Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Protokół ten pozwala na ilościowe oznaczanie DNA w celulo i resekcję po uszkodzeniu DNA. Główną zaletą tej techniki jest znakowanie cyklu komórkowego, które ogranicza komórki do fazy S i G2, zapewniając sygnał bromodeoksyurydyny wynikający z DNA i resekcji. Procedurę zademonstrują Jean-Yves Masson, główny badacz, oraz Sofiane Y. Mersaoui, badaczka ze stopniem doktora.

Pracując pod sterylnym kapturem hodowlanym, umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki sześciodołkowej na tyle potrzebnych warunków. Płytka około 150 000 komórek HeLa do transfekcji lub leczenia farmakologicznego. W trzecim dniu, po całonocnej inkubacji z BrdU w końcowym stężeniu 10 mikromolów, należy napromienić płytki całkowitą dawką pięciu grejów promieniowania rentgenowskiego.

Po napromieniowaniu należy zwrócić płytki do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% wilgotnością tlenku węgla przez trzy godziny. W celu wstępnej ekstrakcji odessać pożywkę i ostrożnie umyć komórki dwukrotnie PBS. Po usunięciu PBS dodaj dwa mililitry buforu A do ekstrakcji wstępnej i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na lodzie przez 10 minut.

Po 10 minutach odessać bufor A, dodać dwa mililitry buforu B do usuwania cytoszkieletu i powtórzyć inkubację. Następnie ostrożnie odessać bufor B i przemyć komórki PBS. Po zaessaniu PBS utrwal komórki, dodając dwa mililitry 4% paraformaldehydu pod kapturem chemicznym.

Po usunięciu paraformaldehydu i przemyciu PBS, przykryj szkiełka nakrywkowe 100% zimnym metanolem do inkubacji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez pięć minut i przemyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS. W celu przepuszczalności inkubuj komórki z dwoma mililitrami PBS zawierającymi 0,5% Tritan X-100 w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS.

W celu barwienia immunologicznego dodaj dwa mililitry buforu blokującego do każdej studzienki. Po godzinie inkubacji dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj pęsety, aby przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratowym parafilmem i ostrożnie ustaw parafilm, aby nie tworzyć pęcherzyków.

Następnie przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przeciwciało pierwszorzędowe przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Następnego dnia usuń kwadraty parafilmu i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS. Po przemyciu dodać 100 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na każde szkiełko nakrywkowe i przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratem parafilmu, jak pokazano.

Inkubować przeciwciało drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez godzinę i chronić płytkę przed światłem za pomocą folii. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami 1X PBS. W przypadku barwienia jądrowego dodaj dwa mililitry roztworu DAPI do każdego szkiełka nakrywkowego i umyj szkiełka nakrywkowe PBS.

Dodać od 10 do 20 mikrolitrów podłoża montażowego specyficznego dla IF na szkiełka mikroskopowe. Użyj igły lub cienkiej pęsety, aby podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu, delikatnie stukając jedną krawędzią w ręcznik papierowy i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych.

W celu pozyskania i analizy obrazu zaimportuj te pliki do programu CellProfiler i przeanalizuj je za pomocą potoku zliczania plamek. Zidentyfikuj główny obiekt, aby zidentyfikować ogniska za pomocą ustawień opisanych w rękopisie tekstowym i zmierz intensywność. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy powstawania ognisk 5-bromo-2-prime-deoksyurydyny i barwienia antygenu jądrowego proliferacji komórek po napromieniowaniu.

Wygenerowane jednoniciowe ścieżki DNA zostały zwizualizowane jako odrębne ogniska. Zidentyfikowane ogniska zostały następnie określone ilościowo i wyrażone jako całkowita zintegrowana intensywność barwienia bromodeoksyurydyny w jądrach. Współbarwienie wykazało zróżnicowanie między resekcją krótkiego zasięgu spowodowaną niehomologicznym łączeniem końców a resekcją dalekiego zasięgu rekombinacji homologicznej przy użyciu przeciwciała anty-PCNA w celu identyfikacji komórek przechodzących przez fazę S.

PCNA jest widoczny w jądrze i osiąga maksymalną ekspresję w fazie S cyklu komórkowego z dość intensywnym barwieniem. Wynik w wartościach jest następnie wykreślany jako wykres rozrzutu w celu rozróżnienia między jądrami dodatnimi i ujemnymi PCNA. Ujemne wyniki PCNA są usuwane ze zbioru danych, aby umożliwić analizę opartą na intensywności BrdU ze względu na niski sygnał BrdU niezależnie od stanu.

Jądra ujemne PCNA mają podstawową zintegrowaną intensywność ognisk BrdU wynoszącą 900 dowolnych jednostek, a wartość ta osiąga 1 800 AU w jądrach dodatnich PCNA. W warunkach kontrolnych siRNA zintegrowana intensywność ognisk BrdU na jądro wynosi około 1 500 AU w jądrach dodatnich PCNA. Po skutecznym knockdown PARP-1 za pomocą siRNA zaobserwowano znaczny wzrost intensywności ognisk BrdU do około 1 900 AU.

Technika ta może dostarczyć kluczowych informacji na temat pierwszego etapu rekombinacji homologicznej, pomagając w ten sposób określić, czy białko jest zaangażowane w pierwszy etap szlaku naprawy. Czas inkubacji przed ekstrakcją musi być ściśle przestrzegany. Nadmierna ekspozycja na te spowoduje nadmierne oderwanie komórek i zwiększony sygnał tła.