Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego
April 28th, 2021
W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.
Protokół ten pozwala na ilościowe oznaczanie DNA w celulo i resekcję po uszkodzeniu DNA. Główną zaletą tej techniki jest znakowanie cyklu komórkowego, które ogranicza komórki do fazy S i G2, zapewniając sygnał bromodeoksyurydyny wynikający z DNA i resekcji. Procedurę zademonstrują Jean-Yves Masson, główny badacz, oraz Sofiane Y. Mersaoui, badaczka ze stopniem doktora.
Pracując pod sterylnym kapturem hodowlanym, umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki sześciodołkowej na tyle potrzebnych warunków. Płytka około 150 000 komórek HeLa do transfekcji lub leczenia farmakologicznego. W trzecim dniu, po całonocnej inkubacji z BrdU w końcowym stężeniu 10 mikromolów, należy napromienić płytki całkowitą dawką pięciu grejów promieniowania rentgenowskiego.
Po napromieniowaniu należy zwrócić płytki do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% wilgotnością tlenku węgla przez trzy godziny. W celu wstępnej ekstrakcji odessać pożywkę i ostrożnie umyć komórki dwukrotnie PBS. Po usunięciu PBS dodaj dwa mililitry buforu A do ekstrakcji wstępnej i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na lodzie przez 10 minut.
Po 10 minutach odessać bufor A, dodać dwa mililitry buforu B do usuwania cytoszkieletu i powtórzyć inkubację. Następnie ostrożnie odessać bufor B i przemyć komórki PBS. Po zaessaniu PBS utrwal komórki, dodając dwa mililitry 4% paraformaldehydu pod kapturem chemicznym.
Po usunięciu paraformaldehydu i przemyciu PBS, przykryj szkiełka nakrywkowe 100% zimnym metanolem do inkubacji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez pięć minut i przemyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS. W celu przepuszczalności inkubuj komórki z dwoma mililitrami PBS zawierającymi 0,5% Tritan X-100 w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS.
W celu barwienia immunologicznego dodaj dwa mililitry buforu blokującego do każdej studzienki. Po godzinie inkubacji dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj pęsety, aby przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratowym parafilmem i ostrożnie ustaw parafilm, aby nie tworzyć pęcherzyków.
Następnie przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przeciwciało pierwszorzędowe przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Następnego dnia usuń kwadraty parafilmu i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS. Po przemyciu dodać 100 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na każde szkiełko nakrywkowe i przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratem parafilmu, jak pokazano.
Inkubować przeciwciało drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez godzinę i chronić płytkę przed światłem za pomocą folii. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami 1X PBS. W przypadku barwienia jądrowego dodaj dwa mililitry roztworu DAPI do każdego szkiełka nakrywkowego i umyj szkiełka nakrywkowe PBS.
Dodać od 10 do 20 mikrolitrów podłoża montażowego specyficznego dla IF na szkiełka mikroskopowe. Użyj igły lub cienkiej pęsety, aby podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu, delikatnie stukając jedną krawędzią w ręcznik papierowy i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych.
W celu pozyskania i analizy obrazu zaimportuj te pliki do programu CellProfiler i przeanalizuj je za pomocą potoku zliczania plamek. Zidentyfikuj główny obiekt, aby zidentyfikować ogniska za pomocą ustawień opisanych w rękopisie tekstowym i zmierz intensywność. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy powstawania ognisk 5-bromo-2-prime-deoksyurydyny i barwienia antygenu jądrowego proliferacji komórek po napromieniowaniu.
Wygenerowane jednoniciowe ścieżki DNA zostały zwizualizowane jako odrębne ogniska. Zidentyfikowane ogniska zostały następnie określone ilościowo i wyrażone jako całkowita zintegrowana intensywność barwienia bromodeoksyurydyny w jądrach. Współbarwienie wykazało zróżnicowanie między resekcją krótkiego zasięgu spowodowaną niehomologicznym łączeniem końców a resekcją dalekiego zasięgu rekombinacji homologicznej przy użyciu przeciwciała anty-PCNA w celu identyfikacji komórek przechodzących przez fazę S.
PCNA jest widoczny w jądrze i osiąga maksymalną ekspresję w fazie S cyklu komórkowego z dość intensywnym barwieniem. Wynik w wartościach jest następnie wykreślany jako wykres rozrzutu w celu rozróżnienia między jądrami dodatnimi i ujemnymi PCNA. Ujemne wyniki PCNA są usuwane ze zbioru danych, aby umożliwić analizę opartą na intensywności BrdU ze względu na niski sygnał BrdU niezależnie od stanu.
Jądra ujemne PCNA mają podstawową zintegrowaną intensywność ognisk BrdU wynoszącą 900 dowolnych jednostek, a wartość ta osiąga 1 800 AU w jądrach dodatnich PCNA. W warunkach kontrolnych siRNA zintegrowana intensywność ognisk BrdU na jądro wynosi około 1 500 AU w jądrach dodatnich PCNA. Po skutecznym knockdown PARP-1 za pomocą siRNA zaobserwowano znaczny wzrost intensywności ognisk BrdU do około 1 900 AU.
Technika ta może dostarczyć kluczowych informacji na temat pierwszego etapu rekombinacji homologicznej, pomagając w ten sposób określić, czy białko jest zaangażowane w pierwszy etap szlaku naprawy. Czas inkubacji przed ekstrakcją musi być ściśle przestrzegany. Nadmierna ekspozycja na te spowoduje nadmierne oderwanie komórek i zwiększony sygnał tła.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia szczegółowy protokół wizualizacji resekcji końców podwójnych nić DNA w fazach S/G2 cyklu komórkowego, wykorzystujące podejście oparte na immunofluorescencji w komórkach HeLa. Metoda umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi na uszkodzenie DNA po napromieniowaniu, skupiając się szczególnie na dynamice resekcji w początkowych stadiach rekombinacji homologicznej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Odpowiedź i mechanizmy naprawy DNA
- Regulacja cyklu komórkowego
- Techniki mikroskopii immunofluorescencyjnej
Tło
- Rozumienie naprawy DNA jest kluczowe dla poznania biologii raka i stabilności genetycznej.
- Podwójne przerwania w DNA są krytycznymi uszkodzeniami, które wyzwalają ścieżki naprawcze.
- Fazy S i G2 są kluczowymi okresami do badania procesów resekcji DNA.
Zastosowanie metod
- Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji ognisk resekcji DNA.
- Komórki HeLa jako system modelowy biologiczny.
- Oprogramowanie CellProfiler do analizy obrazów i ilościowego oznaczania ognisk.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie rozróżnia procesy resekcji DNA krótko- i długozasięgowe.
- Ilościowa ocena wykazała znaczące różnice w intensywności ognisk BrdU w zależności od fazy cyklu komórkowego i wyłączenia PARP-1.
- Wykazano znaczenie interakcji białkowych we wczesnej rekombinacji homologicznej.
Wnioski
- To badanie zapewnia solidną metodę do badania mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA, szczególnie w kontekście dynamiki cyklu komórkowego.
- Wyniki mają znaczenie dla zrozumienia molekularnej podstawy stabilności genetycznej i terapii raka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of DNA double-strand end resection is critical for de-risking target validation in DNA repair and synthetic lethality drug discovery. This BrdU-DNA labeling and cell cycle discrimination imaging protocol enables precise measurement of homologous recombination activity and resistance mechanisms relevant to PARP inhibitor development. The method supports predictive confidence at the intersection of target biology and translational biomarker strategy in oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of DNA repair pathway components in live cell systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing HR from NHEJ repair events via cell cycle markers.
- Facilitates identification of proteins involved in early DNA repair steps, informing target selection.
- Provides quantitative readouts for hypothesis-driven validation of DDR targets.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible immunofluorescence-based quantification of DNA resection.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening and pathway modulation studies.
- Enables robust discrimination of repair pathway engagement for assay development.
- Supports scalable image analysis workflows using automated platforms like CellProfiler.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA repair pathway activity with cell cycle phase for disease-relevant mechanistic studies.
- Enables translational biomarker development by quantifying repair pathway engagement in response to genetic or pharmacologic perturbation.
- Supports risk-adjusted advancement of DDR-targeting agents by clarifying resistance mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, lead identification, and translational research in DNA repair and synthetic lethality programs.
- Discovery Biology: Quantifies DNA end resection to clarify pathway engagement and validate DDR targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and pathway modulation.
- Analytics: Enables automated measurement of BrdU foci intensity and cell cycle discrimination for robust data comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic repair pathway insights to biomarker strategies and resistance profiling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable across cell models and DDR targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in DDR target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardizes DNA resection quantification and supports reproducible, scalable imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in oncology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DDR-targeting assets and resistance mitigation strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence, and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and automated analysis platforms such as CellProfiler.
- Demands strict adherence to buffer incubation times to minimize background and cell loss.
- Standardization across teams is essential for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cell lines or DNA repair contexts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Cell Culture, Treatments, and Coverslip Preparation
1:18
Pre-Extraction and Fixation
2:13
Permeabilization and Immunostaining
3:53
Image Analysis
4:16
Results: Visualization of DNA Double-Strand End Resection During S to G2 Phase of the Cell Cycle Using an Immunofluorescence-Based Method
6:05
Conclusion
