Name: Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę wychwytu fluorescencyjnie znakowanych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w komórkach rdzenia kręgowego in vitro i in vivo. Ta technika umożliwia badanie roli sEV w stanach zapalnych i bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z NIH NINDS R01NS102836 oraz Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) przyznane Seena K. Ajit. Dziękujemy dr Bradleyowi Nashowi za krytyczną lekturę manuskryptu.

UWAGA: Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Drexel University College of Medicine. Myszy CD-1 w ciąży w ciąży w czasie wykorzystano do hodowli astrocytów, a wszystkie matki otrzymano 15 dni po zapłodnieniu. Dziesięciodwunastotygodniowe myszy C57BL/6 wykorzystano do eksperymentów z wychwytem in vivo.
1. Izolacja sEV z komórek makrofagów RAW 264.7
<ol>
	<li>Hodowla RAW 264,7 komórek w 75 cm2 kolbach w pożywce zubożonej w egzosomy DMEM zawierającej 10% zubożonej w egzosomy płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zubożonej w egzosomy i 1% penicyliny-streptomycyny (pen-strep) przez 24-48 godzin.</li>
	<li>Zebrać 300 ml kondycjonowanej pożywki i odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać sklarowany osad i odwirować w temperaturze 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do probówek wirówkowych, wirować przez 35 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
	<li>Przenieść do probówek ultrawirówek i wirować przez 80 minut w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowywać supernatant (pożywkę zubożoną w egzosomy), ponownie zawiesić osad w 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i odwirowywać przez 1 godzinę w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl PBS w celu dalszej charakterystyki przy użyciu analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) lub w buforze testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) do western blot.</li>
</ol>
2. Charakterystyka sEV
<ol>
	<li>Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) 
	UWAGA: Rozkład wielkości i liczba/stężenie cząstek oczyszczonych sEV z ogniw RAW 264.7 zostały zmierzone za pomocą NTA.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć sEV w przefiltrowanym PBS, aby uzyskać 20-60 pęcherzyków na pole widzenia w celu optymalnego śledzenia.</li>
		<li>Wprowadzić rozcieńczoną próbkę do celi przepływowej za pomocą pompy strzykawkowej o stałym natężeniu przepływu.</li>
		<li>Zrób 3-5 filmów po 30 sekund każdy. Ustaw czas otwarcia migawki i wzmocnienie, a następnie ręcznie ustaw ostrość ustawień aparatu, aby uzyskać maksymalną liczbę pęcherzyków, które mają być widoczne i mogą być śledzone i analizowane.</li>
		<li>Przesuwaj próbki między każdym nagraniem, aby wykonać powtórzone pomiary. Zoptymalizuj ustawienia NTA po akwizycji i utrzymuj stałe ustawienia między próbkami.</li>
		<li>Przeanalizuj każdy film za pomocą oprogramowania NTA, aby uzyskać średnią wielkość i stężenie pęcherzyków.</li>
		<li>Wykonuj wszystkie pomiary NTA z identycznymi ustawieniami systemowymi w celu zapewnienia spójności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plama zachodnia
	<ol>
		<li>Określ ilościowo całkowite ilości białka w sEV, lizatach komórkowych i pożywkach zubożonych w egzosomy za pomocą zestawu do oznaczania białek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>W celu przygotowania lizatu komórkowego należy hodować komórki RAW 264,7 w kolbach o długości 75cm2 do uzyskania 80-90% zlewu. Odłącz komórki z 0,25% trypsyną na 10-15 min, zneutralizuj trypsynę pożywką hodowlaną i osadź komórki, wirując z prędkością 400 × g przez 5 min. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce wzrostowej.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 1 × 106 komórek do innej probówki. Przemyć komórki dwukrotnie PBS, stosując te same warunki wirowania, co powyżej, i dodać 50 μl buforu do lizy (bufor RIPA z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteazy) do osadu komórkowego z ostatniego wirowania.</li>
		<li>Zwirować komórki i trzymać je na lodzie przez 20 minut. Mieszaninę poddać odwirowaniu w temperaturze 10 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant (tj. lizat) w świeżych probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Skoncentrować 2 ml pożywki zubożonej w egzosomy do 100 μl za pomocą filtrów odśrodkowych o natężeniu 3 kDa przed ilościowym określeniem ilości białka. Wymieszaj sEV z buforem do lizy w stosunku 1:1, wiruj przez 30 s i inkubuj na lodzie przez 15 minut, aby określić ilościowo ilość białka.</li>
		<li>Wymieszaj równe ilości białka (2 μg) sEVs, lizatu komórkowego RAW 264.7 i pożywki zubożonej w egzosomy z redukującym buforem próbki.</li>
		<li>Denaturacja próbek w temperaturze 95 °C przez 5 minut, przetrzymywanie ich na lodzie przez 5 minut i wirowanie przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g. Załaduj próbki do 12% żelu białkowego tris-glicyny i uruchom żel pod napięciem 125 V przez 45 minut.</li>
		<li>Przenieść białko na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 25 V przez 2 godziny.</li>
		<li>Po przeniesieniu należy zablokować membrany PVDF buforem blokującym (patrz Tabela Materiałów) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować blot z przeciwciałami pierwszorzędowymi na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Podstawowymi stosowanymi przeciwciałami były anty-CD81 (1:1,000), anty-alfa-1,3/1,6-mannozylotransferaza (ALG-2)-oddziałujące białko X (Alix) (1:1,000), anty-kalnexin (1:1,000) i dehydrogenaza anty-gliceraldehydowo-3-fosforanowa (GAPDH) (1:1,000).</li>
		<li>Przemyj bloty 3 x 15 min 1x solą fizjologiczną buforowaną Tris, 0,1% Tween 20 (TBST) i inkubuj w temperaturze pokojowej z koziami przeciwciałami drugorzędowymi anty-mysimi IgG-chrzanowymi (HRP) lub osłem anty-króliczymi przeciwciałami drugorzędowymi IgG-HRP (1:10 000) przez 1 godzinę na shakerze.</li>
		<li>Przemyj bloty 3 x 15 min 1x TBST i wykryj białka za pomocą substratu HRP.</li>
		<li>Analizuj blot za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji przy użyciu obrazowania western blot.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
	<ol>
		<li>Napraw sEV poprzez ponowne zawieszenie ich w 2% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB); wir przez 2 x 15 s.</li>
		<li>Umieść kroplę 10 μl zawiesiny sEV na czystym parafilmie. Unosić pokrytą węglem siatkę formvar na kropli powlekaną stroną skierowaną w stronę zawieszenia. Pozwól membranom wchłonąć się przez 20 minut w suchym środowisku.</li>
		<li>Umieść kratki (membraną do dołu) na kropli PB do prania przez 3 x 2 min.</li>
		<li>Przenieść siatki do 50 μl 1% aldehydu glutarowego na 5 minut.</li>
		<li>Myć kratki 100 μl wody destylowanej przez 8 x 2 min.</li>
		<li>Porównaj próbkę, umieszczając siatki na kropli 1% octanu uranylu na 2 minuty.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w 50 μl 0,2% octanu uranylu z 2% roztworem metylocelulozy na 10 minut na pokrytym parafilmem naczyniu z lodem.</li>
		<li>Użyj pętli ze stali nierdzewnej, aby przytrzymać kratki i usunąć nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
		<li>Wysusz siatkę na powietrzu przez 10 minut, będąc jeszcze w pętli.</li>
		<li>Obserwować pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy napięciu 80 kV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Etykietowanie sEV
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 20 μg sEV w 1 ml buforu rozcieńczającego lub taką samą objętość PBS w 1 ml buforu rozcieńczalnika do kontroli barwnika.</li>
	<li>Rozcieńczyć 3 μl barwnika PKH67 lub PKH26 w 1 ml buforu rozcieńczalnika i wymieszać pipetując.</li>
	<li>Dodać rozcieńczony barwnik PKH do rozcieńczonych sEV i wymieszać przez pipetowanie. Inkubować przez 5 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. W celu kontroli barwnika należy zmieszać rozcieńczony barwnik z rozcieńczonym PBS z kroku 3.1.</li>
	<li>Dodać 2 ml 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS do probówki z mieszanką barwnika i sEV oraz do probówki kontrolnej barwnika, aby wchłonąć nadmiar barwnika.</li>
	<li>Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 2 ml PBS i wirować przez 1 godzinę w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C. Powtórzyć płukanie z PBS i ponownie zawiesić oznakowane sEVs lub kontrolę barwnika w równej objętości PBS.</li>
	<li>Określić ilościowo ilość białka całkowitego metodą Bradforda.</li>
</ol>
4. Wychwyt sEVs przez komórki Neuro-2a
<ol>
	<li>Umieścić 18-milimetrowe szkiełka nakrywkowe na płytce 12-dołkowej i płytkę 10 ×10 4 komórki Neuro-2a w każdym dołku w sumie 1 ml kompletnego podłoża DMEM zawierającego 10% FBS i 1% paciorkowca pióra.</li>
	<li>Zmień pożywkę na pożywkę zubożoną w egzosomy DMEM, gdy zbieg komórek wynosi 80-90%. Dodaj 1, 5 lub 10 μg znakowanych sEV do każdej studzienki przez 1, 4 i 24 godziny w celu wychwytu zależnego od dawki i czasu lub dodaj równą objętość kontroli barwnika.</li>
</ol>
5. Pierwotne kultury astrocytów
<ol>
	<li>Znieczulić 4 młode po urodzeniu 4 dni po urodzeniu, wywołując hipotermię.</li>
	<li>Zbierz mózgi na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór soli Hanka (HBSS) uzupełniony 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES).</li>
	<li>Wypreparuj oba płaty korowe i usuń opony mózgowe. Zmiel chusteczki wysterylizowanym ostrzem.</li>
	<li>Przenieść tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej bufor dysocjacyjny papainy/dezoksyrybonukleazy I i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać co 5 minut 
	UWAGA: W przypadku 4 kory myszy 9 ml papainy o stężeniu 7,5 U/ml w HBSS aktywuje się w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut, filtruje przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i miesza z dezoksyrybonukleazą I do końcowego stężenia 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 5 ml kompletnego DMEM, aby dezaktywować aktywność enzymu. Ostrożnie rozetrzeć tkanki, aby oddzielić je od nich, za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 5 ml i wypolerowanej płomieniowo pipety Pasteura.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować komórki w temperaturze 250 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę i zasiać komórki w 10 ml kompletnego DMEM w kolbie o średnicy 75cm2. Zastąp pożywkę sklarowaną nad osadem 15 ml świeżej pożywki DMEM 4 godziny po posiewie.</li>
	<li>Po 14 dniach in vitro przenieść kolbę do wytrząsarki orbitalnej w celu odłączenia mikrogleju i oligodendrocytów przy 320 obr./min na 6 godzin.</li>
	<li>Trypsynizować pozostałe astrocyty za pomocą 5 ml enzymu dysocjacji komórek (tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml kompletnego DMEM w celu inaktywacji działania enzymatycznego i zagnieździć komórki w ilości 250 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w kompletnym DMEM. Nasiona 5 × 104 komórki na szkiełkach nakrywkowych 12 mm #1.5 w płytce 24-dołkowej.</li>
</ol>
6. Wychwyt sEV przez astrocyty
<ol>
	<li>Gdy astrocyty osiągną 80-90% konfluencji, zmień pożywkę na pożywkę zubożoną w egzosomy DMEM.</li>
	<li>Dodaj 1 μg nieznakowanych, znakowanych sEV, równą objętość kontroli barwnika lub PBS do komórek. Używaj komórek do barwienia 1 h i 24 h po zabiegu sEV.</li>
</ol>
7. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Przepłukać komórki PBS 3x i utrwalić je 4% PFA w PB przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć stałe komórki 3 x 5 min PB i przepuścić je za pomocą 0,1% Triton X-100 w PB przez 10-15 min, a następnie przemyć PB 3 x 5 min.</li>
	<li>Zablokuj komórki 5% normalną surowicą kozią (NGS) w PB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami: białkiem 2 związanym z mikrotubulami (MAP2A, 1:500) dla komórek Neuro-2a lub kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP, 1:500) dla pierwotnych astrocytów w świeżym 5% NGS/PB przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym wstrząsaniem.</li>
	<li>Przemyć 3 x 10 min PB i dodać sprzężone z fluoroforem przeciwciała drugorzędowe (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; lub Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) w 5% NGS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na bujaku.</li>
	<li>Przemyć 3 x 10 min PB i inkubować z 1 μg/ml barwnika jądrowego 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj komórki 3x PB.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach #1 za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Pozostawić je do wyschnięcia przez noc w ciemności i przechowywać przygotowane szkiełka podstawowe w temperaturze 4 °C do czasu zobrazowania pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
8. Absorpcja sEV in vivo 
<ol>
	<li>Wykonać dokanałowe wstrzyknięcie 5 μg nieznakowanych lub znakowanych sEV zawieszonych w 10 μl PBS lub równej objętości (10 μl) kontroli barwnika (przygotowanej w sekcji 3) do myszy C57BL/6.</li>
	<li>Po 6 i 18 godzinach od wstrzyknięcia sEVs, głęboko znieczulij myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję wewnątrzsercową myszy z 0,9% soli fizjologicznej, aby wypłukać krew, a następnie świeżo przygotowaną lodowatą 4% PFA/PB.</li>
	<li>Wypreparować rdzeń kręgowy i umieścić w 4% PFA/PB w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Kriochronić tkanki w 30% sacharozie w PB w temperaturze 4 °C przez 24 godziny lub do momentu, gdy tkanki opadną. Przechowywać tkanki w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania immunohistochemii.</li>
</ol>
9. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Osadź rdzeń kręgowy L4-L5 w związku OCT. Zamrażać na suchym lodzie do całkowitego zestalenia.</li>
	<li>Tkanki należy przeciąć na głębokość 30 μm (przekrój poprzeczny dla rdzenia kręgowego) za pomocą kriostatu i zebrać skrawki na 24-dołkowej płytce zawierającej PB. Umyj sekcje 3 x 5 min 0,3% Tritonem w PB.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 5% NGS w 0,3% Triton/PB przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), Iba1 dla mikrogleju (1:2,000) z 5% NGS w 0,3% Triton/PB i inkubować sekcje przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.</li>
	<li>Przemyć skrawki 3 x 5 min 0,3% Tritonem/PB i dodać przeciwciała drugorzędowe (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 lub Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) w 5% NGS/PB przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3 x 5 min PB i inkubować skrawki w 1 μg/ml DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje 3 x 5 min PB.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na czystym szkiełku samoprzylepnym (Tabela materiałów) za pomocą cienkiego pędzla pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Zwilż szkiełko nakrywkowe medium montażowym. Utwardzać przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obraz pod mikroskopem konfokalnym z odpowiednimi laserami.</li>
</ol>

<ol><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).</li>
<li>Betzer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+strategies+for+in+vivo+tracking+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594(2020).</li>
<li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li>
<li>González, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+labeled+fluorescent+exosomes+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications.</a> Biomedicines. 9 (1), 81(2021).</li>
<li>Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91(2018).</li>
<li>vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Heinrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+using+dialkylcarbocyanine+dyes+for+cell+tracing+in+hard+and+soft+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+model+of+acute+kidney+injury+monitored+by+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).</li>
<li>Wiklander, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+in+vivo+biodistribution+is+determined+by+cell+source%2C+route+of+administration+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316(2015).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6 (1), 7029(2015).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108(2011).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+in+the+brain%3A+Biomarker%2C+messenger+or+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator.</a> Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).</li>
<li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions%3A+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).</li>
<li>Matsumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+alpha-synuclein-containing+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+across+the+blood-brain+barrier+via+adsorptive+mediated+transcytosis%3A+another+mechanism+for+initiation+and+progression+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71(2017).</li>
<li>Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transport+mechanism+of+extracellular+vesicles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).</li>
<li>Shaimardanova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+diagnosis+and+treatment+of+central+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases.</a> Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Hoen, E. N. M. N. -t, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+in+vivo+imaging+of+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 169(2018).</li>
<li>Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tracking+of+lymphocytes+in+vivo%3A+the+migration+of+PKH-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes.</a> Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).</li>
<li>Kuffler, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+sprouting+in+culture+by+motoneurons+isolated+from+the+spinal+cord+of+adult+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs.</a> Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Pužar Dominkuš, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+labeling+of+extracellular+vesicles%3A+Characterization+and+cellular+internalization+of+contaminating+PKH26+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).</li>
<li>Shimomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+lipophilic+fluorescent+dyes+for+labeling+extracellular+vesicles%3A+characterization+and+monitoring+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+taken+up+by+neurons+hijack+the+endosomal+pathway+to+spread+to+interconnected+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10(2018).</li>
<li>Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+HEK293T+extracellular+vesicle+uptake+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry.</a> Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym protokole pokazaliśmy znakowanie sEV barwnikami PKH oraz wizualizację ich wychwytu w rdzeniu kręgowym. Lipofilowe barwniki fluorescencyjne PKH są szeroko stosowane do znakowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej 3,5,6,12,24,25. Ze względu na stosunkowo długi okres półtrwania i nisk...

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) to nanosize'owe pęcherzyki błonowe o zakresie wielkości 50-150 nm. Pochodzą z ciał wielopęcherzykowych (MVB) i są uwalniane z komórek po fuzji MVB z błoną plazmatyczną. sEV zawierają miRNA, mRNA, białka i bioaktywne lipidy, a cząsteczki te są przenoszone między komórkami w postaci komunikacji międzykomórkowej. sEV mogą być internalizowane przez komórki biorcze przez różne szlaki endocytarne, a to wychwytywanie sEV przez komórki biorcze odbywa się za pośrednictwem rozpoznawania cząsteczek powierzchniowych zarówno na EV, jak i komórkach docelowych1.
sEVs zyskały zainteresowanie ze względu na ich zdolność do wywoływania zmian molekularnych i fenotypowych w komórkach akceptorowych, ich użyteczność jako środka terapeutycznego oraz ich potencjał jako nośników dla cząsteczek ładunkowych lub środków farmakologicznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, obrazowanie i śledzenie sEV może być trudne, zwłaszcza w przypadku badań in vivo i warunków klinicznych. W związku z tym opracowano wiele metod oznaczania i obrazowania sEV, aby wspomóc ich biodystrybucję i śledzenie in vitro i in vivo2.
Najczęstszą techniką badania biodystrybucji sEV i interakcji komórek docelowych jest znakowanie ich cząsteczkami barwnika fluorescencyjnego3,4,5,6,7. EV były początkowo znakowane barwnikami błony komórkowej, które były powszechnie używane do obrazowania komórek. Te barwniki fluorescencyjne na ogół barwią dwuwarstwę lipidową lub białka będące przedmiotem zainteresowania na sEV. Kilka barwników lipofilowych wykazuje silny sygnał fluorescencyjny po włączeniu do cytozolu, w tym DiR (jodek 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetrametyloindotrikarbocyjaniny), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′-tetrametyloindokarbocyjaninowy) i DiD (sól 1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametylo indokarbocyjaninianu 4-chlorobenzenosulfonianu)8,9,10,11.
Inne barwniki lipofilowe, takie jak PKH67 i PKH26, mają wysoce fluorescencyjną polarną grupę główną i długi alifatyczny ogon węglowodorowy, który łatwo interkaluje się w dowolną strukturę lipidową i prowadzi do długotrwałego zatrzymywania barwnika i stabilnej fluorescencji12. Barwniki PKH mogą również oznaczać EV, co pozwala na badanie właściwości EV in vivo13. Wiele innych barwników zostało użytych do obserwacji egzosomów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej, w tym barwniki znakujące lipidy14 i barwniki przepuszczalne dla komórek, takie jak ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA-SE)15,16 i ester acetoksymetylu kalceiny (AM)17.
Badania nad przesłuchami między różnymi komórkami w OUN za pośrednictwem sEV dostarczyły ważnych informacji na temat patogenezy chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych18. Na przykład, sEV z neuronów mogą rozprzestrzeniać peptydy beta-amyloidowe i fosforylowane białka tau oraz pomagać w patogenezie choroby Alzheimera19. Dodatkowo, EV pochodzące z erytrocytów zawierają duże ilości alfa-synukleiny i mogą przekraczać barierę krew-mózg i przyczyniać się do patologii choroby Parkinsona20. Zdolność sEV do przekraczania barier fizjologicznych21 i przenoszenia swoich biomolekuł do komórek docelowych sprawia, że są one wygodnymi narzędziami do dostarczania leków terapeutycznych do CNS22.
Wizualizacja wychwytu sEV przez niezliczone komórki OUN w rdzeniu kręgowym umożliwi zarówno badania mechanistyczne, jak i ocenę korzyści terapeutycznych egzogennie podawanych sEV z różnych źródeł komórkowych. W artykule opisano metodologię oznaczania sEV pochodzących z makrofagów i obrazowania ich wychwytu in vitro i in vivo w lędźwiowym rdzeniu kręgowym przez neurony, mikroglej i astrocyty w celu jakościowego potwierdzenia dostarczania sEV przez wizualizację.

<table><tbody><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 ml</td><td>MilliporePrzeciwciało</td><td></td> anty-Alix Z677094 <td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Calnexin</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH (14C10)</td><td>Sygnalizacja komórkowa Technologia</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu przeciwglejowemu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 dla IF; 1:1000 dla</td></tr><tr><td>przeciwciała IHC anty-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MAP2A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12 000 x g</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, 12 mm, #1.5</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, 18 mm, #1.5</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &micro; g / ml</td></tr><tr><td>DC Test białka</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNAza I)</td><td>MiliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Anty-króliczy IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Osioł IgG przeciw królikom H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Podwójnie matowe szkiełka mikroskopowe, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zubożona w egzosomy płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania FluorChem M</td><td>BiałkoSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozia IgG1 Anty-Mysia IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący przechwycenie, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor próbek Laemmli SDS</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NanoSight NTA 3.2</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuro-2a Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kozia surowica</td> wektorowa <td>Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>Membrana transferowa PVDF</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Złote szkiełka Superfrost Plus Szkiełka</td><td>samoprzylepne</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td></tr><tr><td>Kolby T-75</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Cyfrowy transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Firma</td><td></td><td></td></tr> <tr>FEI<td>TEM Grids</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Protein Gel, 12%</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>enzym</td></tr> <tr>dysocjacji komórek<td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,25%</td> <td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Probówki ultrawirówkowe Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110 000 x g</td></tr></tbody></table>

wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) to pęcherzyki o długości 50-150 nm wydzielane przez wszystkie komórki i obecne w płynach ustrojowych. SV przenoszą biomolekuły, takie jak RNA, białka i lipidy, z komórek dawcy do komórek akceptorowych, co czyni je kluczowymi mediatorami sygnałowymi między komórkami. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) sEV mogą pośredniczyć w sygnalizacji międzykomórkowej, w tym w interakcjach neuroimmunologicznych. Funkcje sEV można badać, śledząc wychwyt znakowanych sEV w komórkach biorcy zarówno in vitro, jak i in vivo. W artykule opisano znakowanie sEV z kondycjonowanych pożywek komórek makrofagów RAW 264.7 przy użyciu barwnika błonowego PKH. Pokazuje wychwyt różnych stężeń znakowanych sEV w wielu punktach czasowych przez komórki Neuro-2a i pierwotne astrocyty in vitro. Pokazano również wychwyt sEV dostarczanych dooponowo w neuronach rdzenia kręgowego myszy, astrocytach i mikrogleju uwidoczniony za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reprezentatywne wyniki wskazują na zależną od czasu zmienność w wychwytywaniu sEV przez różne komórki, co może pomóc w potwierdzeniu pomyślnego dostarczania sEV do rdzenia kręgowego.

Po wyizolowaniu sEV z pożywki kondycjonowanej komórek RAW 264.7 za pomocą wirowania, do oznaczenia stężenia i rozkładu wielkości oczyszczonych sEV wykorzystano NTA. Średnia wielkość sEV pochodzących z komórek RAW 264.7 wynosiła 140 nm, a wielkość cząstek w piku wynosiła 121,8 nm, co potwierdza, że większość wykrywalnych cząstek w pomiarze rozpraszania światła mieściła się w zakresie wielkości egzosomów lub sEV wynoszącym 50-150 nm (Rysunek 1A). Zgodnie z wytycznymi zawartymi w minimalnych in...

Opisujemy protokół znakowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z makrofagów barwnikami PKH i obserwowania ich absorpcji in vitro i w rdzeniu kręgowym po podaniu dokanałowym.

Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Wizualizacja wychwytu małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, znanych również jako sEV, przez różne komórki rdzenia kręgowego, może potwierdzić pomyślne dostarczenie sEV. Umożliwia to zarówno mechanistyczne, jak i terapeutyczne badania dokanałowo podawanych sEV z różnych źródeł w modelach Roden. Protokół ten może być wykorzystany do wizualizacji wychwytu sEV przez komórki w łagodnym rdzeniu kręgowym i może pomóc w ocenie roli sEV i jego cząsteczek ładunkowych w zaburzeniach kręgosłupa, bólu i stanach zapalnych.Ta procedura zostanie zademonstrowana przeze mnie, wraz z Xuan Luo i Zhucheng Lin, dwoma doktorantami w laboratorium dr Seena Ajit. Zacznij od umieszczenia 18-milimetrowych szkiełek nakrywkowych w 12-dołkowej płytce, a następnie umieść komórki neuro-2a w każdym dołku z łącznie 1 mililitrem kompletnego DMEM zawierającego 10% FBS i 1% paciorkowca. Gdy płynność liczby komórek osiągnie 80 do 90%, zmień pożywkę na pożywkę zubożoną w egzosomy DMEM w każdej studzience dodaj jeden, 5 lub 10 mikrogramów znakowanych sEV.Przez 1, 4 i 24 godziny. Do zależnego od dawki i czasu wchłaniania do pozostałych studzienek przy równej objętości kontroli barwnika. Zbierz mózgi młodych po urodzeniu na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór soli Hanksa uzupełniony 10 milimolowymi hepami, wypreparuj oba płaty korowe i usuń opony mózgowe.Następnie zmiel chusteczki wysterylizowanym ostrzem. Przenieść tkanki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej pepane lub dezoksyrybonukleus jeden bufor dysocjacyjny i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, obracając probówkę co 5 minut, odessać supernatant i dodać 5 mililitrów kompletnego DMEM do probówki. Aby dezaktywować aktywność enzymu, spróbuj ostrożnie ocenić, aby zdysocjować tkanki za pomocą 5-mililitrowej szklanej pipety serologicznej i polerowanej płomieniowo pipety pastwiskowej.Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, a następnie odwiruj komórki w temperaturze 250 razy G przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, odessać pożywkę i zobaczyć komórki w 10 mililitrach kompletnego DMEM w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Po 4 godzinach powlekania zastąp supernat i pożywkę 15 mililitrami świeżej pożywki DMEM. Po 14 dniach in vitro w celu odłączenia mikrogleju i oligodendrocytów, przenieść kolbę do wytrząsarki orbitalnej z prędkością 320 obr./min na 6 godzin.Użyj 5 mililitrów enzymu dysocjacji komórek przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby tripsynizować, pozostałe astrocyty, aby dezaktywować działanie enzymatyczne, dodaj 5 mililitrów kompletnego DMEM, a następnie osadzaj komórki w temperaturze 250 razy G przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawieś komórki w kompletnym DMEM i zobacz komórki na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych o liczbie 1,5 w płytce 24-dołkowej.Za pomocą PBS przepłucz komórki 3 razy, a następnie utrwal je 4% formaldehydem lub PFA w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj stałe komórki 3 razy przez 5 minut PBS i przepuszczaj je za pomocą 0,1% Triton X 100 w PBS przez 10 do 15 minut. Następnie powtórz pranie z PBS.Użyj 5% normalnej koziej surowicy lub NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować komórki, inkubować komórki neuro-2a z dwukierunkowymi przeciwciałami map i pierwszorzędowymi astrocytami z przeciwciałami GFAP w stosunku 1 do 500 w świeżym 5% NGS lub PBS przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z delikatnym potrząsaniem. Po 3-krotnym umyciu komórek w PBS, dodać przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w 5% NGS. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem na bujaku.Powtórzyć mycie PBS i inkubować komórkę z 1 mikrogramem na mililitr DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj komórki 3 razy PBS. Używając środka mocującego zapobiegającego blaknięciu, zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach numer 1, pozostaw do wyschnięcia przez noc w ciemności i przechowuj przygotowane szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu zobrazowania w mikroskopie konfokalnym.Wypreparuj rdzeń kręgowy i utrwal go w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Wcześniej zabezpiecz tkanki w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 24 godziny lub do momentu, gdy tkanki opadną, a następnie przechowuj tkanki w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu immunohistochemii, zanurz rdzeń kręgowy L4 L5 w związku OCT, a następnie zamroź go na suchym lodzie aż do całkowitego zestalenia. Za pomocą kriostatu należy podzielić tkanki na głębokość 30 mikrometrów i zebrać skrawki na 24-dołkowej płytce zawierającej PBS.Umyj skrawki 3 razy po 5 minut za pomocą 0,3% Tritonu w PBS, zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 5%MGS w 0,3% Triton PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Skrawki inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na shakerze. Umyj sekcje 3 razy przez 5 minut 0,3% Tritonem w Pbs.Następnie dodać odpowiednie stężenie przeciwciał drugorzędowych. Zgodnie z rękopisem tekstu, inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, myć skrawki przy użyciu wyłącznie PBS i inkubować je w 1 mikrogramie na mililitr DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz mycie PBS pod mikroskopem świetlnym, zamontuj sekcje na przezroczystym szkiełku samoprzylepnym za pomocą cienkiego pędzla.Zwilżyć szkiełko nakrywkowe medium montażowym i utwardzić przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej, uzyskać obrazy pod mikroskopem konfokalnym za pomocą odpowiednich laserów, Średnia wielkość RA 2 6 4 0,7 pochodnych sEV wynosiła 140 nanometrów, a szczytowa wielkość cząstek wynosiła 121,8 nanometrów. Z najbardziej wykrywalnymi cząstkami mieszczącymi się w zakresie wielkości egzosomów lub sEVS. Przy 50 do 150 nanometrach western blot sEVs, lizatu komórkowego i eksodepletowanych pożywek wykazał, że próbki białek pochodzących z sEV zawierały białka markerowe sEV Alix CD81 i GAPDH.Lizat komórkowy został wzbogacony retikulum endoplazmatyczne, rezydującym białkiem Calnexin, dzięki czemu Calnexin służył jako ujemny marker zanieczyszczenia komórkowego, ponieważ był nieobecny w sEVs. Zaobserwowano, że wychwyt sEV nastąpił po 1 godzinie, a dla sEV o wielkości 1, 5 i 10 mikrogramów fluorescencję po inkubacji można było wykryć po 4 godzinach, dla 4, 5 i 10 mikrogramów sEV. Zbadano wychwyt sEV znakowanych PKH 26 przez astrocyty pierwotne, a maksymalna fluorescencja z wychwytu sEVS w pierwotnych astrocytach korowych wystąpiła po 24 godzinach, wychwycono sEV znakowane PKH26, a maksymalną fluorescencję zaobserwowano po 6 godzinach, po wstrzyknięciu w neurony, astrocyty i komórki mikrogleju.Włączenie kontroli, nieoznakowanych sEV i kontroli barwnika tworzy kod do wiatru fałszywie dodatnich ostatnich sygnałów ze względu na teraz specyficzne etykietowanie Taniec Opry wybrzeży Unbound dye patch. Wychwyt seVs można potwierdzić poprzez badanie transferu ładunku biomolekularnego do receptury oraz komórek i tkanek oraz określenie zmian w poziomach ekspresji biomolekuł lub genów docelowych. Można również przeprowadzić badania behawioralne w celu zbadania funkcjonalnego wpływu dostarczania sEV.

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych i czułych na wapń do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego z wykorzystaniem polietylenowej pipety ssącej.

Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

W tym filmie demonstrujemy test do wizualizacji i ilościowego określenia poboru komórkowego przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV. Test ten wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego i pozwala na odróżnienie zinternalizowanych EV od tych przyklejonych do powierzchni komórki.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: metoda wizualizacji i ilościowego określania wychwytu komórkowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Nowy preparat ex vivo do obrazowania rdzenia kręgowego myszy. Protokół ten pozwala na obrazowanie dwufotonowe żywych interakcji komórkowych w całym rdzeniu kręgowym.

Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

W tej pracy opisujemy protokoły do badania roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. W szczególności skupiamy się na interakcjach EV z komórkami śródbłonka.

Ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytkowego w celu monitorowania ich migracji i pobierania w eksplantatach chrząstek, używanych jako model choroby zwyrodnieniowej stawów.

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

W tym filmie zaprezentowano metodę preparowania i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Dysocjowane neurony komisuralne są użyteczne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów.

Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

Poznaj metodę wychwytu fluorescencyjnie znakowanych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w komórkach rdzenia kręgowego in vitro i in vivo. Ta technika umożliwia badanie roli sEV w stanach zapalnych i bólu.

Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym

Przeglądaj więcej filmów