Name: Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj udoskonalone techniki chirurgiczne przeszczepu wysp trzustkowych do żyły wrotnej u myszy, które skutecznie zapobiegają krwawieniu i zmniejszają śmiertelność. Metody te wspierają badania nad chorobami wątroby i nowotworami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Departament ds. Weteranów (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536), a Narodowy Instytut Zdrowia przyznaje HW # 1R01DK105183, DK120394, DK118529. Chcielibyśmy podziękować Panu Michaelowi Lee i Pani Lindsay Swaby za redakcję językową

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny oraz Centrum Medycznego Ralpha H. Johnsona w Charleston.
1. Indukcja cukrzycy za pomocą streptozotocyny (STZ)
<ol>
	<li>Preparat myszy biorcy:
	<ol>
		<li>Zważ wszystkie myszy indywidualnie.</li>
		<li>Sprawdź poziom glukozy we krwi z próbki krwi żyły ogonowej za pomocą glukometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie dawki STZ dla trzech różnych scenariuszy:
	<ol>
		<li>W przypadku myszy ze stłuszczeniem wątroby należy wstrzyknąć jedną dawkę STZ [40 mg/kg/dobę, wstrzyknięcie dootrzewnowe] przez 5 kolejnych dni.</li>
		<li>W przypadku myszy NOD-SCID wstrzyknąć 125 mg/kg STZ, pojedyncze wstrzyknięcie, i.p. po całonocnym poście.</li>
		<li>W przypadku myszy C57BL/6 wstrzyknąć 225 mg/kg STZ, pojedyncze wstrzyknięcie, i.p.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczenia dla STZ (13,5 mg/ml): 
	UWAGA: To obliczenie dotyczy pięciu myszy C57BL/6 o masie ciała 30 g:
	<ol>
		<li>Całkowita masa ciała: 5 myszy x 30 g/mysz = 150g</li>
		<li>Potrzebne STZ: 150 g x 225 mg / 1000 g STZ = 33,75 mg</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie STZ:
	<ol>
		<li>Zważyć STZ zgodnie z wcześniej obliczoną dawką.</li>
		<li>Przenieść zważony proszek STZ do zlewki o pojemności 10 ml na lodzie.</li>
		<li>Dodać 3 ml roztworu cytrynianu sodu do zlewki, aby rozpuścić STZ.</li>
		<li>Dobrze wymieszaj, przefiltruj, wysterylizuj przez pory 0,22 μm i użyj roztworu STZ w ciągu 10 minut od przygotowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtrysk STZ:
	<ol>
		<li>Załadować żądaną ilość roztworu STZ (wystarczającą na jedną mysz) do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Wykonaj wstrzyknięcie dootrzewnowe w prawy dolny kwadrant brzucha myszy.</li>
		<li>Obserwuj myszy przez 5 minut po wstrzyknięciu i sprawdź, czy w tym czasie nie ma oznak dyskomfortu przed ponownym umieszczeniem ich w klatkach.</li>
		<li>Monitoruj poziom glukozy we krwi z próbki krwi żyły ogonowej za pomocą glukometru codziennie po wstrzyknięciu STZ. 
		UWAGA: W tym eksperymencie myszy są uważane za cukrzyki, gdy poziom glukozy we krwi na czczo wynosi > 350 mg / dl przez dwa kolejne dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie wysepek
UWAGA: Ludzkie wyspy trzustkowe były hodowane w pożywce CMRL-1066 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) o gęstości 10 000 wysepek (IEQ) na 100 mm naczynia do hodowli komórkowej9. Mysie wysepki hodowano w DMEM z 10% FBS i 1% P/S o tej samej gęstości13. Samce myszy NOD-SCID i C57BL/7 w wieku od 6 do 10 tygodni uzyskano ze źródeł komercyjnych.
<ol>
	<li>Odłącz wyhodowane wyspy trzustkowe od naczynia do hodowli komórkowych poprzez delikatne drapanie.</li>
	<li>Ręcznie wybierz żądaną liczbę wysepek (np. 300-350 wysepek) za pomocą strzykawki o pojemności 1 cm3 i umieść je w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
	<li>Obracaj probówkę przez 10 sekund za pomocą mikrowirówki.</li>
	<li>Usuń supernatant, pozostawiając trochę płynu, aby uniknąć utraty osadu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 200 μl HBSS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Odessać zawieszone wyspy trzustkowe do strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę w pozycji pionowej. Pozwól wysepkom opaść na 1 minutę.</li>
	<li>Popchnąć strzykawkę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki, pozostawiając około 100-150 μl płynu zawierającego wysepki.</li>
	<li>Umieścić głowicę strzykawki w dół i delikatnie postukać w bok strzykawki, aby wysepki równomiernie rozprowadziły się w płynie. Wyspy trzustkowe są teraz gotowe do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
3. Przeszczep wysp trzustkowych
<ol>
	<li>Indukuj i utrzymuj mysz w znieczuleniu ogólnym za pomocą 2% izofluranu. Sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie zwierzęcia.</li>
	<li>Ogol i usuń sierść w okolicy brzucha myszy.</li>
	<li>Należy podać pojedynczą przedoperacyjną dawkę buprenorfiny (0,1 mg/kg i.p.).</li>
	<li>Zdezynfekuj obszar operacyjny trzema naprzemiennymi chusteczkami zawierającymi 2% jodu i 75% alkoholu.</li>
	<li>Wykonaj laparotomię mikronożyczkami, aby wygenerować nacięcie o długości 1-1,5 cm.</li>
	<li>Otwórz jamę otrzewnej za pomocą retraktora. Postępuj zgodnie z metodą A lub metodą B, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
4. Metoda A: (zatamować krwawienie pianką żelową, Rysunek 1A)14,15,16
<ol>
	<li>Przygotowanie myszy
	<ol>
		<li>Umieść sterylną gazę wokół nacięcia.</li>
		<li>Delikatnie wyciągnij jelito za pomocą kleszczy i trzymaj je na gazie.</li>
		<li>Zidentyfikuj żyłę wrotną na podstawie jej lokalizacji i dobrze ją wyeksponuj.</li>
		<li>Przykryj jelito ciepłą gazą mokrą od soli fizjologicznej podczas całego zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż wstępnie załadowaną igłę strzykawki insulinowej z wysepką przez żyłę wrotną w pobliżu dwunastnicy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). W tym celu należy przytrzymać igłę otworem (skosem) skierowanym w dół i ustawić kąt powierzchni otworu równolegle do ściany żyły wrotnej przed przebiciem przez ścianę.
	<ol>
		<li>Pociągnąć za tłok, aby pobrać trochę krwi (20-50 μl) do strzykawki, aby najpierw wymieszać wyspy trzasnkowe.</li>
		<li>Powoli wprowadzaj wysepki do żyły wrotnej, wielokrotnie ciągnąc i popychając zanurzenie.</li>
		<li>Umieścić kawałek pianki żelowej (o wymiarach około 0,5 cm x 0,5 cm) tak, aby pokryć miejsce wstrzyknięcia.</li>
		<li>Dociśnij piankę żelową bawełnianą końcówką, jednocześnie wyciągając igłę z żyły wrotnej.</li>
		<li>Kontynuuj naciskanie żelu przez około 2 minuty, aby upewnić się, że nie ma aktywnego krwawienia.</li>
		<li>Przewróć bawełnianą końcówkę na wierzch i odsuń ją od pianki żelowej, aby upewnić się, że pianka żelowa dobrze zakrywa żyłę wrotną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Metoda B: (zatamować krwawienie z poduszeczki tłuszczowej, <silna klasa="xfig">Rysunek 1C)17
<ol>
	<li>Dokładnie odsłoń żyłę wrotną.
	<ol>
		<li>Użyj dwóch bawełnianych końcówek, aby przytrzymać odsłoniętą żyłę wrotną zarówno z lewej, jak i prawej strony.</li>
		<li>Zidentyfikuj poduszeczkę tkanki tłuszczowej między dwunastnicą a żyłą wrotną.</li>
		<li>Przeniknąć przez poduszeczkę tłuszczową przed wkłuciem igły do żyły wrotnej (<silna klasa="xfig">Ryc. 1D).</li>
		<li>Wprowadzić wysepki, postępując zgodnie z podobną procedurą opisaną powyżej w części 4.2.1 i 4.2.2 metody A.</li>
		<li>Wyciągnij igłę, dociskając tłuszcz bawełnianą końcówką.</li>
		<li>Kontynuuj naciskanie na poduszeczkę tłuszczową przez 1 minutę po wyjęciu igły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po upewnieniu się, że nie ma krwawienia z żyły wrotnej, delikatnie przywróć jelito do jamy otrzewnej w pierwotnym położeniu.</li>
	<li>Pozostawić 0,5 ml ciepłej soli fizjologicznej (36-37 °C) w jamie brzusznej przed zamknięciem. 
	UWAGA: Ciepła sól fizjologiczna ułatwia pooperacyjne przemieszczanie jelit i rekonwalescencję oraz zapobiega martwicy jelit.</li>
	<li>Zamknij warstwę mięśniową szwem 5-0.</li>
	<li>Zamknij warstwę skóry szwem 4-0.</li>
	<li>Umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
	<li>Kontynuuj podawanie leku przeciwbólowego (np. buprenorfiny 0,1 mg/kg i.p.) co 12 godzin i dodatkowego ogrzewania przez 48 godzin po zabiegu. 
	UWAGA: Procedura przeszczepu wysp trzustkowych trwa około 15-20 minut.</li>
</ol>
6. Barwienie H&E i zdjęcie całego odcinka wątroby
<ol>
	<li>Perfuzja wątroby
	<ol>
		<li>Umieść mysz w znieczuleniu, jak opisano powyżej w części 3.1.</li>
		<li>Ostrożnie odsłoń żyłę wrotną i przetnij żyłę główną dolną.</li>
		<li>Ręcznie perfundować wątrobę za pomocą 20 ml 10% paraformaldehydu przez żyłę wrotną przez około 5 minut, używając strzykawki o pojemności 20 ml z igłą 25G18. 
		UWAGA: Perfuzja wątroby może usunąć krew z tkanki wątroby i poprawić unieruchomienie wątroby bez naruszania przeszczepów wysp trzustkowych.</li>
		<li>Wypreparuj perfundowaną całą wątrobę z innych narządów.</li>
		<li>Utrwalić perfundowaną tkankę wątroby w 10% paraformaldehydzie przez 24 godziny.</li>
		<li>Zanurz tkankę w parafinie.</li>
		<li>Wyciąć skrawki tkanki o grubości 5 μm każdy i umieścić je na szkiełku w celu barwienia.</li>
		<li>Wykonaj barwienie H&E, insuliny, fibryny i wielojądrzastych neutrofili (PMN) przy użyciu standardowych metod15,16.</li>
		<li>Zeskanuj cały wycinek wątroby pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
<li>Ballinger, W. F., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+intact+pancreatic+islets+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of intact pancreatic islets in rats.</a> Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).</li>
<li>Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ia+antigen+expression+on+murine+islet+parenchymal+cells+does+not+diminish+islet+allograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival.</a> American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).</li>
<li>Toyofuku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+T-cells+participate+in+rejection+of+islet+allografts+in+the+liver+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice.</a> Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).</li>
<li>Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+to+islet+xenografts+in+a+concordant+rat-to-mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model.</a> Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+studying+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation.</a> Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+enhances+islet+engraftment+by+suppression+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction.</a> Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).</li>
<li>Gou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+suppresses+macrophage+activation+and+promotes+islet+graft+survival+after+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. , (2020).</li>
<li>Contreras, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+preserves+functional+islet+mass+after+intraportal+transplantation%3A+A+novel+link+between+endothelial+cell+activation%2C+thrombosis%2C+inflammation%2C+and+islet+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death.</a> Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+islet+transplant+in+the+mouse%3A+functional+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization.</a> Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+treatment+with+carbon+monoxide+can+yield+islet+allograft+survival+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance.</a> Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).</li>
<li>Desai, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liver+histopathology+on+islet+cell+engraftment+in+the+model+mimicking+autologous+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation.</a> Islets. 9 (6), 140-149 (2017).</li>
<li>Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+formulations+of+thrombomodulin+increase+engraftment+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
<li>Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatoparenchymal+clearance+of+indocyanine+green+in+infectious+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Giornale+di+Malattie+Infettive+e+Parassitarie%22%5BJournal%5D)">Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis.</a> Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+transplantation+of+pancreatic+islets+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cell+and+islet+cotransplantation%3A+Safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W tym badaniu wykazano dwie ulepszone procedury, które mogą zapobiegać krwawieniu i mogą zmniejszać śmiertelność myszy podczas IIT u myszy. Badanie to umożliwia naukowcom wizualizację modelu przeszczepu wysp trzustkowych, który jest unikalny w badaniu natychmiastowej reakcji zapalnej za pośrednictwem krwi po przeszczepie. Model IIT jest charakterystycznym modelem do badania przeżywalności komórek wysp trzustkowych i uszkodzeń niedokrwiennych wątroby w odpowiedzi na przeszczep wysp trzustkowych19. ...

Przeszczepianie wysp trzustkowych (IIT) przez żyłę wrotną jest najczęściej stosowaną metodą przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych w warunkach klinicznych. Mysi model IIT oferuje doskonałą okazję do zbadania transplantacji wysp trzustkowych i przetestowania obiecujących podejść interwencyjnych, które mogą zwiększyć skuteczność przeszczepu wysp trzustkowych1. IIT został po raz pierwszy opisany w latach siedemdziesiątych XX wieku i używany przez kilka grup1,2,3,4,5. Odzyskał popularność po przełomie w transplantacji ludzkich wysp trzustkowych w roku 20006,7. Jednak w większości badań nad przeszczepem wysp trzustkowych wykorzystywano torebkę nerkową jako preferowane miejsce do eksperymentalnego przeszczepu wysp trzustkowych ze względu na jej łatwy sukces. Wręcz przeciwnie, TIZ jest bardziej wymagająca technicznie i rzadziej stosowana w badaniach nad przeszczepem wysp trzustkowych8,9. Jednak w przeciwieństwie do IIT, wyspy trzustkowe przeszczepione pod torebkę nerkową nie cierpią na natychmiastową reakcję zapalną za pośrednictwem krwi, charakteryzującą się zakrzepicą, stanem zapalnym i niedokrwieniem tkanki wątrobowej, a zatem mają lepszą funkcję niż wyspy trzustkowe przeszczepione do wątroby. Model torebki nerkowej może zatem nie naśladować w pełni naprężeń napotykanych przez wyspy trzustkowe podczas przeszczepiania ludzkich wysp trzustkowych10,11,12.
Jednym z głównych powikłań IIT u myszy jest krwawienie z miejsca wstrzyknięcia po przeszczepie, co może spowodować 10-30% śmiertelności wśród różnych szczepów myszy12. W tym artykule opracowano dwa udoskonalone podejścia mające na celu szybsze i bezpieczniejsze zatrzymanie krwawienia oraz zmniejszenie śmiertelności myszy po IIT. Wizualna demonstracja tych wyrafinowanych szczegółów pomoże naukowcom zidentyfikować kluczowe etapy tej technicznie wymagającej procedury. Ponadto lokalizacja przeszczepów wysp trzustkowych w wątrobie biorcy została określona na podstawie badania histologicznego tkanki wątroby (cały odcinek) barwionej hematoksyliną i eozyną (H&E) zawierającej przeszczepione wyspy trzustkowe.

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina v/v</td><td>Fisher Scientific 23426796</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka z igłą</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Strzykawka</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8" igły podskórne</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem, sterylne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie zwierząt system</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Chlorowodorek buprenorfiny, do wstrzykiwań</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny (200 dowodów), klasa biologii molekularnej</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Bardzo cienkie nożyczki do mikro preparowania 4 "proste, ostre</td><td>narzędzie chirurgiczne Roboz Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp; Glukometr</td><td>Paski</td> testowe do pomiaru stężenia glukozy we krwi Abbott <td>Lite</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle Gelfoam (wchłanialna gąbka żelatynowa, USP)</td><td>Pharmacia & Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe 4-calowa bardzo delikatna końcówka</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana podkładka</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły Hegar-Baumgartner 5,25 "</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z igłą o rozmiarze 27 BD</td><td></td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki do przygotowania jodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (P/S)</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Szew polipropylenowy 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Szew polipropylenowy 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 0,9% roztwór dożylny</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Streptozocin (STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Obłożenie chirurgiczne, sterylne</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta na tkanki</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Chociaż wątroba jest obecnie akceptowana jako główne miejsce przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych w warunkach klinicznych, wyspy trzustkowe są przeszczepiane pod torebkę nerkową w większości przedklinicznych badań nad przeszczepem wysp trzustkowych u gryzoni. Model ten jest powszechnie stosowany, ponieważ przeszczep mysich wysp trzustkowych wewnątrz wątroby jest technicznie trudny, a wysoki odsetek myszy może umrzeć z powodu powikłań chirurgicznych, zwłaszcza krwawienia z miejsca wstrzyknięcia po przeszczepie. W tym badaniu przedstawiono dwie procedury, które mogą zminimalizować częstość występowania krwawienia z żyły wrotnej po infuzji. Pierwsza metoda polega na nałożeniu wchłanialnej hemostatycznej gąbki żelatynowej na miejsce wstrzyknięcia, a druga metoda polega na penetracji igły do wstrzykiwania wysp trzustkowych najpierw przez tkankę tłuszczową, a następnie do żyły wrotnej poprzez wykorzystanie tkanki tłuszczowej jako fizycznej bariery zatrzymującej krwawienie. Obie metody mogą skutecznie zapobiegać śmierci myszy wywołanej krwawieniem. Przedstawiono cały wycinek wątroby ukazujący rozmieszczenie wysp trzustkowych oraz objawy zakrzepicy wysp trzustkowych po przeszczepieniu, co jest cechą typową dla przeszczepienia wysp wewnątrzwątrobowych. Te ulepszone protokoły udoskonalają procedury przeszczepiania wysp trzustkowych wewnątrz wątroby i mogą pomóc laboratoriom w przygotowaniu procedury do badania przeżywalności i funkcji wysp trzustkowych w warunkach przedklinicznych.

Przeprowadziliśmy syngeneiczne i ksenogeneiczne przeszczepy wysepek przez żyłę wrotną. Funkcję przeszczepionych wysepek obserwowano w sposób zależny od dawki w obu modelach transplantacji. W modelu syngeneicznego przeszczepu wysepek z wykorzystaniem myszy C57BL/6, transplantacja 250 wysepek doprowadziła do przejściowej normoglikemii, przed powrotem myszy do stanu hiperglikemii. Myszy, które otrzymały 500 wysepek, osiągnęły i utrzymały normoglikemię powyżej 30 dni po transplantacji (Rycina 2A...

Tutaj prezentujemy wyrafinowane procedury chirurgiczne dotyczące skutecznego przeprowadzenia przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrz portalu, klinicznie istotnej, ale technicznie trudnej procedury chirurgicznej u myszy.

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Wątroba jest głównym miejscem przeszczepienia w warunkach klinicznych ludzkich wysp trzustkowych. Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrz wątroby u myszy jest technicznie trudny, a wysoki odsetek myszy może umrzeć z powodu powikłań chirurgicznych, zwłaszcza krwawienia. W tym badaniu dwie metody, które pokazaliśmy, mogą skutecznie zapobiegać śmierci myszy wywołanej krwawieniem.Nasza metoda może być stosowana do badań nad rakiem wątroby i innymi chorobami wątroby, umożliwiając wstrzykiwanie komórek rakowych, mezenchymalnych komórek macierzystych i hepatocytów bezpośrednio do wątroby. Na początek odłącz ludzką kulturę wysepek delikatnym drapaniem. Użyj strzykawki o pojemności 1 centymetra sześciennego, aby pobrać od 300 do 350 wysepek do sterylnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych na lodzie.Po zebraniu wszystkich wysepek odwiruj probówki przez 10 sekund, aby osadzić komórki. Wyrzuć całą objętość supernatantu, aby zapobiec utracie osadu, i ponownie zawieś wysepki w 200 mikrolitrach HBSS zawierających 5% BSA. Załadować zawieszone wyspy trzasnkowe do 5-mililitrowej strzykawki insulinowej i obrócić końcówkę igły strzykawki do góry na 1 minutę, aby wyspy osładowały się na tłoku.Wcisnąć tłok, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, pozostawiając około 100 do 150 mikrolitrów roztworu w strzykawce i odwrócić strzykawkę, delikatnie stukając, aby równomiernie rozprowadzić wysepki. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Ogol brzuch znieczulonej myszy, aby usunąć sierść i zdezynfekuj obszar operacyjny trzema naprzemiennymi chusteczkami z 2% jodem i 75% alkoholem.Następnie wykonaj nacięcie od 1 do 1,5 centymetra w jamie brzusznej i otwórz jamę otrzewnej. Umieść sterylny kawałek gazy wokół nacięcia i za pomocą kleszczy lub bawełnianych końcówek delikatnie przenieś jelito na gazę. Następnie przykryj jelito kawałkiem gazy nasączonej solą fizjologiczną i odsłonij żyłę wrotną.Aby zatrzymać krwawienie wywołane przeniesieniem wysp trzustkowych za pomocą pianki żelowej, należy przytrzymać igłę skosem skierowanym w dół i ustawić końcówkę igły tak, aby otwór był równoległy do ściany żyły wrotnej przed wprowadzeniem igły do żyły wrotnej. Cofnąć tłok, aby pobrać od 20 do 50 mikrolitrów krwi do strzykawki w celu wymieszania z wysepkami przed wprowadzeniem wysepek trzustkowych do żyły wrotnej, wielokrotnie wciskając i cofając tłok. Po dostarczeniu wszystkich wysepek należy umieścić kawałek pianki żelowej o wymiarach około 5 na 5 centymetrów w miejscu wstrzyknięcia.Użyj bawełnianej końcówki, aby docisnąć piankę żelową podczas wyjmowania igły z żyły wrotnej. Przytrzymaj żel na miejscu przez około 2 minuty, zwijając piankę żelową, aby upewnić się, że zakrywa żyłę wrotną. Po zatrzymaniu krwawienia delikatnie przywróć jelito do jamy otrzewnej w pierwotnej pozycji i wstrzyknij 500 mikrolitrów ciepłej soli fizjologicznej do jamy brzusznej.Użyj szwów, aby zamknąć warstwy mięśni i skóry. Następnie umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia, podając środek przeciwbólowy co 12 godzin i podgrzewając przez 48 godzin. Aby zatrzymać krwawienie wywołane przeniesieniem wysp trzustkowych za pomocą poduszeczki tłuszczowej, po odsłonięciu żyły wrotnej, jak pokazano, użyj dwóch bawełnianych końcówek, aby przytrzymać odsłoniętą żyłę po lewej i prawej stronie i zlokalizuj poduszeczkę tkanki tłuszczowej między dwunastnicą a żyłą wrotną.Przeniknąć do poduszeczki tłuszczowej końcówką igły przed włożeniem do żyły wrotnej. Wlej wysepki do żyły wrotnej, jak pokazano. Po dostarczeniu wszystkich wysepek należy dociskać tkankę tłuszczową bawełnianą końcówką przez około 1 minutę, jednocześnie wyjmując igłę z żyły.Następnie należy przywrócić jelito do jamy brzusznej i wykonać pozostałe zabiegi opieki pooperacyjnej, jak pokazano. Efekty przeszczepu wysp trzustkowych są zależne od dawki, ponieważ normalną glikemię obserwuje się 30 dni po przeszczepieniu wysp syngenicznych, gdy przenosi się 500 wysp, ale obserwuje się tylko przejściową normoglikemię po dostarczeniu 250 wysp, przy czym myszy wracają do hiperglikemii po 10 dniach od przeszczepu. W obu grupach obserwuje się zwiększoną masę ciała i identyczne reakcje obserwuje się, gdy ludzkie wyspy trzustkowe są przeszczepiane myszom NOD-SCID z cukrzycą, z normoglikemią obserwowaną, gdy przeszczepia się większą liczbę odpowiedników wysp trzustkowych, ale nie mniejszą.Większość myszy, które mają krwawienie po transferze, umiera po operacji, podczas gdy myszy bez krwawienia przeżywają. Po 28 dniach od przeszczepu barwienie insuliną ujawnia równomierne rozmieszczenie ludzkiej wyspy trzustkowej w wątrobie, głównie w pobliżu naczyń krwionośnych. Oprócz insuliny, fibryny i filtracji komórek wielojądrzastych obserwuje się również w przeszczepionych ludzkich wyspach trzustkowych.Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrz wątroby spowoduje powstanie dużej w żyle wrotnej, która może spowodować krwawienie. Korzystanie z naszych dwóch ulepszonych procedur może zapobiec krwawieniu i zmniejszyć śmiertelność po przeszczepie wysp trzustkowych. Model przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwrotnych może naśladować kliniczne przeszczepianie wysp trzustkowych u ludzi.Nasze udoskonalone procedury mogą prowadzić do wyższych wskaźników przeżycia biorców, co pozwala na dalsze badanie funkcji wysp trzustkowych po przeszczepie.

minimizing-post-infusion-portal-vein-bleeding-during-intrahepatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje zabieg chirurgiczny polegający na dostarczeniu komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten pozwala na badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby.

Wstrzyknięcie żyły wrotnej: metoda badania przerzutów raka do wątroby

W tym filmie opisujemy procedurę wprowadzania komórek wysp trzustkowych do żyły wrotnej wątroby, a następnie aplikacji pianki żelowej, aby skutecznie zapobiec krwawieniu. Krwawienie pooperacyjne jest częstą przyczyną wysokiej śmiertelności podczas przeszczepu wysp trzustkowych.

Mysi model przeszczepu wysp trzustkowych: chirurgiczna metoda wprowadzania wysp trzustkowych do żyły wrotnej i zapobiegania krwawieniu pooperacyjnemu

Narzędzia używane do wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wymagają metod kontrastowania drzew naczyniowych. Film ten zademonstrował delikatną technikę iniekcji zastosowaną w celu uzyskania optymalnego kontrastu drzew naczyniowych i zilustrował potencjalne korzyści wynikające ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych.

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Klirens insuliny wątrobowej jest kluczowy dla regulacji homeostazy glukozy. W tym artykule opisano przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie in situ u myszy.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Poznaj udoskonalone techniki chirurgiczne przeszczepu wysp trzustkowych do żyły wrotnej u myszy, które skutecznie zapobiegają krwawieniu i zmniejszają śmiertelność. Metody te wspierają badania nad chorobami wątroby i nowotworami.

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów