Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki
6 maja 2021
Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.
Protokół ten opisuje ustabilizowane i powtarzalne obrazowanie in vivo trzustki na poziomie komórkowym z nowatorskim oknem obrazowania przyżyciowego trzustki. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest wykonanie nieruchomego, trójwymiarowego obrazowania z rozdzielczością do poziomu komórkowego przez trzy tygodnie w trzustce żywej myszy. Zacznij od przygotowania platformy chirurgicznej i zdezynfekowania powierzchni 70% etanolem.
Po znieczuleniu użyj sondy doodbytniczej z homeotermiczną poduszką grzewczą, aby monitorować temperaturę ciała. Usuń włosy z lewego boku myszy i naprzemiennie stosuj alkohol i jod, obracając się od miejsca nacięcia do zewnętrznej powierzchni, nigdy nie wracając do miejsca nacięcia i kończąc na jodzie. Następnie wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie na lewym boku myszy, preparując skórę i mięsień.
Użyj czarnego lub nylonowego szwu 4-0, aby wykonać szew sznurkowy torebki na marginesie nacięcia. Ostrożnie pociągnij śledzionę kleszczami pierścieniowymi i zidentyfikuj trzustkę. Umieszczając okno z boku myszy, przełóż śledzionę i trzustkę przez otwartą przestrzeń okna.
Następnie delikatnie umieść trzustkę na płytce okienka do obrazowania, jednocześnie umieszczając śledzionę na otwartej przestrzeni okienka. Wstrzyknąć czerwień nuklitową PANC-1 bezpośrednio do trzustki. Użyj igły do cewnika o rozmiarze 31G, aby nanieść krople kleju cyjanoakrylowego n-butylu na margines okienka obrazowania, upewniając się, że nałożono minimalną ilość kleju.
Delikatnie przyłóż 12-milimetrowe okrągłe szkło nakrywkowe do krawędzi okienka obrazowania. Następnie przytrzymaj pętlę do szwów, aby pasowała do bocznego rowka okna i zawiąż ją trzy razy. Wreszcie, aby zapobiec przerwaniu tych ciasnych szwów, gdy myszy nie śpią, odetnij maksymalne proksymalne miejsce krawata.
Zacznij od włączenia mikroskopu przyżyciowego, w tym mocy lasera. Aby wprowadzić cewnik naczyniowy, należy uciskać palcem wskazującym i trzecim palcem na bliższą stronę ogona. W razie potrzeby podgrzej ogon lampą.
Zdezynfekuj żyłę ogonową za pomocą sprayu z 70% etanolem, a następnie wprowadź cewnik o rozmiarze 30 do bocznej żyły ogonowej i uwidocznij niedomykalność krwi w probówce PE-10. Nałóż jedwabną taśmę na cewnik, aby go ustabilizować. Wstrzyknąć dekstran FITC i dekstran TMR lub inne sondy fluorescencyjne, w zależności od przypadku, w zależności od kombinacji sond fluorescencyjnych.
Włóż sondę doodbytniczą, aby automatycznie kontrolować temperaturę ciała za pomocą homeotermicznego systemu poduszek grzewczych. Następnie należy włożyć okienko obrazowania trzustki przygotowane podczas mikroskopii przyżyciowej do uchwytu okienka. Przenieś mysz z platformy chirurgicznej na etap obrazowania.
Aby wykonać obrazowanie przyżyciowe, zacznij od obrazowania trzustki w małym powiększeniu, na przykład czterokrotnie, aby zeskanować cały widok trzustki w okienku obrazowania trzustki. Po określeniu obszaru zainteresowania przełącz się na soczewkę obiektywową o większym powiększeniu, na przykład 20 lub 40 razy, aby wykonać obrazowanie na poziomie komórkowym z rozdzielczością boczną i osiową odpowiednio około 0,5 mikrometra i 3 mikrometrów. Wykonaj obrazowanie Z-stack lub poklatkowe, aby obserwować strukturę 3D lub dynamikę na poziomie komórkowym, taką jak migracja komórek.
Mikroskopia przyżyciowa w połączeniu z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki zapewnia długoterminową stabilność tkanek, która umożliwia uzyskanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu śledzenia poszczególnych wysp trzustkowych przez okres do trzech tygodni. Okno wszczepione czarnej myszy C57 6 N z dożylnie wstrzykniętym przeciwciałem anty-CD31, sprzężonym z fluoroforem Alexa 647, ułatwiło obrazowanie rozległe i powiększone obrazowanie 3D trzustki. Komórki groniaste zidentyfikowano w uśrednionych obrazach tkanki trzustki w sąsiednim układzie naczyniowym, uwidocznionych odpowiednio za pomocą autofluorescencji i przeciwciała anty-CD31.
Korzystając z metody obrazowania mozaikowego, która łączy widok szerokokątny z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, w myszy MIP-GFP zwizualizowano około 40 do 50 wysepek wraz z przylegającymi naczyniami krwionośnymi. Poprzednie badanie wykazało, że wysepki można śledzić przez okres do trzech tygodni przy użyciu tej stabilnej metody obrazowania. Aby uwidocznić komórki rakowe, czerwone krwinki nuklitowe PANC-1 zostały bezpośrednio wszczepione do trzustki myszy podczas operacji, a pobliskie naczynia wybarwiono anty-CD31 sprzężonym z Alexa 647.
Korzystając z tego protokołu, wygenerowano szerokokątne obrazy raka trzustki. Pomogło to nakreślić brzeg guza, a także uzyskać obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest umiejętne wszczepienie okienka obrazowego trzustki u myszy.
Korzystając z innych kombinacji fluorescencyjnych komórek myszy i sond przeciwciał, można było zidentyfikować dynamiczne oddziaływanie pobliskich komórek z wyspami trzustkowymi lub komórkami anulującymi. Metoda ta może być szeroko stosowana przez osoby badające zmiany wysepki w różnych stanach patofizjologicznych i mikrośrodowiskach raka trzustki in situ.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół stabilizowanego i powtarzalnego obrazowania trzustki na poziomie komórkowym in vivo z wykorzystaniem nowatorskiej metody okna do obrazowania intrawitalnego trzustki. Technika ta pozwala na nieruchome, trójwymiarowe obrazowanie z rozdzielczością komórkową przez trzy tygodnie u żywych myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Obrazowanie in vivo
Tło
- Techniki obrazowania in vivo są kluczowe dla badania funkcji narządów.
- Trzustka odgrywa istotną rolę w procesach metabolicznych.
- Tradycyjne metody obrazowania mogą nie zapewniać wystarczającej rozdzielczości.
- Okno do obrazowania intrawitalnego trzustki oferuje nowatorskie podejście.
Cel badania
- Rozwój metody wysokiej rozdzielczości obrazowania trzustki.
- Możliwość długotrwałej obserwacji dynamiki komórkowej trzustki.
- Poprawa zrozumienia funkcji trzustki w żywych modelach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie platformy chirurgicznej i dezynfekcja.
- Znieczulenie myszy i monitorowanie temperatury.
- Usuwanie włosów i nacięcie skóry na lewym boku.
- Zastosowanie technik obrazowania przez okno intrawitalne.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie komórek trzustki przez trzy tygodnie.
- Uzyskano wysokiej rozdzielczości, nieruchome trójwymiarowe obrazy.
- Wykazano wykonalność okna do obrazowania intrawitalnego trzustki.
- Potencjalne zastosowania w badaniu chorób trzustki.
Wnioski
- Okno do obrazowania intrawitalnego trzustki jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Ta metoda poprawia zrozumienie biologii trzustki.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do różnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Stabilized longitudinal in vivo cellular-level imaging of the murine pancreas addresses a critical gap in preclinical model fidelity for pancreatic disease research. This method enables high-resolution, motionless visualization and tracking of islets and cancer cells over several weeks, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery and translational studies. The approach enhances the ability to interrogate dynamic cellular processes and microenvironmental changes relevant to disease progression and therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of pancreatic islet and tumor cell dynamics in situ over time.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular interactions and microenvironmental changes.
- Facilitates functional target validation through longitudinal tracking of disease-relevant cell populations.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing robust, quantitative imaging data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream compound evaluation and phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for assay standardization.
- Enables scalable, high-content imaging workflows for screening candidate interventions.
- Supports reliable evaluation of compound effects on pancreatic microstructure and cell behavior.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant cellular and microenvironmental features.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal biomarker tracking.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on dynamic, in vivo imaging evidence.
- Enhances translational relevance by modeling pathophysiological processes in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging window method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker studies in live animal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of pancreatic cell dynamics and microenvironmental interactions.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for compound screening and assay development.
- Analytics: Delivers high-resolution, longitudinal readouts for comparative analysis of disease progression and intervention effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by supporting biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse pancreatic disease and intervention studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pancreatic disease models.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of pancreatic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires surgical expertise for precise imaging window implantation.
- Demands access to advanced intravital microscopy and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptation may be needed for different murine strains or disease models.
- Longitudinal imaging stability depends on technical proficiency and animal care.
