Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy
13 maja 2021
Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.
Protokół ten może pomóc w poprawie wydajności przedsionków z perfundowanego serca myszy. Główną zaletą tej metody jest to, że miocyty przedsionkowe i komorowe mogą być izolowane jednocześnie w tych samych warunkach trawienia. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmów chorób serca na poziomie komórkowym i subkomórkowym.
Po eutanazji ośmio- do 10-tygodniowego samca czarnej myszy sześciokątnej C57, użyj kleszczy tkankowych, aby podnieść skórę mieczykowatego. Następnie za pomocą nożyczek do tkanek wykonaj niewielkie boczne nacięcie przez skórę. Wykonaj rozwarstwienie między skórą a powięzią.
Przedłuż nacięcie skóry w kierunku pach w kształcie litery V po obu stronach i kontynuuj nacięcie przez klatkę piersiową. Następnie za pomocą kleszczy tkankowych zaciśnij mostek i odchyl klatkę piersiową do góry, aby w pełni odsłonić serce i płuca. Za pomocą zakrzywionych kleszczy oderwij osierdzie.
Jeśli grasica zakrywa duże naczynia, użyj dwóch zakrzywionych kleszczy, aby rozerwać grasicę w obie strony, a następnie delikatnie pociągnij podstawę serca w kierunku ogona, aż aorta i jej tętnice rozgałęzione będą widoczne jako naczynie krwionośne w kształcie litery Y. Przeciąć aortę na lewej tętnicy szyjnej wspólnej, a następnie przeciąć tętnicę ramienno-głowową. Wytnij serce i natychmiast zanurz je na szalce Petriego zawierającej roztwór Tyrode'a, aby umyć i wypompować pozostałą krew.
Następnie przenieś serce na inną szalkę Petriego zawierającą roztwór pierwszy. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając cienkich nożyczek do tęczówki, przytnij nadmiar tkanki. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.
Następnie za pomocą dwóch prostych kleszczy wiążących wykonaj kaniulację wsteczną aorty, uważając, aby cały proces kaniulacji odbywał się pod powierzchnią cieczy. Dostosuj głębokość kaniulacji tak, aby końcówka kaniuli znajdowała się w aorcie wstępującej, uważając, aby nie przeniknąć do zastawek aortalnych. Następnie za pomocą szwu 3-O przed węzłem podwiąż aortę do wcięcia kaniuli.
Delikatnie wstrzyknąć roztwór pierwszy ze strzykawki, aby wypłukać pozostałą krew. Następnie podłącz kaniulowane serce do aparatu Langendorffa, uważając, aby nie wprowadzić do serca żadnych pęcherzyków powietrza. Po podłączeniu kaniulowanego serca do aparatu Langendorffa, należy perfekować serce roztworem jeden przez około dwie minuty.
Za pomocą sterylnej pipety polietylenowej jednorazowego użytku pobrać około 2,5 mililitra roztworu trzy i podgrzać go w łaźni wodnej do późniejszego użycia. Następnie, aby strawić tkanki, perfunduj serce pozostałym roztworem trzy przez około 11 do 12 minut. Po pierwszych dwóch minutach perfuzji z roztworem trzecim, perfundowany roztwór należy zawracać do zbiorników perfuzatu za pomocą pompy perystaltycznej w celu ponownego użycia aż do zakończenia trawienia.
Kiedy serce staje się spuchnięte, staje się lekko blade i wiotkie, za pomocą kleszczy zębatych delikatnie uszczypnij mięsień sercowy. Jeśli odcisk jest widoczny, zakończ trawienie i odłącz serce od aparatu. Aby wyizolować miocyty tętnicze i komorowe, użyj kleszczy do usunięcia komór i przedsionków i umieść je na różnych szalkach Petriego.
Następnie dodaj podgrzany roztwór trzy do obu potraw. Za pomocą kleszczy rozcieraj tkanki do mętnej konsystencji, a następnie delikatnie pipetuj tkankę, aby uzyskać równomierne trawienie bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby zatrzymać pozostałą aktywność enzymu, za pomocą pipety przenieś mętną, strawioną tkankę do roztworu czwartego, a następnie wiruj przez 20 sekund w temperaturze 192 razy G. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w roztworze piątym.
Aby uniknąć paradoksu wapniowego i przeciążenia wapniem, należy ponownie wprowadzać wapń stopniowo, stopniowo dodając do zawiesiny komórkowej łącznie 50 mikrolitrów 100 milimolowych chlorku wapnia na litr. Po dodaniu całego chlorku wapnia należy przechowywać komórki w roztworze Tyrode'a do badania z użyciem zacisku krosowego. Głębokość kaniulacji jest związana z perfuzją przedsionków i jego przydatków.
Gdy końcówka kaniuli znajduje się na aorcie wstępującej, oba przydatki przedsionków są napompowane, co wskazuje na wystarczającą perfuzję przedsionków. Jednak gdy końcówka kaniuli znajduje się u nasady aortalnej, oba przydatki przedsionków są wykrzywione, co wskazuje na niewystarczającą perfuzję. Miocyty przedsionkowe izolowane przez kaniulację w aorcie wstępującej miały wyższe wskaźniki przeżycia niż te izolowane przez kaniulację w korzeniu aorty zarówno przed, jak i po ponownym wprowadzeniu wapnia.
W przeciwieństwie do tego, nie było różnicy we wskaźnikach przeżycia miocytów komorowych wyizolowanych przez kaniulację w aorcie wstępującej lub korzeniu aorty zarówno przed, jak i po reintrodukcji wapnia. Zapis prądu sodowego w izolowanych miocytach przedsionkowych i komorowych za pomocą klamry całokomórkowej oraz gęstości prądu potwierdzają, że jakość wyizolowanych komórek spełnia wymagania eksperymentów elektrofizjologicznych. Podczas przecięcia aorty upewnij się, że zachowałeś wystarczającą ilość gruczołu do podwiązania.
W przeciwnym razie kaniula może przeniknąć do zastawki aortalnej po podwiązaniu.
Przegląd
Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa dla jednoczesnej izolacji komórek mięśniowych przedsionków i komór serca z dorosłych myszy. Metoda zwiększa wydajność izolowanych komórek mięśniowych przedsionków przy jednoczesnym zachowaniu jakości izolowanych komórek do badań elektrofizjologicznych.
Kluczowe Składowe Badania
Dziedzina Nauki
- Fizjologia układu sercowo-naczyniowego
- Biologia komórkowa
- Elektrofizjologia
Tło
- Metoda Langendorffa jest szeroko stosowaną techniką perfuzji serca.
- Jednoczesna izolacja komórek mięśniowych przedsionków i komór serca może zapewnić lepszy wgląd w funkcjonowanie serca.
- Zrozumienie zachowania komórek mięśniowych jest kluczowe dla badania chorób serca.
- Poprawa wydajności izolowanych komórek mięśniowych przedsionków jest niezbędna do uzyskania dokładnych wyników eksperymentalnych.
Cel Badania
- Zwiększenie wydajności izolowanych komórek mięśniowych przedsionków z serc myszy.
- Umożliwienie jednoczesnej izolacji komórek mięśniowych przedsionków i komór serca.
- Zbadanie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw chorób serca.
Metody Użyte
- Uraty samców dorosłych C57BL/6 zostały uśmiercone w celu ekstrakcji serca.
- Przeprowadzono wsteczną kanulację aorty w celu perfuzji.
- Serca perfundowano specyficznymi roztworami do trawienia.
- Komórki mięśniowe zostały wyizolowane i przygotowane do badań elektrofizjologicznych.
Główne Wyniki
- Komórki mięśniowe przedsionków wyizolowane przy użyciu zmodyfikowanej metody wykazywały wyższe wskaźniki przeżywalności.
- Jednoczesna izolacja nie wpłynęła na jakość komórek mięśniowych komór serca.
- Nagrania elektrofizjologiczne potwierdziły żywotność wyizolowanych komórek.
- Optymalna głębokość kanulacji była kluczowa dla skutecznej perfuzji przedsionków.
Wnioski
- Zmodyfikowana metoda Langendorffa poprawia wydajność izolowanych komórek mięśniowych przedsionków.
- Jednoczesna izolacja zwiększa możliwości badawcze w fizjologii serca.
- Ten protokół może ułatwić lepsze zrozumienie mechanizmów chorób serca.
Najczęściej Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
