Name: Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę usuwania związku OCT z tkanki ludzkiej do analizy sfingolipidów metodą LC-ESI-MS/MS. Protokół umożliwia wykorzystanie próbek z biobanków w retrospektywnych badaniach lipidomiki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Usługi i wsparcie projektu badawczego zostały zapewnione przez VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core oraz VCU Lipidomics and Metabolomics Core, które są częściowo wspierane przez fundusze z NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago).

<ol><li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li>
<li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li>
<li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li>
<li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li>
<li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li>
<li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li>
<li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li>
<li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li>
<li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorad%2C+SAF+%22Advances+in+Cancer+Research%22">Advances in Cancer Research</a>. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).</li>
<li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li>
<li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+LC-MS%2FMS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+%28OCT%29+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li>
<li>Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+%28OCT%29+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

OCT jest powszechnym długoterminowym środkiem kriokonserwującym stosowanym w biorepozytoriach. Jednak OCT może powodować supresję jonów, gdy tkanki są analizowane przez różne platformy spektrometrii mas 12,13,14,15 lub powodować utratę sygnału, gdy próbki są analizowane przez LC-ESI-MS / MS 11. OCT w tkankach kriokonserwowanych może również zakłócać metody normalizacji t...

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity znane ze swojej roli w metabolizmie i chorobach człowieka1,2. Regulują złożone procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, przeżycie i śmierć komórek, ruch komórek, transport pęcherzykowy, inwazja komórkowa i przerzuty, angiogeneza i produkcja cytokin1,2,3,4,5,6,7,8,9. Defekty w regulacji metabolizmu sfingolipidów przyczyniają się do inicjacji i progresji nowotworów, określają, jak agresywne są nowotwory oraz jak nowotwory reagują na terapię i rozwijają oporność na nią3,10. Dlatego, ze względu na tak szeroki wpływ na etiologię choroby, metody analityczne, które mogą precyzyjnie określić specyficzne dla choroby zmiany sfingolipidów, są ważnymi narzędziami. Spektrometria mas (MS) jest najdokładniejszą i najbardziej wiarygodną metodą analizy zmian sfingolipidów.
Ludzkie próbki, które mogą być użyte do analizy zmian sfingolipidów, można uzyskać prospektywnie z sali operacyjnej lub retrospektywnie z biorepozytoriów tkanek. Świeże tkanki z operacji są korzystne, ponieważ można je bezpośrednio analizować za pomocą stwardnienia rozsianego lub innych metod analitycznych. Jednak prospektywne pozyskiwanie tkanek wiąże się z przeszkodami administracyjnymi, technicznymi i logistycznymi, a zebranie wystarczającej liczby próbek, aby osiągnąć moc statystyczną, może być wyzwaniem. Pozyskiwanie tkanek z biorepozytoriów jest korzystne, ponieważ można je pozyskać retrospektywnie, w dużych ilościach, a biorepozytoria potwierdzają histologię i patologię, wykorzystują standardowe procedury operacyjne do kriogennego konserwowania i przechowywania tkanek oraz mogą dostarczać danych klinicznopatologicznych, które można wykorzystać do analiz korelacji. Jednakże, aby zachować cechy molekularne i strukturalne, biorepozytoria mogą kriokonserwować tkanki poprzez osadzanie ich w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), który, jak wykazaliśmy, zakłóca testy normalizacji danych i kwantyfikację sfingolipidów za pomocą chromatografii cieczowej z jonizacją elektronrozpylającą tandemową spektrometrię mas (LC-ESI-MS/MS)11. Wykazano również, że alkohol poliwinylowy i glikol polietylenowy, podstawowe składniki związku OCT, powodują tłumienie jonów na innych platformach analizy MS12,13,14,15. W związku z tym związek OCT musi zostać usunięty z tkanek przed analizą sfingolipidomiczną przez SM.
W poprzednim raporcie zatwierdziliśmy protokół usuwania związku OCT z próbek ludzkich do analizy LC-ESI-MS/MS11 oraz metodologię używaną do ważenia tkanek w celu normalizacji danych11. W tym miejscu szczegółowo opisujemy etapy protokołu usuwania związków OCT sfingolipidomicznego (sOCTrP) i pokazujemy reprezentatywne dane z guzów ludzkiego gruczolakoraka płuc i normalnych sąsiednich niezaangażowanych tkanek.

<table><tbody><tr><td>Polipropylenowe końcówki do pipet 1 ml</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Służy do pobierania próbek</td></tr><tr><td>1,5 ml polipropylenowych probówek wirówkowych</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Kolba Erlenmeyera</td><td>VWR</td><td>89091-116</td><td>Służy do ważenia probówek i tkanek</td></tr><tr><td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td><td>Sciex</td><td>NA</td><td>Oprogramowanie do analizy i integracji danych MS</td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11550</td><td>Do faz ruchomych LC</td></tr><tr><td>Skala analityczna</td><td>NA</td><td></td><td>Skala z dokładnością do 0,1 mg</td></tr><tr><td>Dozownik butelkowy</td><td>Sartorius</td><td>LH-723071</td><td>Używany do dozowania rozpuszczalników</td></tr><tr><td>C12-Ceramid (d18:1/C12:0); N-(dodekanoilo)-sphing-4-enina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2212</td><td>Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>C12-glukozyloceramid (d18:1/12:0); N-(dodekanoilo)-1-&beta;-glukozylo-sphing-4-eine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2511</td><td>Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>C12-laktozyloceramid (d18:1/12:0); N-(dodekanoilo)-1-&szlig;-laktozylo-sphing-4-en</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2512</td><td>Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>C12-Sfingomielina&nbsp; (d18:1/C12:0), N-(dodekanoilo)-sphing-4-enine-1-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2312</td><td>Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td><td>VWR</td><td>EM-CX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki do przechowywania biologicznego ClickSeal</td><td>Thermo Scientific</td><td>75007309</td><td>Aby zapobiec zagrożeniu biologicznemu podczas wirowania</td></tr><tr><td>Conflikt</td><td>Decon Labs</td><td>4101</td><td>Dekontaminacja</td></tr><tr><td>Piec kolumnowy CTO-20A/20AC</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td>Do LC</td></tr><tr><td>d17:1-Sphingozyna; &nbsp; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2000</td><td>Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>d17:1-sfingozyno-1-fosforan; heptadekasfing-4-enino-1-fosforan</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2144</td><td>Wewnętrzny wzorzec</td></tr><tr><td>odgazowywania DGU20A5R</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td> Jednorazowe probówki hodowlane Shimadzu NA <td></td></tr><tr><td>13x100mm</td><td>VWR</td><td>53283-800</td><td>Rurki śrubowe 13x100 mm</td></tr><tr><td>Podgrzewana kąpiel wodna</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Do ekstrakcji lipidów przez noc</td></tr><tr><td>Homogenizator 150</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-167</td><td>trójdzielne tkanki</td></tr><tr><td>Homogenizator Plastikowa jednorazowa sonda generatora</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-177</td><td>do homogenizacji</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech 34120</td><td></td><td>Laboratoryjna chusteczka używana do produkcji</td></tr><tr><td>Metanol LC-MS Grade 4L</td><td>Pompa binarna VWR</td><td>EM-MX0486-1</td><td></td></tr><tr><td>Nexera LC-30 AD</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td>Do markera permanentnego LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięcie gwintu fenolowego, Kimble Chase (nasadki do jednorazowych probówek hodowlanych)</td><td>VWR</td><td>89001-502</td><td>13x100 mm zakrętki na rurkę</td></tr><tr><td>solną soli fizjologicznej z buforem fosforanowym</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td>Do pobierania próbek z probówek po umyciu</td></tr><tr><td>Pipeta Repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4987000118</td><td>Do dozowania wewnętrznych wzorców LC-MS</td></tr><tr><td>Zakrętki, niebieskie, czerwone PTFE/biały silikon</td><td>VWR</td><td>89239-020</td><td>Nasadki na fiolki z automatycznym wtryskiwaczem</td></tr><tr><td>Szklane fiolki z gwintem śrubowym z naszywką identyfikacyjną</td><td>VWR</td><td>46610-724</td><td>Fiolki z automatycznym wtryskiwaczem</td></tr><tr><td>SIL-30AC</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD2030P1220</td><td>Do suszenia rozpuszczalników</td></tr><tr><td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Kolumna Ascentis Express C18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>581300-U</td><td>Do LC-MS</td></tr><tr><td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td><td>Sciex</td><td>NA</td><td>Do LC-ESI-MS/MS</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa łaźnia wodna</td><td>Branson</td><td>Model 2800</td><td>do homogenizacji i reprodukcji wyekstrahowanych i wysuszonych lipidów</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>NA</td><td>NA Do</td><td>sOCTrP i ponownego zawieszania wysuszonych</td></tr><tr><td>lipidów VWR Probówki hodowlane Jednorazowe szkło borokrzemianowe</td><td>VWR</td><td>47729572</td><td>13x100 Szklane probówki</td></tr> hodowlane <tr><td>Woda Hipersolve Chromanorm LC-MS</td><td>VWR</td><td>BDH83645.400</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sfingolipidy to składniki komórkowe, które odgrywają dobrze ugruntowaną rolę w ludzkim metabolizmie i chorobach. Spektrometria mas może być wykorzystana do określenia, czy sfingolipidy są zmienione w chorobie i zbadania, czy sfingolipidy mogą być celowane klinicznie. Jednak odpowiednio zasilane badania prospektywne, w których pobiera się tkanki bezpośrednio z sali operacyjnej, mogą być czasochłonne, a także trudne technicznie, logistycznie i administracyjnie. Z kolei w badaniach retrospektywnych można wykorzystać kriokonserwowane próbki ludzkie, które są już dostępne, zwykle w dużych ilościach, w biorepozytoriach tkanek. Inne zalety pozyskiwania tkanek z biorepozytoriów obejmują dostęp do informacji związanych z próbkami tkanek, w tym histologii, patologii, a w niektórych przypadkach zmiennych kliniczno-patologicznych, z których wszystkie można wykorzystać do zbadania korelacji z danymi lipidomicznymi. Jednak ograniczenia techniczne związane z niezgodnością związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) stosowanego w kriokonserwacji i spektrometrii mas stanowią barierę techniczną dla analizy lipidów. Jednak wcześniej wykazaliśmy, że OCT można łatwo usunąć z ludzkich próbek z repozytorium biologicznego poprzez cykle płukania i wirowania bez zmiany ich zawartości sfingolipidów. Wcześniej ustaliliśmy również, że sfingolipidy w tkankach ludzkich kriokonserwowanych w OCT są stabilne przez okres do 16 lat. W tym raporcie przedstawiamy etapy i przepływ pracy w celu analizy sfingolipidów w próbkach tkanek ludzkich, które są osadzone w OCT, w tym mycie tkanek, ważenie tkanek w celu normalizacji danych, ekstrakcja lipidów, przygotowanie próbek do analizy za pomocą chromatografii cieczowej, tandemowej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą (LC-ESI-MS/MS), integracja danych spektrometrii mas, normalizacja danych i analiza danych.

W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy metodę usuwania OCT z kriokonserwowanych tkanek ludzkich oraz ich ważenia w celu przeprowadzenia analizy metodą LC-ESI-MS/MS. Materiały niezbędne do wykonania tej procedury wymieniono w Tabela materiałówPrzedstawiono w Rysunek 1 stanowią wyniki typowego eksperymentu, w którym 10 guzów gruczolakoraka płuca człowieka oraz 10 próbek normalnej tkanki przyległej przemyto w celu usunięcia OCT, a następnie poddano analizie metodą LC-ESI-...

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT jest środkiem kriokonserwującym, który jest niekompatybilny z analizą spektrometrii mas. Korzystając z tego protokołu, naukowcy mogą usunąć OCT z tkanek i określić ilościowo sfingolipidy za pomocą spektrometrii mas z tandemową chromatografią cieczową. Przygotowanie do suszenia tkanek, mycie tkanek i ważenie tkanek zostanie zademonstrowane przez April Boyd z Virginia Commonwealth University, a ekstrakcja lipidów zostanie zademonstrowana przez dr Jeremy'ego Allegooda, dyrektora Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.Na początek wyczyść nożyczki chirurgiczne, zanurzając je w metanolu na pięć minut, a następnie przecierając je czystą chusteczką laboratoryjną. Używając rękawiczek bezpudrowych, zakręć końcem laboratoryjnej chusteczki higienicznej, aby uzyskać drobno zwężający się o długości od 30 do 40 milimetrów. Następnie za pomocą nożyczek oczyszczonych metanolem odetnij na grubym końcu i umieść go w czystym kartonie.Następnie, używając nożyczek oczyszczonych metanolem, odetnij od czterech do pięciu milimetrów końcówki pipety o pojemności jednego mililitra i umieść końcówkę z powrotem w uchwycie końcówki. Aby zmyć OCT z tkanek, dodaj 10 mililitrów lodowatej ultraczystej dejonizowanej wody do każdej probówki zawierającej ludzką tkankę płucną i szczelnie je zakryj. Pozostaw probówki do inkubacji przez 10 minut.Energicznie wiruj każdą probówkę, aż cała tkanka osadzona na ściankach rurki lub osad tkanki zostanie całkowicie zawieszona. Następnie odwirować probówki w wstępnie schłodzonej, wahadłowej wirówce kubełkowej w temperaturze od 4 000 do 5 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania odkręć probówki na lodzie.Ostrożnie zassać roztwór myjący, pozostawiając około 0,5 mililitra supernatantu w probówce, a następnie ponownie zamknąć probówkę. Po usunięciu supernatantu ze wszystkich probówek, należy umyć chusteczki jeszcze dwa razy w ten sam sposób. Po trzech płukaniach usuwania OCT użyj przygotowanej skróconej końcówki pipety, aby dodać 500 mikrolitrów lodowatego PBS do probówki.Za pomocą tej samej końcówki delikatnie ponownie zawiesić osad i przenieść całą zawieszoną tkankę do wstępnie oznaczonej i zważonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Trzymaj probówkę na lodzie, aż wszystkie próbki tkanek zostaną przeniesione. Osadzać tkanki, odwirowując probówki we wstępnie schłodzonej wirówce, a następnie ostrożnie zasysać jak najwięcej PBS bez naruszania osadu i umieszczać probówki z powrotem na lodzie.Za pomocą przygotowanych wcześniej do suszenia chusteczek delikatnie usuń pozostały roztwór do mycia, a następnie zamknij tubkę i umieść ją na lodzie. Aby zważyć probówki, należy umieszczać po jednej probówce w niedawno skalibrowanej, wytarowanej i wyzerowanej wadze analitycznej i zamknąć drzwi komory. Gdy waga się ustabilizuje, zapisz ją w elektronicznym arkuszu kalkulacyjnym.Po zważeniu umieść probówkę z powrotem na lodzie i dodaj 300 mikrolitrów lodowatego PBS. Używając skróconej końcówki pipety, ostrożnie przenieś całą tkankę do dwóch mililitrów lodowatego metanolu w wstępnie oznaczonej szklanej probówce z zakręcaną wodą. Przed ekstrakcją lipidów należy odczekać, aby wewnętrzne wzorce lipidowe tkanek i spektrometrii mas osiągnęły temperaturę pokojową przez 20 minut, a następnie wirować i zanurzać roztwory wzorca wewnętrznego w ultradźwiękowej łaźni wodnej, aż wzorce lipidowe całkowicie się rozpuszczą.Za pomocą pipety powtarzalnej dodać 250 pikomoli wzorców wewnętrznej spektrometrii mas do każdej probówki i delikatnie ponownie zamknąć probówki. Aby ułatwić homogenizację, dostosuj objętość metanolu do dwóch mililitrów, a następnie rozcieraj tkankę za pomocą homogenizatora, przesuwając końcówkę homogenizatora okrężnymi ruchami, delikatnie dociskając do ścianki probówki. Gdy grudki nie są już widoczne, ponownie zakryj tubę.Zanurz rurkę pod kątem 45 stopni w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 5 do 10 sekund. Następnie pod wyciągiem dodaj chloroform i metanol do każdej rurki, aby uzyskać stosunek metanolu do chloroformu do wody wynoszący dwa do jednego do 0,1. Szczelnie zamknij rurki i pozostaw je na blacie do końca dnia.Przed wyjściem tego wieczoru umieść szczelnie zamknięte rurki w łaźni wodnej o temperaturze 48 stopni Celsjusza na nocną inkubację. Następnego dnia osadzać dowolny rozpuszczalnik i rozpuszczalne zanieczyszczenia przez odwirowanie. Następnie w dygestorium ostrożnie zdekantować supernatant do wstępnie oznakowanych probówek ze szkła borokrzemianowego o średnicy od 13 do 100 milimetrów, nachylonych pod kątem od 30 do 45 stopni, aby ułatwić dekantację.Po zdekantowaniu supernatantu ze wszystkich probówek, należy użyć koncentratora próżniowego przy maksymalnej próżni z początkowym jednogodzinnym etapem ogrzewania w temperaturze 40 stopni Celsjusza, aby odparować cały rozpuszczalnik, a następnie dodać 500 mikrolitrów metanolu do każdej probówki. Aby ponownie zawiesić wysuszone ekstrakty lipidowe, należy wirować probówkę przez 5 do 10 sekund, a następnie zanurzyć probówkę w ultradźwiękowej łaźni wodnej pod kątem 45 stopni z obrotem na dwie minuty. Ponownie wirować rurkę przez pięć sekund i ponownie zanurzyć w ultradźwiękowej łaźni wodnej na dodatkową minutę.Usunąć wszelkie nierozpuszczalne zanieczyszczenia przez odwirowanie, a następnie zdekantować supernatant do wstępnie oznakowanej fiolki z automatycznym wstrzykiwaczem nachylonej pod kątem 30 do 45 stopni, aby ułatwić dekantację. Szczelnie zamknąć fiolki przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Chromatografia cieczowa z jonizacją w tandemie, analiza spektrometrii mas po usunięciu OCT potwierdza, że różne gatunki ceramidów i monoheksozylo-ceramidów o długości łańcucha są znacznie podwyższone w guzach gruczolakoraka płuc u ludzi w porównaniu z normalnymi sąsiednimi niezaangażowanymi tkankami.Wzorce sfingolipidów eluują się sekwencyjnie w następującej kolejności: sfingozyna d17:1, sfingozyno-1-fosforan d17:1, C12 laktozylo-ceramid, C12 monoheksozylo-ceramid, C12 sfingomielina i C12 ceramid. Dla każdego z tych gatunków sfingolipidów, przy użyciu ustawień gradientu i oprzyrządowania w tekście, występuje w przybliżeniu dodatnie przesunięcie czasu retencji o 0,15 minuty na każde dwa przyrosty węgla w długości łańcucha. Jednak lipidy o dłuższej długości łańcucha, takie jak C24 i C26, mogą mieć większe przesunięcia czasu retencji.Co więcej, podwójne wiązanie w kwasie tłuszczowym często powoduje ujemne przesunięcie czasu retencji o 0,15 minuty. Tak więc ceramid C18:1 będzie miał czas retencji podobny do ceramidu C16. Zamiast polegać prawie wyłącznie na świeżo pobranych tkankach, protokół ten rozszerza źródła tkanek, które można wykorzystać do analizy spektrometrii mas, o te przechowywane kriogenicznie w biorepozytoriach.

preparation-human-tissues-embedded-optimal-cutting-temperature

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Spektrometria mas z jonizacją metodą desorpcji (DESI-MS) to metoda otoczenia, za pomocą której próbki, w tym tkanki biologiczne, mogą być obrazowane przy minimalnym przygotowaniu próbki. Poprzez rasterowanie próbki poniżej sondy jonizacyjnej, ta technika oparta na rozpylaniu zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, aby dostrzec interesujące cechy molekularne w obrębie skrawków tkanki.

Obrazowanie tkanek biologicznych metodą spektrometrii mas z desorpcją i jonizacją metodą elektrorozpylania

Archiwalne próbki kliniczne z utrwalonego formaliny i zatopionej w parafinie (FFPE) są cennym materiałem do badania chorób. W tym miejscu demonstrujemy proces przygotowania próbki, który pozwala na dogłębną analizę proteomiczną mikrowypreparowanej tkanki FFPE.

Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie

Translacyjne badania nad rakiem są zależne od ekstrakcji tkanek ludzkich. Wiele pracy włożono w optymalizację metod ekstrakcji do analizy ex vivo. W tym miejscu opisujemy metody przetwarzania tkanek pozwalające na maksymalne uzyskanie danych wyjściowych z ograniczonej liczby próbek.

Praca z tkankami ludzkimi w translacyjnych badaniach nad rakiem

Ten protokół opisuje powtarzalną i niezawodną metodę opartego na sublimacji przygotowania tkanki utrwalonej formaliną przeznaczonej do obrazowania spektrometrii mas.

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Protokół ten opisuje kluczowe kroki umożliwiające rygorystyczne i powtarzalne pomiary zarówno glikogenu, jak i glikanów powiązanych z N za pomocą spektrometrii masowej.

Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas

Wieloparametrowa immunohistochemia fluorescencyjna może być wykorzystana do oceny liczby, względnego rozmieszczenia i lokalizacji populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie tej techniki do analizy subpopulacji komórek T w raku jamy ustnej i gardła.

Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie

Poznaj metodę usuwania związku OCT z tkanki ludzkiej do analizy sfingolipidów metodą LC-ESI-MS/MS. Protokół umożliwia wykorzystanie próbek z biobanków w retrospektywnych badaniach lipidomiki.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów