przebijaniu zastawek aortalnych przez końcówkę kaniuli podczas kaniulacji, ponieważ aorta, opierając się na swojej wewnętrznej elastyczności, może ściśle dopasować się do kaniuli i wytwarzać tarcie, które działa jako czynnik ochronny podczas poruszania się do przodu lub do tyłu podczas regulacji głębokości kaniulacji. Jeśli chodzi o położenie wycięcia, serce łatwo zsunie się podczas kaniulacji z powodu grawitacji, jeśli znajdzie się zbyt blisko końcówki kaniuli. I odwrotnie, przestrzeń do regulacji głębokości kaniulacji i pozycji podwiązania będzie bardzo ograniczona, jeśli będzie zbyt duża. Biorąc pod uwagę te okoliczności, przecięcie aorty między lewą tętnicą szyjną wspólną (jak zielona linia na rysunku 2) w celu upewnienia się, że aorta jest wystarczająco długa i może być kaniulowana i podwiązana na aorcie wstępującej, jest lepsze w kroku 3.3. Podczas transekcji w aorcie wstępującej, długość zarezerwowana przynajmniej dla kaniulacji może zabezpieczyć końcówkę kaniuli blisko korzenia aorty i nie przeniknie do zastawek aortalnych po podwiązaniu. Anatomia aorty i pomiar odległości od końcówki kaniuli do ujścia CA wskazują, że przecięcie aorty między lewą tętnicą szyjną wspólną jest idealną pozycją do uzyskania odpowiedniej głębokości kaniulacji aorty.
Stwierdzono, że głębokość kaniulacji jest związana z perfuzją przedsionków, która z kolei działa jako wskaźnik głębokości. Rycina 4 pokazuje, że perfuzja przedsionków jest dobra, gdy głębokość znajduje się w aorcie wstępującej, a oba przydatki przedsionków są napompowane. Jednak perfuzja przedsionków jest niewystarczająca, gdy głębokość jest na poziomie (lub zbliża się) do korzenia aorty, a oba przydatki przedsionków są pochylone. Całkowita i żywotna liczba AM uzyskana z nadmuchanych przydatków przedsionków była wyższa (ryc. 8). Wyniki te wskazują, że głębokość kaniulacji aorty może w pewien sposób wpływać na perfuzję i trawienie przedsionków i przydatków przedsionków, a ostatecznie wpływać na wydajność i jakość AM. Stwierdzono, że wydajność i jakość AM są związane z rozmieszczeniem naczyń zaopatrujących przedsionki. Badanie Fernándeza i wsp.23 wykazało różne anomalie w pochodzeniu i przebiegu mysiego CA. Okazało się, że ujścia CA były bardzo zmienne i nie wszystkie były zlokalizowane w zatoce aortalnej. Niektóre CA mogą pochodzić nieprawidłowo znad zatok aortalnych, zwanych ujściem wysokiego startu. Niektóre CA mogą pochodzić z tej samej zatoki aortalnej, a ujście naczynia przedsionka znajduje się tuż obok. Anatomia aorty w niniejszym badaniu (ryc. 10) jest również zgodna z odkryciem Fernándeza. Może to być przyczyną, dla której próby wyizolowania AM metodą Langendorffa były w dużej mierze nieskuteczne, jeśli głębokość kaniulacji nie jest odpowiednia. W ten sposób końcówka kaniuli będzie miała większą szansę na zablokowanie ujścia naczynia przedsionka, które przylega do ujścia CA, jeśli nie ma wystarczającej ilości miejsca między końcówką kaniuli a ujściem CA. W przeciwieństwie do tego, perfuzja i wydajność komórek komory były prawie nienaruszone, o ile zastawki aortalne nie były penetrowane przez końcówkę kaniuli. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że CA, które dostarczają krew do komory, mają większe ujścia i więcej pochodzenia. Jeśli jedno ujście zostało zamknięte przez kaniulę, perfuzja komory może być skompensowana przez inne CA lub krążenie poboczne, podczas gdy naczynie krwionośne zaopatrujące przedsionek jest raczej małe i nie ma substytutu. Dlatego ważny jest wpływ głębokości kaniulacji aorty.
Inne godne uwagi czynniki i rozwiązania problemów w procesie trawienia i przechowywania komórek są wymienione poniżej. Po pierwsze, rozważ perfuzję natlenionego roztworu Tyrode'a w kroku 4.1, aby spowodować skurcz mięśnia i wypompować resztki krwi, jeśli krew w przedsionkach nie została szybko usunięta po podwiązaniu aorty. Może to pomóc uniknąć niekorzystnego wpływu ca2+ i innych materiałów uwalnianych z uszkodzonych erytrocytów. Po drugie, perfuzja roztworu wolnego od ca2 + z wyprzedzeniem w celu dysocjacji połączenia i rozszerzenia przestrzeni między komórkami może poprawić skuteczność trawienia enzymów, ponieważ interkalowane dyski między CM są połączeniami międzykomórkowymi zależnymi od wapnia. Jednak czas powinien być ograniczony do 3-5 minut, aby uniknąć zjawiska paradoksu wapniowego 24. Zalecany jest mieszany roztwór enzymatyczny. Kolagenaza typu II zaburza sieć macierzy zewnątrzkomórkowej, a trypsyna pomaga usunąć ziarnisty materiał, który pozostaje na powierzchni komórki, jeśli trawienie kolagenazy II jest niekompletne. Zapewnia to gładką powierzchnię ogniwa, co ma kluczowe znaczenie dla utworzenia uszczelnienia GΩ w nagraniu zacisku krosowego. Niemniej jednak stężenie trypsyny powinno być kontrolowane w odpowiednim zakresie, aby uniknąć nadmiernego trawienia i uszkodzenia komórek, ponieważ może to degradować białko błonowe. Stosowanie samej kolagenazy typu II w celu poprawy wydajności komórek może często prowadzić do nadmiernego trawienia tkanek, a izolowane CM będą nietolerancyjne wapnia po długotrwałej ekspozycji na kolagenazę25. Stosowanie monoksymu 2,3-butanodionu (BDM), substancji, która zapobiega spontanicznemu skurczowi poprzez hamowanie ATPazy miozyny i zapobieganie tworzeniu się mostków krzyżowych, jest nadal kontrowersyjne 26,27,28,29. Zgodnie z wcześniejszymi doświadczeniami, dodanie BDM jest konieczne dla tego protokołu. Roztwór enzymatyczny przygotowuje się z roztworem 1, chociaż roztwór 1 nie zawiera wapnia, a wapń dodaje się w celu aktywacji enzymu. Korzyści z dodania BDM do roztworu perfuzyjnego obejmują (1) hamowanie skurczu miocytów i zmniejszanie zużycia tlenu podczas perfuzji roztworu enzymatycznego oraz (2) zapobieganie niedotlenieniu miocytów i poprawę jakości izolowanych miocytów. Niektóre badania wykazały, że BDM może mieć potencjalnie niekorzystny wpływ na właściwości elektryczne komórek. Jednak wyniki rejestracji prądu sodowego w całym kominie nie wykazały niepożądanego efektu. Na etapie przechowywania komórek (krok 6) w licznych badaniach wybrano bufor KB, roztwór bez wapnia o wysokim stężeniu potasu, w którym komórki mogą utrzymać lepszy stan, ponieważ znajdują się w spolaryzowanych i niskich warunkach metabolicznych. Jednak glikokaliks błony komórkowej oddzieli się od dwuwarstwy lipidowej przy braku egzogennego wapnia przez pewien czas, a przepuszczalność błony wzrośnie, wpływając na późniejszą analizę funkcjonalną 30,31,32.
Wszystkie techniki izolacji miocytów można obecnie zasadniczo podzielić na trawienie kawałków (małego fragmentu tkanki) w roztworze enzymatycznym lub perfuzję CA z roztworem enzymatycznym (perfuzja Langendorffa)22. W porównaniu z metodą Langendorffa, metoda trawienia kawałków jest łatwiejsza do wykonania i jest również rutynowo stosowana do izolowania CM w wielu laboratoriach. Jednak metoda ta zwykle prowadzi do niskiej wydajności CM niskiej jakości z tkanek dorosłych22. Co więcej, komórki wyizolowane tą metodą mogą nie nadawać się do przeprowadzania eksperymentów porównawczych. Na przykład, podczas badania specyficznego dla typu komórki działania leku między AM i VM, nie można pominąć ani wykluczyć wpływu różnych warunków izolacji. Dzieje się tak, ponieważ mięsień sercowy i gęstość tkanki komory są znacznie grubsze i gęstsze niż w przedsionku, co skutkuje różnymi czasami trawienia i stężeniami enzymów. Co więcej, nadmierne poruszenie i pipetowanie tkanki podczas trawienia uszkodzi komórki i znacząco wpłynie na badania funkcjonalne. Co więcej, wiele wcześniejszych badań wykazało, że AM są bardziej podatne na wapń. Jednak AM wyizolowane przez obecny protokół mogą być tolerancyjne na gradientowe ponowne wprowadzenie wapnia, prawdopodobnie dlatego, że tkanka jest łatwa do pęknięcia pod koniec procesu trawienia. W związku z tym uszkodzenia mechaniczne są mniejsze, podczas gdy ogniwa doznałyby więcej uszkodzeń mechanicznych, ponieważ etapy metody fragmentów wymagają wielokrotnego pękania i odśrodkowania. Niedawno Ackers i wsp.33 opisali uproszczoną, wolną od Langendorffa metodę izolacji żywotnych miocytów serca i niemiocytów. Maszyny wirtualne i fibroblasty można skutecznie wyizolować, ale nie wspomniano o ilości AM. Protokół ten ma jednak kilka ograniczeń. Po pierwsze, rozmieszczenie naczyń krwionośnych serca może różnić się w zależności od różnic indywidualnych i szczepu myszy, a zalecana głębokość kaniulacji nie może zagwarantować udanej izolacji AMs za każdym razem. Po drugie, dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, może zająć trochę czasu, aby ćwiczyć przecięcie aorty i kaniulację aorty wstecznej. Wreszcie, metoda ta nie została przetestowana w innych modelach chorób serca, z wyjątkiem zdrowych i starszych myszy. W związku z tym będzie wymagało dostosowania stężeń enzymów i czasu trawienia ze względu na rozległość zwłóknienia serca. Wadą różnych warunków trawienia występujących w metodzie chunkowej nie będzie problem w metodzie Langendorffa, w której roztwór enzymu jest równomiernie rozprowadzany w tkance przez łożyska naczyń.
Podsumowując, opisane tutaj protokoły jednoczesnej izolacji pojedynczych AM i VM wykazały, że odpowiednia głębokość kaniulacji aorty może skutecznie poprawić perfuzję przedsionka i wydajność AM. CM wyizolowane tą metodą są wysokiej jakości, mają dobrą tolerancję na wapń i zostały z powodzeniem zastosowane do rejestracji patch clamp i obsługi wapnia (uwalnianie Ca2+ i pomiar fal Ca2+ przez system IonOptix) w zespole34. Przewiduje się, że protokół izolacji może być wykorzystany do przygotowania komórek w serii badań komórkowych i subkomórkowych, co pomoże pogłębić zrozumienie fizjologii i patologii serca. Co ważne, umożliwi to odkrycie bardziej istotnych klinicznie mechanizmów chorób serca i metod interwencji.

Choroba serca jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności na świecie1. Aby poradzić sobie z tym obciążeniem systemu opieki zdrowotnej, niezbędne jest dogłębne zrozumienie fizjologii i patologii serca. Oprócz preparatu całego zwierzęcia i nienaruszonego serca, przygotowanie komórkowe jest kolejnym niezbędnym narzędziem do badania funkcjonalnego i chorobowego2. Stosując klamrę plastrową, obrazowanie wapnia, biologię molekularną i inne zaawansowane technologie, naukowcy mogą uzyskać więcej informacji na temat właściwości elektrofizjologicznych, homeostazy wapnia, szlaków sygnałowych, stanów metabolicznych i transkrypcji genów w pojedynczym kardiomiocycie (CM). Jest to niezwykle pomocne w odkrywaniu fizjologicznych i patologicznych mechanizmów procesu chorobowego serca3,4,5,6,7. Do badań na zwierzętach można wykorzystać gatunki od małych (np. myszy, szczury i świnki morskie) do dużych (np. króliki i psy). Zazwyczaj preferowane są małe zwierzęta, zwłaszcza myszy, ponieważ są one podatne na manipulacje modelami genetycznymi i chorobami8,9,10.
Techniki ściśle izolowanych CM przeszły długi okres rozwoju i wciąż ewoluują11. Perfuzja wsteczna Langendorffa jest najbardziej skuteczną i powtarzalną metodą izolacji CM stosowaną u szczurów i myszy, szczególnie do izolowania miocytów komorowych (VMs)12,13,14,15. Jednak doniesienia o pomyślnie wyizolowanych miocytach przedsionków (AM) są rzadkie16,17,18. Dalsze badania zarówno na poziomie całego narządu/układu oraz komórkowego/subkomórkowego w celu ujawnienia mechanizmów i zbadania nowych podejść terapeutycznych są uzasadnione, ponieważ migotanie przedsionków (AF), najczęstszy rodzaj arytmii, staje się coraz bardziej rozpowszechnione na całym świecie, a obecne metody leczenia zarówno w terapiach farmakologicznych, jak i ablacji serca pozostają nieskuteczne u około 40%-50% pacjentów z migotaniem przedsionków19. Udana izolacja CM dorosłych myszy jest pierwszym krokiem do badania komórkowego. Można zastosować dwie podstawowe metody izolacji: metodę chunk i metodę Langendorffa. W metodzie perfuzji Langendorffa trawienie tkanek zależy od roztworu enzymu dostarczanego przez tętnice wieńcowe i ich odgałęzienia do łożysk naczyń włosowatych. Właściwa głębokość kaniulacji aorty, która pozwala uniknąć penetracji zastawek aortalnych i blokowania ujścia tętnicy wieńcowej, jest warunkiem uzyskania takiego wzorca perfuzji, który jest również niezbędnym krokiem do wydajnego trawienia i idealnej wydajności VM. W związku z tym rozsądnie jest założyć, że głębokość kaniulacji aorty może w podobny sposób wpływać na perfuzję naczynia przedsionka i ostatecznie wpływać na wydajność AM. Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadzono kaniulację aorty na różnych głębokościach i porównano odpowiadającą jej wydajność AM. Dane wykazały, że głębokość kaniulacji aorty ma bezpośredni wpływ na wydajność AM. W tym miejscu wprowadzono protokół do jednoczesnego izolowania AM i VM.

<table><tbody><tr><td>Monoksym 2,3-butanodionu (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy byka (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington</td><td>43D14160</td><td></td></tr><tr><td>Akwizycja i analiza danych</td><td>Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płód Surowica bydlęca (FBS)</td><td>Zhejiang Tianhang Biotechnology</td><td>150207</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td> HEPES Sigma-Aldrich H3375 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pochodzenie 8.5</td><td>OriginLab, Northampton, MA, USA</td><td></td><td>Akwizycja i analiza danych</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Fabryka odczynników w Szanghaju</td><td>810923</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Solarbio</td><td>C0040</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>JULABO</td><td>ED (v.2)</td><td></td></tr></tbody></table>

modyfikacje metody langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Pojedynczy kardiomiocyt jest niezbędnym narzędziem w badaniach biologii i chorób serca na poziomie komórkowym i subkomórkowym jako podstawowa jednostka skurczu i aktywności elektrycznej. Dlatego wyizolowanie żywotnych, wysokiej jakości kardiomiocytów z serca jest początkowym i najważniejszym krokiem eksperymentalnym. Porównując różne protokoły izolowania kardiomiocytów dorosłych myszy, retrogradacja perfuzji Langendorffa jest najbardziej skuteczną i powtarzalną metodą opisaną w literaturze, zwłaszcza w przypadku izolowania miocytów komorowych. Jednak wyizolowanie wysokiej jakości miocytów przedsionkowych z perfundowanego serca pozostaje wyzwaniem i dostępnych jest niewiele raportów z udanej izolacji. Rozwiązanie tego skomplikowanego problemu jest niezwykle ważne, ponieważ oprócz chorób komorowych, choroby przedsionków stanowią dużą część chorób serca. Dlatego uzasadnione są dalsze badania na poziomie komórkowym w celu ujawnienia mechanizmów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół oparty na metodzie perfuzji wstecznej Langendorffa oraz jednocześnie dokonano pewnych modyfikacji głębokości kaniulacji aorty i etapów, które mogą wpływać na proces trawienia w celu wyizolowania miocytów przedsionkowych i komorowych. Ponadto potwierdzono, że izolowane kardiomiocyty są podatne na badanie klamry.

W niniejszej pracy położenie końcówki kaniuli w aorcie definiuje głębokość kaniulacji aorty (zwaną dalej po prostu głębokością), która jednocześnie wyznacza miejsce podwiązania aorty. AM i VM wyizolowane z serca kaniulowanego i podwiązanego na poziomie aorty wstępującej oznaczono odpowiednio jako AMAA i VMAA. Ponadto AM i VM wyizolowane z serca kaniulowanego i podwiązanego u nasady aorty oznaczono odpowiednio jako AMAR i VMAR. Rysunek 2 przedstawia przekrój aorty oraz pozycje przecięcia. Rysunek 3 pokazuje głębokości i miejsca podwiązania odpowiadające pozycjom przecięcia aorty. Głębokość była powiązana z perfuzją przedsionków i uszek przedsionków. Oba uszka przedsionków są wypełnione, gdy końcówka kaniuli znajduje się w aorcie wstępującej, co wskazuje na wystarczającą perfuzję przedsionków. Jednak w przypadku położenia kaniuli u nasady aorty perfuzja przedsionków jest niewystarczająca, a oba uszka przedsionków są pomarszczone (Rysunek 4). Przedstawiono morfologię i żywotność CM wyizolowanych z kaniulowanych serc przy różnych głębokościach po ponownym wprowadzeniu wapnia (Rysunek 5). Morfologia komórek AMAA, AMAR, VMAA i VMAR została zobrazowana pod mikroskopem konfokalnym przed i po ponownym wprowadzeniu wapnia. AM mają kształt wrzecionowaty, natomiast VM mają kształt pręcikowy z prostokątnymi końcami. Ponadto AM i VM posiadają nieuszkodzone błony, wyraźne kontury, wyraźne prążkowane sarkomery i gładką powierzchnię (Rysunek 6). Żywotność komórek oceniano za pomocą barwienia błękitem trypanu. Prawidłowe komórki z nieuszkodzonymi błonami wykluczają błękit trypanu i nie zostaną zabarwione, podczas gdy komórki, które utraciły żywotność, szybko akumulują błękit trypanu wewnątrzkomórkowo (Rysunek 7). AM i VM umieszczono na osobnych szkiełkach przedmiotowych w celu policzenia komórek. Całkowitą wydajność AM oraz procent żywych wrzecionowatych CM (wskaźnik przeżywalności) określono poprzez przeniesienie 10 µL zawiesiny komórkowej na szkiełko przedmiotowe i przeliczenie pod odwróconym mikroskopem fazokontrastowym w 10 polach widzenia przy powiększeniu 4×. Tę samą metodę zastosowano do określenia całkowitej wydajności VM (pręcikowatych) oraz procentu żywych VM. Metoda ta jest preferowana nad użyciem komory countingowej (hemocytometru), ponieważ CM ze względu na swój rozmiar i kształt nie rozkładały się łatwo w obszarze zliczania hemocytometru. Wykres słupkowy (Rysunek 8) przedstawia wskaźniki przeżywalności AMAA, AMAR, VMAA i VMAR przed i po ponownym wprowadzeniu wapnia. Każda wartość reprezentuje średnią ± SD z 10 myszy. Przed ponownym wprowadzeniem wapnia wskaźniki przeżywalności AMAA są istotnie wyższe niż AMAR (odpowiednio 70,9% ± 2,8% i 41,0% ± 5,2%; p &lt; 0,01). Po ponownym wprowadzeniu wapnia wskaźniki przeżywalności AMAA są istotnie wyższe niż AMAR (odpowiednio 69,4% ± 3,0% i 37,7% ± 4,9%; p &lt; 0,01).
Wskaźniki przeżywalności VMAA nie różniły się od wskaźników VMAR (odpowiednio 89,5% ± 2,7% vs 88,1% ± 2,6%; p &gt; 0,05) przed ponownym wprowadzeniem wapnia. Podobnie wskaźniki przeżywalności VMAA nie różniły się od wskaźników VMAR (odpowiednio 82,2% ± 1,9% vs 82,9% ± 1,6%; p &gt; 0,05) po ponownym wprowadzeniu wapnia.
W przypadku serca kaniulowanego na głębokości zalecanej w niniejszym protokole (w aorcie wstępującej), wydajność żywotnych komórek VM i AM wynosi odpowiednio około 4,1 miliona i około 180 000 po ponownym wprowadzeniu wapnia. Rejestracja prądu sodowego metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell (Rysunek 9A, B) oraz gęstości prądów (Rysunek 9C) w izolowanych komórkach AM i VM potwierdzają, że jakość komórek spełnia wymagania dla eksperymentów elektrofizjologicznych. Anatomia aorty (Rysunek 10) pokazuje, że ujście naczynia przedsionkowego znajduje się blisko pierścienia aorty i sąsiaduje z ujściem tętnicy wieńcowej (CA). Tabela 3 przedstawia odległość od końcówki kaniuli do ujścia CA w sercach kaniulowanych i podwiązanych odpowiednio w aorcie wstępującej oraz w pierścieniu aorty.
<img alt="Schemat systemu perfuzji serca z kąpielą wodną, pompą perystaltyczną i przewodami do eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat zmontowanego zmodyfikowanego systemu Langendorffa. System ten jest ekonomiczny i przenośny dla użytkowników. Składa się z dwóch części przewodów plastikowych – jednego dla wody (średnica wewnętrzna 8 mm) i jednego dla perfuzatu (średnica wewnętrzna 1,5 mm) – z których końcowy odcinek jest połączony z medycznym trójdrożnym kranikiem PE z blokadą Luer lock. Szklana butelka zawierająca wodę, zamknięta gumowym korkiem, pełni rolę wymiennika ciepła. Perfuzat jest pompowany przez pompę perystaltyczną do przewodów plastikowych w wymienniku ciepła i wypływa z trójdrożnego kranika połączonego z kaniulą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat anatomii chirurgicznej; zaznaczone struktury jamy nosowej w widoku endoskopowym do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Aorta i tkanki otaczające. Struktura naczyniowa w kształcie litery „Y” to aorta i jej odgałęzienia: tętnica kręgosłupowo-barkowa (strzałka 1) oraz lewa tętnica szyjna wspólna (strzałka 2). Przetnij aortę pomiędzy lewą tętnicą szyjną wspólną (zielona linia), jednocześnie przecinając tętnicę kręgosłupowo-barkową u niektórych myszy; u pozostałych myszy przetnij aortę wstępującą (czarna linia) (stereomikroskop, powiększenie 10×). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Technika chirurgiczna, uretrorrafia, operacja inwersji prącia, układ eksperymentalny, schemat edukacyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Widok z przodu kaniulowanego serca. Czarna zakrzywiona linia reprezentuje krawędź cięcia aorty, która została przetnieciona pomiędzy lewą tętnicą szyjną wspólną. Czerwona zakrzywiona linia reprezentuje krawędź cięcia aorty przetniecionej na wysokości aorty wstępującej. Linia prosta wskazuje miejsce podwiązania aorty: czarna na wysokości aorty wstępującej i czerwona u nasady aorty (stereomikroskop, powiększenie 10 ×). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment na sercu ex vivo, prezentujący układ perfuzyjny do badań fizjologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Stan perfuzji kaniulowanych serc. Przedsionki są odpowiednio ukrwione, a oba uszka przedsionków w sercu są nadmuchnięte (A) zakanulowano i podwiązano na wysokości aorty wstępującej. Jednakże oba uszka przedsionków w sercu są pomarszczone (B) zakanulowano i podwiązano u nasady aorty, co wskazuje na słabą perfuzję przedsionków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy formacji kryształów 10x w czterech wzorach, skala 100µm, analiza porównawcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Ocena morfologii i żywotności komórek po ponownym wprowadzeniu wapnia. AM-y (A) i VM-y (B) wyizolowane z serca kaniulowanego i podwiązanego na aorcie wstępującej są przedstawione odpowiednio jako AMAA i VMAA. AM-y (C) i VM-y (D) wyizolowane z serca kaniulowanego i podwiązanego u nasady aorty są przedstawione odpowiednio jako AMAR i VMAR. Wysokiej jakości CM-y są w stanie spoczynku i posiadają nienaruszone błony, wyraźne kontury, wyraźne prążkowane sarkomery oraz gładką powierzchnię komórki. AM-y mają kształt wrzecionowaty, natomiast VM-y mają kształt pręta lub cegły z prostokątnymi końcami. CM-y, które kurczą się spontanicznie lub zawierają pęcherzyki (blebs) w błonie, są niskiej jakości, a komórki, które kurczą się do kształtu sferycznego, są martwe. Losowe pole widzenia (mikroskop fluorescencyjny, powiększenie 10 × 10; pasy skali, 100 µm). AM = miocyt przedsionkowy, VM = miocyt komorowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe nicieni ilustrujące różnice strukturalne, porównanie próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Morfologia komórek pod mikroskopem konfokalnym przed i po ponownym wprowadzeniu wapnia. Przed ponownym wprowadzeniem wapnia komórki AMAA (A) i AMAR (C) mają kształt wrzecionowaty z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błon. Po ponownym wprowadzeniu wapnia komórki AMAA (B) i AMAR (D) również zachowują kształt wrzecionowaty z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błon. Przed ponownym wprowadzeniem wapnia komórki VMAA (E) i VMAR (G) mają kształt pręto- lub cegłowaty z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błon o prostokątnych końcach. Po ponownym wprowadzeniu wapnia komórki VMAA (F) i VMAR (H) również mają kształt pręto- lub cegłowaty z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błon o prostokątnych końcach (mikroskop konfokalny, obiektyw olejowy, powiększenie 63 × 10; paski skali, 50 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy morfologii bakterii, powiększenie 4x, pokazujący bakterie pręcikowate iB kokowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Ocena żywotności komórek. Uszkodzone komórki, które tracą aktywność, są barwione błęknitem trypanu. W przeciwieństwie do nich, komórki żywe nie ulegają barwieniu błęknitem trypanu (mikroskop fluorescencyjny, powiększenie 4 × 10; paski skali, 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy przeżywalności przed i po CR; istotność statystyczna zaznaczona gwiazdkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Wykres słupkowy przedstawiający przeżywalność grup AMAA, AMAR, VMAA i VMAR przed i po ponownym wprowadzeniu wapnia. CR = ponowne wprowadzenie wapnia. Każda wartość reprezentuje średnią ± SD z 10 myszy. ***p &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td>Zawartość (stężenie końcowe w mmol/L, chyba że wskazano inaczej)</td>
			<td>Odnotowano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór perfuzyjny (roztwór 1)</td>
			<td>113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO (histopatologia)4, 1,2 MgSO44, 12 NaHCO33, 10 KHCO33, 10 HEPES, 15 tauryny, 5 glukozy, 10 2,3-butanodionymonoksymu (BDM)</td>
			<td>które można przechowywać przez 3 dni w 4 °CGlukozę, taurynę i BDM dodaje się w dniu eksperymentu. Przygotować 200 ml roztworu perfuzyjnego dla każdego serca.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór Tyroda (roztwór 2)</td>
			<td>140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl22, 5 glukozy</td>
			<td>które można przechowywać przez 3 dni w temperaturze 4 °CCaCl₂2 or glukozę dodaje się w dniu eksperymentu, a pH dostosowuje się do wartości 7,3-7,4 przy użyciu nasyconego roztworu NaOH w temperaturze pokojowej (28-30°C) za pomocą pH-metru.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Roztwory do izolacji CM u dorosłych myszy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td>Spis treści </td>
			<td>odnotowano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do trawienia (roztwór 3)</td>
			<td>25 ml roztworu 1, 6μL 100 mM/L CaCl22, 25 mg kolagenazy II, 50μL trypsyna (2,5 % 10×)</td>
			<td>dla każdego serca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zatrzymujący 1 (roztwór 4)</td>
			<td>9 ml roztworu 1, 1 ml FBS (płodowej surowicy bydlęcej), 4μL 100 mM/L CaCl22</td>
			<td>dla każdego serca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zatrzymujący 2 (roztwór 5)</td>
			<td>9,5 ml roztworu 1, 0,5 ml FBS (płodowa surowica bydlęca), 4μL 100 mM/L CaCl₂2</td>
			<td>dla każdego serca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do resuspensji komórek (roztwór 6)</td>
			<td>13 ml roztworu 1, 7μL 1 M/L CaCl22, BSA (albumina surowicy bydlęcej) w dawce umożliwiającej utworzenie cienkiej warstwy pokrywającej powierzchnię cieczy</td>
			<td>dla każdego serca</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Roztwory do izolacji i przechowywania CM dorosłych myszy.
<img alt="Eksperyment clampowania napięcia, wykresy pomiaru prądu jonowego, przedstawiające Vm w funkcji I/APF dla AM i VM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9Krzywe prądowo-napięciowe kanałów sodowych. W celu rejestracji prądów sodowych w izolowanych kardiomiocytach zastosowano techniki patch clamp w konfiguracji whole-cell w trybie clampowania napięcia. Protokół clampowania napięcia przedstawiono na wstawce. Prądy sodowe zarejestrowane z AM (A) oraz VM (B) przedstawiono. Gęstości prądu przy potencjałach −45 mV, −40 mV i −35 mV są znacznie wyższe w AM (−32,71 ± 1,597 pA/pF, −31,49 ± 1,820 pA/pF i −29,34 ± 1,939 pA/pF odpowiednio; n = 10) niż w VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± 1,560 pA/pF i −21,86 ± 1,381 pA/pF odpowiednio; n = 8; P &lt; 0.05). (CKrzywe I-V przedstawiają gęstości prądu sodowego znormalizowane do pojemności komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig09large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat anatomiczny wyróżniający obszary 1-5 za pomocą kolorowych strzałek do badań naukowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62514/62514fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Pochodzenie i rozmieszczenie naczynia przedsionkowego. Naczynie przedsionkowe (strzałka 1) i CA (strzałka 2) na panelu A. Panel B przedstawia zbliżenie na naczynie przedsionkowe (strzałka 3). (C) Istnieją dwa otwory o różnych rozmiarach; jeden (strzałka 4) odpowiada naczyniu przedsionkowemu unaczyniającemu wyrostki przedsionkowe, a drugi (strzałka 5) odpowiada CA (stereomikroskop, powiększenie 10 × 5). CA = tętnica wieńcowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62514/62514fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="3">Numer seryjny myszy</td>
			<td >1</td>
			<td >2</td>
			<td >3</td>
			<td >4</td>
			<td >5</td>
			<td >6</td>
			<td >7</td>
			<td >8</td>
			<td >9</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">Głębokość kaniulacji aorty na poziomie aorty wstępującej</td>
			<td >0.5</td>
			<td >0.6</td>
			<td >0.3</td>
			<td >0.4</td>
			<td >0.8</td>
			<td >0.3</td>
			<td >0.8</td>
			<td >0.7</td>
			<td >0.5</td>
			<td >0.7</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">Głębokość kaniulacji aorty na poziomie pierśnia aorty</td>
			<td >0.2</td>
			<td >-0.1</td>
			<td >0.1</td>
			<td >0</td>
			<td >-0.1</td>
			<td >0.1</td>
			<td >-0.2</td>
			<td >0</td>
			<td >-0.1</td>
			<td >0</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3. Odległość od końcówki kaniuli do ujścia tętnicy wieńcowej. Serca myszy C57BL/6 (n = 20) zostały wykorzystane do kaniulacji i podwiązania aorty odpowiednio na wysokości aorty wstępującej oraz pierścienia aortalnego. Aortę poddano analizie anatomicznej i zmierzono odległość od końcówki kaniuli do ujścia tętnicy wieńcowej. Odległość mierzono w milimetrach, a znaki dodatnie lub ujemne oznaczają odpowiednio położenie końcówki kaniuli powyżej i poniżej ujścia tętnicy wieńcowej.

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...

Protokół ten może pomóc w poprawie wydajności przedsionków z perfundowanego serca myszy. Główną zaletą tej metody jest to, że miocyty przedsionkowe i komorowe mogą być izolowane jednocześnie w tych samych warunkach trawienia. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmów chorób serca na poziomie komórkowym i subkomórkowym.Po eutanazji ośmio- do 10-tygodniowego samca czarnej myszy sześciokątnej C57, użyj kleszczy tkankowych, aby podnieść skórę mieczykowatego. Następnie za pomocą nożyczek do tkanek wykonaj niewielkie boczne nacięcie przez skórę. Wykonaj rozwarstwienie między skórą a powięzią.Przedłuż nacięcie skóry w kierunku pach w kształcie litery V po obu stronach i kontynuuj nacięcie przez klatkę piersiową. Następnie za pomocą kleszczy tkankowych zaciśnij mostek i odchyl klatkę piersiową do góry, aby w pełni odsłonić serce i płuca. Za pomocą zakrzywionych kleszczy oderwij osierdzie.Jeśli grasica zakrywa duże naczynia, użyj dwóch zakrzywionych kleszczy, aby rozerwać grasicę w obie strony, a następnie delikatnie pociągnij podstawę serca w kierunku ogona, aż aorta i jej tętnice rozgałęzione będą widoczne jako naczynie krwionośne w kształcie litery Y. Przeciąć aortę na lewej tętnicy szyjnej wspólnej, a następnie przeciąć tętnicę ramienno-głowową. Wytnij serce i natychmiast zanurz je na szalce Petriego zawierającej roztwór Tyrode'a, aby umyć i wypompować pozostałą krew.Następnie przenieś serce na inną szalkę Petriego zawierającą roztwór pierwszy. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając cienkich nożyczek do tęczówki, przytnij nadmiar tkanki. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.Następnie za pomocą dwóch prostych kleszczy wiążących wykonaj kaniulację wsteczną aorty, uważając, aby cały proces kaniulacji odbywał się pod powierzchnią cieczy. Dostosuj głębokość kaniulacji tak, aby końcówka kaniuli znajdowała się w aorcie wstępującej, uważając, aby nie przeniknąć do zastawek aortalnych. Następnie za pomocą szwu 3-O przed węzłem podwiąż aortę do wcięcia kaniuli.Delikatnie wstrzyknąć roztwór pierwszy ze strzykawki, aby wypłukać pozostałą krew. Następnie podłącz kaniulowane serce do aparatu Langendorffa, uważając, aby nie wprowadzić do serca żadnych pęcherzyków powietrza. Po podłączeniu kaniulowanego serca do aparatu Langendorffa, należy perfekować serce roztworem jeden przez około dwie minuty.Za pomocą sterylnej pipety polietylenowej jednorazowego użytku pobrać około 2,5 mililitra roztworu trzy i podgrzać go w łaźni wodnej do późniejszego użycia. Następnie, aby strawić tkanki, perfunduj serce pozostałym roztworem trzy przez około 11 do 12 minut. Po pierwszych dwóch minutach perfuzji z roztworem trzecim, perfundowany roztwór należy zawracać do zbiorników perfuzatu za pomocą pompy perystaltycznej w celu ponownego użycia aż do zakończenia trawienia.Kiedy serce staje się spuchnięte, staje się lekko blade i wiotkie, za pomocą kleszczy zębatych delikatnie uszczypnij mięsień sercowy. Jeśli odcisk jest widoczny, zakończ trawienie i odłącz serce od aparatu. Aby wyizolować miocyty tętnicze i komorowe, użyj kleszczy do usunięcia komór i przedsionków i umieść je na różnych szalkach Petriego.Następnie dodaj podgrzany roztwór trzy do obu potraw. Za pomocą kleszczy rozcieraj tkanki do mętnej konsystencji, a następnie delikatnie pipetuj tkankę, aby uzyskać równomierne trawienie bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby zatrzymać pozostałą aktywność enzymu, za pomocą pipety przenieś mętną, strawioną tkankę do roztworu czwartego, a następnie wiruj przez 20 sekund w temperaturze 192 razy G. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w roztworze piątym.Aby uniknąć paradoksu wapniowego i przeciążenia wapniem, należy ponownie wprowadzać wapń stopniowo, stopniowo dodając do zawiesiny komórkowej łącznie 50 mikrolitrów 100 milimolowych chlorku wapnia na litr. Po dodaniu całego chlorku wapnia należy przechowywać komórki w roztworze Tyrode'a do badania z użyciem zacisku krosowego. Głębokość kaniulacji jest związana z perfuzją przedsionków i jego przydatków.Gdy końcówka kaniuli znajduje się na aorcie wstępującej, oba przydatki przedsionków są napompowane, co wskazuje na wystarczającą perfuzję przedsionków. Jednak gdy końcówka kaniuli znajduje się u nasady aortalnej, oba przydatki przedsionków są wykrzywione, co wskazuje na niewystarczającą perfuzję. Miocyty przedsionkowe izolowane przez kaniulację w aorcie wstępującej miały wyższe wskaźniki przeżycia niż te izolowane przez kaniulację w korzeniu aorty zarówno przed, jak i po ponownym wprowadzeniu wapnia.W przeciwieństwie do tego, nie było różnicy we wskaźnikach przeżycia miocytów komorowych wyizolowanych przez kaniulację w aorcie wstępującej lub korzeniu aorty zarówno przed, jak i po reintrodukcji wapnia. Zapis prądu sodowego w izolowanych miocytach przedsionkowych i komorowych za pomocą klamry całokomórkowej oraz gęstości prądu potwierdzają, że jakość wyizolowanych komórek spełnia wymagania eksperymentów elektrofizjologicznych. Podczas przecięcia aorty upewnij się, że zachowałeś wystarczającą ilość gruczołu do podwiązania.W przeciwnym razie kaniula może przeniknąć do zastawki aortalnej po podwiązaniu.

modifications-langendorff-method-for-simultaneous-isolation-atrial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie wykonujemy retrogradacyjną perfuzję Langendorffa izolowanego serca myszy. Podczas zabiegu czynność serca jest utrzymywana poprzez jego wsteczne perfuzję roztworem perfuzyjnym przez tętnice wieńcowe za pomocą kaniuli wprowadzanej do aorty wstępującej. Model służy do badania patofizjologii serca serca.

Wsteczna perfuzja serca Langendorffa: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Metody izolacji miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAM) od dorosłych myszy do elektrofizjologii lub badań obrazowych. Wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane bezpośrednio lub mogą być utrzymywane w hodowli, aby umożliwić ekspresję interesujących białek, takich jak genetycznie kodowane reportery.

Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Poznaj zmodyfikowaną metodę Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy. Technika ta zapewnia żywotne komórki do badań elektrofizjologicznych.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów