Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

OCT jest środkiem kriokonserwującym, który jest niekompatybilny z analizą spektrometrii mas. Korzystając z tego protokołu, naukowcy mogą usunąć OCT z tkanek i określić ilościowo sfingolipidy za pomocą spektrometrii mas z tandemową chromatografią cieczową. Przygotowanie do suszenia tkanek, mycie tkanek i ważenie tkanek zostanie zademonstrowane przez April Boyd z Virginia Commonwealth University, a ekstrakcja lipidów zostanie zademonstrowana przez dr Jeremy'ego Allegooda, dyrektora Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.

Na początek wyczyść nożyczki chirurgiczne, zanurzając je w metanolu na pięć minut, a następnie przecierając je czystą chusteczką laboratoryjną. Używając rękawiczek bezpudrowych, zakręć końcem laboratoryjnej chusteczki higienicznej, aby uzyskać drobno zwężający się o długości od 30 do 40 milimetrów. Następnie za pomocą nożyczek oczyszczonych metanolem odetnij na grubym końcu i umieść go w czystym kartonie.

Następnie, używając nożyczek oczyszczonych metanolem, odetnij od czterech do pięciu milimetrów końcówki pipety o pojemności jednego mililitra i umieść końcówkę z powrotem w uchwycie końcówki. Aby zmyć OCT z tkanek, dodaj 10 mililitrów lodowatej ultraczystej dejonizowanej wody do każdej probówki zawierającej ludzką tkankę płucną i szczelnie je zakryj. Pozostaw probówki do inkubacji przez 10 minut.

Energicznie wiruj każdą probówkę, aż cała tkanka osadzona na ściankach rurki lub osad tkanki zostanie całkowicie zawieszona. Następnie odwirować probówki w wstępnie schłodzonej, wahadłowej wirówce kubełkowej w temperaturze od 4 000 do 5 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania odkręć probówki na lodzie.

Ostrożnie zassać roztwór myjący, pozostawiając około 0,5 mililitra supernatantu w probówce, a następnie ponownie zamknąć probówkę. Po usunięciu supernatantu ze wszystkich probówek, należy umyć chusteczki jeszcze dwa razy w ten sam sposób. Po trzech płukaniach usuwania OCT użyj przygotowanej skróconej końcówki pipety, aby dodać 500 mikrolitrów lodowatego PBS do probówki.

Za pomocą tej samej końcówki delikatnie ponownie zawiesić osad i przenieść całą zawieszoną tkankę do wstępnie oznaczonej i zważonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Trzymaj probówkę na lodzie, aż wszystkie próbki tkanek zostaną przeniesione. Osadzać tkanki, odwirowując probówki we wstępnie schłodzonej wirówce, a następnie ostrożnie zasysać jak najwięcej PBS bez naruszania osadu i umieszczać probówki z powrotem na lodzie.

Za pomocą przygotowanych wcześniej do suszenia chusteczek delikatnie usuń pozostały roztwór do mycia, a następnie zamknij tubkę i umieść ją na lodzie. Aby zważyć probówki, należy umieszczać po jednej probówce w niedawno skalibrowanej, wytarowanej i wyzerowanej wadze analitycznej i zamknąć drzwi komory. Gdy waga się ustabilizuje, zapisz ją w elektronicznym arkuszu kalkulacyjnym.

Po zważeniu umieść probówkę z powrotem na lodzie i dodaj 300 mikrolitrów lodowatego PBS. Używając skróconej końcówki pipety, ostrożnie przenieś całą tkankę do dwóch mililitrów lodowatego metanolu w wstępnie oznaczonej szklanej probówce z zakręcaną wodą. Przed ekstrakcją lipidów należy odczekać, aby wewnętrzne wzorce lipidowe tkanek i spektrometrii mas osiągnęły temperaturę pokojową przez 20 minut, a następnie wirować i zanurzać roztwory wzorca wewnętrznego w ultradźwiękowej łaźni wodnej, aż wzorce lipidowe całkowicie się rozpuszczą.

Za pomocą pipety powtarzalnej dodać 250 pikomoli wzorców wewnętrznej spektrometrii mas do każdej probówki i delikatnie ponownie zamknąć probówki. Aby ułatwić homogenizację, dostosuj objętość metanolu do dwóch mililitrów, a następnie rozcieraj tkankę za pomocą homogenizatora, przesuwając końcówkę homogenizatora okrężnymi ruchami, delikatnie dociskając do ścianki probówki. Gdy grudki nie są już widoczne, ponownie zakryj tubę.

Zanurz rurkę pod kątem 45 stopni w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 5 do 10 sekund. Następnie pod wyciągiem dodaj chloroform i metanol do każdej rurki, aby uzyskać stosunek metanolu do chloroformu do wody wynoszący dwa do jednego do 0,1. Szczelnie zamknij rurki i pozostaw je na blacie do końca dnia.

Przed wyjściem tego wieczoru umieść szczelnie zamknięte rurki w łaźni wodnej o temperaturze 48 stopni Celsjusza na nocną inkubację. Następnego dnia osadzać dowolny rozpuszczalnik i rozpuszczalne zanieczyszczenia przez odwirowanie. Następnie w dygestorium ostrożnie zdekantować supernatant do wstępnie oznakowanych probówek ze szkła borokrzemianowego o średnicy od 13 do 100 milimetrów, nachylonych pod kątem od 30 do 45 stopni, aby ułatwić dekantację.

Po zdekantowaniu supernatantu ze wszystkich probówek, należy użyć koncentratora próżniowego przy maksymalnej próżni z początkowym jednogodzinnym etapem ogrzewania w temperaturze 40 stopni Celsjusza, aby odparować cały rozpuszczalnik, a następnie dodać 500 mikrolitrów metanolu do każdej probówki. Aby ponownie zawiesić wysuszone ekstrakty lipidowe, należy wirować probówkę przez 5 do 10 sekund, a następnie zanurzyć probówkę w ultradźwiękowej łaźni wodnej pod kątem 45 stopni z obrotem na dwie minuty. Ponownie wirować rurkę przez pięć sekund i ponownie zanurzyć w ultradźwiękowej łaźni wodnej na dodatkową minutę.

Usunąć wszelkie nierozpuszczalne zanieczyszczenia przez odwirowanie, a następnie zdekantować supernatant do wstępnie oznakowanej fiolki z automatycznym wstrzykiwaczem nachylonej pod kątem 30 do 45 stopni, aby ułatwić dekantację. Szczelnie zamknąć fiolki przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Chromatografia cieczowa z jonizacją w tandemie, analiza spektrometrii mas po usunięciu OCT potwierdza, że różne gatunki ceramidów i monoheksozylo-ceramidów o długości łańcucha są znacznie podwyższone w guzach gruczolakoraka płuc u ludzi w porównaniu z normalnymi sąsiednimi niezaangażowanymi tkankami.

Wzorce sfingolipidów eluują się sekwencyjnie w następującej kolejności: sfingozyna d17:1, sfingozyno-1-fosforan d17:1, C12 laktozylo-ceramid, C12 monoheksozylo-ceramid, C12 sfingomielina i C12 ceramid. Dla każdego z tych gatunków sfingolipidów, przy użyciu ustawień gradientu i oprzyrządowania w tekście, występuje w przybliżeniu dodatnie przesunięcie czasu retencji o 0,15 minuty na każde dwa przyrosty węgla w długości łańcucha. Jednak lipidy o dłuższej długości łańcucha, takie jak C24 i C26, mogą mieć większe przesunięcia czasu retencji.

Co więcej, podwójne wiązanie w kwasie tłuszczowym często powoduje ujemne przesunięcie czasu retencji o 0,15 minuty. Tak więc ceramid C18:1 będzie miał czas retencji podobny do ceramidu C16. Zamiast polegać prawie wyłącznie na świeżo pobranych tkankach, protokół ten rozszerza źródła tkanek, które można wykorzystać do analizy spektrometrii mas, o te przechowywane kriogenicznie w biorepozytoriach.