Name: Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metody sztucznej inteligencji do automatycznej analizy rzęsek pierwotnych w próbkach in vitro i in vivo. To podejście umożliwia szybkie, odtwarzalne i bezstronne pomiary długości oraz intensywności fluorescencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 dla NFB oraz American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 dla RB. Dziękujemy Richowi Gruskinowi, dyrektorowi generalnemu firmy Nikon Software, Melissie Bentley, Courtney Haycraft i Teresie Mastracci za wnikliwe komentarze na temat manuskryptu.

1. Pobieranie surowych obrazów
<ol>
	<li>W razie potrzeby napraw i oznacz immunologicznie próbki20.
	<ol>
		<li>Obraz rzęsek za pomocą mikroskopu konfokalnego przy maksymalnej głębi bitowej przy użyciu tego samego rozmiaru piksela z rozdzielczością Nyquista.</li>
		<li>Eksportuj obrazy jako monochromatyczne pliki w formacie obrazu oznaczonego tagiem (.tif). 
		UWAGA: Ten protokół określa sposób korzystania z modułu Ai w szczególności w oprogramowaniu NIS Elements. Jeśli obrazy zostały pozyskane jako pliki .nd2, eksportowanie obrazów jako plików .tif nie jest konieczne i użytkownik może przejść bezpośrednio do kroku 2.3. Jeśli obrazy zostały pozyskane w innym systemie, licencję NIS Elements można zakupić osobno, a .tif pliki można przekonwertować zgodnie z opisem w następnych krokach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Naucz sztuczną inteligencję do rozpoznawania rzęsek
<ol>
	<li>Otwórz zestaw danych treningowych.
	<ol>
		<li>Wybierz około 50 przykładowych obrazów z co najmniej jedną rzęską na klatkę, aby przeszkolić oprogramowanie i skopiować je do jednego folderu. Ten folder służy do kierowania oprogramowaniem podczas otwierania obrazów. Otwórz te 50 ramek w jednym dokumencie ND2 z co najmniej jedną rzęską na klatkę. Wybierz opcję File (Plik) > Import/Export (Importuj/Eksportuj) > Create ND File (Utwórz plik ND z sekwencji plików).</li>
		<li>Wybierz folder zawierający zestaw danych treningowych. Spowoduje to otwarcie listy plików na środku okna dialogowego. Zdefiniuj ręcznie organizację plików, korzystając z co najmniej jednej opcji w menu rozwijanym powyżej. Dostępne opcje to wielopunktowy (dla wielu plików maksymalnej projekcji), seria Z (dla obrazu ze stosu z), czas (dla obrazu poklatkowego) i długość fali (dla plików z wielu kanałów).</li>
		<li>Wprowadź odpowiednie wartości liczbowe pod każdą wybraną opcją. Wybierz opcję Brak wszędzie tam, gdzie opcje nie są zaznaczone. Kliknij przycisk Konwertuj, aby otworzyć dokument ND.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibrowanie obrazów.
	<ol>
		<li>Wprowadź rozmiar w pikselach w lewym dolnym rogu obrazu: Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Nieskalibrowany > Kalibruj dokument > rozmiaru w pikselach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj rzęski.
	<ol>
		<li>Ręcznie zidentyfikuj rzęski, precyzyjnie śledząc poszczególne struktury rzęskowe we wszystkich otwartych ramkach za pomocą funkcji AutoDetect lub Draw Object na pasku narzędzi binarnych. Spowoduje to narysowanie masek binarnych na obiektach zainteresowania. Te pliki binarne posłużą jako przykładowe obiekty do szkolenia oprogramowania w zakresie identyfikacji rzęsek na podstawie cech opartych na pikselach w przyszłej eksperymentalnej analizie obrazu. Wybierz opcję Widok > Formanty analizy > binarnym pasku narzędzi > Rysuj obiekt. 
		UWAGA: Usuń każdą ramkę, która nie ma żadnych plików binarnych, ponieważ oprogramowanie nie rozpocznie trenowania, jeśli nie będzie w stanie wykryć plików binarnych we wszystkich otwartych ramkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trenuj sztuczną inteligencję.
	<ol>
		<li>Rozpocznij szkolenie oprogramowania. Spowoduje to otwarcie pociągu Segment.ai skrzynki. Wybierz NIS.ai > Train Segment.ai.</li>
		<li>W polu Train Segment.ai (Trenowanie ) wybierz kanał źródłowy, który ma być używany do trenowania. Jeśli otwarte są pliki z wielu kanałów, wybierz tylko jeden kanał jako kanał źródłowy. Następnie wybierz odpowiednie pliki binarne prawdy podstawowej, na których chcesz trenować sztuczną inteligencję. Na koniec wybierz liczbę iteracji potrzebnych do wytrenowania sztucznej inteligencji w zależności od rozmiaru i dystrybucji plików binarnych. 
		UWAGA: Jeśli pliki binarne są łatwo wykrywalne z otoczenia i dobrze rozmieszczone na obrazie, oprogramowanie może potrzebować mniej niż 1000 iteracji, aby nauczyć się identyfikować obrazy. Jeśli obrazy mają niski stosunek sygnału do szumu, idealnie jest uruchomić co najmniej 1000 iteracji podczas treningu, aby umożliwić sztucznej inteligencji identyfikację rzęsek w próbkach testowych z dużą pewnością.</li>
		<li>Wybierz folder docelowy, aby zapisać wytrenowany plik sztucznej inteligencji (.sai), a następnie kliknij przycisk Trenuj, aby wytrenować oprogramowanie. Oprogramowanie będzie teraz trenować się w rozpoznawaniu rzęsek na podstawie śledzonych plików binarnych. Ten proces trwa kilka godzin. 
		UWAGA: Podczas treningu oprogramowanie wyświetli wykres przedstawiający straty treningowe. Wykres początkowo pokaże skok, a następnie zwęzi się do idealnie około 1% straty, gdzie utrzymuje się do końca treningu. Zapisz wykres do wykorzystania w przyszłości, zaznaczając pole wyboru Zapisz zrzut ekranu wykresu w polu Train Segment.ai (Rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Jeśli wymagane jest dalsze uściślenie trenowania, kontynuuj trenowanie na tym samym zestawie danych. Alternatywnie możesz trenować na nowym zestawie danych z dokładnie tymi samymi parametrami. Nie zaleca się trenowania już wytrenowanej sztucznej inteligencji na nowym zbiorze danych o różnych parametrach lub różnych obiektach zainteresowania. Wybierz pozycję Trenuj segment.ai > kontynuuj trenowanie > wybierz pozycję Plik wytrenowanej sztucznej inteligencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zidentyfikuj rzęski za pomocą wyszkolonej sztucznej inteligencji
<ol>
	<li>Otwórz eksperymentalny zestaw danych.
	<ol>
		<li>Otwórz eksperymentalne obrazy konfokalne rzęsek w oprogramowaniu, konwertując pliki próbki .tif na pliki .nd2, podobnie jak w kroku 2.1. Wybierz opcję Plik > Importuj/Eksportuj > Utwórz plik ND z sekwencji plików. 
		UWAGA: Obrazy powinny mieć ten sam rozmiar piksela, co te używane do trenowania sztucznej inteligencji. Jeśli obrazy są już w formacie ND2, przejdź do kroku 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibrowanie obrazów.
	<ol>
		<li>Wprowadź rozmiar w pikselach w lewym dolnym rogu obrazu. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Nieskalibrowany > Kalibruj dokument > rozmiaru w pikselach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom wytrenowaną sztuczną inteligencję na otwartych plikach.
	<ol>
		<li>Rozpocznij identyfikację rzęsek za pomocą Ai. Oprogramowanie będzie teraz rysować pliki binarne na rzęskach na podstawie treningu, który otrzymał w poprzednim kroku. Ten proces zajmie kilka sekund. Wybierz NIS.ai > Segment.ai. 
		UWAGA: Oprogramowanie poprosi o wybranie kanału, jeśli otwartych jest wiele kanałów. Kanały są tutaj wymienione według ich nazw. Jeśli nie, pole oznaczone "Mono" zostanie automatycznie zaznaczone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych plików binarnych.
	<ol>
		<li>Gdy sztuczna inteligencja zidentyfikuje rzęski i narysuje pliki binarne, sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych obiektów. W razie potrzeby ręcznie usuń wszystkie błędnie zidentyfikowane pliki binarne. Wybierz opcję Widok > formantów analizy > binarny pasek narzędzi > Usuń obiekt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar długości i intensywności rzęsek
<ol>
	<li>Utwórz nową recepturę Analizy ogólnej 3 (GA3).
	<ol>
		<li>Teraz, gdy rzęski zostały zidentyfikowane i podzielone na segmenty, przystąp do analizy różnych parametrów rzęsek, takich jak długość i intensywność, za pomocą narzędzia GA3. Spowoduje to otwarcie nowego okna z pustym miejscem pośrodku, w którym zostanie zdefiniowana analiza. Wybierz Obraz > Nowy przepis GA3. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz pliki binarne do analizy.
	<ol>
		<li>Ponieważ rzęski są już podzielone na segmenty za pomocą Segment.ai, GA3 automatycznie wykryje pliki binarne odpowiednio oznaczone zgodnie ze sztuczną inteligencją i uwzględni węzeł. Wybierz opcję "Pliki binarne > automatyczne Detect_AI" lub "Pliki binarne > rysuj Object_AI".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz kanały wymagane do analizy. GA3 automatycznie wykryje również kanały na obrazach i wyświetli ich zakładki w sekcji Kanały.</li>
	<li>Usuń obiekty stykające się z krawędzią ramki.
	<ol>
		<li>Ponieważ Ai podzieli na segmenty wszystkie obiekty podobne do rzęsek w ramce, wykryje również niekompletne rzęski wzdłuż krawędzi ramki. Obiekty te można usunąć ręcznie w kroku 3.4 lub automatycznie w wersji ogólnie dostępnej 3. Wybierz Przetwarzanie binarne > Usuń obiekty > Stykające się granice.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz parametry do pomiaru rzęsek.
	<ol>
		<li>Przeciągnij i upuść parametry do pomiaru, takie jak długość rzęsek (długość) i intensywność (suma intensywności obiektu). Połącz węzły z odpowiednim węzłem binarnym (połączenie A) i węzłami kanału (połączenie B). Umieść kursor na połączeniu węzła, aby wyświetlić etykietkę narzędzia, aby pokazać, do którego połączenia należy węzeł. Wybierz Pomiar > Rozmiar > długość obiektu oraz Pomiar > intensywności obiektu > Sumuj intensywność obiektu. 
		UWAGA: >Długość węzła łączy się tylko z węzłem binarnym, podczas gdy Suma intensywności obj łączy się zarówno z węzłem binarnym, jak i węzłem kanału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dołącz pomiary do jednej tabeli.
	<ol>
		<li>Połącz wszystkie pomiary w jednej tabeli wyjściowej, przeciągając i upuszczając węzeł Dołącz kolumnę do schematu blokowego analizy i łącząc go z węzłami pomiaru, długością i intensywnością sumy. Wybierz pozycję Zarządzanie danymi > Podstawowe > Dołącz kolumnę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz rzęski.
	<ol>
		<li>Zmierz rzęski, klikając Uruchom. Ten proces zajmuje kilka chwil, aby zmierzyć wszystkie rzęski na obrazach eksperymentalnych. Długości i intensywności pojawią się w nowym oknie Wyniki analizy. 
		UWAGA: Tabela może czasami zawierać dane z masek, które sztuczna inteligencja rozpoznała jako rzęski, ale były zbyt małe, aby mogły zostać wykryte przez ludzkie oko i wyeliminowane w kroku 3.4. Obiekty te można usunąć ze zbioru danych za pomocą filtru przed analizą statystyczną. W tym przypadku do pomiarów długości rzęsek in vitro użyto filtra o wielkości 1 μm w <silna klasa="xfig">Rysunek 2 i 2 μm dla rzęsek in vivo. Można to zrobić przed wyeksportowaniem danych za pomocą poniższej ścieżki. Wybierz okno Wyniki analizy > Zdefiniuj filtr > Wprowadź wartość > Użyj filtru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksport danych do analizy statystycznej.</li>
</ol>
5. Badania kolokalizacyjne
UWAGA: Analiza kolokalizacji może być zawarta w tym samym przepisie GA3, który jest używany do pomiarów długości rzęsek i analizy intensywności. W przypadku korzystania z tej samej receptury otwórz pliki zgodnie z poniższym opisem i zmierz długość i intensywność obu kanałów wraz ze współczynnikami kolokalizacji w tym samym potoku analizy.
<ol>
	<li>Otwórz eksperymentalny zestaw danych.
	<ol>
		<li>Otwórz eksperymentalne obrazy konfokalne rzęsek w oprogramowaniu, konwertując pliki próbki .tif na pliki .nd2. Wybierz opcję File (Plik) > Import/Export (Importuj/Eksportuj) > Create ND File (Utwórz plik ND z sekwencji plików).</li>
		<li>W wyskakującym okienku wybierz pliki monochromatyczne o 16-bitowej głębi ze wszystkich interesujących Cię kanałów z eksploratora okien znajdującego się w pierwszej kolumnie wyskakującego okienka. Z pierwszego menu rozwijanego wybierz opcję Wielopunktowe lub Seria Z i wprowadź wartość odpowiadającą odpowiednio całkowitej liczbie obrazów lub stosów.</li>
		<li>W drugim polu rozwijanym wybierz opcję Długość fali i zmień wartość na całkowitą liczbę kanałów w folderze. Oprogramowanie automatycznie odblokuje okno wyboru długości fali znajdujące się w prawym dolnym rogu wyskakującego okienka. Użyj menu rozwijanego Kolor, aby wybrać kolor każdego kanału. Podaj każdemu kanałowi inną nazwę w kolumnie Nazwa. Po zaktualizowaniu wszystkich informacji kliknij przycisk Konwertuj. Oprogramowanie automatycznie wygeneruje plik obrazu Wszystkie nałożony na wszystkie pojedyncze obrazy ze wszystkich wybranych kanałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibrowanie obrazów.
	<ol>
		<li>Wprowadź rozmiar w pikselach w lewym dolnym rogu obrazu. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Nieskalibrowany > Kalibruj dokument > rozmiaru w pikselach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom wytrenowaną sztuczną inteligencję na pierwszym kanale.
	<ol>
		<li>Rozpocznij identyfikację rzęsek na jednym z otwartych kanałów (np. ACIII; <silna klasa="xfig">Rysunek 5A) za pomocą sztucznej inteligencji. Oprogramowanie będzie teraz rysować pliki binarne na rzęskach oznaczonych ACIII na podstawie treningu, który otrzymał dla tego kanału. Ten proces zajmie kilka sekund. Wybierz NIS.ai > Segment.ai > Kanały źródłowe > ACIII.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom wytrenowaną sztuczną inteligencję na drugim kanale.
	<ol>
		<li>Rozpocznij identyfikację rzęsek na drugim otwartym kanale (np. MCHR1; <silna klasa="xfig">Rysunek 5B) za pomocą sztucznej inteligencji. Oprogramowanie będzie teraz rysować pliki binarne na rzęskach oznaczonych MCHR1 na podstawie treningu, który otrzymał dla tego kanału. Ten proces zajmie kilka chwil. Wybierz NIS.ai > Segment.ai > Kanały źródłowe > MCHR1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych plików binarnych.
	<ol>
		<li>Gdy sztuczna inteligencja zidentyfikuje rzęski i narysuje pliki binarne, sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych obiektów. W razie potrzeby ręcznie usuń wszystkie błędnie zidentyfikowane pliki binarne. Wybierz opcję Widok > formantów analizy > binarny pasek narzędzi > Usuń obiekt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz nowy przepis GA3.
	<ol>
		<li>Teraz, gdy rzęski zostały zidentyfikowane i podzielone na segmenty, przejdź do analizy kolokalizacji za pomocą narzędzia GA3. Spowoduje to otwarcie nowego okna z pustym miejscem pośrodku, w którym zostanie zdefiniowana analiza. Zostanie wygenerowane okno ze wszystkimi zidentyfikowanymi plikami binarnymi i kanałami. Sprawdź, czy wszystkie żądane kanały i pliki binarne wymagane do analizy są obecne i wybrane. Wybierz Obraz > Nowy przepis GA3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń obiekty stykające się z krawędzią ramki.
	<ol>
		<li>Ponieważ sztuczna inteligencja podzieli na segmenty wszystkie obiekty podobne do rzęsek w ramce, wykryje również niekompletne rzęski wzdłuż krawędzi ramki. Obiekty te można usunąć ręcznie w kroku 5.5 lub automatycznie w wersji ogólnie dostępnej 3. Wybierz opcję Przetwarzanie binarne > Usuń obiekty > Stykające się krawędzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj ścieżkę kolokalizacji w GA3.
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć nakładanie się dwóch kanałów w rzęskach, użyj korelacji współczynnika Mandera. Przeciągnij i upuść węzeł Współczynnik Mandersa w puste miejsce przepisu GA3 i połącz go z odpowiednim plikiem binarnym i kanałami. W tym przypadku "połączenie A" łączy się z plikiem binarnym ACIII, "połączenie B" z kanałem MCHR1, a "połączenie C" z kanałem ACIII, aby określić nakładanie się MCHR1 w obrębie pliku binarnego ACIII. Wybierz Pomiar > Współczynnik proporcji obiektu > Manders. 
		UWAGA: Oprogramowanie umożliwia pomiar kolokalizacji za pomocą korelacji współczynnika Pearsona przy użyciu tych samych kroków, które opisano w tym protokole40.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dołącz pomiary do jednej tabeli.
	<ol>
		<li>Połącz wszystkie pomiary w jednej tabeli wyjściowej. Wybierz pozycję Zarządzanie danymi > Podstawowe > Dołącz kolumnę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mierz kolokalizację.
	<ol>
		<li>Zmierz rzęski, klikając Uruchom. Ten proces zajmuje kilka chwil, aby zmierzyć wszystkie rzęski na obrazach eksperymentalnych. Dane pojawią się w nowym oknie Wyniki analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksport danych do analizy statystycznej.</li>
</ol>

Współautor Wesley Lewis jest pracownikiem firmy Nikon. Nie ujawnia się żadnych informacji finansowych.

Pomiary długości i intensywności są powszechnymi sposobami analizy rzęsek pierwotnych, jednak nie ma ustandaryzowanej konwencjonalnej metody stosowanej w tej dziedzinie. Identyfikacja i kwantyfikacja rzęsek pierwotnych za pomocą oprogramowania takiego jak ImageJ jest czasochłonna i podatna na stronniczość i błędy użytkownika. Utrudnia to dokładną analizę dużych zbiorów danych. Tutaj pokazujemy, że użycie programu AI może przezwyciężyć wiele z tych wyzwań, dzięki czemu możliwa jest wysokoprzepustowa analiza rzęsek pierwotnych. W tym miejscu opisujemy procedurę trenowania aplikacji opartej na sztucznej inteligencji w celu rozpoznawania rzęsek pierwotnych i nakreślamy kroki wymagane do analizy długości i intensywności.
Podczas gdy wstępne szkolenie sztucznej inteligencji w rozpoznawaniu rzęsek wymaga od użytkownika znacznego czasu, po zakończeniu można je wykorzystać na dowolnym zestawie danych uzyskanych o tych samych parametrach. Maska binarna generowana przez sztuczną inteligencję jest modyfikowalna w taki sposób, że wszelkie błędy można poprawić. Jednak błędy w identyfikacji rzęsek powinny sygnalizować użytkownikowi, że sztuczna inteligencja musi być dalej trenowana za pomocą dodatkowych obrazów. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że sztuczną inteligencję można wytrenować do rozpoznawania rzęsek w różnych typach próbek zarówno w 2D, jak i 3D. Poprzednie metody analizy generowane w laboratoriach miały różne ograniczenia, w tym wymaganie ręcznego progowania w celu identyfikacji i problemy z identyfikacją rzęsek obrazowanych na podstawie odcinków tkanki, w których gęstość komórek jest wysoka 36,46,47. Metody te są również wyspecjalizowane w analizie rzęsek, podczas gdy analiza za pomocą oprogramowania NIS Elements może oceniać kilka aspektów obrazów jednocześnie. Ponieważ opisana tutaj sztuczna inteligencja jest częścią pakietu oprogramowania NIS Elements, obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu firmy Nikon można łatwo kontynuować aż do analizy. Jednak obrazowanie za pomocą firmy Nikon nie jest wymagane do korzystania z tej metody. Niezależnie od przechwyconego formatu pliku danych surowych, pliki ".tif" mogą być otwierane przez NIS Elements w celu użycia w sztucznej inteligencji.
Ta aplikacja AI w ramach NIS Elements jest szeroko dostępna i prawdopodobnie jest już częścią oprogramowania do analizy obrazu używanego przez laboratoria badające pierwotne rzęski. Wraz z rozwojem technologii sztucznej inteligencji inne programy do obrazowania mogą rozszerzyć swoje opcje analizy o podobny moduł sztucznej inteligencji. Zastosowanie analizy Ai do identyfikacji rzęsek może być wykorzystane do kilku różnych aspektów analizy rzęsek. Chociaż przedstawiliśmy metody dla kilku prostych analiz, takich jak długość (Rysunek 2 i 3), intensywność (Rysunek 4) i kolokalizacja (Rysunek 5), bardziej wyrafinowaną analizę można dodać do przepływu pracy analizy GA3, jak na Rysunku 6. Na przykład, zamiast mierzyć intensywność całej rzęski, różnice w intensywności w podregionie rzęski mogą być interesujące dla oceny lokalizacji podrzęskowej. Różnice w intensywności w podregionie rzęski mogą wskazywać, że białko gromadzi się na czubku lub podstawie rzęski, na przykład w jaki sposób białka Gli są wzbogacane na końcu rzęski48. Ponadto ta aplikacja AI może być używana do łatwej identyfikacji różnic między genotypami lub grupami leczonymi. Chociaż nasze laboratorium wykorzystuje tę metodę głównie do analizy rzęsek zobrazowanych z wycinków mózgu lub kultur neuronalnych, można ją zastosować do obrazów uzyskanych z różnych linii komórkowych lub innych typów tkanek. Elastyczność typu próbki, do której można wykorzystać tę aplikację, sprawia, że ta metoda analizy jest cenna dla wielu różnych grup badających rzęski pierwotne lub dowolne dyskretne organelle, które są oceniane, takie jak mitochondria, jądro lub ER.

Pierwotne rzęski to organelle czuciowe wystające z większości typów komórek ssaków1,2,3,4. Są to na ogół pojedyncze przydatki, które mają kluczowe znaczenie dla koordynacji różnych szlaków sygnalizacji komórkowej poprzez integrację sygnałów zewnątrzkomórkowych5,6,7. Pierwotne rzęski odgrywają ważną rolę podczas rozwoju embrionalnego i homeostazy tkanek dorosłych, a zakłócenie ich funkcji lub morfologii wiąże się z kilkoma zaburzeniami genetycznymi, które są zbiorczo nazywane ciliopatiami. Ze względu na niemal wszechobecną naturę rzęsek, ciliopatie są związane z szerokim zakresem cech klinicznych, które mogą wpływać na wszystkie układy narządów8,9,10,11,12. W zwierzęcych modelach ciliopatii utrata struktury rzęskowej lub zdolności sygnalizacyjnej przejawia się w kilku klinicznie istotnych fenotypach, w tym otyłości związanej z hiperfagią3,13,14,15. W wielu systemach modelowych wykazano, że zmiany długości rzęsek wpływają na ich zdolność sygnalizacyjną i funkcje16,17,18,19. Istnieje jednak kilka czasochłonnych i technicznych wyzwań związanych z dokładną i powtarzalną oceną długości i składu rzęsek.
Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) dorosłego ssaka to jeden z biologicznych kontekstów, który stanowi wyzwanie dla zrozumienia morfologii i funkcji rzęsek. Chociaż wydaje się, że neurony i komórki w całym OUN posiadają rzęski, ze względu na ograniczone narzędzia i możliwości obserwacji i analizy tych rzęsek, zrozumienie ich funkcji pozostaje nieuchwytne20. Na przykład prototypowy marker rzęsek, acetylowana α-tubulina, nie oznacza rzęsek neuronalnych20. Trudność w badaniu tych rzęsek została częściowo rozwiązana dzięki odkryciu kilku receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), maszynerii sygnalizacyjnej i białek związanych z błoną, które są wzbogacone na błonie rzęsek neuronalnych21,22. Wszystkie te proste podstawowe obserwacje wskazują na znaczenie i różnorodność rzęsek OUN, które do tej pory wydają się nieporównywalne z innymi tkankami. Na przykład różnice w długości rzęsek i lokalizacji GPCR można zaobserwować w całym mózgu, przy czym długości w niektórych jądrach neuronalnych są różne w porównaniu z innymi jądrami19,23. Podobnie, ich zawartość GPCR i maszyneria sygnalizacyjna uzupełniają różnorodność w oparciu o lokalizację neuroanatomiczną i typ neuronalny2,24,25,26,27,28,29. Te proste obserwacje pokazują, że długość i skład rzęsek ośrodkowego układu nerwowego ssaków są ściśle regulowane, podobnie jak w organizmach modelowych, takich jak Chlamydomonas reinhardtii, ale wpływ tych różnic długości na funkcję, sygnalizację i ostatecznie zachowanie rzęsek pozostaje niejasny16,30,31,32.
Dokładny pomiar długości i składu rzęsek okazuje się być technicznym wyzwaniem podatnym na błędy użytkownika i nieodtwarzalności. Obecnie rzęski in vivo i in vitro są najczęściej identyfikowane przy użyciu metod immunofluorescencyjnych, które znakują białka rzęskowe lub fluorescencyjne allele reporterowe wzbogacone w rzęski33,34,35. Długości tych fluorescencyjnie oznakowanych rzęsek są następnie mierzone na podstawie obrazu dwuwymiarowego (2D) za pomocą narzędzi do pomiaru linii w programach do analizy obrazu, takich jak ImageJ36. Proces ten jest nie tylko żmudny i pracochłonny, ale także podatny na stronniczość i błędy. Te same przeszkody pojawiają się podczas pomiaru intensywności rzęsek, które pomagają wskazać zmiany w strukturze rzęsek37. Aby zminimalizować niespójności w tego typu analizach obrazów, programy sztucznej inteligencji (AI) stają się coraz bardziej powszechnymi i przystępnymi cenowo opcjami38.
Ai to zaawansowanie systemów komputerowych, które wykorzystują przewagę algorytmów komputerowych i programowania do wykonywania zadań, które zwykle wymagałyby ludzkiej inteligencji39. Urządzenia AI są uczone dostrzegania powtarzających się wzorców, parametrów i cech oraz podejmowania działań w celu maksymalizacji szans na osiągnięcie pomyślnych wyników. Sztuczna inteligencja jest wszechstronna i można ją wytrenować do rozpoznawania określonych obiektów lub struktur będących przedmiotem zainteresowania, takich jak rzęski, a następnie zaprogramować ją do przeprowadzania różnych analiz na zidentyfikowanych obiektach. W związku z tym złożone dane obrazowe mogą być szybko i powtarzalnie generowane przez klasę Ai<sup="xref">38. Automatyzacja i analiza AI przechwyconych obrazów zwiększy skuteczność i wydajność, jednocześnie ograniczając potencjalne błędy ludzkie i stronniczość39. Ustanowienie opartej na sztucznej inteligencji metodologii identyfikacji rzęsek tworzy spójny sposób dla wszystkich grup badawczych do analizy i interpretacji danych dotyczących rzęsek.
Tutaj używamy modułu Ai do identyfikacji rzęsek zarówno in vivo, jak i in vitro na obrazach 2D. Korzystając z zestawu przykładowych obrazów, sztuczna inteligencja jest szkolona w rozpoznawaniu rzęsek. Po zakończeniu trenowania wyznaczona sztuczna inteligencja jest używana do nakładania maski binarnej na rzęski zidentyfikowane przez sztuczną inteligencję na obrazie. Pliki binarne stosowane przez sztuczną inteligencję można modyfikować, jeśli to konieczne, aby zapewnić, że wszystkie rzęski na obrazach są prawidłowo zidentyfikowane, a identyfikacja niespecyficzna jest eliminowana. Po wykorzystaniu sztucznej inteligencji do identyfikacji rzęsek, niestandardowe programy do analizy ogólnej (GA) są używane do wykonywania różnych analiz, takich jak pomiar długości rzęsek i intensywności fluorescencji. Zebrane dane są eksportowane do tabeli, którą można łatwo odczytać, zinterpretować i wykorzystać do analiz statystycznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Wykorzystanie zautomatyzowanej technologii i sztucznej inteligencji do identyfikacji rzęsek i uzyskania konkretnych pomiarów między grupami eksperymentalnymi pomoże w przyszłych badaniach mających na celu zrozumienie wpływu funkcji i morfologii rzęsek OUN na komunikację i zachowanie komórka-komórka.

<table><tbody><tr><td>Intel Xeon, 3,6 GHz, 32 GB pamięci RAM</td> Procesor <td>Intel Corporation</td><td>W-2123</td><td>używany do uruchamiania NIS Elements.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nikon Elements</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>-</td><td>Oprogramowanie Ai i GA3</td></tr><tr><td>Karta graficzna Quadro RTX 4000 NVIDIA</td><td>Corporation</td><td>Quadro RTX 4000</td><td></td></tr><tr><td>Windows 10 Professional 64-bit</td><td>Microsoft Inc.</td><td>-</td><td>System operacyjny używany do uruchamiania NIS</td></tr><tr><td>Elements Workstation</td><td>HP Development Company, L.P.</td><td>HP&nbsp; Stacja robocza Z4G4</td><td>używana do uruchamiania elementów NIS</td></tr></tbody></table>

podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Rzęski to komórkowe wyrostki oparte na mikrotubulach, które funkcjonują jako centra sygnalizacyjne dla różnych ścieżek sygnałowych w wielu typach komórek ssaków. Długość rzęsek jest wysoce konserwatywna, ściśle regulowana i różni się w zależności od różnych typów komórek i tkanek oraz jest zaangażowana w bezpośredni wpływ na ich zdolność sygnalizacyjną. Na przykład wykazano, że rzęski zmieniają swoją długość w odpowiedzi na aktywację receptorów rzęskowych sprzężonych z białkiem G. Jednak dokładny i powtarzalny pomiar długości licznych rzęsek jest zabiegiem czasochłonnym i pracochłonnym. Obecne podejścia są również podatne na błędy i stronniczość. Programy sztucznej inteligencji (AI) można wykorzystać do pokonania wielu z tych wyzwań dzięki możliwościom, które umożliwiają asymilację, manipulację i optymalizację obszernych zestawów danych. Tutaj pokazujemy, że moduł sztucznej inteligencji można wytrenować do rozpoznawania rzęsek na obrazach zarówno z próbek in vivo, jak i in vitro. Po wykorzystaniu wyszkolonej sztucznej inteligencji do identyfikacji rzęsek, jesteśmy w stanie zaprojektować i szybko wykorzystać aplikacje, które analizują setki rzęsek w jednej próbce pod kątem długości, intensywności fluorescencji i kolokalizacji. To bezstronne podejście zwiększyło naszą pewność siebie i rygor podczas porównywania próbek z różnych pierwotnych preparatów neuronalnych in vitro, a także w różnych regionach mózgu u zwierzęcia i między zwierzętami. Co więcej, technika ta może być wykorzystana do wiarygodnej analizy dynamiki rzęsek z dowolnego typu komórek i tkanek w sposób wysokoprzepustowy w wielu próbkach i grupach poddanych zabiegowi. Ostatecznie podejścia oparte na sztucznej inteligencji prawdopodobnie staną się standardem, ponieważ większość dziedzin zmierza w kierunku mniej stronniczych i bardziej powtarzalnych podejść do pozyskiwania i analizy obrazów.

Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.

Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Obecne metody analizy rzęsek są pracochłonne i podatne na błędy i stronniczość. Nasze podejście ma na celu skrócenie czasu i wysiłku przy jednoczesnym ograniczeniu potencjalnych błędów. Główną zaletą tej techniki jest zwiększony rygor i odtwarzalność oraz ilościowa analiza obrazu.Tego typu podejście jest istotne nie tylko dla analizy rzęsek, ale może być szeroko stosowane do wielu pytań biologicznych komórek, w tym tych dotyczących innych organelli i białek cytoszkieletu. Aby rozpocząć, otwórz zestaw danych treningowych, wybierz plik z menu, kliknij importuj eksport i wybierz utwórz plik ND z sekwencji plików. Wybierz folder zawierający zestaw danych treningowych, a lista plików otworzy się na środku okna dialogowego.Ręcznie zdefiniuj organizację plików, korzystając z co najmniej jednej opcji w menu rozwijanym. Wprowadź odpowiednie wartości liczbowe pod każdą wybraną opcją i wybierz brak wszędzie tam, gdzie opcje nie są wybrane. Kliknij przycisk Konwertuj, aby otworzyć dokument ND.Aby skalibrować obraz, kliknij prawym przyciskiem myszy opcję nieskalibrowany w lewym dolnym rogu obrazu. Kliknij przycisk Kalibruj dokument, a następnie kliknij opcję Rozmiar w pikselach, wprowadź wartość i kliknij przycisk OK. Wybierz opcję wyświetl kontrolki analizy, otwórz binarny pasek narzędzi i wybierz opcję automatycznego wykrywania lub rysuj obiekt, aby ręcznie zidentyfikować rzęski, precyzyjnie śledząc poszczególne struktury rzęskowe we wszystkich otwartych ramkach.Aby wytrenować sztuczną inteligencję, wybierz pozycję nis. ai, kliknij przycisk train segment. ai, aby otworzyć segment pociągu.AI, a następnie wybierz kanał źródłowy, który ma być używany do trenowania. Wybierz odpowiednie pliki binarne GroundTruth, aby wytrenować sztuczną inteligencję. Wybierz wymaganą liczbę iteracji, aby wytrenować sztuczną inteligencję w zależności od rozmiaru binarnego i dystrybucji, a następnie wybierz folder docelowy, aby zapisać wytrenowany plik sztucznej inteligencji, a następnie kliknij przycisk trenuj, aby wytrenować oprogramowanie. Ten proces trwa kilka godzin.Otwórz eksperymentalne obrazy konfokalne rzęsek, jak opisano wcześniej, przekształcając próbkę. TIF do plików ND2. W wyskakującym oknie wybierz opcję wielopunktowy z pierwszego menu rozwijanego i wprowadź wartość odpowiadającą całkowitej liczbie obrazów.W drugim polu rozwijanym wybierz długość fali i zmień wartość na całkowitą liczbę kanałów w folderze. Oprogramowanie automatycznie odblokuje okno wyboru długości fali, znajdujące się na dole, po prawej stronie wyskakującego okienka. W oknie wyboru długości fali użyj menu rozwijanego koloru, aby wybrać kolor każdego kanału.Podaj każdemu kanałowi inną nazwę w kolumnie nazwy. Po zaktualizowaniu wszystkich informacji kliknij przycisk Konwertuj. Skalibruj obrazy zgodnie z wcześniejszym opisem.Upewnij się, że rozmiar piksela eksperymentalnego zestawu danych jest spójny z rozmiarem zestawu danych treningowych. Zidentyfikuj rzęski w pierwszym kanale, korzystając z przeszkolonej sztucznej inteligencji z poprzedniego kroku. Otwórz nis.ai z menu wybierz Segment. ai, a następnie wybierz AC3 w kanałach źródłowych. Następnie zidentyfikuj rzęski w drugim kanale, wybierając MCHR1 w kanałach źródłowych.Oprogramowanie narysuje pliki binarne na oznaczonych rzęskach. Następnie sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych plików binarnych. Wybierz opcję Usuń obiekt na pasku narzędzi binarnych, aby ręcznie usunąć błędnie zidentyfikowane pliki binarne.Po zidentyfikowaniu i segmentacji rzęsek przeanalizuj różne parametry rzęsek, takie jak długość i intensywność, za pomocą narzędzia do analizy ogólnej trzy. Wybierz obraz z menu i kliknij nowy przepis GA3. Otworzy się nowe okno z pustym miejscem pośrodku.GA3 automatycznie wykryje pliki binarne odpowiednio oznaczone zgodnie ze sztuczną inteligencją i uwzględni odpowiedni węzeł. GA3 automatycznie wykryje również kanały na obrazach i wyświetli ich zakładki pod kanałami. Sztuczna inteligencja podzieli na segmenty wszystkie obiekty przypominające rzęski w ramce i wykryje niekompletne rzęski wzdłuż krawędzi ramki.Aby je usunąć, wybierz przetwarzanie binarne, usuń obiekty, a następnie przeciągnij stykający się węzeł obramowania w puste miejsce i połącz węzeł z odpowiednimi plikami binarnymi. Aby zmierzyć długość rzęsek, wybierz rozmiar obiektu pomiaru, a następnie długość. Przeciągnij i upuść parametr do środka i połącz się z odpowiednim węzłem binarnym.Aby zmierzyć intensywność rzęsek, wybierz intensywność obiektu. Przeciągnij i upuść parametr na środek i połącz się z odpowiednim węzłem binarnym i kanałem, który Cię interesuje. W menu pomiaru przejdź do wskaźnika obiektów i wybierz współczynnik Mandera, aby ustawić szlak kolokalizacji w GA3 poprzez pomiar nakładania się dwóch kanałów w obrębie poszczególnych rzęsek.Przeciągnij i upuść węzeł współczynnika Mandera w puste miejsce i podłącz go do odpowiedniego pliku binarnego i kanałów. ApEn pomiary i pojedynczą tabelę, otwierając menu zarządzania danymi. W kategorii podstawowej wybierz kolumnę ApEn, a następnie kliknij przycisk Uruchom teraz, aby zmierzyć rzęski.Wszystkie pomiary pojawią się w jednej tabeli wyjściowej. Reprezentatywne obrazy pokazują, że wyszkolona sztuczna inteligencja prawidłowo zidentyfikowała rzęski in vitro na obrazach komórek IMCD, pierwotnych kultur podwzgórza i kultur hipokampa, ale nie innych struktur nierzęskowych, takich jak mostki cytokinetyczne. Długość rzęsek wahała się od 0,5 do 4,5 mikrometra w komórkach IMCD i od dwóch do 12 mikrometrów w hodowli podwzgórza i hipokampa.Sztuczna inteligencja zmierzyła długości rzęsek znakowanych AC3 in vivo na obrazach naszego jądra łukowatego, jądra przykomorowego i jednego obszaru rogówki amonowej. Zgodnie z analizą, rzęski podwzgórza in vivo miały od 1 do 15 mikrometrów, co widać w białych i brązowych paskach. Podczas gdy rzęski i obszar cornu ammonis wahały się od jednego do 10 mikrometrów, jak widać w szarych paskach.Co ciekawe, intensywność rzęskowego MCHR1 była silniejsza w jądrze przykomorowym niż w jądrze łukowatym. Intensywności MCHR1 w stosunku do AC3 wykreślono w celu zmierzenia ich nakładania się. Większość rzęsek była dodatnia dla obu markerów, podczas gdy niektóre rzęski były dodatnie dla AC3 lub MCHR1.Aby określić ilościowo kolokalizację MTHR1 w obrębie AC3, zmierzono współczynnik nakładania się Mandera i stwierdzono znaczny wzrost nakładania się w jądrze przykomorowym niż w jądrze łukowatym. Aby zmierzyć intensywność na całej długości rzęsek, polarność rzęsek zdefiniowano za pomocą Centrin2-GFP jako markera podstawowego ciała. Pozwoliło to na odróżnienie podstawy rzęsek od końcówek rzęsek wiśniowo-dodatnich ARL13B-M.Zaobserwowano zmiany intensywności ARL13B na całej długości rzęsek, gdzie intensywność ARL13B była wyższa u podstawy niż na końcu rzęski w jądrze łukowatym, widocznym po lewej stronie, a także PVN, jak widać po prawej. Podczas analizowania danych przy użyciu tego podejścia ważne jest, aby upewnić się, że jakość i rozdzielczość eksperymentalnego zestawu danych jest spójna z tymi, które są używane do trenowania sztucznej inteligencji. Główną użytecznością tego podejścia jest to, że po wykryciu rzęsek przez sztuczną inteligencję użytkownik może kreatywnie określić, które właściwości są analizowane, dostosowując przepływ pracy analizy zintegrowany z oprogramowaniem.

artificial-intelligence-approaches-to-assessing-primary-cilia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pierwotna rzęska jest fundamentalnie ważna w proliferacji neuronalnych komórek progenitorowych, różnicowaniu neuronów i funkcjonowaniu neuronów dorosłych. W tym miejscu opisujemy metodę badania ciliogenezy i transportu białek sygnałowych do rzęsek w nerwowych komórkach macierzystych / progenitorowych i zróżnicowanych neuronach przy użyciu pierwotnych kultur neurosfery.

Wykorzystanie pierwotnych kultur neurosfery do badania rzęsek pierwotnych

Pierwotne rzęski to struktury zewnątrzkomórkowe związane z centriolem. Pierwotne wykrywanie rzęsek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala uzyskać obrazy o niezwykle wysokiej jakości. W tym protokole fibroblasty wyrażające rzęski pierwotne zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym.

Proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji

Aby zagwarantować skuteczną i wysokiej jakości analizę funkcjonalną rzęsek w celu diagnozy PCD, niezbędna jest precyzyjna i staranna metoda pobierania i przetwarzania nabłonka oddechowego. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w kierunku PCD podczas pandemii COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został zaktualizowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

Szybka analiza mikroskopii wideo jest stosunkowo łatwym do przeprowadzenia, szybkim, opłacalnym i, w doświadczonych rękach, znacznie niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek, które powinno być dostępne w każdym ośrodku zajmującym się diagnostyką i leczeniem ciężkich chorób płuc.

Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

Ta metoda opisuje wykorzystanie endogennego sygnału w transgenicznym modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2 do obrazowania pierwotnych rzęsek in situ, w trzech wymiarach na dużych obszarach zmineralizowanej tkanki, od pobrania tkanki do analizy organizacji rzęsek. Protokół ten może być również stosowany do innych rodzajów tkanek.

Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2

Zintegrowane zarządzanie obrazami, sztuczna inteligencja (AI) i systemy raportowania zrewolucjonizowały praktykę patologii diagnostycznej. W tym artykule przedstawiamy FlexLIS, najnowocześniejszy system, który umożliwia sztucznej inteligencji wspomaganie patologów w przeprowadzaniu ocen obrazu histopatologicznego i generowaniu raportów diagnostycznych.

Wprowadzenie zintegrowanego systemu zarządzania obrazami patomorfologicznymi, sztucznej inteligencji i raportowania

Niniejszy protokół przedstawia metody ekstrakcji plemników z jąder samców oraz następującą po niej inseminację samic myszy. Procedura ta jest przydatna w badaniach rozwojowych wymagających precyzyjnego określenia czasu, a także w pracach nad organizmami transgenicznymi.

Pozyskiwanie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy

Metody eksperymentalne w inżynierii tkankowej

Poznaj metody sztucznej inteligencji do automatycznej analizy rzęsek pierwotnych w próbkach in vitro i in vivo. To podejście umożliwia szybkie, odtwarzalne i bezstronne pomiary długości oraz intensywności fluorescencji.

Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów