Name: Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Poznaj metodę FlashPack do szybkiej produkcji kolumn kapilarnych UHPLC w laboratorium. Protokół zwiększa prędkość pakowania dziesięciokrotnie przy użyciu standardowej bomby ciśnieniowej 100 bar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta grantem RSF 20-14-00121. Autorzy dziękują P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) za owocne dyskusje.

Protokół pakowania składa się z pięciu kroków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1): 1) przygotowanie stacji pakowania, 2) przygotowanie kapilarnej, 3) przygotowanie zawiesiny sorbentowej, 4) upakowanie kapilarne w bombie ciśnieniowej, oraz 5) upakowanie kolumny w systemie HPLC, rozdwojenie do rozmiaru i instalacja połączenia UHPLC. Optymalizacja FlashPack wymaga wprowadzenia korekt w sekcjach 3 i 4 w porównaniu ze wspólnym protokołem.
1. Zespół stanowiska pakowania
<ol>
	<li>Przygotować zbiornik gazu wypełniony azotem, helem lub argonem wyposażony w jednostopniowy reduktor gazu o ciśnieniu wylotowym > 50 barów. Maksymalne ciśnienie jest ograniczone przez kompatybilność z bombą ciśnieniową.</li>
	<li>Podłączyć reduktor do zaworu odpowietrzającego bomby ciśnieniowej.</li>
	<li>Jeśli bomba ciśnieniowa nie jest wyposażona w zintegrowane mieszadło magnetyczne, umieść bombę na mieszadle magnetycznym.</li>
	<li>Podłącz wąską rurkę z tworzywa sztucznego o średnicy wewnętrznej (np. 0,13 mm) do wylotu odpowietrzającego bomby ciśnieniowej i włóż ją do naczynia z wodą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kapilarne
<ol>
	<li>Przygotuj kapilarnę ze spiekanym castronomią ze zintegrowanym frytem szklanym utworzonym z Kasilu i formamidu15 lub kapilarą z wyciąganym emiterem przygotowaną za pomocą ściągacza laserowego16. Kapilara jest o 10-15 cm dłuższa niż planowana długość kolumny. 
	UWAGA: Patrz Tabela 1 w celu omówienia możliwych problemów związanych z różnymi rozmiarami naczyń włosowatych i rodzajami fryty. Tabela 2 zawiera przykład programu ściągacza laserowego P2000 do wykonywania kapilar z emiterem ciągniętym.</li>
	<li>Zabezpiecz wyciągniętą końcówkę emitera za pomocą przeciętej końcówki pipety z żelem.
	<ol>
		<li>Przytnij końcówkę tak, aby ściśle przylegała do kapilary o średnicy zewnętrznej 360 μm (można ją przesuwać wzdłuż kapilary, ale wymaga to pewnego wysiłku).</li>
		<li>Wsuń odciętą końcówkę pipety na kapilarnę z kierunku przedniego końca kapilary i przesuń ją w górę do końca emitera.</li>
		<li>Przesuń końcówkę ochronną do tyłu, gdy kolumna natryskiwa. Przesuń końcówkę do przodu, aby emiter kończył się wewnątrz końcówki, gdy kolumna nie rozpyla (nawet jeśli kolumna jest pod przepływem, ale nadal nie rozpyla).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie gnojowicy sorbentowej
<ol>
	<li>Przygotuj podstawową fiolkę z sorbentem: Umieść ~50 mg suchego sorbentu w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. W tym przypadku jako przykład używany jest Reprosil Pur C18.</li>
	<li>Dodać 1 ml metanolu do probówki sorbentu.</li>
	<li>Aby całkowicie wymieszać, wiruj rurkę przez 10 sekund za pomocą miksera wirowego.</li>
	<li>Sonikować w kąpieli sonikacyjnej przez 10 s.</li>
	<li>Pozwól sorbentowi dokładnie nasiąknąć przez 20-30 minut. Następnie odwiruj i ponownie poddaj sonikacji.</li>
	<li>Przygotować działającą fiolkę z sorbentem. Użyj fiolki ze stożkowym dnem, która pasuje do bomby. 
	UWAGA: Może to być kolejna probówka wirówkowa o pojemności 1,5 ml lub dowolna inna fiolka, w zależności od konkretnej konstrukcji bomby ciśnieniowej. W tym eksperymencie używana jest stożkowa dolna rurka z nakrętką przyciętą do wysokości bomby ciśnieniowej.</li>
	<li>Zawiesić sorbent w podstawowej fiolce sorbentowej i przenieść 500 μl do roboczej fiolki z sorbentem za pomocą pręta magnetycznego o wymiarach 2 x 3 mm.</li>
	<li>Dodać metanol do ~1 ml do fiolki roboczej.</li>
	<li>Pozostaw fiolkę roboczą na stole na 10 minut, aby sorbent osiadł grawitacyjnie.</li>
	<li>Jeżeli po osiadaniu warstwa sorbentu znajduje się poniżej 4 mm, należy dodać więcej zawiesiny sorbentowej i poczekać, aż sorbent opadnie przez kolejne 10 minut. 
	UWAGA: Przygotowana fiolka robocza jest przeznaczona do przygotowania wielu kolumn przez miesiące. Jeżeli działająca fiolka z sorbentem pozostaje bez mieszania przez więcej niż 2 godziny, należy ją wirować przez 10 s, poddawać sonikacji przez 10 s i osadzać grawitacyjnie. Rutynowo sorbent jest ponownie zawieszany rano przed zapakowaniem. Wtedy dobrze nadaje się do pakowania na cały dzień, jeśli nie ma długich przerw między sekwencyjnym pakowaniem kolumn. Jeśli sorbent w fiolce roboczej wyschnie, należy dodać metanol i uruchomić pełną procedurę przygotowania sorbentu, jak w przypadku fiolki z sorbentem podstawowym (kroki 3.2-3.5).</li>
</ol>
4. Upakowanie kapilarne w bombie ciśnieniowej
UWAGA: Zawsze noś okulary ochronne podczas pracy z bombą ciśnieniową. Nie noś rękawiczek. Znacznie zmniejszają one zmysł dotyku wymagany do prawidłowego obchodzenia się z naczyniami włosowatymi o małej średnicy i prowadzą do błędów.
<ol>
	<li>Umieścić fiolkę z sorbentem w bombie ciśnieniowej i mocno dokręcić wszystkie nakrętki.</li>
	<li>Rozpocznij obroty przy 60-100 obr./min.</li>
	<li>Włóż spiekaną lub ciągniętą kapilarę emitera do bomby: wepchnij ją na sam dół fiolki, a następnie podnieś ją o 2-3 mm i zamocuj nakrętkę. 
	UWAGA: Zastosuj minimalną wymaganą siłę, aby zamocować kapilarę, aby uniknąć uszkodzenia kapilary i tulejki. Najlepsze jest ręczne dokręcanie. Jeśli używany jest klucz imbusowy, należy użyć minimalnej siły wystarczającej do dokręcenia.</li>
	<li>Sprawdź, czy kapilara jest prawidłowo zamocowana - nie może być możliwości przesunięcia kapilary poprzez wyciągnięcie jej ręcznie.</li>
	<li>Bardzo powoli otwórz zawór bomby ciśnieniowej, trzymając otwarty koniec kapilary skierowany z dala od twarzy.</li>
	<li>Obserwuj początkowe etapy procesu pakowania. 
	UWAGA: Natychmiast po zwiększeniu ciśnienia sorbent wypełnia kapilarnę i staje się ona nieprzezroczysta na całej długości. Gdy tylko sorbent zacznie pakować się wewnątrz dystalnego końca, ciśnienie wsteczne wzrasta, przepływ zwalnia, a równomierna zawiesina sorbentowa wewnątrz kapilary przekształca się w kilka pakietów sorbentu oddzielonych szczelinami niezawierającymi sorbentu. Już upakowany sorbent jest widoczny jako gęsto zabarwiony, stale rosnący obszar.</li>
	<li>Obszary wypełnione sorbentem powinny znajdować się na wysokości co najmniej 70% długości kapilarnej z małymi przerwami wolnymi od sorbentu przez cały czas trwania procesu pakowania.</li>
	<li>Istnieje kilka typowych problemów, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu pakowania, które wymagają dostosowania ustawień w locie, aby utrzymać wydajne dostarczanie sorbentu do kapilary. 
	UWAGA: Więcej szczegółów na temat regulacji wydajności dostarczania sorbentu opisano w tabeli 3.
	<ol>
		<li>Problem 1: Gdy nowy sorbent przestanie wchodzić do kapilary, podczas gdy sorbent znajdujący się w środku nadal się porusza, wykonaj poniższe czynności. 
		UWAGA: Jest to najczęstszy problem. W większości przypadków wejście kapilarne jest blokowane przez samoagregujące się klastry sorbentu. Wykonaj następujące kroki jeden po drugim, aż przepływ sorbentu zostanie przywrócony, a następnie pomiń pozostałe kroki związane z problemem.
		<ol>
			<li>Zwiększ prędkość obrotową do 500 obr./min i natychmiast zmniejsz ją z powrotem do 60-100 obr./min. Zwykle przywraca przepływ sorbentu. Sprawdź, czy prędkość obrotowa wynosi co najmniej 60 obr./min przez pozostałą część procesu pakowania.</li>
			<li>Jeśli to nie pomoże, na krótko odpowietrz bombę pakującą i natychmiast zwiększ jej ciśnienie.</li>
			<li>Jeśli to nie pomoże lub zablokowanie nastąpi ponownie, zmień położenie kapilary wewnątrz warstwy sorbentu. Brak sorbentu może być spowodowany tym, że otwarty koniec kapilary znajduje się zbyt wysoko nad prętem magnetycznym, więc koniec kolumny go nie dotyka, lub kapilara wbija się w dno fiolki. Najpierw należy całkowicie odpowietrzyć bombę, poluzować nakrętkę, docisnąć kapilarnę do dna, a następnie pociągnąć ją 2 mm do tyłu. Zamocuj nakrętkę.</li>
			<li>Jeśli zablokowanie nie ustąpi, należy odpowietrzyć system, wyjąć fiolkę z sorbentem, odwirować i ponownie poddać działaniu sonikacji. Sprawdź przedni koniec kapilary pod kątem uszkodzeń pod mikroskopem i w razie potrzeby odetnij ~5 mm przedniego końca.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Problem 2: Gdy sorbent wypełnia tylko niewielką część kapilary długimi pustymi obszarami, wykonaj poniższe czynności.
		<ol>
			<li>Sprawdź prędkość obrotową. Jeśli obrót jest zbyt wolny, łamanie kopuły nie jest wystarczająco wydajne. Zwiększ prędkość obrotową do ~150 obr./min.</li>
			<li>Jeśli rotacja jest zbyt szybka, sorbent zostaje ponownie zawieszony w większej objętości fiolki, a lokalne stężenie sorbentu wokół wejścia do kolumny jest niskie. Zmniejsz prędkość obrotową do 60-100 obr./min.</li>
			<li>Sprawdź poziom sorbentu. Ten sam problem z małą ilością sorbentu w kapilarze obserwuje się, gdy w fiolce nie ma wystarczającej ilości sorbentu. Po zużyciu sorbentu należy napełnić fiolkę nowym sorbentem, aby utrzymać warstwę sorbentu na wysokości nie mniejszej niż 4 mm po osiadaniu wywołanym grawitacją.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj pakowanie kolumny, aż zostanie osiągnięta docelowa długość kolumny plus 5-7 cm.</li>
	<li>Zatrzymaj obrót i bardzo powoli rozhermetyzuj bombę.
	<ol>
		<li>Otwórz trochę zawór bomby i poczekaj, aż bańka pęknie w butelce z wodą. Następnie otwórz zawór nieco szerzej i ponownie poczekaj, aż pęcherzyk pęknie.</li>
		<li>Zmniejszaj ciśnienie stopniowo, aż gaz nie będzie wydostawał się z zaworu. 
		UWAGA: Nie należy od razu otwierać zaworu do końca, ponieważ doprowadzi to do powstania pęcherzyków wewnątrz kapilary i powrotu sorbentu do fiolki. Jeśli tak się stanie, zwiększ ciśnienie w bombie z powrotem i poczekaj, aż kolumna zostanie ponownie zapakowana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy gaz przestanie wypływać z zaworu odpowietrzającego, wyjmij wypełnioną kapilarnę z bomby ciśnieniowej. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby kolumna wyschła. Jeśli nie zostanie natychmiast podłączony do systemu HPLC w celu dalszego pakowania, umieść wypełnioną kapilarnę w magazynie, zanurzając ją w całości w 10% roztworze EtOH. Do przechowywania kapilarnego można użyć płynnego polipropylenowego pojemnika do przechowywania żywności. Odłączone kolumny HPLC są przechowywane w ten sam sposób.</li>
	<li>Jeżeli nie jest planowane dalsze pakowanie, wyjąć fiolkę z sorbentem z bomby i szczelnie ją zamknąć. Zachowaj go do dalszego pakowania kolumn.</li>
</ol>
5. Pakowanie w kolumnie HPLC
<ol>
	<li>Podłącz wypełnioną kapilarnę do systemu HPLC za pomocą połączenia HPLC.</li>
	<li>Rozpocznij przepływ przy 95% rozpuszczalniku B (80 lub 100% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego (FA)) pod ciśnieniem 250-300 barów. W przypadku kapilary z upakowaniem 40 cm należy użyć natężenia przepływu 200-300 nL/min. 
	UWAGA: Natężenie przepływu pakowania wynosi 200 nL/min dla kolumny 40-50 cm o średnicy wewnętrznej 100 μm wypełnionej sorbentem 2 μm. Niektóre inne rozmiary kolumn są wymienione w tabeli 4. Natężenia przepływu dla innych długości kolumn i ID są szacowane na podstawie bezpośredniej proporcjonalności między ciśnieniem zwrotnym a długością i przekrojem poprzecznym kolumny. Dokładne natężenie przepływu jest dostosowywane do rzeczywistej długości upakowania, która jest domyślnie dłuższa niż docelowa długość kolumny. Należy również pamiętać, że ciśnienie 300 bar jest ukierunkowane na fizyczną granicę ciśnienia połączenia HPLC. W przypadku przyłączy o wyższym ciśnieniu należy stosować wyższe natężenia przepływu aż do granicy ciśnienia przyłącza w celu szybszego pakowania.</li>
	<li>Uważaj, czy luźny sorbent wewnątrz kapilary jest pakowany i dodawany do całkowitej długości opakowania.</li>
	<li>Nie zatrzymując przepływu, zanurzyć korpus kolumny dwukrotnie w kąpieli sonicyjnej. 
	UWAGA: Nie zanurzaj końców kolumny i połączeń kapilarnych - tylko część korpusu kolumny. Etap sonikacji pomaga poprawić odtwarzalność kolumn, szczególnie w przypadku bardzo długich kolumn o długości >50 cm (dane niepublikowane); Dodaje to jednak losową szansę na pęknięcie samoorganizującej się fryty sorbentowej wewnątrz końca emitera kapilary ciągniętego emitera i całkowite zablokowanie kolumny. Podczas gdy sonikacja może być uniwersalnie stosowana do dowolnych kolumn ze spiekanym szkłem, sugerujemy sonikację kolumn z ciągniętym emiterem tylko dla długości kolumny > 50 cm.</li>
	<li>Gdy złoże sorbentu przestanie się kurczyć, zanurz korpus kolumny w kąpieli sonicyjnej dwa razy więcej, nie zatrzymując przepływu.</li>
	<li>Uruchom kolumnę na dodatkowe 10 minut przy 300 barach.</li>
	<li>Zatrzymaj przepływ, poczekaj, aż ciśnienie spadnie poniżej trzech barów i odłącz kolumnę.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo kolumnę pod kątem braku szczelin i przebarwień. Jeśli zostaną znalezione, sonikacja pod przepływem może być powtórzona. W przypadku eksperymentów krytycznych rozważ utworzenie nowej kolumny.</li>
	<li>Przytnij kolumnę na żądaną długość. 
	UWAGA: Prawidłowo wykonane cięcie jest warunkiem wstępnym wydajności kolumny. Wykonaj nacięcie w powłoce poliimidowej za pomocą rysika, częściowo rozbij kapilatę i rozsuń dwa kawałki.</li>
	<li>Wypoleruj przód kolumny na płytce ceramicznej lub folią docierającą.</li>
	<li>Podłącz ponownie kolumnę do systemu LC za pomocą połączenia UHPLC.</li>
	<li>Rozpocznij robocze natężenie przepływu od 2% B w zależności od ID kolumny zgodnie z tabelą 4. Poczekaj, aż ciśnienie się wyrówna i sprawdź ciśnienie wsteczne kolumny. 
	UWAGA: Robocze natężenie przepływu jest regulowane zgodnie z parametrami kolumny. Na przykład kolumna o średnicy wewnętrznej 100 μm o długości 30 cm jest uruchamiana z prędkością 500 nL/min.</li>
	<li>Upewnij się, że przeciwciśnienie mieści się w granicach 5% oczekiwanej wartości (patrz Tabela 5), co potwierdza, że kolumna jest prawidłowo zapakowana i gotowa do użycia. 
	UWAGA: Przeciwciśnienie kolumny to całkowite ciśnienie w kanale gradientowym systemu HPLC z podłączoną kolumną pomniejszone o przeciwciśnienie kapilar przed kolumną. Jednocześnie wartości w tabeli 5 są arbitralne (dają arbitralną skalę tego, czego można się spodziewać). Wewnątrzlaboratoryjne podobieństwo ciśnienia zwrotnego między kolumnami jest ważniejszym wskaźnikiem, że wszystko działa poprawnie. Rzeczywiste bezwzględne ciśnienie wsteczne zależy od wielu parametrów, takich jak wielkość i charakterystyka sorbentu, średnica kapilarna, producent i partia, kształt wciąganego końca emitera lub gęstość i długość fryty szklanej, charakterystyka rozpuszczalnika i temperatura otoczenia w pomieszczeniu itp. Jeśli ciśnienie wsteczne jest zbyt wysokie, zapoznaj się z tabelą 1, aby zapoznać się z możliwymi problemami.</li>
</ol>

<ol><li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Now%2C+more+than+ever%2C+proteomics+needs+better+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Now, more than ever, proteomics needs better chromatography.</a> Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).</li>
<li>Shliaha, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomic+analyses+with+ion+mobility+separations+of+endogenous+isomeric+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).</li>
<li>Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview">https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview</a> (2021).</li>
<li>Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlashPack%3A+Fast+and+simple+preparation+of+ultrahigh-performance+capillary+columns+for+LC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).</li>
<li>MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-pressure+reversed-phase+liquid+chromatography+in+packed+capillary+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns.</a> Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).</li>
<li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slurry+concentration+effects+on+the+bed+morphology+and+separation+efficiency+of+capillaries+packed+with+sub-2+%C2%B5m+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles.</a> Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).</li>
<li>Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+high+slurry+concentration+and+sonication+to+pack+high-efficiency%2C+meter-long+capillary+ultrahigh+pressure+liquid+chromatography+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns.</a> Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).</li>
<li>Andrzejczak, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+phytoglobin+overexpression+on+the+plant+proteome+during+nonhost+response+of+barley+%28Hordeum+vulgare%29+to+wheat+powdery+mildew+%28Blumeria+graminis+f.+sp.+tritici%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici).</a> Scientific Reports. 10 (1), 9192(2020).</li>
<li>Elchaninov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+transcriptome%2C+proteome%2C+and+miRNA+profile+of+kupffer+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes.</a> Biomedicines. 8 (12), 627(2020).</li>
<li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequences+of+Hirudo+medicinalis+and+salivary+transcriptome+of+three+closely+related+medicinal+leeches%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches.</a> BMC Genomics. 21 (1), 331(2020).</li>
<li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unusual+peptides+with+new+Cys+frameworks+in+the+venom+of+the+cold-water+sea+anemone+Cnidopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14534(2017).</li>
<li>Loughran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusually+efficient+CUG+initiation+of+an+overlapping+reading+frame+in+POLG+mRNA+yields+novel+protein+POLGARF%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).</li>
<li>Radzisheuskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+methylome+profiling+uncovers+a+direct+link+to+splicing+regulation+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).</li>
<li>Rubtsova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encoded+in+human+telomerase+RNA+is+involved+in+cell+protective+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).</li>
<li>Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-made+frits+for+nanoscale+columns+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Self-made frits for nanoscale columns in proteomics.</a> PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).</li>
<li>Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcolumns+with+self-assembled+particle+frits+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics.</a> Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).</li>
<li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+pressure+%28%3E30%2C000+psi%29+packing+of+capillary+columns+enhancing+depth+of+shotgun+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Własne pakowanie kolumn kapilarnych jest bardzo popularne w dużych laboratoriach pracujących nad wieloma niezależnymi projektami. Jednak powszechna metoda pakowania z zawiesiny sorbentu o niskim stężeniu ma poważne ograniczenia prędkości i nie jest w stanie wytworzyć długich kolumn UHPLC.
FlashPack jest modyfikacją standardowej procedury pakowania, która umożliwia pakowanie z bardzo wysokiego stężenia sorbentu. Podstawą teoretyczną metody jest ciągła destabilizacja żeliwiaka sorbentu na wejściu do kolumny przez cały okres upakowania. To ostatnie osiąga się technicznie poprzez ciągłe uderzanie w wejście kolumny prętem magnetycznym. Metoda destabilizacji żeliwiaka została celowo opracowana tak, aby konfiguracja pakowania była całkowicie podobna do zwykłego procesu pakowania, ale sztuczka FlashPack polega na szczegółach przygotowania zawiesiny sorbentowej, pozycjonowaniu kapilarnym i użyciu pręta magnetycznego podczas procesu pakowania.
Jęczynę sorbentową przygotowuje się jako warstwę sorbentu osadowego w dużej objętości rozpuszczalnika. Interesujące jest to, że uszczelnienie oparte na bombie ciśnieniowej nie wymaga takich samych warunków pakowania dla każdej kolumny. W FlashPack nigdy nie znamy dokładnego stężenia gnojowicy sorbentowej wokół wejścia do kolumny. Nie można go dokładnie zmierzyć i kontrolować, ponieważ zmienia się również podczas procesu pakowania. Jednak końcowe kolumny są nadal bardzo powtarzalne4 niezależnie od tego, w jaki sposób uzyskano uszczelnienie.
Podstawą szybkiego pakowania jest skuteczna destabilizacja żeliwiaka z sorbentu. Z tego powodu ważne jest kontrolowanie przedostawania się sorbentu do kapilary i utrzymanie optymalnych warunków destabilizacji żeliwiaka przez cały okres pakowania. Istnieje kilka możliwych problemów, które mogą uniemożliwić skuteczne dostarczanie sorbentu. Niektóre przykłady to ponowne zawieszenie warstwy sorbentu przez szybki obrót pręta magnetycznego, nieefektywna destabilizacja żeliwiaka spowodowana niewłaściwym względnym położeniem pręta magnetycznego lub zbyt wolnym obrotem pręta magnetycznego. Same kwestie i sposób ich rozwiązania zostały szczegółowo omówione w części poświęconej protokołowi.
Po upakowaniu kolumny głównym parametrem kolumny, który należy sprawdzić, jest ciśnienie zwrotne kolumny. Wartości ciśnienia podane w tabeli 5 stanowią punkt odniesienia do tego, co jest oczekiwane dla jednego z popularnych sorbentów o rozmiarze kulki poniżej 2 μm - ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). W tym samym czasie dodatkowe przeciwciśnienie może być dodane przez frytę lub zbyt wąsko naciągnięty emiter i należy to stale monitorować. Jeśli pakowanie odbywa się w ciągniętym emiterze, nadal sugerujemy zmierzenie oczekiwanego ciśnienia wstecznego kolumny dla konkretnego używanego sorbentu poprzez upakowanie najpierw spiekanych kapilarn, a następnie sprawdzenie, czy fryta samoorganizująca się nie dodaje zbyt dużo. W przypadku problemów z wysokim ciśnieniem należy skorzystać ze wskazówek podanych w Tabeli 1 , aby określić problem.
Z naszego doświadczenia wynika, że wypełniona kolumna bez przebarwień, szczelin i przy odpowiednim przeciwciśnieniu działa w 100% przypadków i daje jakość separacji zbliżoną do tej, jakiej można oczekiwać po długości kolumny i charakterystyce sorbentu. Kolumna z przebarwieniami nie gwarantuje prawidłowego działania, ale mimo to może dać zadowalające efekty.
W większości przypadków, jeśli występują jakiekolwiek problemy z jakością separacji, nie pochodzą one z samej kolumny, ale raczej z innych części systemu separacji, a mianowicie pomp, rozpuszczalników lub połączeń. Szczególnie potencjalnie szkodliwe są wszelkie połączenia po kolumnie. Złe połączenie z objętością martwą między emiterem a spiekaną kolumną prowadzi do znacznego poszerzenia piku i ogonowania z powodu bardzo niskich natężeń przepływu w chromatografii kapilarnej.
Jeszcze jedną ważną kwestią charakterystyczną dla podejścia FlashPack jest to, że wykorzystuje ono wiele drogich sorbentów w działającej fiolce z zawiesiną sorbentową. Należy pamiętać, że zawiesina sorbentowa zawarta w pakiecie FlashPack jest przeznaczona do wielokrotnego użytku. Zadbaj o sorbent. Unikaj niepotrzebnego mieszania pręta magnetycznego, aby zmniejszyć mielenie sorbentu - pamiętaj, aby zatrzymać obrót, gdy tylko uszczelnienie zostanie zakończone. I nie pozostawiać otwartej fiolki z sorbentem w bombie ciśnieniowej, aby uniknąć wysuszenia sorbentu. Chociaż sorbent może być nadal używany po tym czasie, potrzeba czasu, aby ponownie przygotować zawiesinę sorbentu.
Metoda sprawdza się równie dobrze zarówno w przypadku naczyń włosowatych spiekanych, jak i naczyń włosowatych z emiterem wciągniętym. Zasada FlashPack zwiększa szybkość upakowania dla średnic kapilarnych z 20 do 250 μm (mniejsze i większe nie były testowane). Ma to również zastosowanie do wszystkich sorbentów, zarówno pełnych, jak i powierzchownie porowatych, które mogliśmy przetestować (odzwierciedlając, że tworzenie się żeliwiaka sorbentu w wysokim stężeniu zawiesiny sorbentowej nie ogranicza się konkretnie do sorbentów RP). Poza tym parametry rozpuszczalnika wyraźnie wpływają na uszczelnienie zgodnie z ich właściwościami fizycznymi i chemicznymi. Na przykład aceton o mniejszej lepkości zapewnia jeszcze wyższą szybkość upakowania niż metanol przy tym samym ciśnieniu upakowania. Jest jednak również mniej polarny niż metanol i zmniejsza sklejanie się cząsteczek sorbentu. Efekt sam w sobie zapobiega tworzeniu się żeliwiaka sorbentowego na początku upakowania, gdy natężenie przepływu jest jeszcze wysokie. Jednak zmniejszenie interakcji cząstek sorbentu prowadzi również do mniej niezawodnego tworzenia się fryty samoorganizującej się i częstszego blokowania ciągniętych końcówek podczas pakowania. Tak więc, podczas gdy aceton jest lepszy do wypełniania spiekanych kapilarn, jest mniej odpowiedni dla kapilar z ciągnącą emiterem, przy czym metanol jako rozpuszczalnik zawiesinowy jest wolniejszy, ale nadaje się do obu rodzajów zakończeń. Pakowanie z heksanu lub dichlorometanu (DCM) to skrajne przypadki przejścia z metanolu na aceton: są one jeszcze mniej polarne, więc całkowicie zapobiegają tworzeniu się żeliwiaka sorbentowego, jednak w ogóle nie nadają się do pakowania z emiterem ciągniętym. Poza tym zauważono, że wyjątkowo niska polaryzacja DCM prowadzi do przywierania cząstek sorbentu do wewnętrznej ścianki kapilary i tworzenia na niej grubej warstwy. Grubość warstwy stopniowo rośnie i tworzą się losowe bloki lokalne, w wyniku czego kolumna jest upakowana w kilka części oddzielonych obszarami bez sorbentu. Taki efekt zaobserwowano dla sorbentu C18 Peptide Aeris.
Innym zaobserwowanym problemem było to, że sorbent YMC Triart C18 nie był prawidłowo zawieszony w metanolu, ale tworzył pewnego rodzaju płatki. Nie przeszkadza to jednak w pakowaniu go z pakietem FlashPack i zapewnianiu bardzo przyzwoitej wydajności separacji (dane niepublikowane). Tak więc, choć w niektórych przypadkach nie był optymalny, metanol był najbardziej uniwersalnym rozpuszczalnikiem do pracy dla wszystkich badanych sorbentów i kolumn. Należy wspomnieć, że nie analizowaliśmy jeszcze, w jaki sposób różne rozpuszczalniki zawiesinowe wpływają na skuteczność separacji kolumn. Jednocześnie wydajność kolumn wypełnionych metanolem jest już całkowicie równa kolumnom komercyjnym dla tych samych sorbentów4.
FlashPack nie jest jedynym istniejącym podejściem mającym na celu poprawę szybkości upakowania kolumn UHPLC. Szybkie pakowanie z wysokiego stężenia zawiesiny sorbentowej jest również możliwe dzięki zastosowaniu uszczelnienia ultra-wysokociśnieniowego7. Zaletą FlashPack jest to, że jest znacznie prostszy, ponieważ nie wymaga specjalnych pomp ultrawysokociśnieniowych i bomb ciśnieniowych do dostarczania sorbentu i połączeń kapilarnych. Jednocześnie wykazano, że kolumny upakowane pod ekstremalnymi ciśnieniami mogą mieć wyższą skuteczność separacji niż kolumny wypełnione niższym ciśnieniem17. I o ile FlashPack produkuje kolumny identyczne z komercyjnymi użytymi w porównaniu4, dla których nie znamy metody pakowania, o tyle nie przetestowano jeszcze, jak kolumny FlashPack wypadają w porównaniu z kolumnami upakowanymi pod ultra wysokim ciśnieniem.
Podsumowując, opisaną metodę FlashPack można łatwo dostosować do istniejącego protokołu pakowania w laboratorium z pewnymi poprawkami do protokołu, podczas gdy konfiguracja pozostaje całkowicie taka sama. Przyspiesza to napełnianie kolumn kapilarnych HPLC do kilku minut i umożliwia produkcję długich kolumn kapilarnych UHP, co jest oczywiście niemożliwe przy standardowej procedurze pakowania. Ogólna oszczędność czasu i pieniędzy dla laboratorium dzięki zastosowaniu podejścia FlashPack może być liczona w dziesiątkach tysięcy euro rocznie. Dodatkowo, możliwość lokalnej produkcji kolumn kapilarnych UHP otwiera możliwości personalizacji eksperymentów, które są niemożliwe do uzyskania przy użyciu dostępnych produktów komercyjnych.

Nowoczesna proteomika opiera się na spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową z ultra-wysokowydajną chromatografią nanoprzepływową (50-150 μm wewnętrzna średnica kolumny (ID)) zapewniającą najlepszą szybkość i czułość analizy1. Chociaż dostępnych jest wiele komercyjnych kolumn kapilarnych UHPLC, ich cena stanowi znaczną część kosztów materiałów eksploatacyjnych, zwłaszcza gdy w laboratorium prowadzonych jest wiele różnych projektów, a zanieczyszczenie kolumn specyficzne dla projektu jest częstym problemem. Poza tym, pakowanie kolumn we własnym zakresie pozwala na użycie niestandardowych sorbentów specyficznych dla eksperymentu (takich jak np. polyCAT-A sorbent2) oraz charakterystyk kolumn niedostępnych do kupienia jako gotowa kolumna.
Aby sobie z tym poradzić, wiele laboratoriów wyposaża kolumny kapilarne we własnym zakresie. Jednak powszechna procedura pakowania z bombą ciśnieniową o ciśnieniu 100 bar (komórka wtrysku ciśnieniowego) 3 nie nadaje się do wypełnienia kolumny UHPLC ze względu na wysokie ciśnienie wsteczne sorbentów UHPLC poniżej 2 μm, co skutkuje dramatycznym zmniejszeniem szybkości upakowania w porównaniu z sorbentami HPLC o większych rozmiarach. Podczas gdy krótkie kolumny UHPLC mogą być nadal bardzo wolno pakowane, produkcja długich kolumn UHPLC jest fizycznie niemożliwa4.
Standardowe napełnianie kolumn kapilarnych odbywa się przy stosunkowo niskich ciśnieniach - do 100 barów i przy bardzo niskim stężeniu zawiesiny sorbentowej. W związku z tym dostępne są dwa możliwe kierunki przyspieszenia tego procesu. Możliwe jest zwiększenie ciśnienia w opakowaniu5. Wymaga to jednak specjalnego sprzętu i praktycznie zainstalowania nowej metody w laboratorium. Innym sposobem jest zwiększenie stężenia zawiesiny sorbentowej6. Uszczelnienie zawiesiny o wysokim stężeniu sorbentu zostało opisane w połączeniu z bardzo wysokim ciśnieniem upakowania w poprzedniej publikacji7. Jednak przy ciśnieniu 100 barów, które jest stosowane w większości istniejących bomb do pakowania, wyższe stężenie sorbentu powoduje albo spowolnienie szybkości upakowania, albo całkowite zaprzestanie pakowania. Niedawno zademonstrowano, że efekt ten jest spowodowany grupowaniem się sorbentu przy wejściu do kolumny, a prosta sztuczka destabilizacji kopuły sorbentu poprzez uderzenie w wejście do kolumny prętem magnetycznym wewnątrz fiolki z sorbentem została zasugerowana4. Powstała metoda, nazwana FlashPack, wykorzystuje tę samą konfigurację pakowania bomb ciśnieniowych o ciśnieniu 100 barów. Jednocześnie niewielkie, ale krytyczne zmiany w procedurze pakowania pozwalają na pakowanie z bardzo wysokiego stężenia zawiesiny sorbentowej i produkcję bardzo długich kolumn UHPLC (od 50 do 70 cm i dłuższych) w czasie krótszym niż godzina, podczas gdy krótka kolumna może być wyprodukowana w ciągu kilku minut z jakością separacji równą kolumnom handlowym o tych samych parametrach4. Podejście FlashPack zostało już z powodzeniem wykorzystane w wielu projektach proteomicznych do przygotowania zarówno fazy odwróconej (RP)8,9,10,11,12,13,14 oraz interakcji hydrofilowej (HILIC)2 kolumny kapilarne.
Tutaj szczegółowo opisujemy modyfikacje potrzebne do dostosowania podejścia FlashPack do standardowej procedury pakowania bomb ciśnieniowych 100 bar.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl z 0,1% (v/v) kwasem mrówkowym</td><td>Merck</td><td>1.59002</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówkowa 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczny wafel nacinający</td><td>Restek</td><td>20116</td><td>każdy wafel ceramiczny nadaje się do polerowania kapilarnego</td></tr><tr><td>Rysik z wiórkami diamentowymi</td><td>NewObjective</td><td>Rysik z tarczą diamentową</td><td>zalecany do cięcia</td></tr> <tr><td>kapilarnegokapilara z topionej krzemionki 100 mm ID 375 mm OD</td><td>CM Scientific</td><td>TSP100375</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki GELoader</td> System HPLC <td>Eppendorf</td><td>30001222</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz</td> laserowy <td>ThermoScientific</td><td>Ultimate3000 RSLCnano</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Listwa magnetyczna Sutter</td><td>P2000/F</td><td></td></tr><tr><td>2x5 mm</td><td>Merck</td><td>Z283819</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Merck</td><td>1.06018</td><td></td></tr><tr><td>mikroszpatułka</td><td>Merck</td><td>Z193216</td><td></td></tr><tr><td>Tulejka PEEK 360 mm</td><td>VICI</td><td>JR-C360NFPK</td><td>służy do podłączenia kolumny do końcówki pipety UPLC złączka</td></tr><tr><td>, 1000 uL</td> Pipeta <td>Merck</td><td>Z740095</td><td></td></tr><tr><td>, 1000 uL</td><td>Gilson</td><td>Pipetman L P1000L</td><td></td></tr> bomba <tr><td>ciśnieniowa</td><td>NextAdvance</td><td>PC-77 regulator MAG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GCE</td><td>Jetcontrol 600 200/103</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1,9 mm</td><td>Dr. Maisch</td><td>r13.aq.0001</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z nakrętką bez nakrętek, stożkowe dno, wolnostojące, 0,5 mL</td><td>Merck</td><td>AXYST050SS</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z nakrętką bez nakrętek, stożkowe dno, wolnostojące, 1,5 ml</td><td>Merck</td><td>AXYST150SS</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki z O-ringami</td><td>Merck</td><td>AXYSCOC</td><td></td></tr>kąpiel <tr><td>sonikacyjna</td>, <td>Elma</td><td>Elmasonic S30 H</td><td></td></tr><tr><td>union HPLC</td><td>VICI</td><td>JR-C360RU1PK6</td><td>HPLC przyłącze od 1/16 OD kapilary HPLC do 360 um złącze kolumny kapilarnej</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>VICI</td><td>JR-C360RU1FS6</td><td>Przyłącze UPLC od 1/16 OD kapilary HPLC do 360 um wir kolumny kapilarnej</td></tr><tr><td></td><td>BioSan</td><td>V-1plus</td><td></td></tr><tr><td>Woda z 0,1% (v/v) kwasem mrówkowym</td><td>Merck</td><td>Numer katalogowy: 1.59013</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu flashpack

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Kapilarna ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa (UHPLC) jest obecnie metodą wyboru dla etapu separacji próbek w proteomice opartej na LC-MS. Jednak kolumny kapilarne są znacznie mniej wytrzymałe w porównaniu z ich przeciwstawnymi typami o wyższym przepływie. Ze względu na łatwe zanieczyszczenie i blokowanie często wymagają wymiany. To sprawia, że są one znacznie droższą częścią całkowitego kosztu analizy LC-MS. Własne pakowanie kolumn kapilarnych UHPLC pozwala zaoszczędzić dużo pieniędzy i umożliwia dostosowanie do indywidualnych potrzeb. Jednak standardowa procedura pakowania w bombie ciśnieniowej o ciśnieniu 100 barów działa dobrze tylko w przypadku kolumn HPLC, ale jest zbyt wolna w przypadku sorbentów UHPLC. W tym miejscu przedstawiamy opis zoptymalizowanego protokołu FlashPack zastosowanego do tej samej konfiguracji bomby ciśnieniowej o ciśnieniu 100 barów. Metoda opiera się na pakowaniu z zawiesiny o bardzo wysokim stężeniu sorbentu i została opracowana do własnej produkcji kolumn kapilarnych UHPLC o nieograniczonej długości w rozsądnym czasie.

Metoda FlashPack opiera się na standardowej konfiguracji upakowywania i wykorzystuje ten sam proces upakowywania. Upakowywanie odbywa się w standardowych kapilarach emitera z fritem lub z wyciągniętym końcem. Główna optymalizacja polega na stężeniu zawiesiny sorbentu: standardowa metoda jest niekompatybilna z wysokostężoną zawiesiną sorbentu stosowaną w FlashPack. Wynikiem jest szybka metoda produkcji długich kolumn UHPLC, na przykład kolumny o długości 50 cm upakowanej sorbentem 1.9 µm w czasie krótszym niż 1 h (Rycina 2).
Aby zademonstrować zastosowanie podejścia FlashPack, przygotowano kolumnę kapilarną o długości 30 cm i średnicy wewnętrznej (ID) 100 µm (Tabela 6). Pakowanie sorbentu ReprosilPur C18 1,9 µm przeprowadzono pod ciśnieniem 60 barów do kapilary z wyciągniętym emiterem o długości 50 cm i ID 100 µm, przygotowanej za pomocą laserowego wyciągacza P2000. Kapilara została upakowana do długości ~40 cm w ciągu 40 min, przy czym wewnątrz kapilary pozostawiono nieco luźniejszego sorbentu. Upakowaną kapilarę podłączono do systemu HPLC i przepuszczono przez nią rozpuszczalnik B (80% acetonitrile, 0,1% FA) z przepływem 300 nL/min. Po dwóch cyklach 5-sekundowej sonikacji końcowa długość upakowania wyniosła 43 cm. Kolumnę odłączono, przycięto do 30 cm i podłączono do systemu HPLC za pomocą złącza UHPLC. Rutynowo stosujemy nakrętkę i pierścień z PEEK o średnicy 360 µm (sleeveless) oraz stalowe złącze o średnicy 360 µm. Taka kombinacja wytrzymuje ciśnienie do co najmniej 700 barów przy mocnym dokręceniu. Wytworzona kolumna wykazuje ciśnienie wsteczne wynoszące 520 barów przy 2% rozpuszczalnika B i przepływie 500 nL/min, co jest zgodne z oczekiwanym zakresem wartości (Tabela 5).
W celu zademonstrowania sprawności kolumny, wykorzystano wykonaną kolumnę o długości 30 cm do rozdziału 50 fmol trawionego trypsyną białka cytochromu C w 15-minutowym gradiencie od 2% do 50% B. Ekstrahowane chromatogramy jonowe wykazały, że piki są wysoce symetryczne z minimalnym rozmyciem (tailingiem). Średnia wartość FWHM wynosiła około 3 s (Rycina 3).
Tabela 1: Rozwiązywanie problemów w przypadku wysokiego ciśnienia wstecznego kolumny podczas pracy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Program wyciągarki laserowej P2000/F. Program wyciągarki laserowej P2000/F do przygotowania wyciągniętych kapilar emitujących z kapilar z krzemionki topionej powlekanych polimidem o średnicy zewnętrznej (OD) 360 µm i średnicy wewnętrznej (ID) 100 µm, bez powłoki wewnętrznej, w temperaturze pokojowej 23-25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Problemy z pakowaniem specyficzne dla FlashPack oraz punkty kontrolne do weryfikacji podczas procesu pakowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Przykładowe szybkości przepływu podczas pakowania i pracy dla różnych średnic wewnętrznych i długości kolumn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Przewidywane ciśnienie wsteczne dla kolumny wypełnionej 2 µsorbenty sferyczne i prowadzić proces z zastosowaniem roboczego przepływu (zgodnie z wewnętrzną średnicą kolumny) w układzie rozpuszczalników RP w temperaturze pokojowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Przykładowe upakowanie kolumny UHPLC 30 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<img alt="Pakowanie kolumny za pomocą bomby ciśnieniowej; schemat układu chromatograficznego; etapy podłączenia HPLC i UPLC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat pakowania kolumny kapilarnej. Etapy od 1 do 3 są fazami przygotowawczymi, po których następuje pakowanie w bombzie ciśnieniowej, a proces kończy się podłączeniem do układu HPLC. Etapy 3 i 4 zostały zmodyfikowane dla ultrawydajnego protokołu FlashPack. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tworzenie upakowanej kolumny; wykres; długość upakowania w funkcji czasu; analiza systemu chromatograficznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Szybkość upakowania dla kapilary z fritem o średnicy wewnętrznej 100 µm z ReprosilPur C18 AQ 1,9 µm przy 100 barach w metanolu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres chromatografii ze spektrometrią mas pokazujący względną obfitość w funkcji czasu retencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ekstrahowane chromatogramy jonowe peptydów tryptycznych cytochromu C. Ekstrahowane chromatogramy jonowe peptydów tryptycznych cytochromu C po rozdziale 50 fmol w kolumnie kapilarnej z wyciągniętym emiterem o długości 30 cm i średnicy wewnętrznej 100 mm, wypełnionej ReprosilPur C18 AQ 1.9 µm, w gradiencie buforu B (80% acetonitrile, 0.1% FA) i buforu A (2% acetonitrile, 0.1% FA) od 2% do 40% B w czasie 15 min przy przepływie 500 nL/min w RT. Detekcję przeprowadzono przy użyciu spektrometru mas. Intensywności bezwzględne i ekstrahowane zakresy m/z dla każdego peptydu przedstawiono po prawej stronie widm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół dla zoptymalizowanej procedury pakowania kolumn kapilarnych FlashPack. Zastosowanie zoptymalizowanego protokołu do powszechnej konfiguracji bomby ciśnieniowej 100 bar pozwala na 10-krotnie szybsze pakowanie i produkcję długich, ultra wysokowydajnych kolumn kapilarnych.

Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Prosta, wewnętrzna, bardzo wydajna produkcja kolumn kapilarnych z podejściem FlashPack. Celem tej procedury jest wprowadzenie zoptymalizowanego protokołu do szybkiego i łatwego napełniania ultra wysokowydajnych kolumn kapilarnych do analizy proteomicznej LC-MS. Nowoczesna proteomika opiera się na spektrometrii mas sprzężonej z ultra-wysokowydajną kapilarną chromatografią cieczową.Separacja peptydów odbywa się najczęściej w kolumnach kapilarnych o średnicy wewnętrznej 75 mikrometrów. Na równi z produktami komercyjnymi możliwe jest przygotowanie kolumn kapilarnych we własnym zakresie. Specjalnie przygotowane kolumny wykazują właściwości separacji podobne do analogii handlowych, jednocześnie oszczędzając dużo pieniędzy i umożliwiając dostosowanie sorbentu i rozmiaru kolumny.W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną procedurę pakowania do własnej produkcji kolumn kapilarnych, którą nazywamy FlashPack. Ideą stojącą za optymalizacją jest pakowanie z bardzo wysokiego stężenia zawiesiny sorbentowej, przy jednoczesnym użyciu tej samej popularnej konfiguracji pakowania bomb ciśnieniowych 100 barów. Wymaga to ciągłego rozbijania klastrów sorbentu, które tworzą się wokół wejścia do kolumny przy wysokim stężeniu sorbentu i zapobiegają przedostawaniu się nowego materiału sorbentowego do kapilary.Technicznie rzecz biorąc, osiągamy to za pomocą pręta magnetycznego jako młotka, stale podgrzewającego i poruszającego się po kapilarze wewnątrz drutu sorbentowego. Prawidłowo zastosowany FlashPack zwiększa szybkość pakowania nawet 10-krotnie. To sprawia, że nadaje się do pakowania ultra wysokowydajnych sorbentów o bardziej miękkim rozmiarze mikrometrycznym oraz do produkcji bardzo długich kolumn o długości do metra w rozsądnym czasie.Procedura przygotowania kolumny składa się z pięciu kroków. Trzy etapy przygotowawcze, które obejmują montaż stacji pakowania oraz przygotowanie zawiesiny kapilarnej i sorbentowej. Następnie kapilara jest najpierw pakowana do bomby ciśnieniowej pod ciśnieniem od 60 do 100 barów.Następnie następuje podłączenie wypełnionej kapilary do systemu HPLC, napakowanie sorbentu pod wysokim ciśnieniem i cięcie kolumny do odpowiedniego rozmiaru. Procedura FlashPack wymaga wprowadzenia zmian w krokach trzecim i czwartym wspólnego protokołu. W pierwszej kolejności przygotowujemy stanowisko do pakowania.Składa się ze zbiornika azotu o ciśnieniu wylotowym co najmniej 50 barów. Zbiornik jest podłączony do zaworu odpowietrzającego bomby ciśnieniowej, który jest umieszczony w mieszadle magnetycznym. Wylot zaworu odpowietrzającego jest wkładany do butelki z wodą przez wąską kapilarnę ID PEEK, co umożliwia precyzyjną kontrolę rozhermetyzowania.Następnie przygotowujemy kapilarę. Pakowanie może odbywać się w spiekanej kapilarze ze zintegrowaną frytą szklaną utworzoną z Kasilu i formamidu. Inną opcją jest zapakowanie się w kapilarnę przyciągniętą przygotowaną przez ściągacz laserowy Sutter.Kapilara musi być o 10 do 15 centymetrów dłuższa niż planowana długość kolumny. Poniższy film jest przygotowany na przykładzie wypełnienia kapilarnego z ciągniętym emiterem. Zabezpiecz wyciągniętą końcówkę emitera za pomocą przeciętej końcówki pipety z żelem.Szczegółowe informacje znajdują się w wersji tekstowej manuskryptu. Kolejnym etapem jest przygotowanie gnojowicy sorbentowej. Najpierw umieść około 50 miligramów suchego sorbentu w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej.Będzie to standardowa fiolka z sorbentem. Film ten został przygotowany przy użyciu sorbentu mikrometrycznego Reprosil Pur C18 AQ 1.9 firmy Dr.Maisch. Dodać jeden mililitr metanolu do podstawowej fiolki z sorbentem.Wiruj przez 10 sekund. I sonikować w kąpieli sonicyjnej przez kolejne 10 sekund. Pozwól sorbentowi dokładnie namoczyć się przez 20 do 30 minut, a następnie zwiruj i ponownie poddaj sonikacji.Przygotować działającą fiolkę z sorbentem. Musi to być fiolka ze stożkowym dnem, która pasuje do bomby. Może to być kolejna 1,5-mililitrowa probówka wirówkowa lub dowolna inna fiolka, w zależności od konkretnej konstrukcji bomby ciśnieniowej.Używamy listwy stożkowej dolnej z nakrętką przyciętą do wysokości bomby ciśnieniowej. Ponownie zawiesić sorbent w podstawowej fiolce sorbentowej i przenieść 500 mikrolitrów do działającej fiolki sorbentowej wraz z prętem magnetycznym o rozmiarze dwa na trzy milimetry. Udekorować do fiolki roboczej na jeden mililitr z metanolem.Pozostaw fiolkę roboczą na stole na 10 minut, aby sorbent osiadł grawitacyjnie. Wynikiem tego etapu musi być stożkowa dolna fiolka z dolną warstwą luźnego sorbentu o wysokości około czterech milimetrów. Jeśli warstwa jest zbyt niska, i trochę więcej sorbentu z fiolki podstawowej.Tak przygotowana fiolka robocza przeznaczona jest do przygotowania wielu kolumn przez wiele miesięcy. Jeśli działająca fiolka z sorbentem pozostaje bez mieszania przez ponad dwie godziny, przed zapakowaniem musi zostać ponownie zawirowana, poddana sonikacji i osadzona grawitacyjnie. Gdy wszystko jest przygotowane, przejdź do etapu czwartego, pakując bombę ciśnieniową.Zawsze noś okulary ochronne podczas pracy z kapilarami ze stopionej krzemionki i bombą ciśnieniową. Jednocześnie nie zaleca się stosowania rękawic ochronnych. Znacznie zmniejszają one zmysł dotyku niezbędny do prawidłowego obchodzenia się z naczyniami włosowatymi o małej średnicy i prowadzą do błędów.Umieścić fiolkę z sorbentem w bombie ciśnieniowej i mocno zacisnąć wszystkie węzły. Rozpocznij rotację z prędkością od 60 do 100 rund na minutę, włóż spiekaną lub ciągniętą kapilarę emitera do bomby. Wepchnij go na samo dno fiolki, a następnie podnieś go o dwa do trzech milimetrów i zamocuj węzeł.Zastosuj minimalną wymaganą siłę, aby zamocować kapilarę. Sprawdź, czy kapilara jest prawidłowo zamocowana. Nie może być możliwe przesunięcie kapilary poprzez wyciągnięcie jej ręcznie.Bardzo powoli otwórz zawór bomby ciśnieniowej, trzymając otwarty koniec kapilary skierowany z dala od twarzy. Obserwuj początkowe etapy procesu pakowania. Natychmiast po zwiększeniu ciśnienia sorbent wypełnia kapilarnę i staje się ona nieprzezroczysta na całej długości.Gdy tylko sorbent zacznie pakować się w dystalny koniec, ciśnienie wsteczne wzrasta, przepływ zwalnia, a równomierna zawiesina sorbentowa wewnątrz kapilary przekształca się w kilka pakietów sorbentu, oddzielonych szczelinami wolnymi od sorbentu. Już upakowany sorbent jest widoczny jako gęsto zabarwiony, stale rosnący obszar. Obszary wypełnione sorbentem powinny znajdować się na wysokości co najmniej 70% długości kapilary z małymi przerwami wolnymi od sorbentu przez cały czas trwania procesu pakowania.Istnieje kilka typowych problemów, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu pakowania. Wymagają one regulacji ustawień w locie, aby utrzymać wydajne dostarczanie sorbentu do kapilary. Najczęstszym problemem jest sytuacja, w której nowy sorbent przestaje wnikać do kapilary, podczas gdy sorbent znajdujący się w środku nadal się porusza.W większości przypadków wejście do kapilar zostaje zablokowane przez samoagregujące się klastry sorbentu. Postępuj zgodnie z tymi krokami jeden po drugim, aż przepływ sorbentu zostanie przywrócony, a następnie pomiń pozostałe kroki związane z problemem. Zwiększ prędkość obrotową do 500 pocisków na minutę i natychmiast zmniejsz ją z powrotem do 60 pocisków na minutę.W większości przypadków przywraca przepływ sorbentu. Sprawdź, czy prędkość obrotowa wynosi co najmniej 60 obr./min przez pozostałą część procesu pakowania. Jeśli to nie pomoże, na krótko odpowietrz bombę pakującą i natychmiast zwiększ jej ciśnienie.Jeśli to nie pomoże lub zablokowanie nastąpi ponownie, zmień położenie kapilary wewnątrz warstwy sorbentu. Brak sorbentu może być spowodowany tym, że otwarty koniec kapilary znajduje się zbyt wysoko nad prętem magnetycznym, więc koniec kolumny go nie dotyka. Lub kapilara jest umieszczona zbyt nisko i wbija się w dno fiolki.Najpierw całkowicie odpowietrz bombę, następnie poluzuj nakrętkę, popchnij kapilarnę do dołu, a następnie pociągnij ją o dwa milimetry do tyłu. Zamocuj nakrętkę. Otwórz zawór, aby zwiększyć ciśnienie w bombie i kontynuuj pakowanie.Więcej szczegółów na temat problemów z pakowaniem jest opisanych w wersji tekstowej metody. Kontynuuj pakowanie kolumny, aż zostanie osiągnięta docelowa długość kolumny plus pięć do siedmiu centymetrów. Zatrzymaj obrót i bardzo powoli rozhermetyzuj bombę.Otwórz trochę zawór bomby i poczekaj, aż bańka pęknie w butelce z wodą. Następnie otwórz zawór nieco szerzej i ponownie poczekaj, aż pęcherzyk pęknie, aby zwolnić. Dlatego w krokach przyrostowych zmniejszaj ciśnienie, aż gaz nie wydostanie się z zaworu.Nie otwieraj zaworu do końca za jednym razem. Doprowadzi to do bulgotania wewnątrz naczynia włosowatego i powrotu sorbentu do fiolki. Jeśli tak się stanie, zwiększ ciśnienie w bombie z powrotem i poczekaj, aż kolumna zostanie ponownie zapakowana.Gdy gaz przestanie wydostawać się z zaworu odpowietrzającego, wyjmij wypełnioną kapilarnę z bomby ciśnieniowej. Nie pozwól, aby kolumna wyschła. Jeśli nie zostanie natychmiast podłączony do systemu HPLC w celu dalszego pakowania, umieść wypełnioną kapilarnę w magazynie, zanurzając ją w całości w 10% roztworze etanolu.Odłączone kolumny HPLC są przechowywane w ten sam sposób. Jeśli na dziś nie jest planowane dalsze pakowanie, wyjmij fiolkę z sorbentem z bomby i szczelnie ją zamknij. Zachowaj go do dalszego pakowania kolumny.Etap piąty, pakowanie HPLC. Podłącz wypełnioną kapilarnę do systemu HPLC za pomocą połączenia HPLC. Uruchom przepływ rozpuszczalnika o wysokiej zawartości rozpuszczalnika organicznego.Dostosuj przepływ zgodnie z długością opakowania, celując w około 300 barów. W przypadku kapilar wypełnionych 40 centymetrami należy użyć natężenia przepływu 200-300 normalnych litrów na minutę. Uważaj, czy w upakowanej kapilarze nie ma luźnego sorbentu, co zwiększa całkowitą długość upakowanego materiału.Nie zatrzymując przepływu, zanurzyć korpus kolumny dwa razy w kąpieli sonizacyjnej. Ważne jest, aby zanurzyć tylko część korpusu kolumny. Nie zanurzaj końców kolumn i połączeń kapilarnych.Gdy złoże sorbentu przestanie się kurczyć, zanurz korpus kolumny w kąpieli sonicyjnej dwa razy więcej, nie zatrzymując przepływu. Uruchom kolumnę na dodatkowe 10 minut przy 300 paskach. Zatrzymaj przepływ, poczekaj, aż ciśnienie spadnie poniżej trzech barów i odłącz kolumnę.Sprawdź wzrokowo kolumnę pod kątem braku szczelin i przebarwień. Jeśli zostaną znalezione, sonikacja pod przepływem może być powtórzona. W przypadku eksperymentów krytycznych rozważ utworzenie nowej kolumny.Przytnij kolumnę na żądaną długość. Prawidłowo wykonane cięcie jest warunkiem wstępnym wydajności kolumny. Wykonaj nacięcie w powłoce poliamidowej za pomocą rysika.Częściowo pęknij kapilatę i rozsuń dwa kawałki. Wypoleruj przód kolumny na płytce ceramicznej lub folią docierającą. Podłącz ponownie kolumnę do systemu LC za pomocą przyłącza ultra wysokiego ciśnienia.Rozpocznij robocze natężenie przepływu od 2%B. Robocze natężenie przepływu jest regulowane zgodnie z parametrami kolumny. Na przykład 100 mikrometrowych kolumn identyfikacyjnych pracuje z prędkością 500 nanolitrów na minutę.Poczekaj, aż ciśnienie się wyrówna i sprawdź przeciwciśnienie w kolumnie. Odpowiednio przygotowana kolumna daje przeciwciśnienie proporcjonalne do jej długości i charakterystyki sorbentu. Na przykład 30-centymetrowa kolumna kapilarna wypełniona sorbentem o dwóch mikrometrach ma przeciwciśnienie od 450 do 500 barów przy 2% rozpuszczalniku B. Jeśli wyprodukowana kolumna daje przeciwciśnienie w oczekiwanym zakresie, jest gotowa do użycia.Jeśli przeciwciśnienie znacznie wykracza poza oczekiwany zakres, coś jest nie tak z kolumną lub systemem LC. Pakowanie za pomocą FlashPack wytwarza kapilar wypełniony na 50 centymetrów sorbentem o wielkości 1,9 mikrometra w czasie krótszym niż jedna godzina przy ciśnieniu 100 barów. Na przykład produkujemy 30-centymetrową kolumnę ultrawysokociśnieniową o średnicy 100 mikrometrów ID, upakowaną w kapilarnę z ciągniętym emiterem z sorbentem ReprosilPur C18 AQ o średnicy 1,9 mikrometra.Pakowanie odbywało się przy 60 barach w 50-centymetrowej kapilarze z ciągniętym emiterem. Kapilara została wypełniona do 40 centymetrów w ciągu 40 minut, z niewielką ilością sorbentu wewnątrz kapilary, która nie była upakowana. Wypełniona kapilara została podłączona do systemu HPLC i pracowała z prędkością 300 nanolitrów na minutę z rozpuszczalnikiem B, który w naszym przypadku składał się z 80% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.Ostateczna długość po spakowaniu wynosiła 43 centymetry. Kolumna została przycięta o 30 centymetrów. Przy przepływie roboczym 500 nanolitrów na minutę z 99% rozpuszczalnikiem B kolumna dawała ciśnienie wsteczne 275 barów, co jest bliskie oczekiwanej wartości.Aby przetestować kolumnę, oddzieliliśmy 50 fmol tryptycznego trawienia białka cytochromu C w 15-minutowym gradiencie od 2-50% B. Piki chromatograficzne były wysoce symetryczne z minimalnym ogonowaniem. Średni FWHM wynosił około trzech sekund.Opisany protokół jest w stanie wyprodukować kolumny UHPLC w typowym opakowaniu 100 barów ustawionym w rozsądnym czasie. Krótkie kolumny HPLC lub UPLC można spakować w ciągu kilku minut, podczas gdy długie kolumny o długości 30-50 centymetrów są pakowane w mniej niż godzinę. Metoda ta jest skuteczna w pakowaniu sorbentów z RP i innymi chemikaliami do dowolnych identyfikatorów kolumn.Produkowane kolumny są powtarzalnie tak samo skuteczne, jak każda inna komercyjna kolumna o podobnej wielkości i parametrach sorbentu.

simple-house-ultra-high-performance-capillary-column-manufacturing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy dyskretny system wprowadzania próbek kropel do spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS). Opiera się na tanim i jednorazowym chipie mikroprzepływowym, który generuje wysoce monodyspersyjne kropelki w zakresie wielkości 40−60 μm przy częstotliwościach od 90 do 7 000 Hz.

Układ mikroprzepływowy do próbki ICPMS Wprowadzenie

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).

Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Tutaj prezentujemy protokół do działania i optymalizacji kolumny Active Flow Technology (AFT) w trybie Curtain flow (CF) dla zwiększenia wydajności separacji.

Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Opracowano zintegrowany autosampler i kolektor frakcji (LC-mate), aby zautomatyzować powtarzalne separacje HPLC. Kompatybilny z detektorami HPLC generującymi sygnały analogowe, LC-mate zwiększa wydajność systemów obsługiwanych ręcznie i przyspiesza procesy badawcze oparte na wysokowydajnej chromatografii cieczowej.

Automatyczne rozdzielanie HPLC z wykorzystaniem LC-Mate: zintegrowany powtarzalny automatyczny próbnik i kolektor frakcji do mikroskalowego oczyszczania

Poznaj metodę FlashPack do szybkiej produkcji kolumn kapilarnych UHPLC w laboratorium. Protokół zwiększa prędkość pakowania dziesięciokrotnie przy użyciu standardowej bomby ciśnieniowej 100 bar.

Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack

Przeglądaj więcej filmów