Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki
6 maja 2021
Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.
Protokół ten opisuje ustabilizowane i powtarzalne obrazowanie in vivo trzustki na poziomie komórkowym z nowatorskim oknem obrazowania przyżyciowego trzustki. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest wykonanie nieruchomego, trójwymiarowego obrazowania z rozdzielczością do poziomu komórkowego przez trzy tygodnie w trzustce żywej myszy. Zacznij od przygotowania platformy chirurgicznej i zdezynfekowania powierzchni 70% etanolem.
Po znieczuleniu użyj sondy doodbytniczej z homeotermiczną poduszką grzewczą, aby monitorować temperaturę ciała. Usuń włosy z lewego boku myszy i naprzemiennie stosuj alkohol i jod, obracając się od miejsca nacięcia do zewnętrznej powierzchni, nigdy nie wracając do miejsca nacięcia i kończąc na jodzie. Następnie wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie na lewym boku myszy, preparując skórę i mięsień.
Użyj czarnego lub nylonowego szwu 4-0, aby wykonać szew sznurkowy torebki na marginesie nacięcia. Ostrożnie pociągnij śledzionę kleszczami pierścieniowymi i zidentyfikuj trzustkę. Umieszczając okno z boku myszy, przełóż śledzionę i trzustkę przez otwartą przestrzeń okna.
Następnie delikatnie umieść trzustkę na płytce okienka do obrazowania, jednocześnie umieszczając śledzionę na otwartej przestrzeni okienka. Wstrzyknąć czerwień nuklitową PANC-1 bezpośrednio do trzustki. Użyj igły do cewnika o rozmiarze 31G, aby nanieść krople kleju cyjanoakrylowego n-butylu na margines okienka obrazowania, upewniając się, że nałożono minimalną ilość kleju.
Delikatnie przyłóż 12-milimetrowe okrągłe szkło nakrywkowe do krawędzi okienka obrazowania. Następnie przytrzymaj pętlę do szwów, aby pasowała do bocznego rowka okna i zawiąż ją trzy razy. Wreszcie, aby zapobiec przerwaniu tych ciasnych szwów, gdy myszy nie śpią, odetnij maksymalne proksymalne miejsce krawata.
Zacznij od włączenia mikroskopu przyżyciowego, w tym mocy lasera. Aby wprowadzić cewnik naczyniowy, należy uciskać palcem wskazującym i trzecim palcem na bliższą stronę ogona. W razie potrzeby podgrzej ogon lampą.
Zdezynfekuj żyłę ogonową za pomocą sprayu z 70% etanolem, a następnie wprowadź cewnik o rozmiarze 30 do bocznej żyły ogonowej i uwidocznij niedomykalność krwi w probówce PE-10. Nałóż jedwabną taśmę na cewnik, aby go ustabilizować. Wstrzyknąć dekstran FITC i dekstran TMR lub inne sondy fluorescencyjne, w zależności od przypadku, w zależności od kombinacji sond fluorescencyjnych.
Włóż sondę doodbytniczą, aby automatycznie kontrolować temperaturę ciała za pomocą homeotermicznego systemu poduszek grzewczych. Następnie należy włożyć okienko obrazowania trzustki przygotowane podczas mikroskopii przyżyciowej do uchwytu okienka. Przenieś mysz z platformy chirurgicznej na etap obrazowania.
Aby wykonać obrazowanie przyżyciowe, zacznij od obrazowania trzustki w małym powiększeniu, na przykład czterokrotnie, aby zeskanować cały widok trzustki w okienku obrazowania trzustki. Po określeniu obszaru zainteresowania przełącz się na soczewkę obiektywową o większym powiększeniu, na przykład 20 lub 40 razy, aby wykonać obrazowanie na poziomie komórkowym z rozdzielczością boczną i osiową odpowiednio około 0,5 mikrometra i 3 mikrometrów. Wykonaj obrazowanie Z-stack lub poklatkowe, aby obserwować strukturę 3D lub dynamikę na poziomie komórkowym, taką jak migracja komórek.
Mikroskopia przyżyciowa w połączeniu z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki zapewnia długoterminową stabilność tkanek, która umożliwia uzyskanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu śledzenia poszczególnych wysp trzustkowych przez okres do trzech tygodni. Okno wszczepione czarnej myszy C57 6 N z dożylnie wstrzykniętym przeciwciałem anty-CD31, sprzężonym z fluoroforem Alexa 647, ułatwiło obrazowanie rozległe i powiększone obrazowanie 3D trzustki. Komórki groniaste zidentyfikowano w uśrednionych obrazach tkanki trzustki w sąsiednim układzie naczyniowym, uwidocznionych odpowiednio za pomocą autofluorescencji i przeciwciała anty-CD31.
Korzystając z metody obrazowania mozaikowego, która łączy widok szerokokątny z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, w myszy MIP-GFP zwizualizowano około 40 do 50 wysepek wraz z przylegającymi naczyniami krwionośnymi. Poprzednie badanie wykazało, że wysepki można śledzić przez okres do trzech tygodni przy użyciu tej stabilnej metody obrazowania. Aby uwidocznić komórki rakowe, czerwone krwinki nuklitowe PANC-1 zostały bezpośrednio wszczepione do trzustki myszy podczas operacji, a pobliskie naczynia wybarwiono anty-CD31 sprzężonym z Alexa 647.
Korzystając z tego protokołu, wygenerowano szerokokątne obrazy raka trzustki. Pomogło to nakreślić brzeg guza, a także uzyskać obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest umiejętne wszczepienie okienka obrazowego trzustki u myszy.
Korzystając z innych kombinacji fluorescencyjnych komórek myszy i sond przeciwciał, można było zidentyfikować dynamiczne oddziaływanie pobliskich komórek z wyspami trzustkowymi lub komórkami anulującymi. Metoda ta może być szeroko stosowana przez osoby badające zmiany wysepki w różnych stanach patofizjologicznych i mikrośrodowiskach raka trzustki in situ.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół stabilizowanego, powtarzalnego obrazowania in vivo trzustki myszy w rozdzielczości komórkowej z wykorzystaniem nowatorskiego okna do obrazowania intravitalnego trzustki. Metoda ta umożliwia nieruchome, trójwymiarowe obrazowanie mikrostruktur trzustki, w tym wysepek i komórek nowotworowych, przez okres do trzech tygodni, co ułatwia prowadzenie podłużnych badań nad fizjologią i patologią trzustki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia witalna
- Obrazowanie trzustki
- Biologia komórkowa i raków
- Chirurgia małych zwierząt
Wstęp
- Bezpośrednie obrazowanie trzustki in vivo z rozdzielczością komórkową było technicznie trudne ze względu na miękką, blaszkowatą strukturę organu oraz jego podatność na ruchy fizjologiczne.
- Wcześniejsze okna obrazowania jamy brzusznej umożliwiały wizualizację organów brzusznych, lecz brakowało im stabilności niezbędnej do długoterminowego obrazowania trzustki o wysokiej rozdzielczości.
- Obrazowanie podłużne jest niezbędne do śledzenia wysepek i komórek nowotworowych w czasie w modelach chorób.
- Stabilne platformy obrazowania mogą pomóc w wyjaśnieniu dynamicznych procesów komórkowych in situ.
Cel badania
- Opracowanie i opisanie metody implantacji podstawy wspierającej oraz zintegrowanego okna do obrazowania intravitalnego trzustki u myszy.
- Umożliwienie stabilnego, podłużnego obrazowania trzustki o wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.
- Ułatwienie śledzenia i kwantyfikacji wysepek oraz komórek nowotworowych w ciągu kilku tygodni.
Zastosowane Metody
- Chirurgiczna implantacja okna obrazującego trzustkę w celu przestrzennego oddzielenia trzustki od jelit.
- Zastosowanie szwów typu „marszczącego”, kleju tkankowego oraz szkiełka przedmiotowego w celu zabezpieczenia okna i zminimalizowania jego ruchomości.
- Bezpośrednia iniekcja komórek znakowanych fluorescencyjnie (np. PANC-1 nuclite red) oraz dożylna podaż sond fluorescencyjnych (np. FITC dextran, TMR dextran, przeciwciało anty-CD31 sprzężone z Alexa 647).
- Mikroskopia witalna z użyciem obiektywów o niskim i wysokim powiększeniu, obrazowanie Z-stack oraz time-lapse w celu trójwymiarowej i dynamicznej wizualizacji komórkowej.
Główne wyniki
- Okienko obrazujące zapewniło stabilne, nieruchome warunki obrazowania przez okres do trzech tygodni.
- Uzyskano trójwymiarowe obrazy mikrostruktur trzustki o wysokiej rozdzielczości, w tym obrazowanie wysepek oraz komórek nowotworowych.
- Zastosowanie technik obrazowania mozaikowego pozwoliło na wizualizację i śledzenie około 40–50 wysepek oraz sąsiadujących z nimi naczyń krwionośnych.
- Protokół umożliwił wyznaczenie granic guza oraz obserwację dynamicznych oddziaływań komórkowych in situ.
Wnioski
- Opisana metoda umożliwia stabilne, podłużne obrazowanie trzustki myszy in vivo na poziomie komórkowym.
- Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w badaniu dynamiki wysepek trzustkowych oraz mikrośrodowiska nowotworowego w różnych stanach patofizjologicznych.
- Kluczem do sukcesu w długoterminowym obrazowaniu jest umiejętna chirurgiczna implantacja okna obrazującego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Stabilizowany podłużny obrazowanie in vivo na poziomie komórkowym trzustki mysiej wypełnia krytyczną lukę w wierności modeli przedklinicznych stosowanych w badaniach nad chorobami trzustki. Metoda ta umożliwia wysokorozdzielczą, nieruchomą wizualizację i śledzenie wysepek oraz komórek nowotworowych przez kilka tygodni, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego i zwiększa pewność prognostyczną w badaniach wczesnego odkrywania oraz badaniach translacyjnych. Podejście to zwiększa możliwość analizy dynamicznych procesów komórkowych i zmian w mikrośrodowisku, które są istotne dla progresji choroby i interwencji terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację dynamiki wysepek trzustkowych i komórek nowotworowych in situ w czasie.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie interakcji komórkowych i zmian w mikrośrodowisku.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki podłużnemu śledzeniu populacji komórek istotnych dla przebiegu choroby.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy selekcji projektów w portfolio poprzez dostarczenie wiarygodnych, ilościowych danych obrazowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy in vivo do późniejszej oceny związków i screeningu fenotypowego.
- Zapewnia reprodukowalne, ilościowe wyniki obrazowania odpowiednie do standaryzacji testu.
- Umożliwia skalowalne procesy obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) w celu screeningu potencjalnych interwencji.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na mikrostrukturę trzustki oraz zachowanie komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do cech komórkowych i mikrośrodowiskowych istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużne monitorowanie biomarkerów.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu, skorygowane o ryzyko, w oparciu o dynamiczne dowody z obrazowania in vivo.
- Zwiększa istotność translacyjną poprzez modelowanie procesów patofizjologicznych in situ.
Integracja potoku i przepływu pracy
Opisana metoda okna obrazowania integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz translacyjne badania biomarkerów w żywych modelach zwierzęcych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia badanie dynamiki komórek trzustki i oddziaływań mikrośrodowiskowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do przesiewania związków i opracowywania testów.
- Analityka: Dostarcza wysokorozdzielcze odczyty podłużne do analizy porównawczej progresji choroby i efektów interwencji.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez wsparcie dopasowania biomarkerów i modelowania chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań nad chorobami i interwencjami w obrębie trzustki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach chorób trzustki.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem pod kątem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących chorób trzustki.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia chirurgicznego w celu precyzyjnej implantacji okna obrazowego.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej mikroskopii intravitalnej oraz infrastruktury obrazowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych szczepów myszy lub modeli chorób.
- Stabilność obrazowania podłużnego zależy od biegłości technicznej i opieki nad zwierzętami.
