Name: Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny resekcji końców DNA w komórkach HeLa przy użyciu znakowania BrdU i markerów cyklu komórkowego. Technika ta umożliwia rozróżnienie szlaków naprawy HR i NHEJ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marie-Christine Caron za doskonałe porady techniczne. Prace te są wspierane przez fundusze z Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. jest kierownikiem Tier 1 Canada Research Chair w dziedzinie naprawy DNA i terapii raka. J.O'S jest doktorantem FRQS, a S.Y.M jest stypendystą podoktoranckim FRQS.

1. Hodowla komórkowa, zabiegi i przygotowanie szkiełek nakrywkowych
UWAGA: Wszystkie operacje powlekania komórek, transfekcji i zabiegów, z wyjątkiem napromieniania, powinny odbywać się pod sterylnym kapturem do hodowli komórek.
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Na płytce 6-dołkowej umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku na tyle warunków, ile potrzeba. Płytka ~150 000 komórek HeLa do transfekcji lub leczenia farmakologicznego, zgodnie z życzeniem. 
		UWAGA: W przypadku transfekcji zaleca się wykonanie transfekcji odwrotnej w czasie powlekania lub możliwe jest wykonanie transfekcji do przodu kilka godzin po posiewaniu, aby umożliwić przyleganie. Odwrotną transfekcję przeprowadza się poprzez dodanie mieszanki transfekcyjnej do szkiełka nakrywkowego przed dodaniem komórek; W ten sposób transfekcja rozpoczyna się, zanim komórki zaczną przylegać. Z kolei transfekcja do przodu polega na dodaniu mieszanki transfekcyjnej po przyklejeniu się do powierzchni, zwykle następnego dnia. Można to jednak zrobić tego samego dnia, pod warunkiem, że zapewni się wystarczająco dużo czasu, aby komórki się przykleiły.</li>
		<li>Do tej metody użyj 4 dołków: Studnia 1: kontrola siRNA (określana jako siCTRL); Studnia 2: siRNA przeciwko PARP-1 (siPARP-1); Studnia 3: nieleczona; Studnia 4: Komórki, które należy poddać działaniu 5 μM BMN673 1 godzinę przed napromienianiem. 
		UWAGA: W niniejszym protokole wszystkie badania przeprowadzono w warunkach napromieniowania (patrz punkt 1.3).</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez noc, chociaż protokół transfekcji dopuszcza inkubację do 3 dni. Czas inkubacji przed podaniem zabiegu BrdU będzie zależał od skuteczności transfekcji siRNA. Jeśli nie ma transfekcji, inkubacja przez 16 godzin jest wystarczająca, aby umożliwić przyleganie do szkiełka nakrywkowego i pewien wzrost komórek. 
		UWAGA: Warunki w inkubatorze można zmieniać w zależności od używanej linii komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Dodać BrdU w końcowym stężeniu 10 μM do odpowiednich pożywek hodowlanych i inkubować przez 16 godzin (jeden cykl komórkowy). 
		UWAGA: Roztwór BrdU przygotowuje się w dimetylosulfotlenku; użyty roztwór podstawowy ma 10 mM i jest przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Naświetlić płytki całkowitą dawką 5 Gy promieniowania rentgenowskiego (należy zmieniać dawkę promieniowania w zależności od typu naświetlacza, na przykład naświetlacze dla małych zwierząt vs. naświetlacze stołowe). Zobacz tabelę materiałów dla marki i modelu zastosowanego promiennika.</li>
		<li>Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i uwalniać komórki przez 3 godziny.</li>
		<li>Podczas 3-godzinnego okresu inkubacji przygotować dwa, A i B, oraz 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
		UWAGA: A i B oraz sacharoza powinny być przygotowane świeże w dniu utrwalenia, przy użyciu świeżego roztworu sacharozy, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
		<ol>
			<li>Przygotować bufor A (bufor do ekstrakcji wstępnej), zgodnie z kolejnością (30 ml) opisaną w tabeli 1. 
			UWAGA: Sacharoza 1M powinna być przygotowana w dniu użycia, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
			<li>Przygotować bufor B (bufor do usuwania cytoszkieletu) zgodnie z kolejnością opisaną w tabeli 1 (30 ml). 
			UWAGA: Bufor B musi być przygotowany w podanej kolejności, aby zapobiec wytrącaniu się Tween-20 i roztworu deoksycholanu sodu.</li>
			<li>Przygotuj 4% PFA, 2 ml na stan (10 ml), pod kapturem chemicznym (Tabela 1).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstępna ekstrakcja i utrwalanie
UWAGA: Wszystkie wstępne ekstrakcje i utrwalanie są wykonywane z szkiełkami nakrywkowymi pozostającymi na płytce do hodowli tkankowej na lodzie lub w temperaturze 4 °C; szkiełko nakrywkowe jest podnoszone dopiero w ostatnim kroku montażu (zobacz dyskusję).
<ol>
	<li>Ekstrakcja wstępna
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę, ostrożnie umyć komórki dwukrotnie 1x PBS i usunąć PBS. Dodać 2 ml buforu A do ekstrakcji wstępnej i natychmiast inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Ważne jest, aby czas inkubacji w buforze A nie uległ wydłużeniu. Przedłużona inkubacja w przed ekstrakcją spowoduje zwiększenie liczby oderwanych komórek od szkiełka nakrywkowego. Alternatywnie, zamiast inkubacji w temperaturze 4°C, inkubację można przeprowadzić na lodzie.</li>
		<li>Usuń bufor A za pomocą aspiration. 
		UWAGA: Nie myj szkiełek nakrywkowych po usunięciu buforu A. Przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu B do usuwania cytoszkieletu i natychmiast inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ostrożnie odessać bufor B i ostrożnie umyć komórki raz 1x PBS. Ostrożnie zassać 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Napraw komórki, dodając 2 ml 4% PFA pod maską chemiczną. 
		UWAGA: PFA jest toksyczny i musi być manipulowany pod maską chemiczną.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1x PBS i odessać nadmiar.</li>
		<li>Przykryj szkiełka nakrywkowe 100% zimnym metanolem i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze -20 °C przez 5 minut. Przemyć dwukrotnie 1x PBS. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x PBS, a w razie potrzeby płytę zawinąć w folię aluminiową. Komórki nie powinny być przechowywane dłużej niż 5 dni przed kontynuacją protokołu IF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przepuszczalność
<ol>
	<li>Inkubować komórki z 2 ml 1x PBS zawierającego 0,5% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 2 ml 1x PBS.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Krok blokujący
	<ol>
		<li>Przygotuj wystarczającą ilość świeżego buforu blokującego (3% BSA w 1x PBS), aby użyć 2 ml na szkiełko nakrywkowe. 
		UWAGA: Przygotuj dodatkowe 5 ml buforu blokującego, aby przygotować roztwory przeciwciał.</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu blokującego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w świeżym buforze blokującym: BrdU RPN202 1:1000 i antygen jądrowy komórek proliferujących (PCNA) 1:500, 100 μL na szkiełko nakrywkowe. 
		UWAGA: Aby zachować przeciwciało, można użyć mniejszej objętości, 75-100 μl dla szkiełka nakrywkowego 22 x 22 mm, 50-75 μl dla szkiełka nakrywkowego 18 x 18 mm.</li>
		<li>Na każde szkiełko nakrywkowe dodać 100 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Przykryj szkiełka nakrywkowe kwadratem parafilmu za pomocą pęsety i ostrożnie ustaw parafilm, aby nie tworzyć pęcherzyków.</li>
		<li>Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Usuń kwadraty parafilmu i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 2 ml sterylnego 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Przygotować wystarczającą ilość roztworu przeciwciała drugorzędowego w świeżym buforze blokującym: anty-mysi 488 fluorescencyjny wtórny A11011 (dla BrdU) rozcieńczenie 1:800 i anty-królik 568 fluorescencyjny wtórny A11011 (dla PCNA) rozcieńczenie 1:800, 
		UWAGA: Użyte kolory można zmienić w celu dopasowania do potrzeb eksperymentu. Konkretną użytą markę można znaleźć w Tabeli Materiałów.</li>
		<li>Dodać na każde szkiełko nakrywkowe 100 μl roztworu przeciwciał wtórnych, przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratem parafilmu za pomocą pęsety i ostrożnie ustawić parafilm bez pęcherzyków.</li>
		<li>Inkubować przeciwciało drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z płytką pokrytą folią aluminiową.</li>
		<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy 2 ml 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie jądrowe
	<ol>
		<li>Przygotować objętość 2 ml na szkiełko nakrywkowe 1x PBS zawierającej 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) w końcowym stężeniu 1 μg/ml (1:1000).</li>
		<li>Dodać na każde szkiełko nakrywkowe 2 ml roztworu DAPI. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 10 minut z płytką pokrytą folią aluminiową. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1x PBS.</li>
		<li>Przykryj szkiełka nakrywkowe 1x PBS i użyj igły lub cienkiej pęsety, aby podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu, delikatnie stukając jedną krawędzią w ręcznik papierowy. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie upuścić szkiełka ani nie pozwolić, aby płaska powierzchnia z przylegającymi komórkami dotykała papieru.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą 10-20 μl nośników montażowych specyficznych dla IF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Akwizycja i analiza obrazu
UWAGA: Akwizycja obrazu może być wykonana na kilku typach mikroskopów fluorescencyjnych. Użyto mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem olejowym o powiększeniu 63x; zobacz tabelę materiałów dla marki i modelu. Stosy Z nie są wymagane, chociaż mogą być przydatne w zależności od linii komórkowej i poziomu barwienia mitochondriów.
<ol>
	<li>Analiza obrazu
	<ol>
		<li>Dla każdego obrazu utwórz wiele plików TIFF; scal wszystkie płaszczyzny, ale kanały kolorów powinny być oddzielone. Zaimportuj te pliki do programu Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) i przeanalizuj je za pomocą potoku zliczania plamek (dodatkowe wideo 1).</li>
		<li>Prześlij obrazy (rysunek uzupełniający S1A).
		<ol>
			<li>Aby rozpocząć tworzenie projektu, załaduj potok zliczania plamek do programu, a obrazy do analizy znajdują się w podanym obszarze.</li>
			<li>Użyj modułu NamesAndTypes, aby przypisać zrozumiałą nazwę do każdego obrazu, za pomocą której inne moduły będą się do niego odwoływać-C01: Reprezentujący kanał BrdU; C02: Reprezentujący kanał PCNA; C03: Reprezentujący kanał DAPI. 
			UWAGA: Te identyfikatory będą zależeć od mikroskopu; W nazwie pliku powinien znajdować się identyfikator, aby odróżnić kanały.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ, który plik zostanie użyty do identyfikacji jąder i nazwij go (zmień tę nazwę w razie potrzeby) (patrz rysunek uzupełniający S1B i rysunek uzupełniający S1C).
		<ol>
			<li>Wybierz średnicę obiektu z zakresu od 50 do 300 jednostek pikseli, co jest dopuszczalnym zakresem rozmiarów jąder, ale zmień wartość, aby dopasować jądra do obrazu. 
			UWAGA: Może się zdarzyć, że 50 jest zbyt dużą wartością i uniemożliwia identyfikację mniejszych jąder; Podobnie, liczba 300 może pozwolić na zaliczenie dużych grup jąder jako 1.</li>
			<li>Odrzuć obiekty spoza zakresu średnic, aby upewnić się, że zostaną policzone tylko te, które spełniają kryteria.</li>
			<li>Odrzuć obiekty dotykające obramowania, aby usunąć komórki, które mogą znajdować się tylko częściowo w polu.</li>
			<li>Zastosuj próg, aby dopasować go do określonych obrazów. Zwróć uwagę na następujące ustawienia jako przykład. Zmień współczynnik korekcji progowania w zależności od tego, jak rygorystyczna będzie strategia progowania. Inne ustawienia obejmują strategię progową: Globalna; metoda progowania: Otsu; progi dwuklasowe lub trzyklasowe: dwuklasowe; skala wygładzania progów: 1; współczynnik wygładzania progu: 1; dolna i górna granica progu: 0,0 i 1,0; metoda rozróżniania zbitych obiektów: Kształt; oraz metoda rysowania linii podziału między zbitymi obiektami: Propagate. 
			UWAGA: Dla każdego parametru profiler komórek podaje uzupełniające definicje i dostępne możliwości ustawienia zmiennej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zidentyfikuj główny obiekt, aby zidentyfikować ogniska (rysunek uzupełniający S2A).
		<ol>
			<li>Użyj następujących ustawień: wybierz obraz wejściowy: Maskedgreen; nazwij główny obiekt, który ma być zidentyfikowany: BrdUFoci; typowa średnica obiektu: 1-15; odrzuć obiekt spoza zakresu średnic: Tak; odrzuć obiekt dotykający granicy obrazu: Nie; strategia progowa: Adaptacyjna; metoda progowania: Otsu; progowanie dwuklasowe lub trzyklasowe: Trzy klasy; skala wygładzania progu: 1; współczynnik wygładzania progu: 3; i rozmiar filtra wygładzającego: 4.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierz intensywność (rysunek uzupełniający S2B).
		<ol>
			<li>Wybierz obraz, który ma być mierzony: OrigGreen.</li>
			<li>Kliknij Dodaj kolejny obraz. Wybierz obraz, który ma być mierzony: PCNA. Wybierz obiekty do pomiaru: Nuclei. 
			UWAGA: Zostanie to wykorzystane do pomiaru intensywności BrdU i PCNA - ostatecznych danych, które zostaną przedstawione na wykresie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li>
<li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li>
<li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li>
<li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+poly%28ADP-ribose%29+formation+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li>
<li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li>
<li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Precision+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li>
<li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitor+resistance%3A+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li>
<li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954(2019).</li>
<li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19(2014).</li>
<li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li>
<li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li>
<li>Huertas, P., Cruz-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+resection+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li>
<li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano metodę wykorzystującą barwienie IF do pomiaru zmian w resekcji DNA w celuli. Obecnym standardem obserwacji wpływu na resekcję DNA jest barwienie RPA; jednak jest to metoda pośrednia, na którą może mieć wpływ replikacja DNA. Wcześniej opisano inną technikę resekcji IF DNA opartą na inkorporacji BrdU w celu sklasyfikowania wynikającej intensywności w komórkach BrdU-dodatnich i BrdU-ujemnych. Metoda ta pozwoliła na zaliczenie komórek, które nie są poddawane HR, jako dodatnich ze względu na barwie...

Modulacja czynników naprawy DNA jest ciągle rozwijającą się metodą terapii raka, szczególnie w środowiskach nowotworowych z niedoborem naprawy DNA DSB. Hamowanie określonych czynników naprawczych jest jedną z genialnych strategii stosowanych w celu uwrażliwienia komórek rakowych na czynniki uszkadzające DNA. Dziesięciolecia badań doprowadziły do zidentyfikowania różnych mutacji genów naprawy DNA jako biomarkerów dla wyboru strategii terapeutycznej1. W związku z tym dziedzina naprawy DNA stała się centrum opracowywania leków, aby zapewnić szeroki zakres zabiegów, wzmacniając koncepcję medycyny spersonalizowanej. 
DSB są naprawiane przez dwie główne ścieżki: NHEJ i HR2. Szlak NHEJ jest podatny na błędy, szybko liguje dwa końce DNA przy niewielkim lub zerowym przetwarzaniu końca DNA i obejmuje kinazę białkową (DNA-PKcs), kompleks Ku70/80, 53BP1 i białka RIF13. W przeciwieństwie do tego, HR jest wiernym mechanizmem zainicjowanym przez BRCA14. Niezbędnym krokiem w naprawie HR jest proces resekcji końca DNA, który polega na degradacji złamanych końców prowadzącej do jednoniciowego (ss) DNA z końcami 3'-OH. BRCA1 ułatwia rekrutację dalszych białek, które tworzą resektosom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, które są zaangażowane w resekcję DNA od 5' do 3'<klasa sup='xref'>5. 
Początkowa resekcja końcowa jest realizowana poprzez aktywność endonukleazy MRE11, co pozwala na dalsze przetwarzanie przez nukleazy DNA2 i EXO1. Wygenerowane zwisy ssDNA są szybko powlekane białkiem replikacyjnym A (RPA) w celu ochrony przed dalszym przetwarzaniem. Następnie BRCA2, PALB2 i BRCA1 angażują się, aby pośredniczyć w przemieszczeniu RPA i montażu nukleofilamentu RAD51 wymaganym do mechanizmu naprawy ukierunkowanego na homologię. Delikatna równowaga między wykorzystaniem NHEJ i HR jest niezbędna do optymalnego utrzymania integralności genomu. Wybór ścieżki zależy od fazy cyklu komórkowego. HR jest preferencyjnie stosowany w fazach od S do G2, w których resekcja DNA jest na najwyższym poziomie, a chromatydy siostrzane są dostępne w celu zapewnienia prawidłowej naprawy.
Polimeraza 1 (ADP-ryboza) jest jednym z najwcześniejszych białek zrekrutowanych do DSB. Reguluje zarówno aktywność resekcyjną, jak i montaż dalszych efektorów zaangażowanych w NHEJ5,6. PARP-1 jest również wymagany do naprawy jednoniciowych pęknięć DNA podczas replikacji7,8. Ze względu na ważną rolę w naprawie DNA, inhibitory PARP (PARPi) są stosowane w terapiach przeciwnowotworowych. W kilku nowotworach z niedoborem HR leczenie PARPi prowadzi do syntetycznej odpowiedzi śmiertelnej z powodu niezdolności komórek z niedoborem HR do naprawy nagromadzonych uszkodzeń za pomocą alternatywnej ścieżki9,10. Obecnie istnieją cztery zatwierdzone przez FDA PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib i Talazoparib (zwany również BMN 673), które są stosowane w różnych metodach leczenia raka piersi i jajnika11. Jednak oporność na PARPi jest powszechna, a jedną z potencjalnych przyczyn jest ponowne zdobycie biegłości HR12. Utrata lub zahamowanie PARP-1 w obecności napromieniowania rozregulowuje maszynerię resektosomyczną, prowadząc do akumulacji dłuższych odcinków ssDNA13. W związku z tym dogłębne badanie resekcji DNA in vivo ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia szlaków naprawy DNA i późniejszego opracowania nowych strategii leczenia raka i przezwyciężenia oporności na PARPi. 
Zastosowano kilka metod wykrywania zdarzeń resekcji DNA5. Jedną z takich metod jest klasyczna technika oparta na IF, pozwalająca na pośrednie barwienie i wizualizację wyciętego DNA po wywołanym stresem DSB za pomocą przeciwciała anty-RPA. Znakowanie genomowego DNA za pomocą 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU) i wykrywanie tylko ssDNA jest bezpośrednim pomiarem zdarzeń resekcji DNA. Omija monitorowanie RPA, które bierze udział w wielu procesach komórkowych, takich jak replikacja DNA. W opisanej tutaj metodzie komórki inkubowane z BrdU przez pojedynczy cykl komórkowy pozwalają na włączenie BrdU do jednej nici replikującego się komórkowego DNA. Po resekcji barwienie IF przeprowadza się w warunkach pozwalających na wykrycie BrdU tylko w postaci ssDNA, przy użyciu przeciwciała anty-BrdU. Przeciwciało to ma dostęp tylko do odsłoniętych nukleotydów BrdU i nie wykryje tych zintegrowanych z dwuniciowym DNA. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wycięte DNA można uwidocznić w postaci punktowych ognisk BrdU/ssDNA. Intensywność jądrowa tych ognisk może być wykorzystana jako odczyt do ilościowego określenia resekcji po uszkodzeniu DNA. W artykule opisano krok po kroku procesy tej metody, które można zastosować do większości linii komórkowych ssaków. Metoda ta powinna mieć szerokie zastosowanie jako prosty sposób monitorowania resekcji końcowej DNA w celulo, jako dowód słuszności koncepcji.

<table><tbody><tr><td>Alexa 568 koza anty-królik</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11011</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-mysie</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11001</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Anty PARP1 (F1-23)</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Anti PCNA (SY12-07)</td><td>Novus</td><td>NBP2-67390</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anty-Alpha tubulina (DM1A)</td><td>Abcam</td><td>Ab7291</td><td>1:100000</td></tr><tr><td>anty-BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Stacjonarna komórka naświetlacza rentgenowskiego</td><td>Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMN673</td><td>MedChem Express</td><td>HY-16106</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoksyurydyna (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Profilometr komórek</td><td>Broad Institute</td><td>V 3.19</td><td>https://cellprofiler.org/</td></tr> <tr><td>Curwood Parafilm M Laboratoryjna folia do owijania 4 cale / 250 stóp</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td> <td>Invitrogen Life Technology</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoki poziom glukozy</td><td>Fisher</td><td>10063542</td><td></td></tr><tr><td>naukowy EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Płód Surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe Fisherbrand: Kwadraty 22 x 22</td><td>Fisher scientific</td><td>12 541B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>63-krotny obiektyw zanurzeniowy</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 160I INKUBATOR CO2 CU 1-21 TC 120V</td><td>VWR</td><td>51030408</td><td>37% CO2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BioShop Canada</td><td>MAG520.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Bisent Bio Products</td><td>311-010-CS</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>Cedarlane Labs</td><td>15710-S(EM)</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>P-36930</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>siPARPi</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td></tr><tr><td>kontrola siRNA</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td></tr><tr><td>Deoksycholcan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BioShop Kanada</td><td>SUC507.5</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr><tr><td>Trition X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td></td><td></td> Pęseta <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>do BP337500 naukowej Fisher</tbody></table>

ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego dna przy użyciu znakowania brdu-dna w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Badanie odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) to złożona i istotna dziedzina, która stała się jeszcze ważniejsza dzięki zastosowaniu leków ukierunkowanych na DDR w leczeniu raka. Tymi celami są polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), które inicjują różne formy naprawy DNA. Hamowanie tych enzymów za pomocą inhibitorów PARP (PARPi) osiąga syntetyczną śmiertelność poprzez nadanie wrażliwości terapeutycznej komórkom z niedoborem rekombinacji homologicznej (HR) z powodu mutacji w raku piersi typu 1 (BRCA1), BRCA2 lub partnerze i lokalizatorze BRCA2 (PALB2). 
Komórki leczone PARPi akumulują dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB). Pęknięcia te są przetwarzane przez maszynerię resekcji końca DNA, co prowadzi do powstania jednoniciowego (ss) DNA i późniejszej naprawy DNA. W kontekście niedoboru BRCA1 ożywienie resekcji DNA poprzez mutacje w inhibitorach resekcji DNA, takich jak 53BP1 i DYNLL1, powoduje oporność na PARPI. W związku z tym możliwość monitorowania resekcji DNA w celulo ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia szlaków naprawy DNA i opracowania nowych strategii przezwyciężenia oporności na PARPi. Techniki oparte na immunofluorescencji (IF) pozwalają na monitorowanie globalnej resekcji DNA po uszkodzeniu DNA. Strategia ta wymaga znakowania genomowego DNA o długich impulsach za pomocą 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU). Po uszkodzeniu DNA i resekcji końca DNA, powstałe jednoniciowe DNA jest specyficznie wykrywane przez przeciwciało anty-BrdU w warunkach natywnych. Co więcej, resekcję DNA można również badać przy użyciu markerów cyklu komórkowego w celu różnicowania różnych faz cyklu komórkowego. Komórki w fazie S/G2 pozwalają na badanie resekcji końców w HR, podczas gdy komórki G1 mogą być wykorzystywane do badania niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Szczegółowy protokół dla tej metody IF sprzężonej z dyskryminacją cyklu komórkowego opisano w tym artykule.

W niniejszym protokole zastosowano test oparty na bromodeoksyurydynie (BrdU) w celu ilościowego pomiaru odpowiedzi resekcyjnej komórek HeLa na uszkodzenia wywołane napromieniowaniem. Powstałe ślady ssDNA są wizualizowane jako wyraźne ogniska (foci) po barwieniu immunofluorescencyjnym (Rycina 1A). Zidentyfikowane ogniska zostały następnie skwantyfikowane i wyrażone jako całkowita zintegrowana intensywność barwienia BrdU w jądrach komórkowych (Rycina 1B, R...

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Protokół ten pozwala na ilościowe oznaczanie DNA w celulo i resekcję po uszkodzeniu DNA. Główną zaletą tej techniki jest znakowanie cyklu komórkowego, które ogranicza komórki do fazy S i G2, zapewniając sygnał bromodeoksyurydyny wynikający z DNA i resekcji. Procedurę zademonstrują Jean-Yves Masson, główny badacz, oraz Sofiane Y. Mersaoui, badaczka ze stopniem doktora.Pracując pod sterylnym kapturem hodowlanym, umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki sześciodołkowej na tyle potrzebnych warunków. Płytka około 150 000 komórek HeLa do transfekcji lub leczenia farmakologicznego. W trzecim dniu, po całonocnej inkubacji z BrdU w końcowym stężeniu 10 mikromolów, należy napromienić płytki całkowitą dawką pięciu grejów promieniowania rentgenowskiego.Po napromieniowaniu należy zwrócić płytki do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% wilgotnością tlenku węgla przez trzy godziny. W celu wstępnej ekstrakcji odessać pożywkę i ostrożnie umyć komórki dwukrotnie PBS. Po usunięciu PBS dodaj dwa mililitry buforu A do ekstrakcji wstępnej i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na lodzie przez 10 minut.Po 10 minutach odessać bufor A, dodać dwa mililitry buforu B do usuwania cytoszkieletu i powtórzyć inkubację. Następnie ostrożnie odessać bufor B i przemyć komórki PBS. Po zaessaniu PBS utrwal komórki, dodając dwa mililitry 4% paraformaldehydu pod kapturem chemicznym.Po usunięciu paraformaldehydu i przemyciu PBS, przykryj szkiełka nakrywkowe 100% zimnym metanolem do inkubacji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez pięć minut i przemyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS. W celu przepuszczalności inkubuj komórki z dwoma mililitrami PBS zawierającymi 0,5% Tritan X-100 w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS.W celu barwienia immunologicznego dodaj dwa mililitry buforu blokującego do każdej studzienki. Po godzinie inkubacji dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj pęsety, aby przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratowym parafilmem i ostrożnie ustaw parafilm, aby nie tworzyć pęcherzyków.Następnie przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przeciwciało pierwszorzędowe przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Następnego dnia usuń kwadraty parafilmu i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS. Po przemyciu dodać 100 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na każde szkiełko nakrywkowe i przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratem parafilmu, jak pokazano.Inkubować przeciwciało drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez godzinę i chronić płytkę przed światłem za pomocą folii. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami 1X PBS. W przypadku barwienia jądrowego dodaj dwa mililitry roztworu DAPI do każdego szkiełka nakrywkowego i umyj szkiełka nakrywkowe PBS.Dodać od 10 do 20 mikrolitrów podłoża montażowego specyficznego dla IF na szkiełka mikroskopowe. Użyj igły lub cienkiej pęsety, aby podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu, delikatnie stukając jedną krawędzią w ręcznik papierowy i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych.W celu pozyskania i analizy obrazu zaimportuj te pliki do programu CellProfiler i przeanalizuj je za pomocą potoku zliczania plamek. Zidentyfikuj główny obiekt, aby zidentyfikować ogniska za pomocą ustawień opisanych w rękopisie tekstowym i zmierz intensywność. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy powstawania ognisk 5-bromo-2-prime-deoksyurydyny i barwienia antygenu jądrowego proliferacji komórek po napromieniowaniu.Wygenerowane jednoniciowe ścieżki DNA zostały zwizualizowane jako odrębne ogniska. Zidentyfikowane ogniska zostały następnie określone ilościowo i wyrażone jako całkowita zintegrowana intensywność barwienia bromodeoksyurydyny w jądrach. Współbarwienie wykazało zróżnicowanie między resekcją krótkiego zasięgu spowodowaną niehomologicznym łączeniem końców a resekcją dalekiego zasięgu rekombinacji homologicznej przy użyciu przeciwciała anty-PCNA w celu identyfikacji komórek przechodzących przez fazę S.PCNA jest widoczny w jądrze i osiąga maksymalną ekspresję w fazie S cyklu komórkowego z dość intensywnym barwieniem. Wynik w wartościach jest następnie wykreślany jako wykres rozrzutu w celu rozróżnienia między jądrami dodatnimi i ujemnymi PCNA. Ujemne wyniki PCNA są usuwane ze zbioru danych, aby umożliwić analizę opartą na intensywności BrdU ze względu na niski sygnał BrdU niezależnie od stanu.Jądra ujemne PCNA mają podstawową zintegrowaną intensywność ognisk BrdU wynoszącą 900 dowolnych jednostek, a wartość ta osiąga 1 800 AU w jądrach dodatnich PCNA. W warunkach kontrolnych siRNA zintegrowana intensywność ognisk BrdU na jądro wynosi około 1 500 AU w jądrach dodatnich PCNA. Po skutecznym knockdown PARP-1 za pomocą siRNA zaobserwowano znaczny wzrost intensywności ognisk BrdU do około 1 900 AU.Technika ta może dostarczyć kluczowych informacji na temat pierwszego etapu rekombinacji homologicznej, pomagając w ten sposób określić, czy białko jest zaangażowane w pierwszy etap szlaku naprawy. Czas inkubacji przed ekstrakcją musi być ściśle przestrzegany. Nadmierna ekspozycja na te spowoduje nadmierne oderwanie komórek i zwiększony sygnał tła.

assessment-global-dna-double-strand-end-resection-using-brdu-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Podawanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, ciężarnym myszom pozwala na analizę progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych i progenitorowych w embrionalnym mózgu myszy. Metoda ta jest przydatna do określenia skutków stresu genotoksycznego, w tym promieniowania jonizującego, podczas rozwoju mózgu.

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Poznaj metodę ilościowej oceny resekcji końców DNA w komórkach HeLa przy użyciu znakowania BrdU i markerów cyklu komórkowego. Technika ta umożliwia rozróżnienie szlaków naprawy HR i NHEJ.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Przeglądaj więcej filmów