Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych
1 maja 2021
Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.
Obecne metody analizy rzęsek są pracochłonne i podatne na błędy i stronniczość. Nasze podejście ma na celu skrócenie czasu i wysiłku przy jednoczesnym ograniczeniu potencjalnych błędów. Główną zaletą tej techniki jest zwiększony rygor i odtwarzalność oraz ilościowa analiza obrazu.
Tego typu podejście jest istotne nie tylko dla analizy rzęsek, ale może być szeroko stosowane do wielu pytań biologicznych komórek, w tym tych dotyczących innych organelli i białek cytoszkieletu. Aby rozpocząć, otwórz zestaw danych treningowych, wybierz plik z menu, kliknij importuj eksport i wybierz utwórz plik ND z sekwencji plików. Wybierz folder zawierający zestaw danych treningowych, a lista plików otworzy się na środku okna dialogowego.
Ręcznie zdefiniuj organizację plików, korzystając z co najmniej jednej opcji w menu rozwijanym. Wprowadź odpowiednie wartości liczbowe pod każdą wybraną opcją i wybierz brak wszędzie tam, gdzie opcje nie są wybrane. Kliknij przycisk Konwertuj, aby otworzyć dokument ND.
Aby skalibrować obraz, kliknij prawym przyciskiem myszy opcję nieskalibrowany w lewym dolnym rogu obrazu. Kliknij przycisk Kalibruj dokument, a następnie kliknij opcję Rozmiar w pikselach, wprowadź wartość i kliknij przycisk OK. Wybierz opcję wyświetl kontrolki analizy, otwórz binarny pasek narzędzi i wybierz opcję automatycznego wykrywania lub rysuj obiekt, aby ręcznie zidentyfikować rzęski, precyzyjnie śledząc poszczególne struktury rzęskowe we wszystkich otwartych ramkach.
Aby wytrenować sztuczną inteligencję, wybierz pozycję nis. ai, kliknij przycisk train segment. ai, aby otworzyć segment pociągu.
AI, a następnie wybierz kanał źródłowy, który ma być używany do trenowania. Wybierz odpowiednie pliki binarne GroundTruth, aby wytrenować sztuczną inteligencję. Wybierz wymaganą liczbę iteracji, aby wytrenować sztuczną inteligencję w zależności od rozmiaru binarnego i dystrybucji, a następnie wybierz folder docelowy, aby zapisać wytrenowany plik sztucznej inteligencji, a następnie kliknij przycisk trenuj, aby wytrenować oprogramowanie. Ten proces trwa kilka godzin.
Otwórz eksperymentalne obrazy konfokalne rzęsek, jak opisano wcześniej, przekształcając próbkę. TIF do plików ND2. W wyskakującym oknie wybierz opcję wielopunktowy z pierwszego menu rozwijanego i wprowadź wartość odpowiadającą całkowitej liczbie obrazów.
W drugim polu rozwijanym wybierz długość fali i zmień wartość na całkowitą liczbę kanałów w folderze. Oprogramowanie automatycznie odblokuje okno wyboru długości fali, znajdujące się na dole, po prawej stronie wyskakującego okienka. W oknie wyboru długości fali użyj menu rozwijanego koloru, aby wybrać kolor każdego kanału.
Podaj każdemu kanałowi inną nazwę w kolumnie nazwy. Po zaktualizowaniu wszystkich informacji kliknij przycisk Konwertuj. Skalibruj obrazy zgodnie z wcześniejszym opisem.
Upewnij się, że rozmiar piksela eksperymentalnego zestawu danych jest spójny z rozmiarem zestawu danych treningowych. Zidentyfikuj rzęski w pierwszym kanale, korzystając z przeszkolonej sztucznej inteligencji z poprzedniego kroku. Otwórz nis.
ai z menu wybierz Segment. ai, a następnie wybierz AC3 w kanałach źródłowych. Następnie zidentyfikuj rzęski w drugim kanale, wybierając MCHR1 w kanałach źródłowych.
Oprogramowanie narysuje pliki binarne na oznaczonych rzęskach. Następnie sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych plików binarnych. Wybierz opcję Usuń obiekt na pasku narzędzi binarnych, aby ręcznie usunąć błędnie zidentyfikowane pliki binarne.
Po zidentyfikowaniu i segmentacji rzęsek przeanalizuj różne parametry rzęsek, takie jak długość i intensywność, za pomocą narzędzia do analizy ogólnej trzy. Wybierz obraz z menu i kliknij nowy przepis GA3. Otworzy się nowe okno z pustym miejscem pośrodku.
GA3 automatycznie wykryje pliki binarne odpowiednio oznaczone zgodnie ze sztuczną inteligencją i uwzględni odpowiedni węzeł. GA3 automatycznie wykryje również kanały na obrazach i wyświetli ich zakładki pod kanałami. Sztuczna inteligencja podzieli na segmenty wszystkie obiekty przypominające rzęski w ramce i wykryje niekompletne rzęski wzdłuż krawędzi ramki.
Aby je usunąć, wybierz przetwarzanie binarne, usuń obiekty, a następnie przeciągnij stykający się węzeł obramowania w puste miejsce i połącz węzeł z odpowiednimi plikami binarnymi. Aby zmierzyć długość rzęsek, wybierz rozmiar obiektu pomiaru, a następnie długość. Przeciągnij i upuść parametr do środka i połącz się z odpowiednim węzłem binarnym.
Aby zmierzyć intensywność rzęsek, wybierz intensywność obiektu. Przeciągnij i upuść parametr na środek i połącz się z odpowiednim węzłem binarnym i kanałem, który Cię interesuje. W menu pomiaru przejdź do wskaźnika obiektów i wybierz współczynnik Mandera, aby ustawić szlak kolokalizacji w GA3 poprzez pomiar nakładania się dwóch kanałów w obrębie poszczególnych rzęsek.
Przeciągnij i upuść węzeł współczynnika Mandera w puste miejsce i podłącz go do odpowiedniego pliku binarnego i kanałów. ApEn pomiary i pojedynczą tabelę, otwierając menu zarządzania danymi. W kategorii podstawowej wybierz kolumnę ApEn, a następnie kliknij przycisk Uruchom teraz, aby zmierzyć rzęski.
Wszystkie pomiary pojawią się w jednej tabeli wyjściowej. Reprezentatywne obrazy pokazują, że wyszkolona sztuczna inteligencja prawidłowo zidentyfikowała rzęski in vitro na obrazach komórek IMCD, pierwotnych kultur podwzgórza i kultur hipokampa, ale nie innych struktur nierzęskowych, takich jak mostki cytokinetyczne. Długość rzęsek wahała się od 0,5 do 4,5 mikrometra w komórkach IMCD i od dwóch do 12 mikrometrów w hodowli podwzgórza i hipokampa.
Sztuczna inteligencja zmierzyła długości rzęsek znakowanych AC3 in vivo na obrazach naszego jądra łukowatego, jądra przykomorowego i jednego obszaru rogówki amonowej. Zgodnie z analizą, rzęski podwzgórza in vivo miały od 1 do 15 mikrometrów, co widać w białych i brązowych paskach. Podczas gdy rzęski i obszar cornu ammonis wahały się od jednego do 10 mikrometrów, jak widać w szarych paskach.
Co ciekawe, intensywność rzęskowego MCHR1 była silniejsza w jądrze przykomorowym niż w jądrze łukowatym. Intensywności MCHR1 w stosunku do AC3 wykreślono w celu zmierzenia ich nakładania się. Większość rzęsek była dodatnia dla obu markerów, podczas gdy niektóre rzęski były dodatnie dla AC3 lub MCHR1.
Aby określić ilościowo kolokalizację MTHR1 w obrębie AC3, zmierzono współczynnik nakładania się Mandera i stwierdzono znaczny wzrost nakładania się w jądrze przykomorowym niż w jądrze łukowatym. Aby zmierzyć intensywność na całej długości rzęsek, polarność rzęsek zdefiniowano za pomocą Centrin2-GFP jako markera podstawowego ciała. Pozwoliło to na odróżnienie podstawy rzęsek od końcówek rzęsek wiśniowo-dodatnich ARL13B-M.
Zaobserwowano zmiany intensywności ARL13B na całej długości rzęsek, gdzie intensywność ARL13B była wyższa u podstawy niż na końcu rzęski w jądrze łukowatym, widocznym po lewej stronie, a także PVN, jak widać po prawej. Podczas analizowania danych przy użyciu tego podejścia ważne jest, aby upewnić się, że jakość i rozdzielczość eksperymentalnego zestawu danych jest spójna z tymi, które są używane do trenowania sztucznej inteligencji. Główną użytecznością tego podejścia jest to, że po wykryciu rzęsek przez sztuczną inteligencję użytkownik może kreatywnie określić, które właściwości są analizowane, dostosowując przepływ pracy analizy zintegrowany z oprogramowaniem.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia oparty na sztucznej inteligencji (AI) schemat pracy służący do zautomatyzowanej identyfikacji i analizy ilościowej rzęsek w próbkach in vivo i in vitro. Podejście to usprawnia pomiar rzęsek, ograniczając nakład pracy manualnej oraz ryzyko błędów subiektywnych, i umożliwia wysokoprzepustową, powtarzalną analizę długości rzęsek, intensywności fluorescencji oraz kolokalizacji w różnych typach komórek i tkankach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Analiza obrazowania
- Neuronauka
Wprowadzenie
- Rzęski są organellami opartymi na mikrotubulach, które pełnią funkcję centrów sygnalizacyjnych w komórkach ssaków.
- Długość rzęsek jest ściśle regulowana i różni się w zależności od typu komórki i tkanki, co wpływa na zdolność sygnalizacyjną.
- Tradycyjne metody pomiaru rzęsek są czasochłonne, podatne na błędy i obarczone ryzykiem stronniczości.
- Sztuczna inteligencja (AI) oferuje potencjał dla obiektywnej i skalowalnej analizy obrazów w biologii komórki.
Cel badania
- Opracowanie i zademonstrowanie opartej na AI metody automatycznej identyfikacji i pomiaru rzęsek.
- Umożliwienie szybkiej, powtarzalnej i bezstronnej analizy właściwości rzęsek w dużych zbiorach danych.
- Ułatwienie porównania charakterystyki rzęsek w różnych próbkach, obszarach mózgu i warunkach doświadczalnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zestawów danych treningowych z ręcznie adnotowanymi obrazami rzęsek.
- Kalibracja obrazów i trenowanie modułu AI w celu rozpoznawania struktur rzęsek.
- Zastosowanie wytrenowanej sztucznej inteligencji do segmentacji rzęsek w eksperymentalnych obrazach konfokalnych.
- Zautomatyzowany pomiar długości rzęsek, intensywności fluorescencji oraz kolokalizacji markerów przy użyciu zintegrowanych narzędzi analitycznych.
Główne wyniki
- Sztuczna inteligencja (AI) precyzyjnie zidentyfikowała rzęski in vitro (komórki IMCD, hodowle podwzgórza i hipokampa) oraz in vivo (jądro łukowate, jądro przykomorowe, obszary Cornu Ammonis).
- Ilościowo określono rozkłady długości rzęsek w zależności od typu komórek i obszaru mózgu (np. 0,5–4,5 μm w komórkach IMCD, 2–12 μm w hodowlach podwzgórza/hipokampa, 1–15 μm w rzęskach podwzgórza in vivo).
- Analiza intensywności fluorescencji ujawniła regionalne różnice w ekspresji markerów rzęskowych (np. wyższa intensywność MCHR1 w jądrze przykomorowym).
- Analiza ko-lokalizacji z wykorzystaniem współczynnika Mandersa wykazała znaczące nakładanie się markerów rzęskowych z regionalną zmiennością.
- Profilowanie intensywności wzdłuż długości rzęsek wykazało polarność, z wyższą intensywnością ARL13B u podstawy niż na wierzchołku.
Wnioski
- Przepływ pracy oparty na AI umożliwia szybką, bezstronną i powtarzalną analizę rzęsek w wielu próbkach i warunkach.
- Podejście to zwiększa rygor oraz wiarygodność ilościowej analizy obrazu.
- Metoda ta może zostać dostosowana do analizy innych organelli i struktur komórkowych w różnorodnych kontekstach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowana analiza rzęsek oparta na sztucznej inteligencji eliminuje krytyczne wąskie gardło w ilościowej biologii komórki, umożliwiając wysokoprzepustowy, obiektywny pomiar cech rzęsek w różnorodnych próbkach. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania i walidacji celów poprzez standaryzację obrazowych odczytów fenotypowych. Podejście to wspiera rygorystyczne i powtarzalne generowanie danych, niezbędne do triage'u portfolio oraz zachowania ciągłości badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia wydajny screening fenotypowy poprzez ilościowe określanie długości rzęsek oraz intensywności markerów w różnych typach komórek.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki obiektywnym i powtarzalnym wynikom analizy obrazu.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez porównywanie dynamiki rzęsek w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy badaniu szlaków sygnałowych i weryfikacji hipotez.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane przepływy pracy analizy obrazów do późniejszego wysokoprzepustowego przesiewania wysokiej zawartości (high-content screening).
- Standaryzuje wyniki ilościowe, takie jak długość, intensywność i kolokalizacja, w celu zapewnienia powtarzalności testu.
- Umożliwia skalowalną, zautomatyzowaną analizę dużych zbiorów danych i wielu grup traktowanych.
- Wspiera rzetelną ocenę związków poprzez minimalizację błędów i subiektywizmu operatora.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie pomiarów fenotypowych do systemów istotnych dla choroby poprzez zapewnienie możliwości porównań między próbkami i regionami.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki zestandaryzowanym punktom końcowym opartym na obrazowaniu.
- Dostarcza kryteria postępu skorygowane o ryzyko, oparte na ilościowych, powtarzalnych danych.
- Usprawnia rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez rygorystyczną analizę obrazu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda analizy obrazów oparta na AI integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, wspierając testowanie hipotez oraz ilościowe fenotypowanie.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza obiektywne, ilościowe wyniki dla analizy szlaków opartych na hipotezach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do użycia, powtarzalne schematy analizy obrazu dla zastosowań wysokoprzepustowych.
- Analityka: Generuje zestandaryzowane pomiary długości, intensywności i kolokalizacji rzęsek w celu rzetelnego porównania danych.
- Badania translacyjne: Umożliwia wyrównanie fenotypowe między próbkami i regionami na potrzeby badań nad biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, adaptacyjną platformę do analizy obrazowej różnych organelli i typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w testach fenotypowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w analizie obrazu.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie ryzyka biologicznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko i postępy prac dzięki ilościowym, obiektywnym danym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie trenowania AI, kalibracji obrazu i mikroskopii konfokalnej.
- Zależne od dostępu do wysokiej jakości aparatury obrazowej oraz infrastruktury oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja parametrów akwizycji i analizy obrazów.
- Metoda jest adaptowalna do różnych typów komórek i tkanek przy zastosowaniu odpowiednich zbiorów danych treningowych.
- Niezbędna jest spójność rozdzielczości i jakości obrazów pomiędzy zbiorami danych treningowych a eksperymentalnych.
