Name: Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości do monitorowania objętości węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka Braf/Pten. Technika umożliwia powtarzalne pomiary progresji przerzutów i ocenę skuteczności leczenia farmakologicznego w badaniach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować S. Burchielli (FTGM, Piza) za pomoc w procedurach na zwierzętach. Praca ta była wspierana przez ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica, instytucjonalne fundusze dla LP; MFAG #17095 przyznany przez AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro do LP.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (protokoły dla zwierząt #754/2015-PR i #684/2018-PR).
1. Indukcja czerniaka
UWAGA: Sześciotygodniowy Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox myszy [B6. W pracy wykorzystano Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (patrz Tabela Materiałów).
<ol>
	<li>Potraktuj myszy 4-hydroksytamoksyfenem (4-HT), nakładając 3 μL 5 mM 4-HT na ~1cm2 ogolonej skóry górnej części pleców, jak opisano wcześniej11,16,17, przez 3 dni z rzędu. 
	UWAGA: Spowoduje to aktywację enzymu Cre i spowoduje zmianę z wt Braf na BrafV600E i utratę Pten. Te dwa uderzenia wystarczą, aby wywołać powstawanie czerniaka.</li>
	<li>Obserwuj, że guzy pierwotne rozwijają się w miejscu malowania skóry w ciągu 2-3 tygodni i osiągają objętość 50-100 mm3 w ciągu 4 tygodni. W tym momencie obserwuj również przerzuty do innych miejsc na skórze, węzłów chłonnych i płuc (t0).</li>
	<li>Użyj suwmiarki do pomiaru objętości guza pierwotnego i przerzutów podskórnych, a obrazowanie ultrasonograficzne do pomiaru objętości pachwinowych węzłów chłonnych. Powtórz te pomiary po tygodniu (t1, 5 tygodni po malowaniu skóry) i po dwóch tygodniach (t2, 6 tygodni po malowaniu skóry).</li>
	<li>W ostatnim punkcie czasowym poddaj myszy eutanazji poprzez przedawkowanie gazowego seworanu.</li>
	<li>Przeanalizuj pierwotny guz i węzły chłonne za pomocą oględzin, a następnie wytnij je do badań histologicznych, jak podano w16.</li>
</ol>
2. Procedura obrazowania
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia gazowego i dostarczaj 3% izofluranu w czystym tlenie, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie łapy.</li>
	<li>Przenieś zwierzę na podgrzewaną deskę - stanowiącą część stacji obrazowania UHFUS - trzymając zwierzę w pozycji leżącej. Użyj sondy doodbytniczej nasmarowanej wazeliną, aby zmierzyć temperaturę ciała. Dostosuj temperaturę deski, aby utrzymać temperaturę ciała myszy w fizjologicznym zakresie (36 ± 1°C).</li>
	<li>Zwilż oczy myszy maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Dostarczyć gaz narkotyczny (1,5% izofluranu w czystym tlenie) przez maskę na nos myszy. Dostosuj zawartość procentową izofluranu, aby utrzymać prawidłową głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Pokryj przednią i tylną łapę pastą przewodzącą i przyklej je do elektrod płytki EKG osadzonych w tablicy. Sprawdź, czy parametry fizjologiczne (tętno, sygnał oddechowy i temperatura ciała) są prawidłowo rejestrowane i wyświetlane.</li>
	<li>Usuń włosy z obu obszarów pachwinowych, nakładając środek do depilacji i pokryj je akustycznym środkiem sprzęgającym.</li>
	<li>Zamocuj sondę liniową UHFUS (częstotliwość środkowa 40 MHz) w specjalistycznym silniku 3D osadzonym w stacji obrazowania UHFUS, umożliwiając zautomatyzowany i stopniowy ruch sondy.</li>
	<li>Prawidłowo zorientuj i wyreguluj położenie sondy ultrasonograficznej, aby uzyskać obrazy pachwinowego węzła chłonnego w krótkiej osi (lewy/prawy) i umieść obszar zainteresowania w strefie ogniskowej.</li>
	<li>Zeskanuj całą objętość pachwinowego węzła chłonnego jako sekwencję obrazów 2D w trybie B, zgodnie z wcześniejszym opisem18. Uzyskuj obrazy na wielu poziomach węzła chłonnego poprzez liniowy ruch głowicy z rozmiarami kroków w skali mikrometrycznej, aby generować dane 3D w postaci automatycznie bramkowanych pętli filmowych z oddychaniem i sercem.</li>
	<li>Ustaw zapis obrazu z następującymi parametrami: odległość skanowania w zakresie od 2 do 5 mm (w zależności od wielkości węzłów chłonnych); wielkość kroku 44 μm, z wynikiem 46-114 kroków skanowania/wycinki węzłów chłonnych i czasem akwizycji 1-3 min na zwierzę. Cyfrowe przechowywanie uzyskanych obrazów w formacie RAW (DICOM) w celu dalszych analiz offline.</li>
	<li>Pod koniec sesji obrazowania przerwij znieczulenie gazowe i pozwól zwierzęciu dojść do siebie na płycie grzewczej w pozycji leżącej mostka. Opiekuj się zwierzęciem, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję na brzuchu.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie końcowe obrazów ultrasonograficznych
<ol>
	<li>Otwórz zestaw danych obrazów 3D DICOM lewego/prawego pachwinowego węzła chłonnego na platformie oprogramowania do przetwarzania końcowego obrazów ultrasonograficznych.</li>
	<li>segmentacja:
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Metoda wieloplasterkowa, aby wyświetlić zarówno bieżące klatki, jak i miniatury wszystkich klatek odpowiadających każdemu obrazowi zarejestrowanemu podczas akwizycji 3D.</li>
		<li>Wybierz miniaturę pierwszej klatki, aby wczytać ją do widoku konturowania. W widoku konturowania kliknij lewym przyciskiem myszy, aby upuścić punkty wzdłuż granicy węzła chłonnego. Po ustawieniu żądanej liczby punktów (zakres 10-15) kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć kontur.</li>
		<li>Po zakończeniu pierwszego konturu użyj widoku miniatur, aby wybrać następny obraz do konturowania. W razie potrzeby pomiń kilka obrazów (średnio 3 klatki) między konturami, aby zmniejszyć liczbę ręcznych ścieżek potrzebnych dla każdej objętości 3D. 
		UWAGA: Platforma oprogramowania do przetwarzania końcowego obrazów ultrasonograficznych automatycznie generuje kontury między ręcznymi ścieżkami, skracając w ten sposób czas analizy.</li>
		<li>Powtarzaj ten proces, aż cała wolumin zostanie obrysowany. Po zakończeniu kliknij Zakończ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie makiety 3D i pomiar objętości:
	<ol>
		<li>W obszarze roboczym okna Tryb 3D kliknij ikonę Pomiar objętości pod obszarem wyświetlania obrazu, aby aktywować widok powierzchni. 
		UWAGA: Widok powierzchni tworzy widok kompilacji, który odwzorowuje wolumin wygenerowany przez użytkownika na uzyskany obraz. Widok powierzchni można obrócić do dowolnej pozycji.</li>
		<li>Zwróć uwagę na pomiar głośności wymieniony w lewym dolnym rogu widoku sześcianu. 
		UWAGA: Segmentację i generowanie objętości 3D można również uzyskać za pomocą niestandardowego oprogramowania i/lub ogólnodostępnego/komercyjnego oprogramowania do ogólnego przetwarzania obrazu. Zaczynając od ręcznej segmentacji, oprogramowanie powinno zapewnić matematyczny i/lub pikselowy opis konturów węzłów chłonnych. Kontury te zostałyby połączone w przestrzeni 3D, aby odwzorować zewnętrzną powierzchnię węzłów chłonnych. Wszystkie kroki opisane w procedurze obrazowania i przetwarzania końcowego obrazów ultrasonograficznych są podsumowane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma%3A+updates+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).</li>
<li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li>
<li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma%3A+a+cost-effectiveness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Actas+Dermo-Sifiliograficas%22%5BJournal%5D)">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li>
<li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li>
<li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li>
<li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy%3A+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li>
<li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).</li>
<li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braf%28V600E%29+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li>
<li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li>
<li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li>
<li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li>
<li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF%28V600E%29+inhibition+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li>
<li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li>
<li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li>
<li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li>
<li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li>
<li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li>
<li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dane uzyskane w tym badaniu potwierdzają zdolność obrazowania ultrasonograficznego do monitorowania przerzutowego zajęcia pachwinowych węzłów chłonnych mysiego modelu czerniaka Braf/Pten. Jak wykazanowcześniej16, technika ta jest szczególnie przydatna do oceny skuteczności leczenia farmakologicznego. Dzieje się tak, ponieważ umożliwia monitorowanie zmian objętości węzłów chłonnych u tego samego zwierzęcia w czasie, poprzez porównanie pomiarów pobranych przy t1 i t2...

Czerniak jest agresywną formą raka skóry, która często rozprzestrzenia się na inne miejsca na skórze (przerzuty podskórne), a także na węzły chłonne, płuca, wątrobę, mózg i kości1. W ostatniej dekadzie do praktyki klinicznej wprowadzono nowe leki, które przyczyniły się do poprawy średniej długości życia pacjentów z czerniakiem z przerzutami. Pozostają jednak ograniczenia, w tym zmienny czas i stopień odpowiedzi, poważne skutki uboczne oraz pojawienie się nabytej oporności1. Dlatego tak ważne jest wykrycie rozprzestrzeniania się przerzutów we wczesnych stadiach, czyli gdy dotrą do lokalnych węzłów chłonnych.
Biopsja lokalnych węzłów chłonnych (wartowniczych węzłów chłonnych) jest zwykle wykonywana w celu sprawdzenia obecności komórek czerniaka. Jednak obrazowanie ultrasonograficzne staje się nieinwazyjną metodą wykrywania zajęcia przerzutów, ponieważ przewyższa ocenę kliniczną i może pomóc uniknąć niepotrzebnej biopsji2,3,4. Ponadto obrazowanie ultrasonograficzne wydaje się odpowiednie do monitorowania węzłów chłonnych, zwłaszcza w przypadku zaawansowanego wieku i/lub chorób współistniejących5,6. Cechy, które są wykrywane przez analizę ultrasonograficzną i pozwalają na różnicowanie między prawidłowymi i przerzutowymi węzłami chłonnymi, obejmują zwiększony rozmiar (objętość), zmianę kształtu z owalnego na okrągły, nieregularny margines, zmieniony wzór echogeniczny i zmienione (zwiększone) unaczynienie7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Genetycznie modyfikowane myszy Ptenlox/lox (myszy Braf/Pten) zostały niedawno udostępnione społeczności naukowej jako specyficzny tkankowo i indukowalny model przerzutowego czerniaka8. W tym modelu zwierzęcym guzy pierwotne rozwijają się bardzo szybko: stają się widoczne w ciągu 2-3 tygodni po indukcji zmiany z typu dzikiego (wt) Braf na BrafV600E i utracie Pten, podczas gdy osiągają objętość 50-100 mm3 w ciągu 4 tygodni. W ciągu kolejnych 2 tygodni wzrostowi guza pierwotnego towarzyszy postępujący wzrost obciążenia przerzutami w innych miejscach skóry, węzłach chłonnych i płucach.
myszy Braf/Pten były szeroko wykorzystywane do wielu celów, w tym do analizy szlaków sygnałowych związanych z melanomagenezą9,10, identyfikacja komórek czerniaka pochodzenia11,12,13, oraz testowania nowych opcji terapeutycznych zarówno w zakresie terapii celowanej, jak i immunoterapii8,14,15,16. W szczególności użyliśmy myszy Braf/Pten, aby wykazać, że atenuowana Listeria monocytogenes (Lmat) działa jako szczepionka przeciw czerniakowi. W przypadku stosowania ogólnoustrojowego w warunkach terapeutycznych Lmat nie wiąże się z ogólną toksycznością, ponieważ selektywnie kumuluje się w miejscach guza. Ponadto powoduje niezwykłe zmniejszenie masy pierwotnego czerniaka i zmniejszenie obciążenia przerzutami w węzłach chłonnych i płucach. Na poziomie molekularnym Lmat powoduje apoptotyczne zabijanie komórek czerniaka, co jest spowodowane, przynajmniej częściowo, działaniami nieautonomicznymi komórkami (rekrutacja na miejscu limfocytów T CD4 + i CD8 +)16.
Gdy myszy Braf/Pten są używane do modelowania czerniaka, wzrost pierwotnych guzów i przerzutów podskórnych może być monitorowany za pomocą pomiarów suwmiarką. Jednak zaangażowanie węzłów chłonnych i płuc musi zostać zbadane przy użyciu alternatywnej techniki, być może nieinwazyjnej, która pozwala naukowcom śledzić to samo zwierzę w czasie. W artykule opisano zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1), w połączeniu z późniejszą analizą wolumetryczną 3D uzyskanych danych, do podłużnego monitorowania wzrostu wielkości (objętości) pachwinowych węzłów chłonnych.

<table><tbody><tr><td>4-hydroksytamoksyfen</td><td>Merck</td><td>H6278</td><td>lek stosowany do indukcji nowotworu</td></tr><tr><td>B6. Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) myszy</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013590</td><td></td></tr><tr><td>Blu gel</td><td>Sooft Ialia</td><td></td><td>roztwór okulistyczny</td></tr> żel <tr><td>BRAFV600E przeciwciało</td><td>Spring Bioscience Corporation</td><td>E19290</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo (isoflorane)</td><td>Zoetis</td><td></td><td>płyn do znieczulenia gazowego</td></tr><tr><td>Przeciwciało MLANA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M2-7C10</td><td></td></tr><tr><td>Sigma gel</td><td>Parker</td><td></td><td>Electrode</td></tr><tr><td>Gel Transonic clear</td><td>Telic SAU</td><td></td><td>żel ultrasonograficzny</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Reckitt Benckiser IT</td><td></td><td>Krem do depilacji</td></tr><tr><td>Kompaktowy podwójny system anestezjologiczny</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>System anestezjologiczny na bazie izofluranu wyposażony w stożek nosowy i komorę indukcyjną</td></tr><tr><td>MX550S</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>Sonda liniowa UHFUS</td></tr><tr><td>Vevo 3100</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>System UHFUS</td></tr><tr><td>Stacja obrazowania Vevo Fujifilm</td><td>, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>Stacja obrazowania UHFUS i Advancing Physiological Monitoring Unit wyposażone w podgrzewaną płytę</td></tr><tr><td>Vevo Lab</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>platforma programowa do obróbki końcowej obrazów ultrasonograficznych</td></tr></tbody></table>

analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka braf/pten

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Genetycznie modyfikowane myszy Ptenlox/lox (myszy Braf/Pten) są szeroko stosowane jako model in vivo przerzutowego czerniaka. Po wywołaniu guza pierwotnego przez leczenie tamoksyfenem, w ciągu 4-6 tygodni po indukcji obserwuje się wzrost obciążenia przerzutami. W artykule pokazano, w jaki sposób można wykorzystać obrazowanie ultradźwiękami o ultrawysokiej częstotliwości (UHFUS) do monitorowania wzrostu zajęcia przerzutów do pachwinowych węzłów chłonnych poprzez pomiar wzrostu ich objętości.
System UHFUS służy do skanowania znieczulonych myszy za pomocą sondy liniowej UHFUS (22-55 MHz, rozdzielczość osiowa 40 μm). Obrazy w trybie B z pachwinowych węzłów chłonnych (zarówno po lewej, jak i prawej stronie) są rejestrowane w widoku krótkiej osi, umieszczając zwierzęta w pozycji leżącej grzbietowej. Zapisy ultrasonograficzne są pozyskiwane przy użyciu kroku o rozmiarze 44 μm na zmotoryzowanym ramieniu mechanicznym. Następnie dwuwymiarowe (2D) akwizycje w trybie B są importowane do platformy oprogramowania do końcowego przetwarzania obrazów ultrasonograficznych, a pachwinowe węzły chłonne są identyfikowane i segmentowane półautomatycznie w uzyskanych obrazach przekrojowych 2D. Wreszcie, automatycznie uzyskuje się całkowitą rekonstrukcję objętości trójwymiarowej (3D) wraz z renderowaniem objętości węzłów chłonnych, która jest również wyrażona jako pomiar bezwzględny.
Ta nieinwazyjna technika in vivo jest bardzo dobrze tolerowana i pozwala na zaplanowanie wielu sesji obrazowania na tym samym zwierzęciu doświadczalnym przez 2 tygodnie. W związku z tym idealnie nadaje się do oceny wpływu leczenia farmakologicznego na chorobę z przerzutami.

Po naniesieniu 4-HT na skórę myszy Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox, indukowana jest aktywność Cre, co prowadzi do przełączenia na poziomie genomicznym z wt Braf na BrafV600E, przy jednoczesnej utracie Pten (Rysunek 3A). W ciągu 2–3 tygodni u myszy rozwijają się pierwotne guzy w miejscu aplikacji z 100% penetrancją. Po czterech tygodniach od podania 4-HT (t0) guzy pierwotne osiągają objętość 50–100 mm3, a ich wzrost można mierzyć ...

Czerniak jest bardzo agresywną chorobą, która szybko rozprzestrzenia się na inne narządy. Protokół ten opisuje zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości, w połączeniu z renderowaniem 3D, do monitorowania objętości pachwinowych węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka z przerzutami Braf/Pten.

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Nasza metoda umożliwia monitorowanie wzrostu zajęcia przerzutów do pachwinowych węzłów chłonnych poprzez pomiar wzrostu ich objętości. Ta nieinwazyjna metoda jest bardzo dobrze tolerowana, dlatego można zaplanować wiele sesji obrazowania na tym samym zwierzęciu doświadczalnym w ciągu dwóch tygodni. Metoda ta idealnie nadaje się do oceny wpływu leczenia farmakologicznego na chorobę z przerzutami.Zastosowaliśmy tę metodę do modelu czerniaka Braf/Pten, ale w zasadzie można ją dostosować do oceny skuteczności różnych leków w różnych przedklinicznych mysich modelach raka z przerzutami. Procedurę zademonstrują dr Marianna Vitiello, doktor habilitowany z mojego laboratorium, oraz dr Claudia Kusmic, badaczka z IFC-CNR. W celu indukcji czerniaka nałóż trzy mikrolitry pięciomilimolowego 4-hydroksytamoksyfenu na około jeden centymetr kwadratowy ogolonej skóry górnej części pleców przez trzy dni z rzędu.Sześć tygodni po malowaniu skóry użyj suwmiarki, aby zmierzyć objętość guza pierwotnego, a ostatecznie przerzutów podskórnych. Następnie użyj obrazowania ultrasonograficznego, aby zmierzyć objętość pachwinowych węzłów chłonnych. Po przeanalizowaniu pierwotnego guza i węzłów chłonnych za pomocą oględzin, należy je wyciąć do badań histologicznych.Po potwierdzeniu znieczulenia przenieś zwierzę na podgrzewaną deskę stacji obrazowania ultrasonograficznego ultrawysokiej częstotliwości, trzymając zwierzę w pozycji leżącej. Dostosuj temperaturę płyty za pomocą sondy doodbytniczej nasmarowanej wazeliną, aby utrzymać temperaturę ciała myszy w zakresie fizjologicznym. Pokryj przednią i tylną łapę pastą przewodzącą i przyklej je do elektrod płytki EKG osadzonych w tablicy.Sprawdź, czy parametry fizjologiczne są prawidłowo rejestrowane i wyświetlane. Usuń włosy z obu obszarów pachwinowych, nakładając środek do depilacji i pokryj je akustycznym środkiem sprzęgającym. Następnie zamocuj liniową sondę ultradźwiękową o ultrawysokiej częstotliwości w specjalistycznym silniku 3D osadzonym w stacji obrazowania, umożliwiając zautomatyzowany i stopniowy ruch sondy.Prawidłowo zorientuj i dostosuj położenie sondy ultradźwiękowej, aby uzyskać obrazy o krótkim dostępie do pachwinowego węzła chłonnego i umieść obszar zainteresowania w strefie ogniskowej. Ustaw odległość skanowania od dwóch do pięciu milimetrów, rozmiar kroku na 44 mikrometry, uzyskując wynik od 46 do 114 kroków skanowania na wycinek węzłów chłonnych i czas akwizycji od jednej do trzech minut na zwierzę. Skanuj całą objętość pachwinowego węzła chłonnego jako sekwencję obrazów 2D w trybie B, uzyskując obrazy na wielu poziomach poprzez liniowy ruch przetwornika z rozmiarami kroków w skali mikrometrycznej, aby wygenerować dane 3D w zakresie oddychania i pętli filmowych bramkowanych sercem.Po zobrazowaniu zapisz cyfrowo pozyskane obrazy w formacie RAW do dalszych analiz offline. Aby przetworzyć obrazy ultrasonograficzne, otwórz zestaw danych obrazów 3D pachwinowych węzłów chłonnych, wybierz metodę wielowarstwową i naciśnij przycisk Start, aby wyświetlić zarówno bieżące klatki, jak i miniatury wszystkich klatek odpowiadających każdemu obrazowi przechwyconemu podczas akwizycji 3D. Wybierz miniaturę pierwszej klatki, w której widoczny jest węzeł chłonny, aby załadować ją do widoku konturowania.W widoku konturowania kliknij lewym przyciskiem myszy, aby upuścić punkty wzdłuż granicy węzła chłonnego. Po ustawieniu żądanej liczby punktów liź w prawo, aby zakończyć kontur. Po zakończeniu pierwszego konturu użyj widoku miniatur, aby wybrać następny obraz do konturowania.W razie potrzeby pomiń kilka obrazów między konturami, aby zmniejszyć liczbę ręcznych ścieżek potrzebnych dla każdej objętości 3D. Powtarzaj ten proces, aż cały wolumin zostanie obrysowany, a następnie kliknij Zakończ. W obszarze roboczym okna trybu 3D kliknij ikonę pomiaru objętości pod obszarem wyświetlania obrazu, aby wyświetlić wartość liczbową objętości węzła chłonnego i aktywować widok powierzchni z renderowaniem 3D objętości węzła chłonnego.Leczenie myszy 4-hydroksytamoksyfenem indukuje aktywność enzymu CreER, powodując zmianę na poziomie genomu z Braf typu dzikiego na zmutowany Braf V600E, podczas gdy Pten zostaje utracony. Cztery tygodnie po leczeniu 4-hydroksytamoksyfenem guzy pierwotne osiągają objętość od 50 do 100 milimetrów sześciennych, a ich wzrost można mierzyć suwmiarką przez dodatkowe dwa tygodnie, wykazując w ten sposób stopniowy wzrost pigmentacji obserwowany w pachwinowych węzłach chłonnych. Złogi melaniny są niezmiennie spowodowane obecnością przerzutów komórek czerniaka, co potwierdza barwienie immunohistochemiczne antygenu czerniaka MelanA i Braf V600E.Pod koniec fazy segmentacji wszystkie odcinki wykazały nakładkę zewnętrznego konturu węzła chłonnego. Rendery 3D prawego pachwinowego węzła chłonnego, analizowane po czterech, pięciu i sześciu tygodniach po leczeniu 4-HT są pokazane tutaj. Określono również ilościowo wzrost objętości lewych i prawych pachwinowych węzłów chłonnych tego samego zwierzęcia w czasie.Zaleca się połączenie obrazowania ultrasonograficznego z odpowiednim barwieniem immunohistochemicznym, tak aby obecność komórek nowotworowych została potwierdzona na poziomie molekularnym. Oprócz węzłów chłonnych, objętość przerzutów podskórnych może być również monitorowana w czasie za pomocą obrazowania ultrasonograficznego. Jeśli dwutygodniowy przedział czasowy jest zbyt krótki, aby ocenić działanie badanego leku, wybierz bardziej obwodowe miejsce indukcji lub genotyp mniej podatny na nowotwory.

analysis-lymph-node-volume-ultra-high-frequency-ultrasound-imaging

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

W tym filmie demonstrujemy technikę obrazowania pachwinowego węzła chłonnego w modelu mysim za pomocą ultrawysokiej częstotliwości obrazowania ultradźwiękowego. Ta nieinwazyjna technika obrazowania pozwala na monitorowanie zmian objętości węzłów chłonnych u zwierzęcia w czasie.

Analiza objętości pachwinowych węzłów chłonnych myszy: technika obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w celu określenia objętości pachwinowego węzła chłonnego w modelu mysim

Ten protokół opisuje zastosowanie ultradźwięków o wysokiej częstotliwości (HFUS) do obrazowania węzłów chłonnych szyjnych myszy. Technika ta optymalizuje wizualizację i kwantyfikację morfologii, objętości i przepływu krwi węzłów chłonnych szyjnych. Przedstawiono również biopsję węzłów chłonnych szyjnych pod kontrolą obrazu oraz przetwarzanie tkanki limfatycznej do oceny histologicznej.

Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości węzłów chłonnych szyjnych myszy

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Ten protokół opisuje kroki podjęte w celu wywołania guzów płuc KRAS u myszy, jak również ilościowe określenie powstałych guzów za pomocą obrazowania ultradźwiękowego. Małe guzy są wizualizowane we wczesnych punktach czasowych jako linie B. W późniejszych punktach czasowych pomiary względnej objętości guza są osiągane za pomocą narzędzia pomiarowego w oprogramowaniu ultrasonograficznym.

Wykrywanie progresji guza płuc u myszy za pomocą obrazowania ultrasonograficznego

Obrzęk limfatyczny to obrzęk kończyn spowodowany dysfunkcją układu limfatycznego. Opisujemy przewlekły model obrzęku limfatycznego mysiego ogona i nowatorskie zastosowanie technologii nanotransfekcji tkanek (TNT) do dostarczania ładunku genetycznego do ogona.

Model obrzęku limfatycznego mysiego ogona

Dostępny jest protokół jednoczesnego wstrzykiwania komórek rakowych i fibroblastów oraz monitorowania wzrostu guza w czasie. Protokół ten można wykorzystać do zrozumienia molekularnych podstaw roli fibroblastów jako regulatorów wzrostu guza.

Mysi model do badania roli fibroblastów związanych z rakiem we wzroście guza

Obecny protokół opisuje ultrasonografię wysokiej częstotliwości do wizualizacji całej tarczycy myszy i monitorowania wzrostu anaplastycznego raka tarczycy.

Ultrasonografia o wysokiej rozdzielczości do analizy ortotopowych guzów ATC w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy

Przedstawiony tutaj eksperymentalny projekt dostarcza użytecznego modelu reprodukcyjnego do badań specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ podczas przerzutów do węzłów chłonnych (LN), co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8+ osób postronnych.

Model przerzutów do węzłów chłonnych drenujących do oceny dynamiki limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas nowotworzenia

Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości do monitorowania objętości węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka Braf/Pten. Technika umożliwia powtarzalne pomiary progresji przerzutów i ocenę skuteczności leczenia farmakologicznego w badaniach przedklinicznych.

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten (Wideo) | JoVE Journal

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Przeglądaj więcej filmów