In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Protokół ten opisuje test angiogenezy kiełkowania in vitro, który podsumowuje wiele cech tworzenia naczyń krwionośnych i może być wykorzystany do testowania leków. Ta metoda jest łatwa do wdrożenia w laboratorium, niezawodna i skalowalna. Ma wiele podobieństw z testami z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka i mikrosfer.

Model ten silnie naśladuje fenotyp, wykazując wadliwą selekcję komórek wierzchołka śródbłonka i zorientowaną migrację komórek śródbłonka, która prowadzi do patologicznej angiogenezy. Prace mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów regulujących angiogenezę kiełkowania, kluczowych genów i zaangażowanych szlaków sygnałowych, w szczególności poprzez przeprowadzanie genetycznych badań przesiewowych. Ważne jest regularne sprawdzanie etapów pluripotencji i morfologii linii komórkowych.

Ważne jest również, aby przeprowadzić kariotypowanie linii komórkowych, ponieważ mają one tendencję do hodowli w celu utraty lub uzyskania chromosomów. Rozpocznij od pokrycia jednej studzienki z sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej 500 mikrolitrami 0,1% roztworu żelatyny i umieść ją w inkubatorze dwutlenku węgla na 30 minut. Następnie umyj płytki pokryte żelatyną PBS i dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego podłoża CM plus minus

Aby uzyskać czystą populację mysich embrionalnych komórek macierzystych lub mESC, trypsynizuj płytkę hodowli komórkowej z 10x buforem TVP przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki różnicującej mezodermę przed przeniesieniem ich na pokrytą żelatyną płytkę sześciodołkową na 30 minut, aby umożliwić mysim fibroblastom embrionalnym przyczepienie się, podczas gdy mESC pozostają w zawiesinie. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki przed zliczeniem żywych komórek za pomocą hemocytometru Neubauera w niebieskim barwniku trypanowym.

Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej mezodermę. Przygotuj cztery 94-milimetrowe naczynia polistyrenowe o niskim mocowaniu, dodając na dno 15 mililitrów sterylnej wody.

Po przeniesieniu zawiesiny komórek do sterylnego plastikowego zbiornika, załadować cztery pozycje pipety wielokanałowej po 22 mikrolitry zawiesiny komórek na kanał. Podnieś i umieść odwróconą pokrywę naczynia o średnicy 94 milimetrów na czystej powierzchni komory przepływowej wewnętrzną stroną skierowaną do góry. Umieść 40 kropli zawiesiny komórek na wewnętrznej powierzchni każdej pokrywki i ostrożnie odwróć pokrywkę bez zakłóceń, aby umieścić ją z powrotem na naczyniu, tak aby krople były skierowane w stronę wody.

Inkubuj szalki w inkubatorze dwutlenku węgla przez cztery dni, traktując to jako dzień zero różnicowania. Po czterech dniach inkubacji zbierz wiszące krople w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów za pomocą pipety P1000. Pozostawić osad EB w probówce przed usunięciem supernatantu.

Ponownie zawiesić EB w trzech mililitrach 2x pożywki do różnicowania naczyń krwionośnych przed przeniesieniem i równomiernym rozprowadzeniem zawiesiny EB w naczyniu pokrytym agarem o grubości 60 milimetrów. Inkubować naczynia w inkubatorze dwutlenku węgla do dziewiątego dnia, odświeżając podłoże co dwa dni. Przygotuj 35-milimetrowe naczynie hodowlane, dodając jeden mililitr pożywki do kiełkowania na jej dnie.

Aby wywołać żelowanie, inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zbierz dziewięciodniowe EB z jednej płytki agarowej w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i usuń supernatant. Ponownie zawiesić EB w dwóch mililitrach zimnej pożywki do kiełkowania, aby przenieść ją do naczynia hodowlanego pokrytego pierwszą warstwą pożywki do kiełkowania.

Rozłóż EB na całej płycie, upewniając się, że znajdują się w równej odległości od siebie. Pierwsze formowanie się kiełków powinno być widoczne po inkubacji przez około 24 do 48 godzin. W 12 dniu za pomocą szpatułki ostrożnie przenieś żel kolagenowy zawierający EB na szklane szkiełko.

Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety i odwodnij żel, umieszczając na żelu arkusz gazy z nylonowej bielizny i chłonne karty filtracyjne. Wywieraj nacisk ciężarkiem 250 gramów przez dwie minuty. Następnie usuń nylonowe papiery, aby szkiełka wyschły na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po wysuszeniu utrwalić EB za pomocą roztworu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia należy usunąć utrwalacz przed pięciokrotnym umyciem szkiełek za pomocą PBS. Przepuszczalność EB i PBS zawierających 0,1% Triton X-100.

Po 15 minutach usunąć roztwór przepuszczalny, aby przemyć szkiełka pięć razy PBS przez pięć minut. Inkubować EB w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i przemywać PBS przez pięć minut. Następnie dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnie inkubować szkiełka z przeciwciałem wtórnym koziego anty-Rat Alexa 555 w buforze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut i jeden raz wodą przed zamontowaniem ich do mikroskopii. Test angiogenezy kiełkowania 3D przeprowadzono na trzech EB z dwoma lekami, DC101 i DAPT.

Oba związki stopniowo blokowały angiogenezę w modelu EB przy rosnących stężeniach. Różne stężenia leków w EB wykazały, że wysokie dawki DC101 hamują liczbę i długość kiełków naczyniowych. DAPT miał odwrotne działanie przy dawce jednego mikromola na litr.

DAPT znacznie zwiększył liczbę komórek wierzchołka śródbłonka na kiełki naczynia, które mają fenotyp błędnego kierowania nawet przy niskich dawkach, w porównaniu z DC101. Wadliwe kiełkowanie naczyń zaobserwowano w dziedzicznych hemordwotocznych teleangiektazjach EB z kontroli ACVRL1 i heterozygotycznych genotypach ACVRL1 z licznymi błędnymi fenotypami kiełkującymi pod losowymi kątami w stosunku do naczyń rodzicielskich. Mieszaniny linii mESC typu dzikiego w stosunku jeden do jednego z nieznakowaną linią mESC typu dzikiego doprowadziły do równego udziału w wiodących komórkach wierzchołka śródbłonka.

Przeprowadzono analizę mikroskopową tej reprezentatywnej chimerycznej EB w celu zidentyfikowania genotypowego pochodzenia wiodących komórek wierzchołka śródbłonka. Aby określić ilościowo pokrycie komórek ściennych kiełka naczynia, EB utrwalono i wybarwiono pod kątem markerów komórek śródbłonka, PECAM i markera komórek ściennych, aktyny alfa mięśni gładkich. Obraz w dużym powiększeniu ujawnił, że jeden pojedynczy kiełek naczynia był otoczony komórkami muralu.

Transformację binarną przeprowadzono po rozdzieleniu kanałów barwnych i określono ilościowo stosunek naczyń dodatnich PECAM pokrytych dodatnimi komórkami muralowymi alfa SMA. Tło genetyczne linii embrionalnych komórek macierzystych jest również kluczowym czynnikiem, który naukowcy muszą wziąć pod uwagę, ponieważ niektóre linie kiełkują lepiej niż inne. Metoda ta może być stosowana do przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych przy użyciu metod RNAi lub banku mysich embrionalnych komórek macierzystych zawierających mutacje genowe.