Name: In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta metoda umożliwia modelowanie chorób naczyniowych i testowanie leków w kontrolowanym środowisku in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, oraz przez Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

1. Przygotowanie pożywki i hodowla mESC
<ol>
	<li>Przygotuj kondycjonowaną pożywkę +/- (CM+/-) za pomocą suplementu 1x Pożywka Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) z 10% (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,05 mM β-merkaptoetanolu, 1x aminokwasy endogenne (NEAA 1x), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.</li>
	<li>Przygotować kondycjonowaną pożywkę +/+ (CM+/+) przy użyciu suplementu CM+/- pożywki z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF) (1,500 U/ml) i 0,1 mM β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Przygotować kondycjonowaną pożywkę +/+ w obecności dwóch inhibitorów (CM+/+ 2i) przy użyciu pożywki z suplementem CM+/+ o stężeniu 1 μM PD0325901 i 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Przygotować 0,1% roztwór żelatyny, mieszając 25 ml wstępnie podgrzanego 2% roztworu żelatyny w 500 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (DPBS).</li>
	<li>Przygotować 10x bufor Trypsyna Fosforanu Versene (TVP 10x) mieszając trypsynę (2,5%) z TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% surowicy kurczaka, 0,01% trypsyny (2,5%) w H2O) (stosunek 1:10, obj. / obj.). 
	UWAGA: Przefiltruj wszystkie roztwory przez filtr porowy 0,22 μm. Pożywkę hodowlaną należy przechowywać przez długi czas w temperaturze -20 °C, a pozostałe odczynniki przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Pokryć dwie 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych 0,1% roztworem żelatyny (500 μl na studzienkę) i inkubować je przez 30 minut w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera).</li>
	<li>Umyć płytki pokryte żelatyną PBS i dodać 500 μl pożywki CM+/-.</li>
	<li>Rozmrozić dwie fiolki z 1 x 106 kriokonserwowanymi, napromieniowanymi mysimi fibroblastami zarodkowymi (MEF) w temperaturze 37 °C i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki z 5 ml pożywki CM+/-.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odessać pożywkę i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 12 ml pożywki CM+/- o stężeniu 1,67 x 105 komórek na ml.</li>
	<li>Wysiać 500 μl zawiesiny MEF na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (2,4 x 10,5 komórek nacm2) i inkubować płytkę przez noc (o/n) w inkubatorzeCO2</li>.
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę z kriokonserwowanymi mESC (1 x 106) w pożywce CM+/+ 2i.</li>
	<li>Wysiać zawiesinę mESC na wstępnie umytej 12-dołkowej płytce z MEF w 1 ml pożywki CM+/+2i i przenieść płytkę do inkubatoraCO2. Odświeżaj podłoże codziennie.</li>
	<li>Przy 70% konfluencji przemyj kolonie mESC DPBS. Dodać 150 μl ciepłego 10x buforu TVP i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, aby zainicjować dysocjację enzymatyczną.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć bufor TVP, ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki CM+/+ 2i i rozdzielić kolonie na pojedyncze komórki za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Pasażuj komórki, przenosząc je na nową 12-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z MEF (stosunek podziału: 1:3-1:5). Delikatnie wymieszać, aby rozprowadzić komórki i inkubować w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Odśwież pożywkę hodowlaną (2-3 ml) i codziennie obserwuj wzrost/morfologię komórek. Powtarzaj przejście seryjne przy zbieganiu 70% co 2 dni. Przełącz się na pożywkę CM+/+ na dwa pasaże przed zainicjowaniem różnicowania komórek.</li>
</ol>
2. Formacja EB w wiszącej kropli
<ol>
	<li>Przygotować świeżą pożywkę do różnicowania mezodermy, uzupełniając pożywkę CM+/- zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF) (50 ng·mL-1) i białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Pokryj jedno zagłębienie 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej 500 μl 0,1% roztworu żelatyny i umieść je w inkubatorze CO2 na 30 minut.</li>
	<li>Umyć płytki pokryte żelatyną PBS i dodać 500 μl pożywki CM+/-.</li>
	<li>Aby uzyskać czystą populację mESC, trypsynizuj płytkę kultury komórkowej za pomocą 10x buforu TVP przez 30 s w temperaturze pokojowej, ponownie zawieś komórki w 1 ml pożywki różnicującej mezodermę, a następnie przenieś je na pokrytą żelatyną płytkę 6-dołkową na 30 minut, umożliwiając MEF przyłączenie, podczas gdy mESC pozostają w zawiesinie.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i policzyć komórki za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypanowego w celu wykluczenia żywych/martwych komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do różnicowania mezodermy, aż do uzyskania 4,55 x 104 komórek na ml.</li>
	<li>Napełnij dno naczyń polistyrenowych o średnicy 94 mm z niskim mocowaniem 15 ml sterylnej wody. 
	UWAGA: Cztery szalki zawierające wiszące krople (1,6 x 105 komórek w 3,52 ml pożywki) będą wymagane do przetestowania jednego konkretnego stanu za pomocą testu angiogenezy kiełkowania 3D.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika z tworzywa sztucznego i załadować w czterech pozycjach pipety wielokanałowej 22 μl zawiesiny komórek na kanał (1 x 10,3 komórki na kroplę 22 μl).</li>
	<li>Podnieś i odwróć pokrywę naczynia 94 mm i umieść ją na czystej powierzchni komory przepływowej wewnętrzną stroną skierowaną do góry.</li>
	<li>Umieść 40 kropli zawiesiny komórek na wewnętrznej powierzchni każdej pokrywy. Ostrożnie odwróć pokrywkę bez zakłóceń i umieść ją z powrotem na naczyniu, tak aby krople były skierowane w stronę wody.</li>
	<li>Inkubować naczynia w inkubatorzeCO2 . Potraktuj to jako dzień różnicowania 0. Utrzymuj płytki przez 4 dni, aby utworzyły EB.</li>
</ol>
3. Test konkurencji dla pozycji komórki końcówki
<ol>
	<li>Hodowla jednej fluorescencyjnej i jednej niefluorescencyjnej linii mESC, jak opisano wcześniej13. Na przykład stosuje się mESC 7ACS/EYFP oznaczone kolorem żółtym i mESC R1.</li>
	<li>Przygotować mozaikę EB, mieszając równe ilości dwóch linii mESC (stosunek 1:1) i inkubować wiszące naczynia kroplowe w inkubatorze CO2 zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
</ol>
4. Pływająca hodowla EBs do różnicowania naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Przed zebraniem EB z wiszących kropli przygotuj następujące elementy.
	<ol>
		<li>Przygotować 5% roztwór agaru wH2Oi wysterylizować go w autoklawie (20 min w temperaturze 120 °C).</li>
		<li>Użyj ciepłego 5% roztworu agaru do przygotowania pożywki G-MEM BHK-21 zawierającej 1% agaru i szybko wlej 3 ml do jednego z naczyń polistyrenowych o średnicy 60 mm. Pozostawić agar do zastygnięcia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać naczynia w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj świeżą pożywkę 2x do różnicowania naczyń krwionośnych, uzupełniając pożywkę CM+/- o bFGF (100 ng·mL-1) i VEGF-A (50 ng·mL-1). Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Zebrać wiszące krople w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000 i usunąć supernatant po kilku minutach sedymentacji EB.</li>
	<li>Ponownie zawiesić EB w 3 ml 2x pożywki do różnicowania naczyń krwionośnych, przenieść zawiesinę EB do jednego naczynia pokrytego agarem i rozprowadzić EB jednorodnie, aby uniknąć agregacji.</li>
	<li>Inkubować naczynia w inkubatorze CO2 i odświeżać pożywkę co 2 dni do 9 dnia przy użyciu 1x pożywki do różnicowania naczyń w obecności bFGF (50 ng·mL-1) i VEGF-A (25 ng·mL-1).</li>
	<li>Alternatywnie, dodaj płytkowy czynnik wzrostu-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 w 4 dniu i 5 ng·mL-1 w dniu 6 i dniu 8) do pożywki różnicującej naczynia krwionośne, aby promować różnicowanie komórek ściennych.</li>
</ol>
5. Analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zbierz 9-dniowe EB do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000 i umyj je raz ciepłym PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki G-MEM BHK-21 zawierającej 0,2 mg·mL-1 kolagenazy A i inkubować komórki w inkubatorze CO2 przez 5 minut.</li>
	<li>Oddziel EBs, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Zatrzymaj aktywność kolagenazy, dodając 1 ml zimnego podłoża G-MEM BHK-21 z 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS z 2% FBS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru Neubauera.</li>
	<li>Ponownie zawiesić 400 000 komórek w 100 μl PBS z 2% FBS na warunek barwienia.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze 4 °C z następującymi przeciwciałami: sprzężonym z APC szczurzym przeciwciałem przeciwko myszom PECAM-1 (klon MEC13.3) i sprzężonym ze szczurem CD45 (klon 30-F11) lub przeciwciałami kontrolnymi izotypu.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS zawierającego 2% FBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 x 106 komórek na ml.</li>
	<li>Przefiltruj komórki za pomocą probówki z polistyrenu o okrągłym dnie, z zatrzaskiem z sitkiem do komórek.</li>
	<li>Przeanalizuj 20 000 zdarzeń PECAM-1 (+) za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
6. 3D test angiogenezy kiełkowania i barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>W dniu 9 przygotuj pożywkę do kiełkowania, dodając 10% FBS (obj./obj.), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), ludzką rekombinowaną erytropoetynę (hEPO) (20 ng·mL-1), ludzką interleukinę-6 (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-merkaptoetanolu, NEAA (1x), L-glutaminę (1x), pirogronian sodu (1x), kolagen z ogona szczura typu I (1,25 mg·mL-1), i NaOH (3,1 mM) do pożywki GMEM BHK-1.</li>
	<li>Aby uniknąć żelowania kolagenu, utrzymuj kiełkujące podłoże na lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Aby ocenić działanie cząsteczek pro/antyangiogennych, dodaj wybrany lek lub nośnik do pożywki kiełkującej w wybranym stężeniu.</li>
	<li>Zebrać 9-dniowe EB z jednej płytki agarowej o średnicy 60 mm w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (odpowiednik jednego warunku) i usunąć supernatant po kilku minutach sedymentacji.</li>
	<li>Przykryć dno naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm 1 ml pożywki do kiełkowania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu wywołania żelowania.</li>
	<li>Ponownie zawiesić EB w 2 ml zimnego podłoża do kiełkowania.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm pokrytego pierwszą warstwą pożywki do kiełkowania.</li>
	<li>Rozłóż EB na całej płycie i upewnij się, że znajdują się w równej odległości od siebie. Inkubować naczynie w inkubatorze CO2 . Pierwsze formowanie się kiełków następuje w ciągu 24-48 godzin.</li>
	<li>W 12 dniu żel kolagenowy zawierający EB jest ostrożnie przenoszony na szkiełko podstawowe (75 x 26 mm) za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety (P1000) i odwodnij żel, umieszczając na żelu arkusz gazy z nylonowego lnu i chłonne karty filtracyjne (bibuła żelowa). Wywieraj nacisk, umieszczając ciężarek (250 g) na 2 minuty. Ostrożnie usuń nylon/bibułę filtracyjną i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Utrwalić EB za pomocą roztworu (patrz Tabela Materiałów) o/n w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, utrwalić mozaikowe fluorescencyjne EB za pomocą paraformaldehydu (PFA) (4%) o/n w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Usuń utrwalacz. Umyj szkiełka pięć razy za pomocą PBS przez 5 minut w temperaturze RT.</li>
	<li>Przepuszczalność EB w PBS zawierającym 0,1% Triton-X100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór przepuszczalny. Umyć szkiełka pięciokrotnie PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować EB w buforze blokującym (PBS z 2% albuminą surowicy bydlęcej, BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do barwienia kiełków śródbłonka należy użyć szczurzego przeciwciała pierwszorzędowego anty-mysiego anty-PECAM-1 (rozcieńczenie 1:100) w buforze blokującym o/n w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć szkiełka pięciokrotnie PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-szczurzym Alexa 555 w buforze blokującym (rozcieńczenie 1:250) i, w razie potrzeby, z przeciwciałem anty-α-SMA sprzężonym z FITC w buforze blokującym (rozcieńczenie 1:250) w celu barwienia komórek ściennych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy PBS przez 5 minut i jeden raz za pomocą H20 przed ich zamontowaniem.</li>
</ol>
7. Obrazowanie konfokalne, analiza morfometryczna i ilościowa pędów śródbłonka EB
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy o wysokiej rozdzielczości wybarwionych immunologicznie EB poprzez łączenie płaszczyzny ogniskowej (z-stacking) przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Użyj obiektywu z 10-krotnym powiększeniem, aby zobrazować całe EB.</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy uzyskane za pomocą ImageJ, aby ocenić morfologię i określić ilościowo cechy dodatnich kiełków śródbłonka PECAM-1 zgodnie z ustalonymi metodami kwantyfikacji13,14,21.
	<ol>
		<li>Oblicz średnią liczbę kiełków śródbłonka na EB, ręcznie licząc całkowitą liczbę kiełków na poszczególne EB.</li>
		<li>Zmierz długość poszczególnych kiełków za pomocą narzędzia do rysowania ImageJ. Zdefiniuj podstawę kiełka śródbłonka, zaczynając od obszaru rdzenia EB i ręcznie narysuj linię, aż koniec końcówki kiełka.</li>
		<li>Oblicz średnią liczbę komórek końcówki na kiełek, ręcznie licząc liczbę komórek końcówki na pojedynczy kiełek, a następnie oblicz średnią na EB.</li>
		<li>Oblicz orientację filopodiów, ręcznie określając oś kiełka macierzystego i zmierz kąt ostry między nimi za pomocą narzędzia kątowego oprogramowania ImageJ. Oblicz liczbę kiełków o orientacji >50° i podziel ją przez całkowitą liczbę kiełków interesującego nas EB. 
		UWAGA: Kąty zawsze mieściły się w zakresie od 0° do 90°.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj obrazy o wysokiej rozdzielczości wybarwionych immunologicznie EB za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyj obiektywu o 40-krotnym powiększeniu, aby uzyskać obrazy w wysokiej rozdzielczości pojedynczych pędów śródbłonka.</li>
	<li>Określ ilościowo pokrycie naczyń kiełkami EC z dodatnim wynikiem PECAM-1 otoczonymi dodatnimi MC α-SMA za pomocą oprogramowania ImageJ.
	<ol>
		<li>Podziel scalone obrazy na osobne kanały czerwony i zielony.</li>
		<li>Przekształć obrazy do ich formy binarnej.</li>
		<li>Zmierz całkowitą powierzchnię komórkową kiełka zajmowaną oddzielnie przez PECAM-1 (komórki śródbłonka oznaczone na czerwono) i przez α-SMA (komórki ścienne oznaczone na zielono) komórki.</li>
		<li>Wygeneruj scalony obraz za pomocą funkcji kalkulatora obrazów i operatora AND. Zmierz całkowity obszar komórkowy obrazu. Aby obliczyć pokrycie, należy podzielić obszar kolokalizowanego obrazu przez obszar obrazu binarnego PECAM-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeanalizować konkurencję komórek o położenie końcówki śródbłonka / łodygi kiełków rozwiniętych przez mozaikę EB, ręcznie należy ocenić liczbę komórek wierzchołkowych i oznaczyć ich pochodzenie genotypowe na podstawie sygnału fluorescencyjnego. Oblicz średnie wartości na EB.</li>
</ol>

<ol><li>Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+phenotypic+drug+discovery%3A+an+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+into+the+next+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: into the next decade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).</li>
<li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-Chip%3A+A+new+paradigm+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li>
<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).</li>
<li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+image+generation+for+drug+discovery+using+generative+adversarial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Networks%3A+The+Official+Journal+of+the+INternational+Neural+Network+Society%22%5BJournal%5D)">High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks.</a> Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).</li>
<li>Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+and+image-based+profiling+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Machine learning and image-based profiling in drug discovery.</a> Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).</li>
<li>Wagner, B. K., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+sophisticated+phenotypic+screening+and+modern+mechanism-of-action+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).</li>
<li>Scannell, J. W., Bosley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+quality+beats+quantity%3A+Decision+theory%2C+drug+discovery%2C+and+the+reproducibility+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis.</a> PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).</li>
<li>Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+considerations+for+the+use+of+genetically+engineered+mouse+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).</li>
<li>Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3A+models+in+multiple+species+needed+for+therapeutic+development+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%3A+Official+Journal+of+the+Movement+Disorder+Scoiety%22%5BJournal%5D)">Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease.</a> Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).</li>
<li>Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).</li>
<li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+contributes+to+the+pathogenesis+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2.</a> Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).</li>
<li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+haploid+mouse+embryonic+stem+cell+biobank+resource+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics.</a> Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li>
<li>Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+vessels%2C+big+role%3A+Renal+microcirculation+and+progression+of+renal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury.</a> Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).</li>
<li>Jourde-Chiche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+structure+and+function+in+kidney+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Endothelium structure and function in kidney health and disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).</li>
<li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+scalable+assay+to+study+perfused+3D+angiogenic+sprouting+of+iPSC-derived+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro.</a> Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).</li>
<li>Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+guidance+of+emerging+vessel+sprouts+requires+soluble+Flt-1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1.</a> Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).</li>
<li>Sato, Y., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endothelial+cell+movement+by+pericytes+and+smooth+muscle+cells%3A+activation+of+a+latent+transforming+growth+factor-beta+1-like+molecule+by+plasmin+during+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture.</a> Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).</li>
<li>Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+activates+signal+transduction+pathways+resulting+in+vascular+endothelial+growth+factor+resistance+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes.</a> Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li>
<li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).</li>
<li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).</li>
<li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+fibrin+gel+bead+assay+for+the+study+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).</li>
<li>Gau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+intervention+of+MKL%2FSRF+signaling+by+CCG-1423+impedes+endothelial+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).</li>
<li>Torres-Estay, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+modulate+male-derived+endothelial+cell+homeostasis+using+androgen+receptor-dependent+and+receptor-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms.</a> Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Merjaneh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-angiogenic+capacities+of+microvesicles+produced+by+skin+wound+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts.</a> Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Anastomosed+microvascular+network+model+with+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).</li>
<li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).</li>
<li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aortic+ring+model+of+angiogenesis%3A+a+quarter+century+of+search+and+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).</li>
<li>Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+endothelial+cell+sprouting+assay+in+synthetic+hydrogel+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays.</a> Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).</li>
<li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).</li>
<li>Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+vasculatures+on-chip+platforms+and+their+applications+for+organ-specific+in+vitro+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling.</a> Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).</li>
<li>Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+organ-specific+vasculature+with+organ-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices.</a> Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).</li>
<li>Pollet, A., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+the+vasculature+using+organ-on-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).</li>
<li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology%3A+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje bezstronny, solidny i powtarzalny test kiełkowania naczyń krwionośnych oparty na EB 3D, który można poddać badaniom przesiewowym pod kątem leków i genów modulujących angiogenezę. Metoda ta ma przewagę nad wieloma szeroko stosowanymi testami dwuwymiarowymi (2D) wykorzystującymi hodowle komórek śródbłonka, takimi jak ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) do monitorowania migracji (test bocznego zadrapania lub test z komorą Boydena)22,23...

W ciągu ostatnich trzech dekad, odkrywanie leków na podstawie celów (TDD) było szeroko stosowane w odkrywaniu leków przez przemysł farmaceutyczny. TDD obejmuje zdefiniowany cel molekularny odgrywający ważną rolę w chorobie i opiera się na rozwoju stosunkowo prostych systemów hodowli komórkowych i odczytów do badań przesiewowych leków1. Najbardziej typowe modele chorób stosowane w programach TDD obejmują tradycyjne metody hodowli komórek, takie jak komórki nowotworowe lub unieśmiertelnione linie komórkowe hodowane w sztucznych środowiskach i niefizjologicznych podłożach. Chociaż wiele z tych modeli dostarczyło realnych narzędzi do identyfikacji skutecznych kandydatów na leki, stosowanie takich systemów może być wątpliwe ze względu na ich słabe znaczenie dla choroby2.
Dla większości chorób, mechanizmy leżące u podstaw są rzeczywiście złożone, a różne typy komórek, niezależne szlaki sygnałowe i wiele zestawów genów często przyczyniają się do określonego fenotypu choroby. Dotyczy to również chorób dziedzicznych, których główną przyczyną jest mutacja w jednym genie. Wraz z niedawnym pojawieniem się technologii indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i narzędzi do edycji genów, możliwe jest teraz generowanie organoidów 3D i modeli chorób narządów na chipach, które mogą lepiej podsumować ludzką złożoność in vivo3,4. Rozwój takich technologii wiąże się z odrodzeniem zainteresowania programami odkrywania leków fenotypowych (PDD)1. PDD można porównać do empirycznych badań przesiewowych, ponieważ nie opierają się one na wiedzy na temat tożsamości konkretnego celu leku ani hipotezie na temat jego roli w chorobie. Obecnie coraz częściej uznaje się, że podejście PDD w znacznym stopniu przyczynia się do odkrycia pierwszych w swojej klasie leków5. Ponieważ rozwój technologii organoidów ludzkich i organów na chipach jest wciąż w powijakach, oczekuje się, że modele iPSC (uzupełnione o innowacyjne narzędzia do obrazowania i uczenia maszynowego6,7) dostarczą w najbliższej przyszłości wielu nowatorskich, złożonych modeli chorób opartych na komórkach do badań przesiewowych leków i powiązanych programów PDD, aby przezwyciężyć niską produktywność podejścia TDD8, 9.
Podczas gdy modele ludzkich organoidów i organów na chipach mogą dostarczyć ważnych informacji na temat złożoności choroby i identyfikacji nowych leków, wprowadzanie leków do nowej praktyki klinicznej również opiera się na danych z modeli zwierzęcych w celu oceny ich skuteczności i bezpieczeństwa. Wśród nich myszy modyfikowane genetycznie są z pewnością najbardziej preferowanymi modelami ssaków. Mają wiele zalet, ponieważ mają stosunkowo krótki czas generacji jak na ssaki, mają wiele fenotypów podobnych do chorób ludzkich i można nimi łatwo manipulować genetycznie. Z tego powodu są one szeroko stosowane w programach do odkrywania leków10. Jednak wypełnienie luki między myszami a ludźmi pozostaje ważnym wyzwaniem11. Opracowanie mysich modeli in vitro równoważnych ludzkim modelom organoidowym i modelom narządów na chipie mogłoby przynajmniej częściowo wypełnić tę lukę, ponieważ umożliwi bezpośrednie porównanie skuteczności i bezpieczeństwa leków między danymi in vivo na myszach i in vitro na ludziach.
Tutaj opisany jest test kiełkowania naczyń krwionośnych w ciałach embrionalnych myszy (EBs). Naczynia krwionośne składają się z komórek śródbłonka (wewnętrzna wyściółka ścian naczyń), komórek ściennych (komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i perycytów)12. Protokół ten opiera się na różnicowaniu mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) w unaczynione EB za pomocą wiszących kropel, które podsumowują komórki śródbłonka de novo i różnicowanie komórek muralowych13,14. Mysie ESC można łatwo ustalić w hodowli z izolowanych blastocyst myszy dnia 3.5 o różnym pochodzeniu genetycznym15. Dają one również możliwości analizy klonalnej, śledzenia linii i mogą być łatwo manipulowane genetycznie w celu generowania modeli chorób13,16.
Ponieważ naczynia krwionośne odżywiają wszystkie narządy, nie jest zaskakujące, że wiele chorób, jeśli nie wszystkie, jest związanych ze zmianami w mikrokrążeniu. W stanach patologicznych komórki śródbłonka mogą przyjąć stan aktywowany lub mogą stać się dysfunkcyjne, co prowadzi do śmierci komórek ściennych lub migracji z naczyń krwionośnych. Mogą one powodować nadmierną angiogenezę lub rozrzedzenie naczyń, mogą indukować nieprawidłowy przepływ krwi i wadliwą barierę naczyń krwionośnych, co prowadzi do wynaczynienia komórek odpornościowych i stanu zapalnego12,17,18,19. Badania nad lekami modulującymi naczynia krwionośne są zatem wysokie, a wiele czynników molekularnych i koncepcji zostało już zidentyfikowanych w celu ukierunkowania terapeutycznego. W tym kontekście opisany protokół jest szczególnie przydatny do budowania modeli chorób i testowania leków, ponieważ podsumowuje kluczowe cechy angiogenezy kiełkowania in vivo, w tym selekcję komórek wierzchołka śródbłonka i łodygi, migrację i proliferację komórek śródbłonka, prowadzenie komórek śródbłonka, tworzenie rurki i rekrutację komórek ściennych. Wykazuje również podobieństwa do niedawno opisanych testów naczyniowych 3D opartych na technologiach ludzkiego iPSC20.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Milipore, Merck</td><td>805740</td><td>Zagrożenie biologiczne: podczas obchodzenia się</td></tr> z <tr><td>Agar Noble</td><td>Difco, BD Pharmigen</td><td>214220</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluo 555 kozie przeciwciało przeciw szczurom IgG</td><td>Life technologies</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>APC sprzężone szczurze przeciwciało anty-mysie PECAM-1 (klon MEC13.3)</td> <td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APC Szczur IgG2a &kappa; Kontrola izotypu (Klon&nbsp; R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do hodowli tkankowych z kontrastem w odwróconej fazie Axiovert 25</td><td></td> Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów-2 (bFGF) Wirówka <td></td><td></td></tr> stołowa <tr><td></td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>, Allegra X-15R</td> Komora bezpieczeństwa biologicznego <td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>BioVanguard (zielona linia)</td><td>Telstar</td><td>133H401001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Komora do zliczania komórek, Buerker, 0,100 mm</td><td>Marienfeld</td><td>640211</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych 60 x 15 mm</td><td>Corning</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych, 35 x 10 mm</td><td>Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych 12-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biorad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kurczaka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I, wysokie stężenie, ogon szczura, 100 mg</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalne skanowanie laserowe Mikroskop, TCS SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe, 24 &razy; 50 mm</td><td>Vwr</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPT &gamma;? inhibitor sekretazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DC101 anty mysi VEGFR-2 Clone</td><td>BioXcell</td><td>BP0060</td><td></td></tr><tr><td>DC101 izotyp szczura IgG1</td><td>BioXcell</td><td>BP0290</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438-5X</td><td>Zagrożenie biologiczne: podczas obchodzenia się</td></tr> z <tr><td>DPBS (10x) należy przestrzegać odpowiednich instrukcji bezpieczeństwa, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 40 mM</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Embrionalne komórki macierzyste Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>16141-079</td><td>Powinny być testowane pod kątem maksymalnej żywotności i wzrostu komórek ES. Inaktywacja ciepła przy 60& C i przechowywać w &minus; 20 &stopni; C przez okres do 1 roku</td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf 5415R</td><td>Eppendorf AG&</td><td>nbsp; </td><td></td>Z605212</tr><tr><td>Erytropoetyna, ludzka (hEPO), 250 j. (2,5 &mikro; g) (1 mL)</td><td>Roche</td><td>11120166001</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Rekombinowane mysie białko LIF (10? jednostek&nbsp; &nbsp; 1 mL)</td><td>Milipore, Merck</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówki 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówki 50 ml</td><td>Greiner Bio-0ne</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra, przezroczysta, sterylna F.Gilson, P-200</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra, przezroczysta, sterylna F.Gilson, P10</td><td>Greiner Bio-One</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra, przezroczysta, sterylny F.Gilson, P1000</td><td>Greiner Bio-One</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>FITC sprzężony anty-&alfa; Aktyna mięśni gładkich (SMA) (klon 1A4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td></td></tr><tr><td>FITC sprzężony szczur anty-mysz CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103107</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2b, &kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało (klon RTK4530)</td><td>Biolegend</td><td>400605</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne media montażowe</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Kompres gazowy</td><td>Cutisoft</td><td>45846</td><td></td></tr><tr><td>Gaza Cutisoft 10 x 10 cm</td><td>Bsn Medical</td><td>45844_00</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła żelowa, klasa GB003</td><td>Whatman</td><td>WHA10547922</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny, typ B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow's MEM (GMEM)</td><td>Gibco, Thermofisher naukowy</td><td>21710082</td><td></td></tr><tr><td>IHC Utrwalacz</td> BD <td>Pharmigen</td><td>550523</td><td></td></tr><tr><td>IncuSafe Inkubator CO2</td><td>PHCBi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-6, ludzka (hIL-6)</td><td>Roche</td><td>11138600001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko na szkiełka mikroskopowe</td><td>Kartell Labware</td><td>278</td><td></td></tr><tr><td>, szkło Starfrost</td><td>Knittel</td><td>VS113711FKB.0</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Cdh5_1_SG Test Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00110467</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Eng_1_SG Test Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00148981</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Epha4_1_SG Test Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00093576</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Ephb2_1_SG Test Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00154014</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Flt1_1_SG Test Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00096292 Mm_Flt4_1_SG</td><td></td></tr> Test <tr><td>Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00099064</tr><tr><td>Mm_Gapdh_3_SG Test gruntujący QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT01658692</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Kdr_1_SG Test gruntu QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00097020</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT00156982</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Nr2f2_1_SG Test gruntujący QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00153104</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT01052044</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Tek_1_SG Test startera QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00114576</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowane fibroblasty embrionalne myszy (ICR)&nbsp; (2 mln)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>A24903</td><td>Przechowywać fiolki w ciekłym azocie (195,79 &deg; C) w nieskończoność</td></tr><tr><td>Linia embrionalnych komórek macierzystych myszy 7AC5 / EYFP (ATCC SCRC-1033)</td> <td>ATCC</td><td>SCRC-1033</td><td>Wygenerowana przez dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanizmy rozwoju. 76 (1&ndash; 2), 79&ndash; 90 (1998)].</td></tr><tr><td>Linie embrionalnych komórek macierzystych myszy Acvrl1 +/- i Acvrl1 +/+</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Lejdzie [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&ndash; 2712 (2018)].</td></tr><tr><td>Linia embrionalnych komórek macierzystych myszy E14</td><td></td><td></td><td>Dostarczona przez laboratorium M Letarte i wygenerowana zgodnie z Cho, SK i wsp. Krew. 98 (13), 3635&ndash; 3642 (2001).</td></tr><tr><td>Linia embrionalnych komórek macierzystych myszy R1 (ATCC SCRC-1011)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td>Wygenerowana przez dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada. [Nagy, A., et al. Procedury Narodowej Akademii Nauk Stanów Zjednoczonych Ameryki. 90 (18), 8424&ndash; 8428 (1993)].</td></tr><tr><td>Embrionalne komórki macierzyste myszy linii Z/Red (szczep 129/Ola)</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane przez Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&ndash; 246 (2004)].</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/VIS NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB, Rekombinowane ludzkie</td> przeciwciało <td>Peprotech</td><td>100-14B</td><td></td></tr><tr><td>Pecam-1, Szczurzy anty-mysz</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>szalka Petriego, PS, 94/16 mm, standardowa, z otworami wentylacyjnymi, sterylna</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy acu 2</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155 019</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G Multichannel P8 x 200G</td><td>Gilson</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G Zestaw startowy, zestaw 4 pipet, P2G, P20G, P200G, P1000G</td><td>Gilson</td><td>F167360</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki BMP-4 Białko</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 10 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607 180</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 25 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760 180</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 5 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606 180</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu 100 mM</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 5ml okrągłodenne z nakrętką z sitkiem</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (BioXtra)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>Trypsyna (2,5%)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania, 500 ml</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>VEGFA165 , rekombinowana mysia</td> woda <td>Peprotech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>, sterylna</td> kąpiel wodna <td>Fresenius-Kabi</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>, Lab-Line Digital</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18052A</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Ostatnie postępy w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) i technologiach edycji genów umożliwiają rozwój nowych modeli chorób opartych na komórkach ludzkich dla programów odkrywania leków fenotypowych (PDD). Chociaż te nowatorskie urządzenia mogą dokładniej przewidywać bezpieczeństwo i skuteczność badanych leków u ludzi, ich opracowanie do celów klinicznych nadal w dużym stopniu opiera się na danych dotyczących ssaków, w szczególności na wykorzystaniu mysich modeli chorób. Równolegle z ludzkimi organoidami lub modelami chorób typu organoid na chipie, opracowanie odpowiednich modeli mysich in vitro stanowi zatem niezaspokojoną potrzebę oceny bezpośrednich porównań skuteczności i bezpieczeństwa leków między gatunkami oraz w warunkach in vivo i in vitro. W tym miejscu opisano test kiełkowania naczyń krwionośnych, który wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała zarodkowe (EB). Unaczynione EB hodowane na żelu kolagenowym 3D rozwijają nowe naczynia krwionośne, które rozszerzają się w procesie zwanym angiogenezą kiełkowania. Model ten podsumowuje kluczowe cechy angiogenezy kiełkowania in vivo - tworzenia naczyń krwionośnych z wcześniej istniejącej sieci naczyniowej - w tym selekcję komórek końcówki śródbłonka, migrację i proliferację komórek śródbłonka, prowadzenie komórek, tworzenie rurki i rekrutację komórek ściennych. Jest podatny na badania przesiewowe pod kątem leków i genów modulujących angiogenezę i wykazuje podobieństwa do niedawno opisanych trójwymiarowych (3D) testów naczyniowych opartych na technologiach ludzkiego iPSC.

Przegląd protokołu testu kiełkowania naczyń krwionośnych przedstawiono na Rysunku 1. Dziewięciodniowe ciałka embrionalne (EB) pochodzące z trzech niezależnych linii mESC 129/Ola (Z/Red, R1 i E14) zostały rozdzielone enzymatycznie do pojedynczych komórek przy użyciu kolagenazy A. Komórki barwiono pod kątem PECAM-1 i analizowano za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) zgodnie z opisem. Wszystkie linie komórkowe wykazały silną różnicowanie w kierunku śródbłonka i nie zaobserwowano...

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Protokół ten opisuje test angiogenezy kiełkowania in vitro, który podsumowuje wiele cech tworzenia naczyń krwionośnych i może być wykorzystany do testowania leków. Ta metoda jest łatwa do wdrożenia w laboratorium, niezawodna i skalowalna. Ma wiele podobieństw z testami z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka i mikrosfer.Model ten silnie naśladuje fenotyp, wykazując wadliwą selekcję komórek wierzchołka śródbłonka i zorientowaną migrację komórek śródbłonka, która prowadzi do patologicznej angiogenezy. Prace mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów regulujących angiogenezę kiełkowania, kluczowych genów i zaangażowanych szlaków sygnałowych, w szczególności poprzez przeprowadzanie genetycznych badań przesiewowych. Ważne jest regularne sprawdzanie etapów pluripotencji i morfologii linii komórkowych.Ważne jest również, aby przeprowadzić kariotypowanie linii komórkowych, ponieważ mają one tendencję do hodowli w celu utraty lub uzyskania chromosomów. Rozpocznij od pokrycia jednej studzienki z sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej 500 mikrolitrami 0,1% roztworu żelatyny i umieść ją w inkubatorze dwutlenku węgla na 30 minut. Następnie umyj płytki pokryte żelatyną PBS i dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego podłoża CM plus minus.Aby uzyskać czystą populację mysich embrionalnych komórek macierzystych lub mESC, trypsynizuj płytkę hodowli komórkowej z 10x buforem TVP przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki różnicującej mezodermę przed przeniesieniem ich na pokrytą żelatyną płytkę sześciodołkową na 30 minut, aby umożliwić mysim fibroblastom embrionalnym przyczepienie się, podczas gdy mESC pozostają w zawiesinie. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki przed zliczeniem żywych komórek za pomocą hemocytometru Neubauera w niebieskim barwniku trypanowym.Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej mezodermę. Przygotuj cztery 94-milimetrowe naczynia polistyrenowe o niskim mocowaniu, dodając na dno 15 mililitrów sterylnej wody.Po przeniesieniu zawiesiny komórek do sterylnego plastikowego zbiornika, załadować cztery pozycje pipety wielokanałowej po 22 mikrolitry zawiesiny komórek na kanał. Podnieś i umieść odwróconą pokrywę naczynia o średnicy 94 milimetrów na czystej powierzchni komory przepływowej wewnętrzną stroną skierowaną do góry. Umieść 40 kropli zawiesiny komórek na wewnętrznej powierzchni każdej pokrywki i ostrożnie odwróć pokrywkę bez zakłóceń, aby umieścić ją z powrotem na naczyniu, tak aby krople były skierowane w stronę wody.Inkubuj szalki w inkubatorze dwutlenku węgla przez cztery dni, traktując to jako dzień zero różnicowania. Po czterech dniach inkubacji zbierz wiszące krople w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów za pomocą pipety P1000. Pozostawić osad EB w probówce przed usunięciem supernatantu.Ponownie zawiesić EB w trzech mililitrach 2x pożywki do różnicowania naczyń krwionośnych przed przeniesieniem i równomiernym rozprowadzeniem zawiesiny EB w naczyniu pokrytym agarem o grubości 60 milimetrów. Inkubować naczynia w inkubatorze dwutlenku węgla do dziewiątego dnia, odświeżając podłoże co dwa dni. Przygotuj 35-milimetrowe naczynie hodowlane, dodając jeden mililitr pożywki do kiełkowania na jej dnie.Aby wywołać żelowanie, inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zbierz dziewięciodniowe EB z jednej płytki agarowej w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i usuń supernatant. Ponownie zawiesić EB w dwóch mililitrach zimnej pożywki do kiełkowania, aby przenieść ją do naczynia hodowlanego pokrytego pierwszą warstwą pożywki do kiełkowania.Rozłóż EB na całej płycie, upewniając się, że znajdują się w równej odległości od siebie. Pierwsze formowanie się kiełków powinno być widoczne po inkubacji przez około 24 do 48 godzin. W 12 dniu za pomocą szpatułki ostrożnie przenieś żel kolagenowy zawierający EB na szklane szkiełko.Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety i odwodnij żel, umieszczając na żelu arkusz gazy z nylonowej bielizny i chłonne karty filtracyjne. Wywieraj nacisk ciężarkiem 250 gramów przez dwie minuty. Następnie usuń nylonowe papiery, aby szkiełka wyschły na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po wysuszeniu utrwalić EB za pomocą roztworu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia należy usunąć utrwalacz przed pięciokrotnym umyciem szkiełek za pomocą PBS. Przepuszczalność EB i PBS zawierających 0,1% Triton X-100.Po 15 minutach usunąć roztwór przepuszczalny, aby przemyć szkiełka pięć razy PBS przez pięć minut. Inkubować EB w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i przemywać PBS przez pięć minut. Następnie dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnie inkubować szkiełka z przeciwciałem wtórnym koziego anty-Rat Alexa 555 w buforze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut i jeden raz wodą przed zamontowaniem ich do mikroskopii. Test angiogenezy kiełkowania 3D przeprowadzono na trzech EB z dwoma lekami, DC101 i DAPT.Oba związki stopniowo blokowały angiogenezę w modelu EB przy rosnących stężeniach. Różne stężenia leków w EB wykazały, że wysokie dawki DC101 hamują liczbę i długość kiełków naczyniowych. DAPT miał odwrotne działanie przy dawce jednego mikromola na litr.DAPT znacznie zwiększył liczbę komórek wierzchołka śródbłonka na kiełki naczynia, które mają fenotyp błędnego kierowania nawet przy niskich dawkach, w porównaniu z DC101. Wadliwe kiełkowanie naczyń zaobserwowano w dziedzicznych hemordwotocznych teleangiektazjach EB z kontroli ACVRL1 i heterozygotycznych genotypach ACVRL1 z licznymi błędnymi fenotypami kiełkującymi pod losowymi kątami w stosunku do naczyń rodzicielskich. Mieszaniny linii mESC typu dzikiego w stosunku jeden do jednego z nieznakowaną linią mESC typu dzikiego doprowadziły do równego udziału w wiodących komórkach wierzchołka śródbłonka.Przeprowadzono analizę mikroskopową tej reprezentatywnej chimerycznej EB w celu zidentyfikowania genotypowego pochodzenia wiodących komórek wierzchołka śródbłonka. Aby określić ilościowo pokrycie komórek ściennych kiełka naczynia, EB utrwalono i wybarwiono pod kątem markerów komórek śródbłonka, PECAM i markera komórek ściennych, aktyny alfa mięśni gładkich. Obraz w dużym powiększeniu ujawnił, że jeden pojedynczy kiełek naczynia był otoczony komórkami muralu.Transformację binarną przeprowadzono po rozdzieleniu kanałów barwnych i określono ilościowo stosunek naczyń dodatnich PECAM pokrytych dodatnimi komórkami muralowymi alfa SMA. Tło genetyczne linii embrionalnych komórek macierzystych jest również kluczowym czynnikiem, który naukowcy muszą wziąć pod uwagę, ponieważ niektóre linie kiełkują lepiej niż inne. Metoda ta może być stosowana do przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych przy użyciu metod RNAi lub banku mysich embrionalnych komórek macierzystych zawierających mutacje genowe.

in-vitro-three-dimensional-sprouting-assay-angiogenesis-using-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Ten protokół przedstawia test kiełkowania naczyniówki, model ex vivo proliferacji mikronaczyniowej. Test ten może być stosowany do oceny szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniówek i oceny leczenia farmakologicznego przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.

Test kiełkowania naczyniówki ex vivo w angiogenezie mikronaczyniowej oka

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Poznaj trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta metoda umożliwia modelowanie chorób naczyniowych i testowanie leków w kontrolowanym środowisku in vitro.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Przeglądaj więcej filmów