Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek
4 sierpnia 2021
Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.
Wiele badań nad terapią genową i neuronauką obejmuje wstrzykiwanie wektorów AAV do mózgów naczelnych innych niż ludzie. Aby te badania zakończyły się sukcesem, technika iniekcji musi być wiarygodna. Nasza technika iniekcji jest natychmiastowa i dokładna.
Ta procedura dobrze sprawdza się w przypadku wstrzykiwań u zwierząt znieczulonych lub obudzonych. Nasza domowa kaniula jest łatwa w obsłudze i tania. Procedurę zademonstruje Kevin Mai, technik inżynier z mojego laboratorium.
Aby rozpocząć, stępić końcówkę igły podskórnej o rozmiarze 30 i średnicy 13 milimetrów za pomocą szlifierki tarczowej. Następnie przytnij kawałek rurki ze stali nierdzewnej na długość zależną od głębokości docelowego obszaru mózgu. Za pomocą szlifierki tarczowej ukosuj jeden koniec przeciętej rury i wygładź drugi.
Usuń zadziory z wnętrza tubki za pomocą przeciągacza. Następnie przyciąć kawałek rurki PTFE na długość odpowiednią do objętości roztworu wektorowego, który ma zostać załadowany. Rozszerz oba końce tubki, wprowadzając igłę podskórną.
Włożyć igłę podskórną na około pięć milimetrów do jednego końca rurki PTFE. Następnie włóż nieskośny koniec rurki ze stali nierdzewnej około pięciu milimetrów do drugiego końca. Przetestuj kaniulę, wstrzykując przefiltrowaną wodę przez piastę igły podskórnej.
Upewnij się, że woda płynnie wypływa ze skośnej końcówki rurki ze stali nierdzewnej i że woda nie wycieka z żadnego złącza. Po przetestowaniu kaniuli umieść ją w torbie autoklawu i wysterylizuj przez autoklawowanie. Delikatnie przenieś roztwór wektora do wysterylizowanej probówki PCR za pomocą pipetera P-20, unikając tworzenia się pęcherzyków.
Następnie przymocuj kaniulę ze ściętą końcówką skierowaną w dół do pionowo zorientowanego uchwytu stereotaktycznego. Następnie podłącz jednomililitrową strzykawkę typu luer lock do piasty igły podskórnej kaniuli. Zanurz skośną końcówkę w roztworze wektorowym.
Następnie zastosuj delikatne podciśnienie za pomocą jednomililitrowej strzykawki, aby załadować roztwór do kaniuli, jednocześnie wizualnie śledząc menisk między roztworem a powietrzem. Po załadowaniu roztworu wektorowego kontynuuj delikatne podciśnienie, aż roztwór dotrze do piasty igły. Następnie wyjmij jednomililitrową strzykawkę i powoli wstrzyknij kolorowy olej mineralny wzdłuż wewnętrznej ścianki piasty igły podskórnej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
Przymocuj piastę igły podskórnej do jednego z dwóch otwartych portów trójdrożnego kurka typu luer lock. Następnie zamknij port. Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra powietrzem i podłącz ją do jednego z dwóch pozostałych portów.
Na koniec zamknij pozostały port kranu, aby podłączyć strzykawkę do kaniuli. Podłączenie strzykawki wtłacza powietrze do kurka, a przetaczanie tego powietrza do wolnego portu zapobiega wypychaniu roztworu wektorowego z powrotem w dół kaniuli. Powoli wtłaczać powietrze ze strzykawki do kaniuli.
Gdy kolorowy olej pojawi się na końcu igły w rurki PTFE, sprawdź, czy między roztworem a kolorowym olejem nie ma powietrza. Kontynuuj wywieranie nadciśnienia, aż kropla roztworu wektorowego będzie widoczna na skośnej końcówce kaniuli. Następnie zamknij kurek, aby zapobiec wydostawaniu się wektora z kaniuli grawitacyjnie.
Po załadowaniu roztworu wektorowego przymocuj kaniulę do manipulatora stereotaktycznego. Następnie, aby podłączyć kran do elektrycznej pompy powietrza, wyjmij rurkę pompy od niesterylnego asystenta. Chwyć złącze luer lock przez ściankę sterylnej tulei.
Upuść kołnierz rękawa, pozwalając mu grawitacyjnie rozciągać się wzdłuż rury. Następnie przymocuj zawór odcinający i szczelnie przyklej tuleję wokół złącza luer lock. Następnie przetestuj pompę powietrza i kaniulę, ustawiając pompę powietrza na niskie ciśnienie, przed włączeniem i zwiększeniem ciśnienia, aż olej przejdzie przez kaniulę i na końcu kaniuli będzie widoczna kropla roztworu wektorowego.
Przyklej plastikową linijkę do rurki PTFE, aby zmierzyć ruch menisku podczas wstrzykiwania. Następnie wbij kaniulę w dół za pomocą manipulatora stereotaktycznego, aż końcówka dotrze do powierzchni i zapisz głębokość. Skieruj kaniulę do najgłębszego miejsca, które ma zostać wstrzyknięte wzdłuż toru.
Powierzchnia ulegnie wgłębieniom w kontakcie. Aby zminimalizować błędne ukierunkowanie spowodowane kompresją tkanki, należy zjechać kaniulą w dół i przekroczyć najgłębsze miejsce wstrzyknięcia o 500 mikrometrów. Następnie powoli się wycofaj.
Inne alternatywy to powolne wkręcanie kaniuli w dół lub szybkie jej wbijanie i czekanie na dole przez jedną do pięciu minut. Po umieszczeniu kaniuli w najgłębszym miejscu wstrzyknięcia użyj elektrycznej pompy powietrza, aby wstrzyknąć 0,5 mikrolitra roztworu wektorowego w ciągu 10 do 30 sekund. Potwierdź przepływ wtrysku, śledząc menisk między kolorowym olejem a roztworem wektorowym w rurce PTFE.
Po odczekaniu jednej minuty wycofać kaniulę do następnego miejsca wstrzyknięcia wzdłuż toru. Po ostatnim wstrzyknięciu pozostaw kaniulę na miejscu na 10 minut, aby uniknąć wypływu wektora. Następnie schowaj kaniulę i wyrzuć ją do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
Wstrzyknięcie wektorów AAV przenoszących kanałowy transgen rodopsyny II w lewym wzgórku górnym, a następnie stymulacja ciągłym niebieskim światłem o mocy 40 miliwatów, wytworzyło serię kolejnych potencjałów czynnościowych. Jednomilisekundowe impulsy świetlne nie wywoływały potencjałów czynnościowych przy 40 miliwatach, ale niezawodnie wywoływały je przy 160 miliwatach. Optyczna stymulacja wzgórka górnego wyzwalana przez sakkady sterowane wzrokowo stopniowo zmniejszała przyrost sakkady.
Powolność tej zmiany jest zgodna z plastycznością indukowaną optogenetycznie. Dostarczanie żółtego światła laserowego do robaka okoruchowego po wstrzyknięciach AAV w jądro reticularis tegmentae pontis hamowało aktywność włókien omszałych, które są wejściem do móżdżku. To tłumienie zmniejszyło aktywność komórek Purkinjego, które są wyjściem móżdżku.
Podczas tłumienia optogenetycznego szybkość wystrzeliwania zmniejszyła się i zmieniła w wzór pękających porów, co sugeruje, że zahamowane wprowadzanie włókien omszałych do komórek Purkinjego wpływa na fazę zwalniania sakkady, napędzając drugą serię. Rodopsyna kanałowa ulegała ekspresji wyłącznie w komórkach Purkinjego robaka okoruchowego. Dostarczanie krótkich impulsów świetlnych zwiększyło aktywność prostego kolca izolowanej komórki Purkinjego.
Pojedynczy 1,5-milisekundowy impuls świetlny często wywoływał więcej niż jeden prosty skok. Optogenetyczna prosta aktywacja kolca, która miała miejsce podczas sakkady, zwiększyła amplitudę sakady, potwierdzając dezhibiącą rolę komórek Purkinjego w generatorze impulsów okoruchowych. Pęcherzyki powietrza w kaniuli mogą zakłócać menisk wektora oleju, komplikować określanie objętości iniekcji i uniemożliwiać precyzyjną kontrolę natężenia przepływu.
Z tych powodów ładowanie roztworów wektorowych bez pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla tej procedury. Sześć do ośmiu tygodni po wstrzyknięciu można przeprowadzić manipulacje optogenetyczne i przetworzyć tkankę mózgową do analizy histologicznej. Technika ta pozwala naukowcom na przetestowanie wielu wektorów u kilku zwierząt, co z kolei ułatwia rozwój i walidację nowych wektorów.
Szczególnym obszarem obecnego zainteresowania jest rozwój wektorów, które będą ukierunkowane na określone typy neuronów.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia niezawodną i błyskawiczną technikę wstrzykiwania wektorów AAV do mózgów naczelnych zwierząt niebędących ludźmi, co jest kluczowe dla zastosowań optogenetycznych. Metoda ta umożliwia celowanie w konkretne obszary mózgu, a skuteczna stymulacja kolcolca górnego doprowadziła do istotnych zmian elektrofizjologicznych i dostarczyła informacji na temat plastyczności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Optogenetyka
- Terapia genowa
Wprowadzenie
- Optogenetyka wymaga precyzyjnego i niezawodnego dostarczania wektorów wirusowych.
- Technika iniekcji musi umożliwiać dokładne celowanie i identyfikację obszarów mózgu.
- Poprzednie metody mogą cechować się niską skutecznością lub precyzją, co wymusza zastosowanie ulepszonych technik.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej procedury iniekcji wektorów AAV u naczelnych.
- Zbadanie wpływu stymulacji optogenetycznej na odpowiedzi neuronalne.
- Ustanowienie metody możliwej do zastosowania zarówno u osobników w stanie czuwania, jak i znieczulonych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano własnoręcznie wykonaną kaniulę do podawania roztworów wektorów.
- Do konstrukcji użyto igły hipodermicznej o rozmiarze 30G oraz rurki ze stali nierdzewnej.
- Metoda obejmowała szczegółowe etapy przygotowania, napełniania i wstrzykiwania roztworu.
- Iniekcje roztworu wektora przeprowadzono pod precyzyjną kontrolą przy użyciu elektrycznej pompy powietrznej.
- Odpowiedzi elektrofizjologiczne monitorowano w trakcie oraz po wykonaniu iniekcji.
Główne wyniki
- Wstrzyknięcie wektorów AAV doprowadziło do znaczącej generacji potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na stymulację optyczną.
- Zmiany elektrofizjologiczne sugerują optogenetycznie indukowaną plastyczność odpowiedzi sakadycznych.
- Infuzja wektora doprowadziła do zaobserwowanej supresji wyjść móżdżku, co wskazuje na zmienione wzorce aktywności neuronalnej.
Wnioski
- Zaproponowana technika iniekcji umożliwia precyzyjne celowanie w badaniach optogenetycznych na modelach naczelnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów neuronalnych i plastyczności związanej z przetwarzaniem bodźców wzrokowych.
- Poprawiona dokładność iniekcji ma istotne znaczenie dla przyszłych zastosowań w terapii genowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne i precyzyjne przestrzennie dostarczanie wektorów AAV do mózgów naczelnych zwierząt niedziałających (NHP) jest kluczowym elementem rozwoju translacyjnej optogenetyki oraz neurologicznej terapii genowej. Niniejsza metoda rozwiązuje problem reprodukowalności podawania wektorów u NHP, wspierając rzetelną walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego przed translacją kliniczną. Zdolność tej metody do ułatwienia testowania wielu wektorów w ograniczonych kohortach zwierzęcych bezpośrednio wpływa na efektywność portfela i pewność prognostyczną w rozwoju terapii CNS.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę konstruktów optogenetycznych i tropizmu wektorów w systemie NHP istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów neuronalnych poprzez kontrolowaną modulację optyczną i odczyty elektrofizjologiczne.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka, umożliwiając precyzyjne przestrzenne i wolumetryczne dostarczanie kandydackich wektorów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane obszary mózgu NHP do dalszych analiz optogenetycznych i elektrofizjologicznych.
- Standaryzuje objętości i szybkości wstrzykiwania, co poprawia powtarzalność między seriami eksperymentów.
- Umożliwia ilościową ocenę ekspresji wektora i efektów funkcjonalnych w celu przesiewania kandydackich wektorów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez modelowanie istotnych dla ludzi obwodów neuronalnych u NHP.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania wektorów po walidację przedkliniczną w systemie o wysokiej wierności.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, umożliwiając solidną, możliwą do zweryfikowania histologicznie dostarczanie i ekspresję konstruktów terapeutycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta technika wstrzykiwania jest stosowana na styku wczesnego etapu odkryć, walidacji celu oraz opracowywania modeli przedklinicznych dla programów optogenetyki i terapii genowej OUN.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie precyzyjnej manipulacji obwodami neuronalnymi u NHP.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe podawanie wektorów do porównawczej oceny konstrukcji kandydackich.
- Analityka: Dostarcza mierzalne parametry, takie jak objętość wstrzyknięcia, szybkość podawania oraz pośmiertne potwierdzenie histologiczne.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie reakcji neuronalnych podobnych do ludzkich u NHP.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zstandaryzowany, skalowalny protokół możliwy do dostosowania do różnych kombinacji wektorów i celów.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów w OUN.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i przepustowość testowania wektorów u NHP.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez umożliwienie generowania solidnych danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów terapii genowej OUN.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaksycznej oraz znajomości neuroanatomii NHP w celu zapewnienia dokładnego celowania.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do produkcji kaniul, oprzyrządowania do iniekcji oraz infrastruktury do analizy histologicznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest adaptowalna do różnych obszarów mózgu i typów wektorów poprzez odpowiednie modyfikacje protokołu.
- Kluczowe jest dokładne usunięcie pęcherzyków powietrza, aby zachować precyzję iniekcji i uniknąć zakłóceń przepływu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Making a Cannula
2:09
Loading the Vector Solution for Injection
4:14
Cannula Insertion into the Target Brain Area and Injection
6:33
Results: Optogenetic Manipulations by Adeno-Associated Viral (AAV) Vector Injections in Awake Monkeys
8:39
Conclusion
