Name: Barwienie cytoplazmatycznego Ca2+ Fluo-4/AM w miazgi jabłkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę barwienia cytoplazmatycznego Ca²⁺ za pomocą Fluo-4/AM w protoplastach miazgi jabłkowej. Ta technika umożliwia nieinwazyjne obrazowanie jonów wapnia w komórkach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Poprawy Odmian Rolniczych Prowincji Shandong (2019LZGC007) oraz Zespół ds. Innowacji Drzew Owocowych Systemu Technologii Nowoczesnego Przemysłu Rolniczego w Shandong (SDAIT-06-05).

1. Ekstrakcja protoplastu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy: 20 mM CaCl2, 5 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego i 0,4 M D-sorbitolu. 
	UWAGA: pH roztworu podstawowego dostosowano do 5,8 za pomocą 0,1 M buforu Tris, przefiltrowano przez filtry rozpuszczalne w wodzie 0,22 μm i przechowywano w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór enzymatyczny: zmieszać 0,3% (m/v) Macerozymu R-10 i 0,5% (m/v) celulazy R-10 z roztworem zasadowym.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml roztworu enzymatycznego do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wybierz zdrowe i dojrzałe jabłko. Następnie pokrój miazgę na rozmiary 10 x 5 x 1 mm3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-1C).</li>
	<li>Umieść kawałki miąższu owoców jabłek w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór enzymatyczny, a następnie zamknij probówkę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 70 obr./min w wytrząsarce w ciemności.</li>
	<li>Umyj kawałki miazgi. Odessać cały roztwór enzymatyczny, a następnie dodać 0,5 ml roztworu podstawowego.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby uzyskać zawiesinę protoplastów, należy odessać roztwór z dna probówki wirówkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E).</li>
</ol>
2. Barwienie fluorescencyjne drobnocząsteczkowymi jonami wapnia
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór ładujący Fluo-4/AM z 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 i 10x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS: 80 mM Na2HPO4, 1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4 i 26 mM KCI) w stosunku 1:1:2.</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu nasycającego Fluo-4/AM do 99 μl zawiesiny protoplastów obecnej w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że końcowe stężenie barwnika fluorescencyjnego wynosi 5 μM. Wymieszaj roztwór, a następnie zamknij probówkę.</li>
	<li>Leczenie La3+: Przygotować 100 μM roztworu La3+ z 98 μl zawiesiny protoplastów, 1 μl 10 mM La3+ i 1 μl roztworu ładującego Fluo-4/AM. Wymieszaj roztwór i zamknij probówkę.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć protoplasty przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać 70 μl roztworu i dodać 70 μl roztworu podstawowego.</li>
	<li>Zawiesinę protoplastów inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu całkowitej deestryfikacji.</li>
	<li>Odessać 15 μl zawiesiny protoplastów i wlać na szkiełko.</li>
	<li>Obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym (rysunek uzupełniający S1). 
	UWAGA: Użyj kolorowej kamery o wysokiej czułości, tj. matrycy CMOS 3.2 MP (2048 x 1536) o rozdzielczości piksela 3.45 μm.</li>
	<li>Wybierz kanał GFP do obrazowania (20x). Ustaw jasność na 0.5. 
	UWAGA: Oświetlenie to kostki świetlne LED o regulowanej intensywności ze zintegrowanym zestawem filtrów z twardą powłoką. Długość fali wzbudzenia Fluo-4/AM wynosi 490 nm.</li>
</ol>
3. Test żywotności protoplastów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy dioctanu fluoresceiny (FDA): Rozpuścić FDA w acetonie, aż końcowe stężenie wyniesie 1 mg/ml.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy FDA z 1 μl roztworu podstawowego i 99 μl acetonu.</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu roboczego FDA do 99 μl zawiesiny protoplastów. Wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół, a następnie zamknąć probówkę. 
	UWAGA: Końcowe stężenie FDA wynosi 100 μg/L.</li>
	<li>Bejcować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Przygotuj szkiełka i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Wybierz kanał GFP do obrazowania (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1F).</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Analizuj uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów i arkuszy kalkulacyjnych (np. Image-Pro Plus i Excel 2010).</li>
	<li>Wybierz dwie średnice pionowe z protoplastów, aby obliczyć intensywność fluorescencji (rysunek uzupełniający S2). Zmierzono intensywność fluorescencji wszystkich protoplastów poddanych różnym zabiegom. Do końcowej obróbki użyj oprogramowania do edycji zdjęć.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeprowadzić analizę statystyczną za pomocą oprogramowania statystycznego (rysunek uzupełniający S3). Dane prezentowane są w postaci średniej ± SD. Test t studenta został wykorzystany do analizy różnic między grupami eksperymentalnymi.</li>
</ol>

<ol><li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+calcium%3A+Transport+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).</li>
<li>Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Sciences+in+China%22%5BJournal%5D)">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li>
<li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li>
<li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color%2C+flavor%2C+texture%2C+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables%3A+desirable+levels%2C+instrumental+and+sensory+measurement%2C+and+the+effects+of+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li>
<li>Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+apple+fruit+firmness--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal-+American+Pomological+Society%22%5BJournal%5D)">Factors affecting apple fruit firmness--a review.</a> Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).</li>
<li>Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+softening+of+apple+%28Malus+domestica%29+fruit%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Experimental+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review.</a> New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).</li>
<li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+across+plant+membranes%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li>
<li>Miqueloto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+fruit+calcium+content+and+susceptibility+to+bitter+pit+in+cultivars+of+apple%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+horticulturae%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple.</a> Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).</li>
<li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+%27Huangguan%27+pears+during+cold+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li>
<li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Horticulture+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li>
<li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Agricultural+Research+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).</li>
<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+practical+red+fluorescent+probe+for+cytoplasmic+calcium+ions+with+greatly+improved+cell-membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability.</a> Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca%282%29%28%2B%29+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics.</a> Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca%282%29%28%2B%29+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators.</a> Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2%2B-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+inexpensive+method+of+loading+fluorescent+dye+into+pollen+tubes+and+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs.</a> PLoS One. 11, 0152320(2016).</li>
<li>Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calreticulin+is+required+for+calcium+homeostasis+and+proper+pollen+tube+tip+growth+in+Petunia%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia.</a> Planta. 245 (5), 909-926 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADK2+positively+modulates+abscisic+acid-induced+stomatal+closure+by+affecting+accumulation+of+H2O2%2C+Ca2%2B+and+nitric+oxide+in+Arabidopsis+guard+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells.</a> Plant Science. 262, 81-90 (2017).</li>
<li>Niu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+availability+regulates+the+development+of+root+hairs+in+Arabidopsis+thaliana+%28L.%29+Heynh%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.</a> Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).</li>
<li>Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading+calcium+fluorescent+probes+into+protoplasts+to+detect+calcium+in+the+flesh+tissue+cells+of+Malus+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica.</a> Horticulture Research. 7, 91(2020).</li>
<li>Boyer, J., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+phytochemicals+and+their+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Journal%22%5BJournal%5D)">Apple phytochemicals and their health benefits.</a> Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li>
<li>Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hyperpolarization-activated+calcium+channels+in+apical+pollen+tubes+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia.</a> New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx6+regulates+left%2Fright+patterning+in+mouse+embryos+through+effects+on+nodal+cilia+and+perinodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling.</a> PLoS One. 3 (6), 2511(2008).</li>
<li>DeSimone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+taste+receptor+cell+%5BCa2%2B%5Di+modulate+chorda+tympani+responses+to+salty+and+sour+taste+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).</li>
<li>Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluo-3+to+measure+cytosolic+Ca2%2B+in+platelets+and+neutrophils.+Loading+cells+with+the+dye%2C+calibration+of+traces%2C+measurements+in+the+presence+of+plasma%2C+and+buffering+of+cytosolic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2.</a> Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+Ca+content+and+distribution+in+two+Gesneriaceae+species+reveals+distinctive+mechanisms+to+cope+with+high+rhizospheric+soluble+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).</li>
<li>Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+Ca2%2B+in+cells+of+intact+wheat+roots%3A+loading+of+acetoxymethyl+ester+of+Fluo-3+under+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature.</a> Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).</li>
<li>Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+loading+ester+fluorescent+Ca2%2B+and+pH+indicators+into+pollen+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia.</a> Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+actin+filaments+induces+mitochondrial+Ca2%2B+release+to+the+cytoplasm+and+%5BCa2%2B%5Dc+changes+in+Arabidopsis.+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs.</a> BMC Plant Biology. 10, 53(2010).</li>
<li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

W tym badaniu żywe protoplasty uzyskano w procesie hydrolizy enzymatycznej. Pamiętaj, że ta metoda wymaga świeżych jabłek. Obecny protokół pozwala na szybką izolację dużej liczby protoplastów z miazgi owocowej w celu wykorzystania w badaniach naukowych. Możliwość zastosowania tej metody nie ogranicza się do "Fuji"; protoplasty miazgi jabłkowej odmian 'Dounan' i 'Honey Crisp' mogą być również ekstrahowane za pomocą tego samego protokołu (rysunek uzupełniający S4). Roztwór protoplastu po enzymolizie zawier...

Ca2+ odgrywa ważną rolę w transdukcji i metabolizmie sygnałów roślinnych1,2. Ponadto reguluje cechy jakości owoców3,4, w tym twardość, zawartość cukru i podatność na zaburzenia fizjologiczne podczas przechowywania5,6. Cytoplazmatyczny Ca2+ odgrywa ważną rolę w transdukcji sygnału oraz reguluje wzrost i rozwój roślin7. Zaburzenie komórkowej homeostazy wapnia może wywołać gorzką pestkę u jabłek8, chorobę brązowej plamistości u gruszek9 oraz zgniliznę pępkową u pomidorów10, wpływając na jakość owoców i powodując poważne straty ekonomiczne3,11. Obrazowanie wapnia ma wystarczającą rozdzielczość przestrzenną i czasową i jest ważną metodą obserwacji dynamiki Ca2+ w żywych komórkach12,13.
Obecnie istnieją dwie główne metody wewnątrzkomórkowego obrazowania wapnia w żywych komórkach: jedna wykorzystuje chemiczne małocząsteczkowe sondy fluorescencyjne14, a druga to czujnik kodujący geny (GECI)15,16. Biorąc pod uwagę trudności w ustanowieniu stabilnego systemu transgenicznego na drzewach owocowych i dłuższy rozwój owoców, GECIS nie nadaje się do obrazowania fluorescencyjnego owocówCa2+.
Małocząsteczkowe sondy fluorescencyjne, takie jak Fluo-4/AM, mają szczególną zaletę: ich forma estru AM (przepuszczalna dla komórek pochodna estru acetoksymetylowego) może być łatwo ładowana masowo do żywych komórek bez potrzeby transfekcji, co czyni ją elastyczną, szybką i niecytotoksyczną17. Fluo-4/AM może być z powodzeniem załadowany do łagiewki pyłkowej Pyrus pyrifolia18 i Petunia,19, a także do komórek ochronnych20 i włośników Arabidopsis21.
Obecnie istnieje niewiele doniesień na temat barwienia komórek miazgi fluorescencyjnym wapniem22. Jako ważny pierwiastek mineralny, wapń odgrywa kluczową rolę we wzroście i kontroli jakości owoców drzew, takich jak jabłka. Jabłonie są uznawane na całym świecie za ważny gatunek gospodarczy, a jabłka są uważane za zdrową żywność23. W tym badaniu uzyskaliśmy żywotne protoplasty z miąższu owoców jabłoni poprzez hydrolizę enzymatyczną, a następnie załadowaliśmy drobnocząsteczkowe odczynniki fluorescencyjne do cytoplazmy w celu wykrycia Ca2+.

<table><tbody><tr><td>10&krotnie buforowana solą fizjologiczną</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS (roztwór buforowany fosforanem) to buforowy roztwór fosforanowy, który może zapewnić stosunkowo stabilne środowisko jonowe i zdolność buforowania pH. Jest to roztwór soli buforowej często stosowany w biologii do klonowania molekularnego i hodowli komórek. pH wynosi 7,4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>Bufor biologiczny</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>Dwuwodny chlorek wapnia jest białą lub szarą substancją chemiczną, głównie w postaci granulatu.</td></tr><tr><td>Celulaza R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7352</td><td>Degrade ściany komórkowe roślin.</td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Solarbio</td><td>S8090</td><td>Posiada dobre właściwości nawilżające, zapobiega wysuszeniu, a także zapobiega krystalizacji cukru, soli itp.</td></tr><tr><td>F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6867</td><td>Pluronic F-127 to niejonowy poliol powierzchniowo czynny (masa cząsteczkowa około 12500 daltonów), który okazał się korzystny w promowaniu rozpuszczania nierozpuszczalnych w wodzie barwników i innych materiałów w pożywkach fizjologicznych.</td></tr><tr><td>FDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td>FDA to perfekcyjny substrat esterazy przenikający komórkę, który może służyć jako sonda żywotności, która mierzy zarówno aktywność enzymatyczną, która jest wymagana do aktywacji jej fluorescencji, jak i integralność błony komórkowej, która jest wymagana do wewnątrzkomórkowego zatrzymywania ich produktu fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Zielony fluorescencyjny wskaźnik wapnia Fluo-4/AM jest ulepszoną wersją wskaźnika wapniowego Fluo-3/AM. Fluo-4/AM ładuje się szybciej i jest jaśniejszy przy tym samym stężeniu. Można go dobrze wzbudzić za pomocą lasera jonowego argonu o długości fali 488 nm.</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>Obserwować obraz fluorescencyjny.</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7351</td><td>Rozkład tkanki roślinnej w celu oddzielenia pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td>Jest szeroko stosowany do przygotowywania w eksperymentach biochemicznych i biologii molekularnej.</td></tr></tbody></table>

barwienie cytoplazmatycznego ca2+ fluo-4/am w miazgi jabłkowej

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Cytozolowy Ca2+ odgrywa kluczową rolę w rozwoju roślin. Obrazowanie wapnia jest najbardziej wszechstronną metodą wykrywania dynamicznych zmian Ca2+ w cytoplazmie. W tym badaniu uzyskaliśmy żywotne protoplasty komórek miazgi w procesie hydrolizy enzymatycznej. Wyizolowane protoplasty inkubowano z drobnocząsteczkowym odczynnikiem fluorescencyjnym (Fluo-4/AM) przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Sondy fluorescencyjne z powodzeniem wybarwiały cytozolowy Ca2+, ale nie gromadziły się w wakuolach. La3 +, bloker kanału Ca2 +, zmniejszał intensywność fluorescencji cytoplazmatycznej. Wyniki te sugerują, że Fluo-4/AM może być stosowany do wykrywania zmian w cytozolowym Ca2+ w miąższu owocu. Podsumowując, przedstawiamy metodę skutecznego izolowania protoplastów z komórek miąższowych owocu i wykrywaniaCa2+ poprzez załadowanie małocząsteczkowego odczynnika fluorescencyjnego wapnia do cytoplazmy komórek miazgi.

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem zastosowano metodę enzymatyczną w celu otrzymania żywych protoplastów z miąższu (Rysunek 1). Niektóre protoplasty posiadały wakuole, natomiast inne nie. Protoplasty nie wykazywały fluorescencji w przypadku braku wprowadzenia do nich fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+. Po wprowadzeniu Fluo-4/AM do protoplastów, fluorescencję wykazala cytoplazma, ale nie wakuola (Rysunek 2). Wynik ten wskazał, że Fluo-4/AM skutecznie ...

Izolowane protoplasty komórek miazgi jabłkowej zostały załadowane odczynnikiem fluorescencyjnym wapnia w celu wykrycia cytoplazmatycznego stężenia Ca2+.

Barwienie cytoplazmatycznego Ca2+ Fluo-4/AM w miazgi jabłkowej

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

Jako ważny pierwiastek mineralny, wapń odgrywa kluczową rolę we wzroście i kontroli jakości owoców drzew, takich jak jabłko, może regulować twardość, zawartość cukru, okres przechowywania i zaburzenia fizjologiczne podczas przechowywania. Obrazowanie wapnia jest najbardziej zachodnią metodą wykrywania dynamicznych zmian jonów wapnia w cytoplazmie. Małocząsteczkowe wskaźniki fluorescencyjne, takie jak fluo-4/AM, mają selektywność specyficzną dla jonów wapnia i mogą być nieinwazyjnie ładowane przez inkubację estryfikacji, która jest elastyczna, szybka i niecytotoksyczna.Protokół ten wprowadzi metodę ładowania małocząsteczkowego chemicznego odczynnika fluorescencyjnego fluo-4/AM do protoplastów roślinnych. Ekstrakcja protoplastu Dodaj 0,5 mililitra roztworu enzymatycznego do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Wybierz zdrowe i dojrzałe jabłko, a następnie pokrój miąższ na 10 razy 5 razy 1 mililitr sześcienny.Umieść kawałki miazgi w roztworze enzymatycznym, a następnie zamknij probówkę. Inkubować probówkę w temperaturze 28 stopni przez godzinę. Zakuty w kajdany z prędkością 70 obr./min w ciemności.Następnie umyj kawałki miazgi, odessaj cały roztwór enzymatyczny, a następnie dodaj 0,5

staining-the-cytoplasmic-ca2-with-fluo-4am-in-apple-pulp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia w celu wizualizacji osadzania się celulozy w ścianach komórkowych Arabidopsis thaliana, rośliny dwuliściennej, przy użyciu bieli kalkofluorowej, która specyficznie wiąże się z β połączonymi glukanami, wykazując fluorescencję w świetle UV.

Barwienie Calcofluor White: prosta metoda wizualizacji fluorescencji indukowanej promieniowaniem UV osadów celulozy w ścianach komórkowych skrawków łodyg roślin dwuliściennych

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Tutaj opisana jest metoda uczynienia tkanek roślinnych przezroczystymi przy jednoczesnym zachowaniu stabilności białek fluorescencyjnych. Technika ta ułatwia głębokie obrazowanie oczyszczonych tkanek roślinnych bez fizycznego cięcia.

Optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego

Poznaj metodę barwienia cytoplazmatycznego Ca²⁺ za pomocą Fluo-4/AM w protoplastach miazgi jabłkowej. Ta technika umożliwia nieinwazyjne obrazowanie jonów wapnia w komórkach roślinnych.

Barwienie cytoplazmatycznego Ca²⁺ Fluo-4/AM w miazgi jabłkowej

Przeglądaj więcej filmów