Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps
9 czerwca 2021
Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.
Protokół bada neurony ziarniste móżdżku na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji kluczowego wzrostu morfologicznego. Do zalet tej techniki zalicza się celowanie specyficzne dla komórki, szybką ekspresję transfekowanych konstruktów oraz rzadkie znakowanie komórek, co pozwala na badanie autonomicznych efektów komórkowych. Zacznij od wycięcia 11,2 milimetrowego segmentu z końcówki pipety ładującej i umieść wyciętą część na końcówce strzykawki Hamilton jako przekładkę, aby ograniczyć głębokość wstrzyknięcia do 1,5 milimetra.
Zabezpiecz przekładkę na końcówce strzykawki za pomocą kleju lub parafilmu. Aby zbadać morfologię pojedynczych elektroporowanych CGN ze strzałkowych odcinków mózgu eksperymentalnego szczeniaka, wykonaj obrazy stosu Z z prędkością 0,5 mikrometra na stos pod mikroskopem konfokalnym. Obraz po jednej komórce na okno obrazu, aby umożliwić łatwą analizę obrazu i rekonstrukcję 3D.
Analizuj długość neurytów i tworzenie się pazurów dendrytycznych w sposób zaślepiony za pomocą prostego znacznika neurytów. Prześlij jednokanałowe obrazy stosu Z elektroporowanych CGN na Fidżi i kliknij Wtyczki"Segmentacja"i Simple Neurite Tracer"Wybierz Utwórz nową przeglądarkę 3D"z menu rozwijanego. Przewiń do podstawy dendrytu łączącego się z somą komórkową i rozpocznij ścieżkę, klikając skrzyżowanie.
Ręcznie prześledź ścieżkę, klikając sekcje, w których sygnał wypełnienia komórek jest najjaśniejszy, i naciskając Y, aby zachować ślad. Śledź do końca dendrytu i potwierdź ścieżkę, naciskając F. Alternatywnie śledź aż do podstawy pazura. Następnie prześledź pazur od podstawy struktury aż do końca najdłuższego neurytu.
Śledź gałęzie drugorzędne i trzeciorzędne, przytrzymując Control w systemie Windows lub ALT w systemie macOS i klikając ścieżkę. Potwierdź ścieżkę, naciskając F. Zwróć uwagę, że pomiary ścieżek są widoczne w osobnym oknie. Zsumuj wszystkie rozmiary gałęzi pazurów, aby uzyskać całkowitą długość każdego pazura.
W reprezentatywnej analizie obrazy projekcyjne elektroporowanych CGN od 3 do 14 dni po wstrzyknięciu wykazały postępujący spadek liczby dendrytów. CGN przeszły fazę wzrostu dendrytycznego, po której nastąpiła rafinacja z 3 DPI do 7 DPI, co spowodowało przycięcie ponad 50% nadmiaru dendrytów. Zdarzenie to zbiega się ze stopniowym wydłużaniem się pozostałych altan w tworzeniu struktur przypominających szpony na końcu każdego dendrytu, co wskazuje, że te procesy rozwojowe zachodzą równocześnie.
Przy 7 DPI pazury znaleziono na około 75% dendrytów. Każdy oznaczony CGN został zrekonstruowany w NMRS w celu ilościowego określenia całkowitej powierzchni i objętości somato-dendrytycznej. Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w wielkości CGN w poszczególnych fazach rozwoju.
Chociaż przy 7 DPI, CGN wykazały znaczny spadek głośności o 20% w porównaniu z 3, 5 i 10 DPI. Najważniejsze w zabiegu jest dokładne zlokalizowanie móżdżku przed wstrzyknięciem. Metodę tę można dostosować do genetycznego manipulowania genami in vivo w celu zbadania ich roli w rozwoju neuronów ziarnistych poprzez transfekcję shRNA, siRNA lub rekombinazy Cre.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania rozwoju morfologicznego neuronów ziarnistych móżdżku (CGNs) w rozwijającym się móżdżku myszy z wykorzystaniem elektroporacji in vivo. Technika ta umożliwia rzadkie znakowanie i manipulację genetyczną neuronów CGN, co pozwala na szczegółową analizę wzrostu dendrytów, tworzenia się wypustek (claw formation) oraz synaptogenezy podczas kluczowych etapów rozwoju. Metoda ta łączy precyzyjny wtrysk, obrazowanie konfokalne oraz ilościową analizę morfometryczną w celu śledzenia dojrzewania neuronów CGN w czasie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
Wstęp
- Neurony przechodzą znaczące zmiany strukturalne i funkcjonalne podczas rozwoju mózgu.
- Móżdżek gryzoni jest systemem modelowym do badania morfogenezy pojedynczych komórek, w szczególności CGNs.
- CGNs tworzą wyspecjalizowane wypustki dendrytyczne (tzw. pazury), które mają kluczowe znaczenie dla wejść synaptycznych.
- Tradycyjne metody znakowania często nie zapewniają specyficzności komórkowej lub odpowiedniej rozdzielczości czasowej.
Cel badania
- W celu wizualizacji i ilościowej oceny rozwoju morfologicznego poszczególnych CGN in vivo.
- W celu śledzenia wzrostu dendrytów, ich przycinania oraz tworzenia się zakończeń typu „pazur” (claw formation) w różnych punktach czasowych rozwoju.
- W celu zapewnienia platformy do autonomicznie komórkowej manipulacji genetycznej CGN.
Zastosowane metody
- Elektroporacja in vivo progenitorów neuronów ziarnistych w rozwijającym się móżdżku myszy.
- Rzadkie znakowanie CGN w celu przeprowadzenia przejrzystej analizy morfologicznej.
- Mikroskopia konfokalna z obrazowaniem w stosach Z dla rekonstrukcji 3D.
- Ręczne śledzenie i ilościowe określanie długości neurytów oraz struktur pazurkowatych dendrytów przy użyciu programów Fiji i Simple Neurite Tracer.
Główne wyniki
- Obrazy projekcyjne z okresu od 3 do 14 dni po wstrzyknięciu (DPI) wykazały stopniowy spadek liczby dendrytów na pojedynczy CGN.
- Między 3. a 7. dniem DPI w CGN zachodziło przycinanie dendrytów, w wyniku czego usunięto ponad 50% nadmiarowych dendrytów.
- Na końcach pozostałych dendrytów utworzyły się struktury przypominające pazury, które do 7. dnia DPI występowały w ok. 75% dendrytów.
- Wielkość CGN pozostała w dużej mierze stała, choć w 7. dniu DPI zaobserwowano istotny, 20-procentowy spadek objętości w porównaniu z innymi punktami czasowymi.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia szczegółową, komórkowospecyficzną analizę rozwoju morfologicznego CGN in vivo.
- Przycinanie dendrytów i tworzenie wypustek typu „claw” są procesami zachodzącymi równocześnie podczas dojrzewania CGN.
- Metoda ta może być dostosowana do manipulacji genetycznych w celu badania funkcji genów w rozwoju CGN.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza in vivo morfologii neuronów ziarnistych móżdżku (CGN) oraz rozwoju synaps odpowiada na krytyczną potrzebę uzyskania wiarygodności prognostycznej w walidacji celów neurodevelopmentalnych. Możliwości rzadkiego znakowania oraz manipulacji genetycznych umożliwiają ograniczanie ryzyka mechanistycznego na najwcześniejszych etapach odkryć w obszarze OUN. Podejście to wspiera ciągłość translacyjną poprzez powiązanie morfogenezy komórkowej z integracją synaptyczną, co dostarcza informacji istotnych dla decyzji portfelowych w badaniach i rozwoju ukierunkowanych na neurobiologię.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji genów w morfogenezie i synaptogenezie CGN.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez izolację efektów autonomicznych komórkowo in vivo.
- Zapewnia ilościowe odczyty dla weryfikacji celów w oparciu o postawione hipotezy.
- Ułatwia selekcję celów neurorozwojowych na podstawie fenotypów morfologicznych i synaptycznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowane, powtarzalne schematy obrazowania i analizy morfologii neuronalnej.
- Dostarcza ilościowe parametry, takie jak liczba dendrytów, tworzenie się wypustek (claw formation) oraz długość neurytów, do dalszych badań przesiewowych.
- Umożliwia standaryzację testów poprzez ślepą, wspomaganą programowo analizę morfometryczną.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do przesiewu związków chemicznych lub genetycznych w badaniach nad OUN.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Powiązanie fenotypów morfologicznych z rozwojem synaptycznym istotnym dla choroby w modelach gryzoni.
- Wsparcie ciągłości procesu od wczesnego etapu odkryć do walidacji przedklinicznej interwencji neurorozwojowych.
- Zapewnienie platformy do oceny translacyjnych biomarkerów dojrzewania synaptycznego.
- Zmniejszenie ryzyka rozwoju badań poprzez powiązanie zmian komórkowych z funkcjonalnymi efektami synaptycznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje cały proces – od wczesnego etapu odkrywania po identyfikację wiodących związków w badaniach nad OUN, umożliwiając iteracyjne testowanie hipotez oraz ilościowe fenotypowanie interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej w zakresie funkcji genów w morfogenezie neuronów i tworzeniu synaps.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki analizy struktury dendrytów i synaps.
- Analityka: Umożliwia ślepy pomiar długości neurytów, wypustek dendrytycznych i objętości komórek przy wsparciu oprogramowania.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy komórkowe z rozwojem synaptycznym istotnym dla chorób in vivo.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do różnorodnych manipulacji genetycznych i modelowych systemów OUN w ramach programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neurorozwojowych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie in vivo oraz analizę morfometryczną w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez powiązanie perturbacji genów z mierzalnymi fenotypami neuronalnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne dane in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie neuroanatomii gryzoni oraz precyzyjnych technik iniekcji stereotaktycznej.
- Wymaga dostępu do mikroskopii konfokalnej i zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazu (np. Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu przeprowadzenia ślepej analizy i interpretacji danych.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych konstruktów genetycznych (shRNA, siRNA, rekombinaza Cre) na potrzeby badań autonomii komórkowej.
- Dokładność iniekcji oraz efektywność znakowania komórek są kluczowe dla uzyskania powtarzalnych wyników.
Często zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
