Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym

Wizualizacja wychwytu małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, znanych również jako sEV, przez różne komórki rdzenia kręgowego, może potwierdzić pomyślne dostarczenie sEV. Umożliwia to zarówno mechanistyczne, jak i terapeutyczne badania dokanałowo podawanych sEV z różnych źródeł w modelach Roden. Protokół ten może być wykorzystany do wizualizacji wychwytu sEV przez komórki w łagodnym rdzeniu kręgowym i może pomóc w ocenie roli sEV i jego cząsteczek ładunkowych w zaburzeniach kręgosłupa, bólu i stanach zapalnych.

Ta procedura zostanie zademonstrowana przeze mnie, wraz z Xuan Luo i Zhucheng Lin, dwoma doktorantami w laboratorium dr Seena Ajit. Zacznij od umieszczenia 18-milimetrowych szkiełek nakrywkowych w 12-dołkowej płytce, a następnie umieść komórki neuro-2a w każdym dołku z łącznie 1 mililitrem kompletnego DMEM zawierającego 10% FBS i 1% paciorkowca. Gdy płynność liczby komórek osiągnie 80 do 90%, zmień pożywkę na pożywkę zubożoną w egzosomy DMEM w każdej studzience dodaj jeden, 5 lub 10 mikrogramów znakowanych sEV.

Przez 1, 4 i 24 godziny. Do zależnego od dawki i czasu wchłaniania do pozostałych studzienek przy równej objętości kontroli barwnika. Zbierz mózgi młodych po urodzeniu na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór soli Hanksa uzupełniony 10 milimolowymi hepami, wypreparuj oba płaty korowe i usuń opony mózgowe.

Następnie zmiel chusteczki wysterylizowanym ostrzem. Przenieść tkanki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej pepane lub dezoksyrybonukleus jeden bufor dysocjacyjny i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, obracając probówkę co 5 minut, odessać supernatant i dodać 5 mililitrów kompletnego DMEM do probówki. Aby dezaktywować aktywność enzymu, spróbuj ostrożnie ocenić, aby zdysocjować tkanki za pomocą 5-mililitrowej szklanej pipety serologicznej i polerowanej płomieniowo pipety pastwiskowej.

Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, a następnie odwiruj komórki w temperaturze 250 razy G przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, odessać pożywkę i zobaczyć komórki w 10 mililitrach kompletnego DMEM w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Po 4 godzinach powlekania zastąp supernat i pożywkę 15 mililitrami świeżej pożywki DMEM. Po 14 dniach in vitro w celu odłączenia mikrogleju i oligodendrocytów, przenieść kolbę do wytrząsarki orbitalnej z prędkością 320 obr./min na 6 godzin.

Użyj 5 mililitrów enzymu dysocjacji komórek przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby tripsynizować, pozostałe astrocyty, aby dezaktywować działanie enzymatyczne, dodaj 5 mililitrów kompletnego DMEM, a następnie osadzaj komórki w temperaturze 250 razy G przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawieś komórki w kompletnym DMEM i zobacz komórki na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych o liczbie 1,5 w płytce 24-dołkowej.

Za pomocą PBS przepłucz komórki 3 razy, a następnie utrwal je 4% formaldehydem lub PFA w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj stałe komórki 3 razy przez 5 minut PBS i przepuszczaj je za pomocą 0,1% Triton X 100 w PBS przez 10 do 15 minut. Następnie powtórz pranie z PBS.

Użyj 5% normalnej koziej surowicy lub NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować komórki, inkubować komórki neuro-2a z dwukierunkowymi przeciwciałami map i pierwszorzędowymi astrocytami z przeciwciałami GFAP w stosunku 1 do 500 w świeżym 5% NGS lub PBS przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z delikatnym potrząsaniem. Po 3-krotnym umyciu komórek w PBS, dodać przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w 5% NGS. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem na bujaku.

Powtórzyć mycie PBS i inkubować komórkę z 1 mikrogramem na mililitr DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj komórki 3 razy PBS. Używając środka mocującego zapobiegającego blaknięciu, zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach numer 1, pozostaw do wyschnięcia przez noc w ciemności i przechowuj przygotowane szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu zobrazowania w mikroskopie konfokalnym.

Wypreparuj rdzeń kręgowy i utrwal go w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Wcześniej zabezpiecz tkanki w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 24 godziny lub do momentu, gdy tkanki opadną, a następnie przechowuj tkanki w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu immunohistochemii, zanurz rdzeń kręgowy L4 L5 w związku OCT, a następnie zamroź go na suchym lodzie aż do całkowitego zestalenia. Za pomocą kriostatu należy podzielić tkanki na głębokość 30 mikrometrów i zebrać skrawki na 24-dołkowej płytce zawierającej PBS.

Umyj skrawki 3 razy po 5 minut za pomocą 0,3% Tritonu w PBS, zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 5%MGS w 0,3% Triton PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Skrawki inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na shakerze. Umyj sekcje 3 razy przez 5 minut 0,3% Tritonem w Pbs.

Następnie dodać odpowiednie stężenie przeciwciał drugorzędowych. Zgodnie z rękopisem tekstu, inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, myć skrawki przy użyciu wyłącznie PBS i inkubować je w 1 mikrogramie na mililitr DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz mycie PBS pod mikroskopem świetlnym, zamontuj sekcje na przezroczystym szkiełku samoprzylepnym za pomocą cienkiego pędzla

Zwilżyć szkiełko nakrywkowe medium montażowym i utwardzić przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej, uzyskać obrazy pod mikroskopem konfokalnym za pomocą odpowiednich laserów, Średnia wielkość RA 2 6 4 0,7 pochodnych sEV wynosiła 140 nanometrów, a szczytowa wielkość cząstek wynosiła 121,8 nanometrów. Z najbardziej wykrywalnymi cząstkami mieszczącymi się w zakresie wielkości egzosomów lub sEVS. Przy 50 do 150 nanometrach western blot sEVs, lizatu komórkowego i eksodepletowanych pożywek wykazał, że próbki białek pochodzących z sEV zawierały białka markerowe sEV Alix CD81 i GAPDH.

Lizat komórkowy został wzbogacony retikulum endoplazmatyczne, rezydującym białkiem Calnexin, dzięki czemu Calnexin służył jako ujemny marker zanieczyszczenia komórkowego, ponieważ był nieobecny w sEVs. Zaobserwowano, że wychwyt sEV nastąpił po 1 godzinie, a dla sEV o wielkości 1, 5 i 10 mikrogramów fluorescencję po inkubacji można było wykryć po 4 godzinach, dla 4, 5 i 10 mikrogramów sEV. Zbadano wychwyt sEV znakowanych PKH 26 przez astrocyty pierwotne, a maksymalna fluorescencja z wychwytu sEVS w pierwotnych astrocytach korowych wystąpiła po 24 godzinach, wychwycono sEV znakowane PKH26, a maksymalną fluorescencję zaobserwowano po 6 godzinach, po wstrzyknięciu w neurony, astrocyty i komórki mikrogleju.

Włączenie kontroli, nieoznakowanych sEV i kontroli barwnika tworzy kod do wiatru fałszywie dodatnich ostatnich sygnałów ze względu na teraz specyficzne etykietowanie Taniec Opry wybrzeży Unbound dye patch. Wychwyt seVs można potwierdzić poprzez badanie transferu ładunku biomolekularnego do receptury oraz komórek i tkanek oraz określenie zmian w poziomach ekspresji biomolekuł lub genów docelowych. Można również przeprowadzić badania behawioralne w celu zbadania funkcjonalnego wpływu dostarczania sEV.