Name: Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj metodę stabilizowanej wizualizacji trzustki na poziomie komórkowym in vivo w mysim modelu z oknem obrazowania przyżyciowego. Technika umożliwia bezruchowe, trójwymiarowe obrazowanie mikrostruktur trzustki przez trzy tygodnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant nr 14-2020-002 z Funduszu Badawczego SNUBH oraz przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Wszystkie procedury opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z 8wydaniem Przewodnika po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (2011)26 i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Koreańskim Instytucie Zaawansowanej Nauki i Technologii (KAIST) oraz Narodowym Szpitalu Bundang Uniwersytetu w Seulu (SNUBH).
1. Przygotowanie okna i innych materiałów
<ol>
	<li>Niestandardowy projekt okna obrazowania przyżyciowego trzustki, aby odizolować trzustkę od jelita w jamie brzusznej18 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B). Szczegółowy plan okna jest opisany na rysunku uzupełniającym poprzedniego badania18.</li>
	<li>Użyj myszy C57BL / 6N, 8-12-tygodniowych samców, do obrazowania trzustki w miejscu przyżyciowym. Wstrzyknąć przeciwciało anty-CD31 sprzężone z fluoroforem Alexa 647, 2 godziny przed obrazowaniem, w celu oznakowania naczynia18.</li>
	<li>Do badania wysp trzustkowych należy przygotować transgeniczny model myszy, w którym wysepki są znakowane fluorescencyjnym białkiem reporterowym. W tym przypadku wykorzystaliśmy MIP-GFP, w którym zielone białko fluorescencyjne uległo ekspresji pod kontrolą promotora genu insuliny 1 u myszy, który jest aktywny w komórkach beta wszystkich wysp trzustkowych w klasie mouse<sup="xref">24.</li>
	<li>Do badania raka trzustki przygotuj transgeniczne komórki rakowe oznaczone fluorescencyjnym białkiem reporterowym i nagimi myszami BALB/C. W tym badaniu wykorzystano komórki PANC-1 NucLight Red. Komórki rakowe PANC-125 zostały oznaczone sondą fluorescencyjną NucLight Red.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, szkło nakrywkowe (z PEG lub bez) i okienka obrazowe za pomocą autoklawu.</li>
	<li>Nałóż powłokę PEG na szkło nakrywkowe, aby zapobiec reakcji zapalnej i zwiększyć biokompatybilność, która jest odpowiednia do długotrwałego obrazowania.</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Przygotuj sterylną platformę chirurgiczną i wysterylizuj powierzchnie 70% etanolem. 
	UWAGA: W przypadku sesji obrazowania podłużnego niezbędna jest technika aseptyczna.</li>
	<li>Znieczulenie myszy mieszaniną tiletaminy/zolazepamu (30 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie tiletaminy/zolazepamu zamiast ketaminy ze względu na jej niekorzystny wpływ na hiperglikemię. Na potrzeby eksperymentu należy dobrać optymalne znieczulenie9,27.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę ciała za pomocą sondy doodbytniczej z poduszką grzewczą sterowaną homeotermicznie.</li>
	<li>Ogol lewy bok myszy i nałóż trzy rundy naprzemiennego peelingu na bazie alkoholu i jodu. 
	UWAGA: Jeśli używany jest krem do depilacji, nie pozostawiaj go na dłużej niż 1 minutę, aby uniknąć oparzeń chemicznych.</li>
	<li>Wykonaj 1,5 cm nacięcie na lewym boku myszy i wypreparuj skórę i mięśnie.</li>
	<li>Wykonaj szew sznurkowy z czarnym lub nylonowym szwem 4-0 na marginesie nacięcia.</li>
	<li>Użyj mikro retraktora na nacięciu i delikatnie odsłoń śledzionę.</li>
	<li>Ostrożnie połącz śledzionę za pomocą kleszczy pierścieniowych i zidentyfikuj trzustkę.</li>
	<li>Umieść okienko z boku myszy i przepuść śledzionę i trzustkę przez otwartą przestrzeń okna. Manipulacja trzustką musi być bardzo delikatna, ponieważ może powodować krwawienie lub zapalenie trzustki</li>
	<li>Delikatnie umieść trzustkę na płytce okienka obrazowego; śledziona zostanie umieszczona na otwartej przestrzeni okienka.</li>
	<li>W celu badania na komórkach rakowych wstrzyknąć PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 komórek) bezpośrednio do trzustki. 
	UWAGA: W celu obrazowania ortotopowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka trzustki można ułatwić bezpośrednią implantację komórki rakowej, takiej jak PANC-1 lub inna komórka ludzkiego raka trzustki28. Aby uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przyżyciowej, komórki PANC-1 transdukowano czerwonym białkiem fluorescencyjnym za pomocą odczynnika lentiwirusowego NucLight Red, który oznacza jądro29. Chociaż maksymalna objętość wstrzyknięcia jest niepewna, zmniejsz objętość, jak to możliwe, aby uniknąć efektu ciśnienia w trzustce.</li>
	<li>Nałóż krople kleju cyjanoakrylowego N-butylu na margines okienka obrazowania.
	<ol>
		<li>Aby zminimalizować ilość nałożonego kleju, do aplikacji należy użyć igły do cewnika 31 G. Jeśli ilość kropli jest duża, tkanka przypadkowo przylgnie do okna lub szkła nakrywkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie przyłóż okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 12 mm do krawędzi okienka obrazowania.</li>
	<li>Pociągnij pętlę do szwów, aby pasowała do bocznego rowka okna i zawiąż ją trzy razy.</li>
	<li>Przetnij maksymalne proksymalne miejsce węzła, aby zapobiec przerwaniu ciasnych szwów, gdy te myszy nie śpią.</li>
	<li>Pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu (2-3 godziny) i wstrzyknij ketoprofen (5 mg/kg, podskórnie w luźną skórę u podstawy szyi lub biodra zwierzęcia) w celu złagodzenia bólu. Ponownie oceniaj objawy bólu co 12 godzin, a ketoprofen należy rozważać co 24 godziny przez 1-3 dni. 
	UWAGA: Analgezja wpływa na wydzielanie insuliny w odpowiedzi na glukozę9. Wybór i czas leczenia analgezyjnego muszą być zindywidualizowane do celów doświadczalnych.</li>
	<li>Umieść mysz w klatce z wystarczającą ilością ściółki, aby uniknąć kontaktu okna z klatką. Unikaj trzymania domu z myszami bez operacji okna.</li>
</ol>
3. Obrazowanie przyżyciowe
<ol>
	<li>Włącz mikroskop przyżyciowy, w tym moc lasera.</li>
	<li>Włącz poduszkę grzewczą i ustaw regulację hometermiczną na 37 °C. 
	UWAGA: Alternatywnie użyj pasywnej poduszki grzewczej lub lampy z częstą kontrolą, jeśli nie ma regulacji homeotermicznej.</li>
	<li>Znieczulenie domięśniowe należy wykonać mieszaniną tiletaminy/zolazepamu (30 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie tiletaminy/zolazepamu zamiast ketaminy ze względu na jej niekorzystny wpływ na hiperglikemię. Na potrzeby eksperymentów należy dobrać optymalne znieczulenie9,27.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik naczyniowy do wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Uciskaj bliższą stronę ogona palcem wskazującym i trzecim jako alternatywę dla zakładania opaski uciskowej. W razie potrzeby podgrzej ogon lampą.</li>
		<li>Wysterylizuj żyłę ogonową za pomocą sprayu z 70% etanolem.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik 30 G do żyły ogonowej bocznej. Niedomykalność krwi zostanie uwidoczniona w probówce PE10.</li>
		<li>Nałóż jedwabną taśmę na cewnik, aby go ustabilizować.</li>
		<li>Wstrzyknąć dekstran FITC/TMR lub inne sondy fluorescencyjne (25 μg anty-CD31 sprzężone z Alexa 647), w zależności od kombinacji sond fluorescencyjnych18. 
		UWAGA: W przypadku fluorescencyjnych sond z przeciwciałami sprzężonymi wstrzyknąć 2 godziny przed sesją obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś mysz z platformy chirurgicznej na etap obrazowania.</li>
	<li>Włóż sondę doodbytniczą, aby automatycznie kontrolować temperaturę ciała za pomocą homeotermicznego systemu poduszek grzewczych.</li>
	<li>Włóż okienko obrazowania trzustki do uchwytu okienka przygotowanego podczas konfiguracji mikroskopii przyżyciowej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). W przypadku mikroskopu odwróconego uchwyt na okienko może nie być wymagany.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie przyżyciowe.
	<ol>
		<li>Do obrazowania trzustki należy zacząć od soczewki obiektywowej o małym powiększeniu (np. 4x) do skanowania całego widoku trzustki w oknie obrazowania trzustki (zalecane pole widzenia: 2500 x 2500 μm).</li>
		<li>Po określeniu obszaru zainteresowania przełącz się na soczewkę obiektywu o większym powiększeniu (20x lub 40x), aby wykonać obrazowanie na poziomie komórkowym (zalecane pole widzenia: 500 x 500 μm lub 250 x 250 μm). W tym eksperymencie rozdzielczość boczna i osiowa wynosiła odpowiednio około 0,5 μm i 3 μm.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie stosowe z lub poklatkowe, aby obserwować strukturę 3D lub dynamikę na poziomie komórkowym, taką jak migracja komórek. 
		UWAGA: W przypadku obrazowania komórek transgenicznych z ekspresją białka fluorescencyjnego (MIP-GFP), 30 s przerywanej ekspozycji na laser 488 nm o mocy do 0,43 mW było tolerowane bez zauważalnego fotowybielania lub uszkodzenia tkanek. W przypadku obrazowania białek fluorescencyjnych znakowanych za pomocą Alexa 647 moc lasera 640 nm do 0,17 mW była tolerowana bez zauważalnego fotowybielania lub uszkodzenia tkanek. Długotrwała ekspozycja lasera wzbudzającego o mocy powyżej tego ustawienia może prowadzić do fotowybielania lub uszkodzenia tkanek przez fototoksyczność. Dostosuj odpowiednie wzmocnienie i moc, aby odpowiednio zobrazować obszar zainteresowania. Szczegółowe ustawienie parametrów w mikroskopii przyżyciowej musi być zindywidualizowane dla każdej mikroskopii przyżyciowej przygotowanej w instytucie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+pancreatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li>
<li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).</li>
<li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li>
<li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+pancreas%3A+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li>
<li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603(2021).</li>
<li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li>
<li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li>
<li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li>
<li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405(2015).</li>
<li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolism+Journal%22%5BJournal%5D)">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li>
<li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li>
<li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li>
<li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+%28panc-1%29+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li>
<li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Academies+Collection%3A+Reports+funded+by+National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li>
<li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824(2016).</li>
<li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li>
<li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li>
<li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile%2C+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449(2019).</li>
<li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li>
<li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li>
<li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+cancer+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li>
<li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer%3A+overview+and+comparison+with+other+types+of+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół składa się z obrazowania przyżyciowego trzustki przy użyciu nowatorskiego, zintegrowanego okna obrazowania przyżyciowego trzustki zmodyfikowanego z okna obrazowania jamy brzusznej. Wśród opisanych powyżej protokołów pierwszym krytycznym krokiem jest wszczepienie okienka obrazowania trzustki przyżyciowej u myszy. Do nakładania kleju w oknie ważne jest, aby nałożyć klej między marginesem okna a szkłem nakrywkowym, ale nie na tkankę trzustki, ponieważ może to znacznie przerwać obrazowanie przyżyciowe....

Trzustka jest organem brzusznym z funkcją zewnątrzwydzielniczą w przewodzie pokarmowym i funkcją endokrynną polegającą na wydzielaniu hormonów do krwiobiegu. Obrazowanie komórkowe trzustki w wysokiej rozdzielczości może ujawnić patofizjologię różnych chorób związanych z trzustką, w tym zapalenia trzustki, raka trzustki i cukrzycy1. Konwencjonalne narzędzia do diagnostyki obrazowej, takie jak tomografia komputerowa, obrazowanie w rozdzielczości magnetycznej i ultrasonografia, są szeroko dostępne w dziedzinie klinicznej1,2. Jednak te metody obrazowania ograniczają się do wizualizacji tylko zmian strukturalnych lub anatomicznych, podczas gdy nie można określić zmian na poziomie komórkowym lub molekularnym. Biorąc pod uwagę, że zmiany molekularne w cukrzycy lub raku trzustki u ludzi mogą rozpocząć się ponad 10 lat przed diagnozą3,4, wykrycie chorób trzustki na podstawie ich przemiany molekularnej w okresie utajonym może potencjalnie zapewnić wczesną diagnozę i szybką interwencję. W ten sposób obrazowanie, które przezwycięży ograniczenia rozdzielczości i dostarczy cennych informacji na temat funkcji, znacznie przyciągnie uwagę, zapewniając wczesną diagnozę raka trzustki lub zaawansowaną identyfikację zmian w wyspach trzustkowych podczas progresji cukrzycy 5.
W szczególności w przypadku wysepek, obrazowanie jądrowe, obrazowanie bioluminescencyjne i optyczna koherentna tomografia zostały zasugerowane jako nieinwazyjne techniki obrazowania wysp trzustkowych6. Jednak rozdzielczość tych metod jest znacznie niska, z typowymi wartościami od kilkudziesięciu do setek mikrometrów, oferując ograniczoną zdolność do wykrywania zmian na poziomie komórkowym w wysepkach. Z drugiej strony, poprzednie badania wysepek trzustkowych w wysokiej rozdzielczości przeprowadzono w warunkach ex vivo7,8 (np. krojenie lub trawienie trzustki), niefizjologiczne9 (np. eksterioryzacja trzustki) i warunki heterotopowe10,11,12 (np. implantacja pod torebką nerkową, wewnątrz wątroby i w przedniej komorze oka), co ogranicza ich interpretację i implikacje kliniczne. Jeśli uda się ustalić in vivo, fizjologiczny i ortotopowy model obrazowania o wysokiej rozdzielczości, będzie to kluczowa platforma do badania wysp trzustkowych.
Obrazowanie przyżyciowe, które ujawnia patofizjologię na poziomie mikroskopijnej rozdzielczości u żywego zwierzęcia, spotkało się ostatnio z dużym zainteresowaniem13. Spośród metod obrazowania in vivo, opracowanie okna obrazowania jamy brzusznej14, które wszczepia okienko do brzucha myszy, pozwoliło na odkrycie nowych odkryć (tj. stadium przed mikroprzerzutami wczesnych przerzutów do wątroby15 i mechanizm utrzymania komórek macierzystych w nabłonku jelitowym16). Chociaż okno obrazowania jamy brzusznej dostarcza cennych wyników, zastosowania tego okienka w przypadku trzustki i wynikające z nich badania obrazowania przyżyciowego oparte na chorobach związanych z trzustką nie zostały dokładnie zbadane.
W przeciwieństwie do dobrze zdefiniowanych cech ciała stałego ludzkiej trzustki, trzustka myszy jest rozproszoną strukturą przypominającą tkankę miękką17. Dlatego nieustannie wpływają na nią ruchy fizjologiczne, w tym perystaltyka jelit i oddychanie. Poprzednie badanie nad zastosowaniem okna obrazowania jamy brzusznej dla trzustki wykazało, że wędrowanie występuje z powodu artefaktów ruchowych wywołanych wypróżnieniami18. W uzyskanym uśrednionym obrazie zaobserwowano silne rozmycie, co utrudniało wizualizację i identyfikację struktur w mikroskali.
Tutaj opisujemy użycie nowatorskiego, zintegrowanego okna obrazowania przyżyciowego trzustki w połączeniu z mikroskopią przyżyciową19,20 do badania podłużnych zdarzeń na poziomie komórkowym w chorobach obejmujących trzustkę. Oprócz szczegółowego opisu metodologii z poprzedniego badania18, w tym artykule omówione zostanie rozszerzone zastosowanie okna obrazowania trzustki w różnych chorobach związanych z trzustką. W tym protokole wykorzystano niestandardowy system skaningowej mikroskopii konfokalnej z szybkością wideo, jako system mikroskopii przyżyciowej. Jako źródło wzbudzenia wykorzystano cztery moduły laserowe (długości fal 405, 488, 561 i 640 nm), a cztery kanały sygnałów emisyjnych wykryto za pomocą fotopowielaczy (PMT) przez filtry pasmowoprzepustowe (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Skanowanie laserowe składało się z obracającego się zwierciadła wielokątnego (oś X) i zwierciadła skanującego galwanometru (oś Y), które umożliwiało skanowanie z szybkością wideo (30 klatek na sekundę). Szczegółowe informacje na temat mikroskopii przyżyciowej zostały opisane w poprzednich badaniach10,18,19,20,21,22,23.
W naszym poprzednim badaniu wysepek18, udało nam się i stabilnie zobrazować wysepki u żywych myszy za pomocą transgenicznego modelu myszy (MIP-GFP)24, w którym wysepki były oznaczone GFP. Metoda ta umożliwiła wizualizację zmian zachodzących w wysepkach w wysokiej rozdzielczości w okresie 1 tygodnia. Ułatwiło to również obrazowanie tych samych wysp trzustkowych przez okres do 3 tygodni, co sugeruje możliwość długoterminowych badań wysp trzustkowych w celu funkcjonalnego śledzenia lub monitorowania podczas patogenezy cukrzycy 18. Ponadto opracowaliśmy ortotopowy model raka trzustki, w którym fluorescencyjne komórki raka trzustki (PANC-1 NucLight Red)25 zostały bezpośrednio wszczepione do trzustki myszy. Dzięki zastosowaniu okna obrazowania przyżyciowego trzustki, model ten może być wykorzystany jako platforma do badania patofizjologii komórkowej i molekularnej w mikrośrodowisku guza raka trzustki oraz do monitorowania terapeutycznego nowych kandydatów na leki.

<table><tbody><tr><td>Estry sukcynimidylowe Alexa Fluor 647 (estry NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td>Sonda fluorescencyjna do koniugatu z przeciwciałem</td></tr><tr><td>BALB/C Nude</td><td>OrientBio</td><td>BALB/C Nude</td><td>BALB/C Nude</td></tr><tr><td>BD Rurka polietylenowa Intramedic Cewnik</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td>PE10 do połączenia z igłą</td></tr><tr><td>C57BL/6N</td><td>OrientBio</td><td>C57BL/6N</td><td>C57BL/6N C57BL/6N</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe okrągłe</td><td>Marienfeld</td><td>0111520</td><td>Szkło nakrywkowe do okienka obrazowania trzustki</td></tr><tr><td>FITC Dextran 2MDa</td><td>Merck (dawniej Sigma Aldrich)</td><td>FD200S</td><td>Do identyfikacji naczyń Płaszczyzna bitowa</td></tr><tr><td>IMARIS 8.1</td><td></td><td>IMARIS</td><td>Przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>Mikroskopia przyżyteczkowa</td><td>IVIM tech</td><td>IVM-C</td><td>Mikroskopia przyżyciowa</td></tr><tr><td>Nożyczki IRIS</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>S-1107-10</td><td>Ten produkt można zastąpić produktem innej firmy</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>401</td><td>Klej cyjanoakrylowy N-butylu</td></tr><tr><td>Uchwyt na mikroigły</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>H-1126-10</td><td>Ten produkt można zastąpić produktem innej firmy</td></tr><tr><td>Mikro ściągacz</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>17004-03</td><td>Ten produkt można zastąpić produktem innej firmy</td></tr><tr><td>Kleszcze do mikrokleszczyków</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1034</td><td>Ten produkt można zastąpić produktem innej firmy</td></tr><tr><td>MIP-GFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>006864</td><td>B6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td></tr><tr><td>Nylon 4-0</td><td>AILEE</td><td>NB434</td><td>Niewchłanialny szew</td></tr><tr><td>Omnican N 100 30G</td><td>B BRAUN</td> FT9172220S <td></td><td>Do cewnika naczyniowego, używaj tylko części igły</td></tr><tr><td>PANC-1 NucLightRed</td><td>Wykonane</td> na <td>zamówienie Wykonane</td><td>w laboratorium</td></tr><tr><td>Okno obrazowania trzustki</td><td>Geumto</td><td>Engineering Na zamówienie niestandardowe</td><td>Okno obrazowania trzustki - zamówienie niestandardowe</td></tr><tr><td>Physiosuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02</td><td>Homeotermiczny regulator temperatury</td></tr><tr><td>Oczyszczony NA/LE Szczurzy anty-mysz CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553708</td><td>Przeciwciało do znakowania naczyń in vivo</td></tr><tr><td>Kleszcze pierścieniowe</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1090-3</td><td>Ten produkt można zastąpić produktem innej firmy</td></tr><tr><td>Rompun</td><td></td><td>Bayer Rompun</td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td>TMR Dextran 65-85kDa</td><td>Merck (dawniej Sigma Aldrich)</td><td>T1162</td><td>Do identyfikacji statku</td></tr><tr><td>Uchwyt okienny</td><td>Geumto Engineering</td><td>Na zamówienie Uchwyt</td><td>do okien - na zamówienie</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 100</td><td>Środek znieczulający</td></tr></tbody></table>

stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Bezpośrednie obrazowanie in vivo trzustki w rozdzielczości komórkowej na żywym modelu małego zwierzęcia było technicznie trudne. Niedawne badanie obrazowania przyżyciowego, z oknem obrazowania jamy brzusznej, umożliwiło wizualizację dynamiki komórkowej w narządach jamy brzusznej in vivo. Jednak ze względu na miękką strukturę trzustki myszy przypominającą arkusz, na którą łatwo wpływają ruchy fizjologiczne (np. perystaltyka i oddychanie), trudno było przeprowadzić ustabilizowane obrazowanie podłużne in vivo przez kilka tygodni na poziomie komórkowym w celu identyfikacji, śledzenia i ilościowego określenia wysp trzustkowych lub komórek rakowych w trzustce myszy. W niniejszym artykule opisujemy metodę wszczepiania nowatorskiej podstawy nośnej, zintegrowanego okna obrazowania przyżyciowego trzustki, które może przestrzennie oddzielić trzustkę od jelita w celu podłużnego obrazowania przyżyciowego poklatkowego mikrostruktury trzustki. Podłużne obrazowanie in vivo z oknem obrazowania umożliwia stabilną wizualizację, pozwalającą na śledzenie wysp trzustkowych przez okres 3 tygodni oraz trójwymiarowe obrazowanie mikrostruktury w wysokiej rozdzielczości, czego dowodem jest tutaj ortotopowy model raka trzustki. Dzięki naszej metodzie dalsze badania obrazowe przyżyciowe mogą wyjaśnić patofizjologię różnych chorób obejmujących trzustkę na poziomie komórkowym.

Mikroskopia wewnątrzorganizmowa w połączeniu ze zintegrowanym oknem obrazowania wewnątrzorganizmowego trzustki z podstawą wspierającą umożliwia podłużne obrazowanie trzustki myszy na poziomie komórkowym. Niniejszy protokół z wykorzystaniem okna obrazowania wewnątrzorganizmowego trzustki zapewnia długotrwałą stabilność tkanki, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu śledzenia poszczególnych wysepek przez okres do 3 tygodni. W rezultacie możliwe jest uzyskanie obrazowania mozaikowego dla rozszerzon...

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Protokół ten opisuje ustabilizowane i powtarzalne obrazowanie in vivo trzustki na poziomie komórkowym z nowatorskim oknem obrazowania przyżyciowego trzustki. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest wykonanie nieruchomego, trójwymiarowego obrazowania z rozdzielczością do poziomu komórkowego przez trzy tygodnie w trzustce żywej myszy. Zacznij od przygotowania platformy chirurgicznej i zdezynfekowania powierzchni 70% etanolem.Po znieczuleniu użyj sondy doodbytniczej z homeotermiczną poduszką grzewczą, aby monitorować temperaturę ciała. Usuń włosy z lewego boku myszy i naprzemiennie stosuj alkohol i jod, obracając się od miejsca nacięcia do zewnętrznej powierzchni, nigdy nie wracając do miejsca nacięcia i kończąc na jodzie. Następnie wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie na lewym boku myszy, preparując skórę i mięsień.Użyj czarnego lub nylonowego szwu 4-0, aby wykonać szew sznurkowy torebki na marginesie nacięcia. Ostrożnie pociągnij śledzionę kleszczami pierścieniowymi i zidentyfikuj trzustkę. Umieszczając okno z boku myszy, przełóż śledzionę i trzustkę przez otwartą przestrzeń okna.Następnie delikatnie umieść trzustkę na płytce okienka do obrazowania, jednocześnie umieszczając śledzionę na otwartej przestrzeni okienka. Wstrzyknąć czerwień nuklitową PANC-1 bezpośrednio do trzustki. Użyj igły do cewnika o rozmiarze 31G, aby nanieść krople kleju cyjanoakrylowego n-butylu na margines okienka obrazowania, upewniając się, że nałożono minimalną ilość kleju.Delikatnie przyłóż 12-milimetrowe okrągłe szkło nakrywkowe do krawędzi okienka obrazowania. Następnie przytrzymaj pętlę do szwów, aby pasowała do bocznego rowka okna i zawiąż ją trzy razy. Wreszcie, aby zapobiec przerwaniu tych ciasnych szwów, gdy myszy nie śpią, odetnij maksymalne proksymalne miejsce krawata.Zacznij od włączenia mikroskopu przyżyciowego, w tym mocy lasera. Aby wprowadzić cewnik naczyniowy, należy uciskać palcem wskazującym i trzecim palcem na bliższą stronę ogona. W razie potrzeby podgrzej ogon lampą.Zdezynfekuj żyłę ogonową za pomocą sprayu z 70% etanolem, a następnie wprowadź cewnik o rozmiarze 30 do bocznej żyły ogonowej i uwidocznij niedomykalność krwi w probówce PE-10. Nałóż jedwabną taśmę na cewnik, aby go ustabilizować. Wstrzyknąć dekstran FITC i dekstran TMR lub inne sondy fluorescencyjne, w zależności od przypadku, w zależności od kombinacji sond fluorescencyjnych.Włóż sondę doodbytniczą, aby automatycznie kontrolować temperaturę ciała za pomocą homeotermicznego systemu poduszek grzewczych. Następnie należy włożyć okienko obrazowania trzustki przygotowane podczas mikroskopii przyżyciowej do uchwytu okienka. Przenieś mysz z platformy chirurgicznej na etap obrazowania.Aby wykonać obrazowanie przyżyciowe, zacznij od obrazowania trzustki w małym powiększeniu, na przykład czterokrotnie, aby zeskanować cały widok trzustki w okienku obrazowania trzustki. Po określeniu obszaru zainteresowania przełącz się na soczewkę obiektywową o większym powiększeniu, na przykład 20 lub 40 razy, aby wykonać obrazowanie na poziomie komórkowym z rozdzielczością boczną i osiową odpowiednio około 0,5 mikrometra i 3 mikrometrów. Wykonaj obrazowanie Z-stack lub poklatkowe, aby obserwować strukturę 3D lub dynamikę na poziomie komórkowym, taką jak migracja komórek.Mikroskopia przyżyciowa w połączeniu z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki zapewnia długoterminową stabilność tkanek, która umożliwia uzyskanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu śledzenia poszczególnych wysp trzustkowych przez okres do trzech tygodni. Okno wszczepione czarnej myszy C57 6 N z dożylnie wstrzykniętym przeciwciałem anty-CD31, sprzężonym z fluoroforem Alexa 647, ułatwiło obrazowanie rozległe i powiększone obrazowanie 3D trzustki. Komórki groniaste zidentyfikowano w uśrednionych obrazach tkanki trzustki w sąsiednim układzie naczyniowym, uwidocznionych odpowiednio za pomocą autofluorescencji i przeciwciała anty-CD31.Korzystając z metody obrazowania mozaikowego, która łączy widok szerokokątny z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, w myszy MIP-GFP zwizualizowano około 40 do 50 wysepek wraz z przylegającymi naczyniami krwionośnymi. Poprzednie badanie wykazało, że wysepki można śledzić przez okres do trzech tygodni przy użyciu tej stabilnej metody obrazowania. Aby uwidocznić komórki rakowe, czerwone krwinki nuklitowe PANC-1 zostały bezpośrednio wszczepione do trzustki myszy podczas operacji, a pobliskie naczynia wybarwiono anty-CD31 sprzężonym z Alexa 647.Korzystając z tego protokołu, wygenerowano szerokokątne obrazy raka trzustki. Pomogło to nakreślić brzeg guza, a także uzyskać obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest umiejętne wszczepienie okienka obrazowego trzustki u myszy.Korzystając z innych kombinacji fluorescencyjnych komórek myszy i sond przeciwciał, można było zidentyfikować dynamiczne oddziaływanie pobliskich komórek z wyspami trzustkowymi lub komórkami anulującymi. Metoda ta może być szeroko stosowana przez osoby badające zmiany wysepki w różnych stanach patofizjologicznych i mikrośrodowiskach raka trzustki in situ.

stabilized-longitudinal-vivo-cellular-level-visualization-pancreas

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Ten film demonstruje procedurę wszczepienia okna obrazowania trzustki w celu oddzielenia trzustki od jelit w celu podłużnego obrazowania poklatkowego w wysokiej rozdzielczości mikrostruktury trzustki.

Instalacja okna obrazowania przyżyciowego trzustki w modelu mysim: zintegrowane okno obrazowania trzustki do poklatkowego obrazowania in vivo mikrostruktury mysiej trzustki

W tym filmie opisujemy obrazowanie trzustki myszy w trybie przyżyciowym przez ustabilizowane okno do długoterminowej wizualizacji dynamiki komórkowej.

Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Przedstawiamy protokół chirurgicznego wszczepienia stabilizowanego okna optycznego do obrazowania w subkomórkowej rozdzielczości mysiej trzustki, umożliwiając seryjne i podłużne badania zdrowej i chorej trzustki.

Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Opisano model implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy. W porównaniu z innymi podobnymi metodami, procedura ta jest bardzo szybka, prosta i dostępna, oferując możliwość zbadania w wygodny sposób reakcji ściany naczyniowej na różne stenty uwalniające leki oraz molekularnych mechanizmów restenozy.

Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

Tutaj opisujemy półinwazyjną metodę mikroskopii optycznej do indukcji skrzepu fotozakrzepowego Rose Bengal w korze somatosensorycznej myszy in vivo.  Opisano techniczne aspekty procedury obrazowania, począwszy od indukcji zdarzenia fotozakrzepowego, a skończywszy na zastosowaniu i gromadzeniu danych.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Poznaj metodę stabilizowanej wizualizacji trzustki na poziomie komórkowym in vivo w mysim modelu z oknem obrazowania przyżyciowego. Technika umożliwia bezruchowe, trójwymiarowe obrazowanie mikrostruktur trzustki przez trzy tygodnie.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki (Wideo) | JoVE Journal

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Przeglądaj więcej filmów