Barwienie cytoplazmatycznego Ca²⁺ Fluo-4/AM w miazgi jabłkowej

Jako ważny pierwiastek mineralny, wapń odgrywa kluczową rolę we wzroście i kontroli jakości owoców drzew, takich jak jabłko, może regulować twardość, zawartość cukru, okres przechowywania i zaburzenia fizjologiczne podczas przechowywania. Obrazowanie wapnia jest najbardziej zachodnią metodą wykrywania dynamicznych zmian jonów wapnia w cytoplazmie. Małocząsteczkowe wskaźniki fluorescencyjne, takie jak fluo-4/AM, mają selektywność specyficzną dla jonów wapnia i mogą być nieinwazyjnie ładowane przez inkubację estryfikacji, która jest elastyczna, szybka i niecytotoksyczna.

Protokół ten wprowadzi metodę ładowania małocząsteczkowego chemicznego odczynnika fluorescencyjnego fluo-4/AM do protoplastów roślinnych. Ekstrakcja protoplastu Dodaj 0,5 mililitra roztworu enzymatycznego do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Wybierz zdrowe i dojrzałe jabłko, a następnie pokrój miąższ na 10 razy 5 razy 1 mililitr sześcienny.

Umieść kawałki miazgi w roztworze enzymatycznym, a następnie zamknij probówkę. Inkubować probówkę w temperaturze 28 stopni przez godzinę. Zakuty w kajdany z prędkością 70 obr./min w ciemności.

Następnie umyj kawałki miazgi, odessaj cały roztwór enzymatyczny, a następnie dodaj 0,5 mililitra roztworu zasadowego. Wirować z prędkością 300 g przez 2 minuty. Zawiesinę protoplastów można uzyskać przez zasysanie dolnego roztworu.

Barwienie odczynnikiem fluorescencji chemicznej drobnocząsteczkowej. Przygotuj roztwór ładujący fluo-4/AM z 2-milimolowym fluo-4/AM, 20% etylo127 i 10-krotnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w stosunku jeden do jednego, do dwóch. Dodaj 1 mikrolitr roztworu nasycającego fluo-4 / AM do 99 mikrolitrów zawiesiny protoplastów.

Końcowe stężenie barwników fluorescencyjnych wynosi 5 mikromolowych. Wymieszaj roztwór, a następnie zamknij probówkę. W tym samym czasie lantan żelazo wapń lub unikalność małocząsteczkowego chemicznego środka fluorescencyjnego.

Dodaj jeden mikrolitr lub 10 mikrolitrów więcej lantanu, a następnie jeden mikrolitrowy roztwór ładujący fluo-4 / AM do 98 mikrolitrowej zawiesiny protoplastów. Końcowe stężenie lantanu żelaza wynosi 100 mikromolów. Wymieszaj roztwór, a następnie zamknij probówkę.

Inkubować w temperaturze 37 stopni przez 30 minut w ciemności. Następnie odwirować z prędkością 300 G przez dwie minuty. Odessać do roztworu o objętości 17 mikrolitrów i dodać roztwór podstawowy o objętości 17 mikrolitrów.

Inkubować zawiesinę protoplastów w temperaturze 37 stopni przez 30 minut, aby całkowicie Następnie odessać 50 mikrolitrów zawiesiny protoplastów i wlać na szkiełko. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wybierz 20-krotne powiększenie i kanał GFP do obserwacji.

Równomiernie dostosuj jasność do 0,5. Krytycznym krokiem w tej proponowanej metodzie jest umycie plamy w protoplastach i inkubacja ich przez 30 minut. Niedostateczne płukanie powoduje nadmierne wsparcie dla fluorescencji podczas obserwacji i inkubacji, co pozwala na lepsze załadowanie lub sondę do cytoplazmy.

Test żywotności protoplastów Weź 99 mikrolitrów zawiesiny protoplastów po inkubacji w temperaturze 37 stopni przez 30 minut. Dodać 1 ml roztworu FD do zawiesiny protoplastów. Wymieszać roztwór, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie zamknąć probówkę.

Pozostań w temperaturze pokojowej przez pięć minut w ciemności. Przygotuj szkiełka i obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym z kanałem GFP. Przedstawiamy Państwu wyniki Poniżej rysunku pierwszego.

Stosujemy metodę enzymatyczną, we wszystkich przypadkach pozyskujemy protoplasty z miazgi. Niektóre protoplasty miały wakuolę, podczas gdy inne nie. Protoplasty barwiono FD przez pięć minut i wykazano fluorescencyjny w cytoplazmie, co wskazuje, że wysoka temperatura, 37 stopni, nie wpływa na żywotność lub protoplasty Ryc.

Protoplasty nie wykazywały fluorescencji w jednym ze wskaźników fluorescencji żelaza wapniowego lub nie są one do nich załadowane. Niż w fluo-4 / AM został załadowany do protoplastu, cytoplast, ale nie wakuola, stał się fluorescencyjny. Żelazo lantanu, które skutecznie blokuje kanały wapniowe będące błoną komórkową, zostało dodane do obciążenia Protoplast fluo-4 / AM.

Przy końcowym stężeniu 100 mikromolowych żelazek lantanu znacznie zmniejsza intensywność fluorescencji wapnia. Wyniki te wykazały ponadto, że fluo-4/AM skutecznie pozostaje w żelazie wapniowym w cytoplastach i wykazuje dynamiczne zmiany w zawartości żelaza wapniowego. Rycina trzecia: Wyniki fluo-4 / AM analizowano przy użyciu zatwierdzonego przez IMH oraz oprogramowania 6.0 barwienie fluo-4 / AM z dodatkiem żelaza lantanowego, co znacznie obniżyło wartość kwiatową cytoplazmatycznego żelaza wapniowego.

W tym filmie wszystkie protoplasty zostały uzyskane w wyniku hydrolizy enzymatycznej. Udało nam się załadować sondy fluorescencyjne do protoplastów pod kątem 37 stopni. Co więcej, metoda ta nie wpłynęła na żywotność protoplastów.

Podsumowując, opisana tutaj metoda w sposób szczegółowy. Dynamiczne zmiany cytoplazmatycznych jonów wapnia w komórkach miazgi jabłkowej, zapewniając w ten sposób 10 równych podpór dla dalszych celów badań związanych z wapniem.