Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Nasza metoda umożliwia monitorowanie wzrostu zajęcia przerzutów do pachwinowych węzłów chłonnych poprzez pomiar wzrostu ich objętości. Ta nieinwazyjna metoda jest bardzo dobrze tolerowana, dlatego można zaplanować wiele sesji obrazowania na tym samym zwierzęciu doświadczalnym w ciągu dwóch tygodni. Metoda ta idealnie nadaje się do oceny wpływu leczenia farmakologicznego na chorobę z przerzutami.

Zastosowaliśmy tę metodę do modelu czerniaka Braf/Pten, ale w zasadzie można ją dostosować do oceny skuteczności różnych leków w różnych przedklinicznych mysich modelach raka z przerzutami. Procedurę zademonstrują dr Marianna Vitiello, doktor habilitowany z mojego laboratorium, oraz dr Claudia Kusmic, badaczka z IFC-CNR. W celu indukcji czerniaka nałóż trzy mikrolitry pięciomilimolowego 4-hydroksytamoksyfenu na około jeden centymetr kwadratowy ogolonej skóry górnej części pleców przez trzy dni z rzędu.

Sześć tygodni po malowaniu skóry użyj suwmiarki, aby zmierzyć objętość guza pierwotnego, a ostatecznie przerzutów podskórnych. Następnie użyj obrazowania ultrasonograficznego, aby zmierzyć objętość pachwinowych węzłów chłonnych. Po przeanalizowaniu pierwotnego guza i węzłów chłonnych za pomocą oględzin, należy je wyciąć do badań histologicznych.

Po potwierdzeniu znieczulenia przenieś zwierzę na podgrzewaną deskę stacji obrazowania ultrasonograficznego ultrawysokiej częstotliwości, trzymając zwierzę w pozycji leżącej. Dostosuj temperaturę płyty za pomocą sondy doodbytniczej nasmarowanej wazeliną, aby utrzymać temperaturę ciała myszy w zakresie fizjologicznym. Pokryj przednią i tylną łapę pastą przewodzącą i przyklej je do elektrod płytki EKG osadzonych w tablicy.

Sprawdź, czy parametry fizjologiczne są prawidłowo rejestrowane i wyświetlane. Usuń włosy z obu obszarów pachwinowych, nakładając środek do depilacji i pokryj je akustycznym środkiem sprzęgającym. Następnie zamocuj liniową sondę ultradźwiękową o ultrawysokiej częstotliwości w specjalistycznym silniku 3D osadzonym w stacji obrazowania, umożliwiając zautomatyzowany i stopniowy ruch sondy.

Prawidłowo zorientuj i dostosuj położenie sondy ultradźwiękowej, aby uzyskać obrazy o krótkim dostępie do pachwinowego węzła chłonnego i umieść obszar zainteresowania w strefie ogniskowej. Ustaw odległość skanowania od dwóch do pięciu milimetrów, rozmiar kroku na 44 mikrometry, uzyskując wynik od 46 do 114 kroków skanowania na wycinek węzłów chłonnych i czas akwizycji od jednej do trzech minut na zwierzę. Skanuj całą objętość pachwinowego węzła chłonnego jako sekwencję obrazów 2D w trybie B, uzyskując obrazy na wielu poziomach poprzez liniowy ruch przetwornika z rozmiarami kroków w skali mikrometrycznej, aby wygenerować dane 3D w zakresie oddychania i pętli filmowych bramkowanych sercem.

Po zobrazowaniu zapisz cyfrowo pozyskane obrazy w formacie RAW do dalszych analiz offline. Aby przetworzyć obrazy ultrasonograficzne, otwórz zestaw danych obrazów 3D pachwinowych węzłów chłonnych, wybierz metodę wielowarstwową i naciśnij przycisk Start, aby wyświetlić zarówno bieżące klatki, jak i miniatury wszystkich klatek odpowiadających każdemu obrazowi przechwyconemu podczas akwizycji 3D. Wybierz miniaturę pierwszej klatki, w której widoczny jest węzeł chłonny, aby załadować ją do widoku konturowania.

W widoku konturowania kliknij lewym przyciskiem myszy, aby upuścić punkty wzdłuż granicy węzła chłonnego. Po ustawieniu żądanej liczby punktów liź w prawo, aby zakończyć kontur. Po zakończeniu pierwszego konturu użyj widoku miniatur, aby wybrać następny obraz do konturowania.

W razie potrzeby pomiń kilka obrazów między konturami, aby zmniejszyć liczbę ręcznych ścieżek potrzebnych dla każdej objętości 3D. Powtarzaj ten proces, aż cały wolumin zostanie obrysowany, a następnie kliknij Zakończ. W obszarze roboczym okna trybu 3D kliknij ikonę pomiaru objętości pod obszarem wyświetlania obrazu, aby wyświetlić wartość liczbową objętości węzła chłonnego i aktywować widok powierzchni z renderowaniem 3D objętości węzła chłonnego.

Leczenie myszy 4-hydroksytamoksyfenem indukuje aktywność enzymu CreER, powodując zmianę na poziomie genomu z Braf typu dzikiego na zmutowany Braf V600E, podczas gdy Pten zostaje utracony. Cztery tygodnie po leczeniu 4-hydroksytamoksyfenem guzy pierwotne osiągają objętość od 50 do 100 milimetrów sześciennych, a ich wzrost można mierzyć suwmiarką przez dodatkowe dwa tygodnie, wykazując w ten sposób stopniowy wzrost pigmentacji obserwowany w pachwinowych węzłach chłonnych. Złogi melaniny są niezmiennie spowodowane obecnością przerzutów komórek czerniaka, co potwierdza barwienie immunohistochemiczne antygenu czerniaka MelanA i Braf V600E.

Pod koniec fazy segmentacji wszystkie odcinki wykazały nakładkę zewnętrznego konturu węzła chłonnego. Rendery 3D prawego pachwinowego węzła chłonnego, analizowane po czterech, pięciu i sześciu tygodniach po leczeniu 4-HT są pokazane tutaj. Określono również ilościowo wzrost objętości lewych i prawych pachwinowych węzłów chłonnych tego samego zwierzęcia w czasie.

Zaleca się połączenie obrazowania ultrasonograficznego z odpowiednim barwieniem immunohistochemicznym, tak aby obecność komórek nowotworowych została potwierdzona na poziomie molekularnym. Oprócz węzłów chłonnych, objętość przerzutów podskórnych może być również monitorowana w czasie za pomocą obrazowania ultrasonograficznego. Jeśli dwutygodniowy przedział czasowy jest zbyt krótki, aby ocenić działanie badanego leku, wybierz bardziej obwodowe miejsce indukcji lub genotyp mniej podatny na nowotwory.