Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Wątroba jest głównym miejscem przeszczepienia w warunkach klinicznych ludzkich wysp trzustkowych. Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrz wątroby u myszy jest technicznie trudny, a wysoki odsetek myszy może umrzeć z powodu powikłań chirurgicznych, zwłaszcza krwawienia. W tym badaniu dwie metody, które pokazaliśmy, mogą skutecznie zapobiegać śmierci myszy wywołanej krwawieniem.

Nasza metoda może być stosowana do badań nad rakiem wątroby i innymi chorobami wątroby, umożliwiając wstrzykiwanie komórek rakowych, mezenchymalnych komórek macierzystych i hepatocytów bezpośrednio do wątroby. Na początek odłącz ludzką kulturę wysepek delikatnym drapaniem. Użyj strzykawki o pojemności 1 centymetra sześciennego, aby pobrać od 300 do 350 wysepek do sterylnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych na lodzie.

Po zebraniu wszystkich wysepek odwiruj probówki przez 10 sekund, aby osadzić komórki. Wyrzuć całą objętość supernatantu, aby zapobiec utracie osadu, i ponownie zawieś wysepki w 200 mikrolitrach HBSS zawierających 5% BSA. Załadować zawieszone wyspy trzasnkowe do 5-mililitrowej strzykawki insulinowej i obrócić końcówkę igły strzykawki do góry na 1 minutę, aby wyspy osładowały się na tłoku.

Wcisnąć tłok, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, pozostawiając około 100 do 150 mikrolitrów roztworu w strzykawce i odwrócić strzykawkę, delikatnie stukając, aby równomiernie rozprowadzić wysepki. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Ogol brzuch znieczulonej myszy, aby usunąć sierść i zdezynfekuj obszar operacyjny trzema naprzemiennymi chusteczkami z 2% jodem i 75% alkoholem.

Następnie wykonaj nacięcie od 1 do 1,5 centymetra w jamie brzusznej i otwórz jamę otrzewnej. Umieść sterylny kawałek gazy wokół nacięcia i za pomocą kleszczy lub bawełnianych końcówek delikatnie przenieś jelito na gazę. Następnie przykryj jelito kawałkiem gazy nasączonej solą fizjologiczną i odsłonij żyłę wrotną.

Aby zatrzymać krwawienie wywołane przeniesieniem wysp trzustkowych za pomocą pianki żelowej, należy przytrzymać igłę skosem skierowanym w dół i ustawić końcówkę igły tak, aby otwór był równoległy do ściany żyły wrotnej przed wprowadzeniem igły do żyły wrotnej. Cofnąć tłok, aby pobrać od 20 do 50 mikrolitrów krwi do strzykawki w celu wymieszania z wysepkami przed wprowadzeniem wysepek trzustkowych do żyły wrotnej, wielokrotnie wciskając i cofając tłok. Po dostarczeniu wszystkich wysepek należy umieścić kawałek pianki żelowej o wymiarach około 5 na 5 centymetrów w miejscu wstrzyknięcia.

Użyj bawełnianej końcówki, aby docisnąć piankę żelową podczas wyjmowania igły z żyły wrotnej. Przytrzymaj żel na miejscu przez około 2 minuty, zwijając piankę żelową, aby upewnić się, że zakrywa żyłę wrotną. Po zatrzymaniu krwawienia delikatnie przywróć jelito do jamy otrzewnej w pierwotnej pozycji i wstrzyknij 500 mikrolitrów ciepłej soli fizjologicznej do jamy brzusznej.

Użyj szwów, aby zamknąć warstwy mięśni i skóry. Następnie umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia, podając środek przeciwbólowy co 12 godzin i podgrzewając przez 48 godzin. Aby zatrzymać krwawienie wywołane przeniesieniem wysp trzustkowych za pomocą poduszeczki tłuszczowej, po odsłonięciu żyły wrotnej, jak pokazano, użyj dwóch bawełnianych końcówek, aby przytrzymać odsłoniętą żyłę po lewej i prawej stronie i zlokalizuj poduszeczkę tkanki tłuszczowej między dwunastnicą a żyłą wrotną.

Przeniknąć do poduszeczki tłuszczowej końcówką igły przed włożeniem do żyły wrotnej. Wlej wysepki do żyły wrotnej, jak pokazano. Po dostarczeniu wszystkich wysepek należy dociskać tkankę tłuszczową bawełnianą końcówką przez około 1 minutę, jednocześnie wyjmując igłę z żyły.

Następnie należy przywrócić jelito do jamy brzusznej i wykonać pozostałe zabiegi opieki pooperacyjnej, jak pokazano. Efekty przeszczepu wysp trzustkowych są zależne od dawki, ponieważ normalną glikemię obserwuje się 30 dni po przeszczepieniu wysp syngenicznych, gdy przenosi się 500 wysp, ale obserwuje się tylko przejściową normoglikemię po dostarczeniu 250 wysp, przy czym myszy wracają do hiperglikemii po 10 dniach od przeszczepu. W obu grupach obserwuje się zwiększoną masę ciała i identyczne reakcje obserwuje się, gdy ludzkie wyspy trzustkowe są przeszczepiane myszom NOD-SCID z cukrzycą, z normoglikemią obserwowaną, gdy przeszczepia się większą liczbę odpowiedników wysp trzustkowych, ale nie mniejszą.

Większość myszy, które mają krwawienie po transferze, umiera po operacji, podczas gdy myszy bez krwawienia przeżywają. Po 28 dniach od przeszczepu barwienie insuliną ujawnia równomierne rozmieszczenie ludzkiej wyspy trzustkowej w wątrobie, głównie w pobliżu naczyń krwionośnych. Oprócz insuliny, fibryny i filtracji komórek wielojądrzastych obserwuje się również w przeszczepionych ludzkich wyspach trzustkowych.

Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrz wątroby spowoduje powstanie dużej w żyle wrotnej, która może spowodować krwawienie. Korzystanie z naszych dwóch ulepszonych procedur może zapobiec krwawieniu i zmniejszyć śmiertelność po przeszczepie wysp trzustkowych. Model przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwrotnych może naśladować kliniczne przeszczepianie wysp trzustkowych u ludzi.

Nasze udoskonalone procedury mogą prowadzić do wyższych wskaźników przeżycia biorców, co pozwala na dalsze badanie funkcji wysp trzustkowych po przeszczepie.