Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack

Prosta, wewnętrzna, bardzo wydajna produkcja kolumn kapilarnych z podejściem FlashPack. Celem tej procedury jest wprowadzenie zoptymalizowanego protokołu do szybkiego i łatwego napełniania ultra wysokowydajnych kolumn kapilarnych do analizy proteomicznej LC-MS. Nowoczesna proteomika opiera się na spektrometrii mas sprzężonej z ultra-wysokowydajną kapilarną chromatografią cieczową.

Separacja peptydów odbywa się najczęściej w kolumnach kapilarnych o średnicy wewnętrznej 75 mikrometrów. Na równi z produktami komercyjnymi możliwe jest przygotowanie kolumn kapilarnych we własnym zakresie. Specjalnie przygotowane kolumny wykazują właściwości separacji podobne do analogii handlowych, jednocześnie oszczędzając dużo pieniędzy i umożliwiając dostosowanie sorbentu i rozmiaru kolumny.

W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną procedurę pakowania do własnej produkcji kolumn kapilarnych, którą nazywamy FlashPack. Ideą stojącą za optymalizacją jest pakowanie z bardzo wysokiego stężenia zawiesiny sorbentowej, przy jednoczesnym użyciu tej samej popularnej konfiguracji pakowania bomb ciśnieniowych 100 barów. Wymaga to ciągłego rozbijania klastrów sorbentu, które tworzą się wokół wejścia do kolumny przy wysokim stężeniu sorbentu i zapobiegają przedostawaniu się nowego materiału sorbentowego do kapilary.

Technicznie rzecz biorąc, osiągamy to za pomocą pręta magnetycznego jako młotka, stale podgrzewającego i poruszającego się po kapilarze wewnątrz drutu sorbentowego. Prawidłowo zastosowany FlashPack zwiększa szybkość pakowania nawet 10-krotnie. To sprawia, że nadaje się do pakowania ultra wysokowydajnych sorbentów o bardziej miękkim rozmiarze mikrometrycznym oraz do produkcji bardzo długich kolumn o długości do metra w rozsądnym czasie.

Procedura przygotowania kolumny składa się z pięciu kroków. Trzy etapy przygotowawcze, które obejmują montaż stacji pakowania oraz przygotowanie zawiesiny kapilarnej i sorbentowej. Następnie kapilara jest najpierw pakowana do bomby ciśnieniowej pod ciśnieniem od 60 do 100 barów.

Następnie następuje podłączenie wypełnionej kapilary do systemu HPLC, napakowanie sorbentu pod wysokim ciśnieniem i cięcie kolumny do odpowiedniego rozmiaru. Procedura FlashPack wymaga wprowadzenia zmian w krokach trzecim i czwartym wspólnego protokołu. W pierwszej kolejności przygotowujemy stanowisko do pakowania.

Składa się ze zbiornika azotu o ciśnieniu wylotowym co najmniej 50 barów. Zbiornik jest podłączony do zaworu odpowietrzającego bomby ciśnieniowej, który jest umieszczony w mieszadle magnetycznym. Wylot zaworu odpowietrzającego jest wkładany do butelki z wodą przez wąską kapilarnę ID PEEK, co umożliwia precyzyjną kontrolę rozhermetyzowania.

Następnie przygotowujemy kapilarę. Pakowanie może odbywać się w spiekanej kapilarze ze zintegrowaną frytą szklaną utworzoną z Kasilu i formamidu. Inną opcją jest zapakowanie się w kapilarnę przyciągniętą przygotowaną przez ściągacz laserowy Sutter.

Kapilara musi być o 10 do 15 centymetrów dłuższa niż planowana długość kolumny. Poniższy film jest przygotowany na przykładzie wypełnienia kapilarnego z ciągniętym emiterem. Zabezpiecz wyciągniętą końcówkę emitera za pomocą przeciętej końcówki pipety z żelem.

Szczegółowe informacje znajdują się w wersji tekstowej manuskryptu. Kolejnym etapem jest przygotowanie gnojowicy sorbentowej. Najpierw umieść około 50 miligramów suchego sorbentu w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej.

Będzie to standardowa fiolka z sorbentem. Film ten został przygotowany przy użyciu sorbentu mikrometrycznego Reprosil Pur C18 AQ 1.9 firmy Dr.Maisch. Dodać jeden mililitr metanolu do podstawowej fiolki z sorbentem.

Wiruj przez 10 sekund. I sonikować w kąpieli sonicyjnej przez kolejne 10 sekund. Pozwól sorbentowi dokładnie namoczyć się przez 20 do 30 minut, a następnie zwiruj i ponownie poddaj sonikacji.

Przygotować działającą fiolkę z sorbentem. Musi to być fiolka ze stożkowym dnem, która pasuje do bomby. Może to być kolejna 1,5-mililitrowa probówka wirówkowa lub dowolna inna fiolka, w zależności od konkretnej konstrukcji bomby ciśnieniowej.

Używamy listwy stożkowej dolnej z nakrętką przyciętą do wysokości bomby ciśnieniowej. Ponownie zawiesić sorbent w podstawowej fiolce sorbentowej i przenieść 500 mikrolitrów do działającej fiolki sorbentowej wraz z prętem magnetycznym o rozmiarze dwa na trzy milimetry. Udekorować do fiolki roboczej na jeden mililitr z metanolem.

Pozostaw fiolkę roboczą na stole na 10 minut, aby sorbent osiadł grawitacyjnie. Wynikiem tego etapu musi być stożkowa dolna fiolka z dolną warstwą luźnego sorbentu o wysokości około czterech milimetrów. Jeśli warstwa jest zbyt niska, i trochę więcej sorbentu z fiolki podstawowej.

Tak przygotowana fiolka robocza przeznaczona jest do przygotowania wielu kolumn przez wiele miesięcy. Jeśli działająca fiolka z sorbentem pozostaje bez mieszania przez ponad dwie godziny, przed zapakowaniem musi zostać ponownie zawirowana, poddana sonikacji i osadzona grawitacyjnie. Gdy wszystko jest przygotowane, przejdź do etapu czwartego, pakując bombę ciśnieniową.

Zawsze noś okulary ochronne podczas pracy z kapilarami ze stopionej krzemionki i bombą ciśnieniową. Jednocześnie nie zaleca się stosowania rękawic ochronnych. Znacznie zmniejszają one zmysł dotyku niezbędny do prawidłowego obchodzenia się z naczyniami włosowatymi o małej średnicy i prowadzą do błędów.

Umieścić fiolkę z sorbentem w bombie ciśnieniowej i mocno zacisnąć wszystkie węzły. Rozpocznij rotację z prędkością od 60 do 100 rund na minutę, włóż spiekaną lub ciągniętą kapilarę emitera do bomby. Wepchnij go na samo dno fiolki, a następnie podnieś go o dwa do trzech milimetrów i zamocuj węzeł.

Zastosuj minimalną wymaganą siłę, aby zamocować kapilarę. Sprawdź, czy kapilara jest prawidłowo zamocowana. Nie może być możliwe przesunięcie kapilary poprzez wyciągnięcie jej ręcznie.

Bardzo powoli otwórz zawór bomby ciśnieniowej, trzymając otwarty koniec kapilary skierowany z dala od twarzy. Obserwuj początkowe etapy procesu pakowania. Natychmiast po zwiększeniu ciśnienia sorbent wypełnia kapilarnę i staje się ona nieprzezroczysta na całej długości.

Gdy tylko sorbent zacznie pakować się w dystalny koniec, ciśnienie wsteczne wzrasta, przepływ zwalnia, a równomierna zawiesina sorbentowa wewnątrz kapilary przekształca się w kilka pakietów sorbentu, oddzielonych szczelinami wolnymi od sorbentu. Już upakowany sorbent jest widoczny jako gęsto zabarwiony, stale rosnący obszar. Obszary wypełnione sorbentem powinny znajdować się na wysokości co najmniej 70% długości kapilary z małymi przerwami wolnymi od sorbentu przez cały czas trwania procesu pakowania.

Istnieje kilka typowych problemów, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu pakowania. Wymagają one regulacji ustawień w locie, aby utrzymać wydajne dostarczanie sorbentu do kapilary. Najczęstszym problemem jest sytuacja, w której nowy sorbent przestaje wnikać do kapilary, podczas gdy sorbent znajdujący się w środku nadal się porusza.

W większości przypadków wejście do kapilar zostaje zablokowane przez samoagregujące się klastry sorbentu. Postępuj zgodnie z tymi krokami jeden po drugim, aż przepływ sorbentu zostanie przywrócony, a następnie pomiń pozostałe kroki związane z problemem. Zwiększ prędkość obrotową do 500 pocisków na minutę i natychmiast zmniejsz ją z powrotem do 60 pocisków na minutę.

W większości przypadków przywraca przepływ sorbentu. Sprawdź, czy prędkość obrotowa wynosi co najmniej 60 obr./min przez pozostałą część procesu pakowania. Jeśli to nie pomoże, na krótko odpowietrz bombę pakującą i natychmiast zwiększ jej ciśnienie.

Jeśli to nie pomoże lub zablokowanie nastąpi ponownie, zmień położenie kapilary wewnątrz warstwy sorbentu. Brak sorbentu może być spowodowany tym, że otwarty koniec kapilary znajduje się zbyt wysoko nad prętem magnetycznym, więc koniec kolumny go nie dotyka. Lub kapilara jest umieszczona zbyt nisko i wbija się w dno fiolki.

Najpierw całkowicie odpowietrz bombę, następnie poluzuj nakrętkę, popchnij kapilarnę do dołu, a następnie pociągnij ją o dwa milimetry do tyłu. Zamocuj nakrętkę. Otwórz zawór, aby zwiększyć ciśnienie w bombie i kontynuuj pakowanie.

Więcej szczegółów na temat problemów z pakowaniem jest opisanych w wersji tekstowej metody. Kontynuuj pakowanie kolumny, aż zostanie osiągnięta docelowa długość kolumny plus pięć do siedmiu centymetrów. Zatrzymaj obrót i bardzo powoli rozhermetyzuj bombę.

Otwórz trochę zawór bomby i poczekaj, aż bańka pęknie w butelce z wodą. Następnie otwórz zawór nieco szerzej i ponownie poczekaj, aż pęcherzyk pęknie, aby zwolnić. Dlatego w krokach przyrostowych zmniejszaj ciśnienie, aż gaz nie wydostanie się z zaworu.

Nie otwieraj zaworu do końca za jednym razem. Doprowadzi to do bulgotania wewnątrz naczynia włosowatego i powrotu sorbentu do fiolki. Jeśli tak się stanie, zwiększ ciśnienie w bombie z powrotem i poczekaj, aż kolumna zostanie ponownie zapakowana.

Gdy gaz przestanie wydostawać się z zaworu odpowietrzającego, wyjmij wypełnioną kapilarnę z bomby ciśnieniowej. Nie pozwól, aby kolumna wyschła. Jeśli nie zostanie natychmiast podłączony do systemu HPLC w celu dalszego pakowania, umieść wypełnioną kapilarnę w magazynie, zanurzając ją w całości w 10% roztworze etanolu.

Odłączone kolumny HPLC są przechowywane w ten sam sposób. Jeśli na dziś nie jest planowane dalsze pakowanie, wyjmij fiolkę z sorbentem z bomby i szczelnie ją zamknij. Zachowaj go do dalszego pakowania kolumny.

Etap piąty, pakowanie HPLC. Podłącz wypełnioną kapilarnę do systemu HPLC za pomocą połączenia HPLC. Uruchom przepływ rozpuszczalnika o wysokiej zawartości rozpuszczalnika organicznego.

Dostosuj przepływ zgodnie z długością opakowania, celując w około 300 barów. W przypadku kapilar wypełnionych 40 centymetrami należy użyć natężenia przepływu 200-300 normalnych litrów na minutę. Uważaj, czy w upakowanej kapilarze nie ma luźnego sorbentu, co zwiększa całkowitą długość upakowanego materiału.

Nie zatrzymując przepływu, zanurzyć korpus kolumny dwa razy w kąpieli sonizacyjnej. Ważne jest, aby zanurzyć tylko część korpusu kolumny. Nie zanurzaj końców kolumn i połączeń kapilarnych.

Gdy złoże sorbentu przestanie się kurczyć, zanurz korpus kolumny w kąpieli sonicyjnej dwa razy więcej, nie zatrzymując przepływu. Uruchom kolumnę na dodatkowe 10 minut przy 300 paskach. Zatrzymaj przepływ, poczekaj, aż ciśnienie spadnie poniżej trzech barów i odłącz kolumnę.

Sprawdź wzrokowo kolumnę pod kątem braku szczelin i przebarwień. Jeśli zostaną znalezione, sonikacja pod przepływem może być powtórzona. W przypadku eksperymentów krytycznych rozważ utworzenie nowej kolumny.

Przytnij kolumnę na żądaną długość. Prawidłowo wykonane cięcie jest warunkiem wstępnym wydajności kolumny. Wykonaj nacięcie w powłoce poliamidowej za pomocą rysika.

Częściowo pęknij kapilatę i rozsuń dwa kawałki. Wypoleruj przód kolumny na płytce ceramicznej lub folią docierającą. Podłącz ponownie kolumnę do systemu LC za pomocą przyłącza ultra wysokiego ciśnienia.

Rozpocznij robocze natężenie przepływu od 2%B. Robocze natężenie przepływu jest regulowane zgodnie z parametrami kolumny. Na przykład 100 mikrometrowych kolumn identyfikacyjnych pracuje z prędkością 500 nanolitrów na minutę.

Poczekaj, aż ciśnienie się wyrówna i sprawdź przeciwciśnienie w kolumnie. Odpowiednio przygotowana kolumna daje przeciwciśnienie proporcjonalne do jej długości i charakterystyki sorbentu. Na przykład 30-centymetrowa kolumna kapilarna wypełniona sorbentem o dwóch mikrometrach ma przeciwciśnienie od 450 do 500 barów przy 2% rozpuszczalniku B. Jeśli wyprodukowana kolumna daje przeciwciśnienie w oczekiwanym zakresie, jest gotowa do użycia.

Jeśli przeciwciśnienie znacznie wykracza poza oczekiwany zakres, coś jest nie tak z kolumną lub systemem LC. Pakowanie za pomocą FlashPack wytwarza kapilar wypełniony na 50 centymetrów sorbentem o wielkości 1,9 mikrometra w czasie krótszym niż jedna godzina przy ciśnieniu 100 barów. Na przykład produkujemy 30-centymetrową kolumnę ultrawysokociśnieniową o średnicy 100 mikrometrów ID, upakowaną w kapilarnę z ciągniętym emiterem z sorbentem ReprosilPur C18 AQ o średnicy 1,9 mikrometra.

Pakowanie odbywało się przy 60 barach w 50-centymetrowej kapilarze z ciągniętym emiterem. Kapilara została wypełniona do 40 centymetrów w ciągu 40 minut, z niewielką ilością sorbentu wewnątrz kapilary, która nie była upakowana. Wypełniona kapilara została podłączona do systemu HPLC i pracowała z prędkością 300 nanolitrów na minutę z rozpuszczalnikiem B, który w naszym przypadku składał się z 80% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.

Ostateczna długość po spakowaniu wynosiła 43 centymetry. Kolumna została przycięta o 30 centymetrów. Przy przepływie roboczym 500 nanolitrów na minutę z 99% rozpuszczalnikiem B kolumna dawała ciśnienie wsteczne 275 barów, co jest bliskie oczekiwanej wartości.

Aby przetestować kolumnę, oddzieliliśmy 50 fmol tryptycznego trawienia białka cytochromu C w 15-minutowym gradiencie od 2-50% B. Piki chromatograficzne były wysoce symetryczne z minimalnym ogonowaniem. Średni FWHM wynosił około trzech sekund.

Opisany protokół jest w stanie wyprodukować kolumny UHPLC w typowym opakowaniu 100 barów ustawionym w rozsądnym czasie. Krótkie kolumny HPLC lub UPLC można spakować w ciągu kilku minut, podczas gdy długie kolumny o długości 30-50 centymetrów są pakowane w mniej niż godzinę. Metoda ta jest skuteczna w pakowaniu sorbentów z RP i innymi chemikaliami do dowolnych identyfikatorów kolumn.

Produkowane kolumny są powtarzalnie tak samo skuteczne, jak każda inna komercyjna kolumna o podobnej wielkości i parametrach sorbentu.