Name: Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 30 s
Description: Poznaj zaawansowaną strategię immunofenotypowania megakariocytów ludzkich z próbek pierwotnych i kultur in vitro. Ta metoda umożliwia identyfikację kolejnych etapów różnicowania MK oraz sortowanie FACS do badań multi-omowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marcosowi Pérezowi Basterrechea, Lorenie Rodríguez Lorenzo i Begoñi García Méndez (HUCA) oraz Palomie Cerezo, Almudenie Payero i Maríi de la Poveda-Colomo (HCSC) za wsparcie techniczne. Praca ta była częściowo wspierana przez granty medyczne (Roche SP200221001) dla A.B., stypendium RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Hiszpania) oraz stypendium I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Hiszpania i Fondos FEDER) na rzecz L.G., stypendium Severo Ochoa (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spain) do P.M.-B. oraz stypendium podoktorskie w 2018 r. (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Hiszpania) dla A.A.-H. Dziękujemy Reinierowi van der Lindenowi za podzielenie się swoją wiedzą (i czasem), a zwłaszcza za mądre rady dotyczące wielokolorowej mieszanki paneli z przeciwciałami znakowanymi i przygotowania do kontroli jednokolorowych kulek.

<ol><li>Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Mechanisms+That+Control+Platelet+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thrombosis+And+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production.</a> Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).</li>
<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Incredible+Journey%3A+From+Megakaryocyte+Development+To+Platelet+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation.</a> Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+Of+The+Demarcation+Membrane+System+%28DMS%29+In+Megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Couldwell, G., Machlus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+Of+Megakaryopoiesis+And+Platelet+Production+During+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation.</a> Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).</li>
<li>Kosaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Platelet+Production+From+Mature+Megakaryocytes%3A+Does+Platelet+Release+Occur+Via+Proplatelets%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Hematology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets.</a> International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).</li>
<li>Lefrancais, E., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Biogenesis+In+The+Lung+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Platelet Biogenesis In The Lung Circulation.</a> Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).</li>
<li>Nieswandt, B., Stritt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+Rupture+For+Acute+Platelet+Needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs.</a> Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+Induces+Thrombopoiesis+Through+Megakaryocyte+Rupture+In+Response+To+Acute+Platelet+Needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs.</a> Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Biased+Stem+Cells+Reside+At+The+Apex+Of+The+Haematopoietic+Stem-Cell+Hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Routes+Of+Lineage+Development+Reshape+The+Human+Blood+Hierarchy+Across+Ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116(2016).</li>
<li>Yamamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Analysis+Unveils+Self-Renewing+Lineage-Restricted+Progenitors+Generated+Directly+From+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Human+Megakaryocyte+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding Human Megakaryocyte Development.</a> Cell Stem Cell. , (2020).</li>
<li>Meinders, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repercussion+Of+Megakaryocyte-Specific+Gata1+Loss+On+Megakaryopoiesis+And+The+Hematopoietic+Precursor+Compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment.</a> Plos One. 11 (5), 0154342(2016).</li>
<li>Meinders, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sp1%2FSp3+Transcription+Factors+Regulate+Hallmarks+Of+Megakaryocyte+Maturation+And+Platelet+Formation+And+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function.</a> Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).</li>
<li>Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Of+Megakaryocytes+From+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> Bio-Protocol. 5 (21), 1639(2015).</li>
<li>Choudry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Characterization+Of+Human+Megakaryocyte+Polyploidization+And+Lineage+Commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Thrombosis+And+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment.</a> Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271(2021).</li>
<li>Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prospective+Isolation+Of+Viable%2C+High+Ploidy+Megakaryocytes+From+Adult+Murine+Bone+Marrow+By+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting.</a> Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).</li>
<li>Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+Of+Human+Megakaryocytes+By+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting.</a> Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).</li>
<li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+The+Quest+For+In+Vitro+Platelet+Production+By+Re-Tailoring+The+Concepts+Of+Megakaryocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation.</a> Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).</li>
<li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Platelet+Production+For+Transfusion+Purposes%3A+Where+Are+We+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+And+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now.</a> Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864(2020).</li>
<li>Butov, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Megakaryocyte+Culture+From+Human+Bone+Marrow+Aspirates+As+A+Research+And+Diagnostic+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool.</a> Platelets. , 1-8 (2020).</li>
<li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gold+Standard+Protocol+For+Human+Megakaryocyte+Culture+Based+On+The+Analysis+Of+1%2C500+Umbilical+Cord+Blood+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+And+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples.</a> Thrombosis And Haemostasis. , (2020).</li>
</ol>

Produkcja materiałów audiowizualnych została wsparta przez BD Biosciences.

Większość badań koncentrujących się na badaniu megakariopoezy za pomocą cytometrii przepływowej ograniczała się do tej pory do identyfikacji podzbiorów MK przy użyciu tylko markerów powierzchniowych specyficznych dla linii (tj. CD42A/CD42B, CD41/CD61), podczas gdy wcześniejsze etapy różnicowania MK były słabo zbadane. W niniejszym artykule przedstawiamy strategię immunofenotypowania w celu kompleksowej charakterystyki ludzkiej megakariopoezy za pomocą cytometrii przepływowej. Ogólnie rzecz biorąc, chcielibyśmy p...

Megakariocyty (MK) rozwijają się z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) w wyniku złożonego procesu zwanego megakariopoezą, który jest koordynowany głównie przez hormon trombopoetynę (TPO). Klasyczny pogląd na megakariopoezę opisuje podróż komórkową od HSC przez szereg hierarchicznych etapów zaangażowanych komórek progenitorowych i prekursorowych, prowadzących ostatecznie do dojrzałego MK. Podczas dojrzewania MK doświadczają wielu rund endomitozy, rozwijają skomplikowany wewnątrzkomórkowy system błony demarkacyjnej (DMS), który zapewnia wystarczającą powierzchnię błony do produkcji płytek krwi oraz wydajnie wytwarzają i pakują mnóstwo czynników, które są zawarte w różnych granulkach odziedziczonych przez dojrzałe płytki krwi1,2,3. W efekcie dojrzałe MK to duże komórki (40-60 μm) charakteryzujące się wysoce poliploidalnym jądrem (osiągającym nawet >64N). Ostatnie badania sugerują alternatywne drogi, dzięki którym HSC różnicują się w MK, omijając tradycyjne punkty kontrolne zobowiązania rodowodu w odpowiedzi na pewne warunki fizjopatologiczne4,5,6,7,8,9,10,11. Wyniki te podkreślają, że różnicowanie układu krwiotwórczego w kierunku dojrzałego MK jest procesem ciągłym i adaptacyjnym, który odpowiada na potrzeby biologiczne.
Wraz z rosnącą wiedzą na temat biologii komórki i molekularnych aspektów charakteryzujących megakariopoezę12, większość badań poświęconych badaniu procesu za pomocą cytometrii przepływowej ogranicza się do identyfikacji dojrzałych MK za pomocą specyficznych dla linii markerów powierzchniowych (np. CD42A/B, CD41/CD61), podczas gdy wcześniejsze etapy różnicowania MK pozostają niezbadane. Wcześniej udokumentowaliśmy strategię etapowania megakariopoezy w hodowlach MK szpiku kostnego myszy i szpiku kostnego pochodzących ze szpiku kostnego13,14, którą dostosowaliśmy i zastosowaliśmy do ludzi15. W niniejszym artykule przedstawiono strategię immunofenotypowania, która pozwala na scharakteryzowanie megakariopoezy, od HSC do dojrzałych MK, w ludzkich źródłach pierwotnych (szpik kostny -BM- i krew obwodowa -PB-) lub hodowlach in vitro przy użyciu panelu integrującego specyficzne i niespecyficzne markery powierzchniowe MK (m.in. CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT i CD71). Pomimo swoich dużych rozmiarów i kruchości, MK mogą być immunofenotypowane przy użyciu wyżej wymienionych markerów powierzchni komórek i wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w określonych warunkach ciśnienia i średnicy dyszy w celu zminimalizowania pękania komórek i/lub uszkodzenia. Technika ta ułatwia podejście multiomiczne w celu lepszego zrozumienia złożoności megakariopoezy i produkcji płytek krwi w zdrowiu i chorobie ludzkiej. Warto zauważyć, że będzie on stanowił użyteczne narzędzie wspomagające diagnostykę i rokowanie w kontekście klinicznym rosnącego zapotrzebowania.
W tym manuskrypcie dokumentujemy strategię etapowania ludzkiej megakariopoezy za pomocą panelu integrującego specyficzne dla MK i niespecyficzne markery powierzchniowe z pierwotnych źródeł lub wygenerowane in vitro. Dodatkowo udostępniamy protokół sortowania, z aktywowanym fluorescencją sortownikiem komórek, preferowanych frakcji i dojrzałych MK (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Ten krok nie jest popularny, ponieważ jest trudny technicznie ze względu na duży rozmiar i kruchość MK. Jednak już wcześniej stosowano go zarówno w próbkach szpiku kostnego myszy, jak i ludzkiego, a także ze względu na postęp technologiczny, za każdym razem uzyskując lepszy wynik16,17,18. Głównymi źródłami ludzkimi, w których można badać MK lub prekursory MK, są między innymi szpik kostny, krew pępowinowa i krew obwodowa. Istotne znaczenie ma właściwe przetwarzanie próbki w celu wyizolowania odpowiedniej frakcji komórkowej do analizy na każdej próbce. Uwzględniono standardowe procedury, z pewnymi względami, które należy wziąć pod uwagę, dążąc do badania megakariopoezy.

<table><tbody><tr><td>Dysza 130 mikronów</td><td>BD</td><td>643943</td><td>wymagana do sortowania MK</td></tr><tr><td>5810R Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Izolacja i mycie</td></tr><tr><td>komórek A-4-62 Rotor kubełkowy</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Izolacja i mycie</td></tr><tr><td>komórek Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge</td><td>ELITech Group</td><td></td><td>Zautomatyzowane urządzenie cytologiczne, w którym szkiełka są barwione Mat-Gr& UML; nwald Giemsa</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator Galaxy 170 S</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Inkubacja komórek</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytospin Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td>Do przygotowania cytospinów</td></tr><tr><td>Sorter FACSAria IIu</td> Lasery <td>BD</td><td></td><td>488 nm i 633 nm</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACSCanto II</td><td></td><td>Lasery BD 488 nm , 633 nm i 405 nm</td>Mikroskop Olympus BX 41 <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>Microphotographs</td></tr><tr><td>Olympus Microscope BX 61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microphotographs Zoe Fluorescent Cell Imager</td><td>BioRad</td><td></td><td>Microphotographs</td></tr><tr><td>Aby uzyskać PBMCs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipidy Cholesterol Bogaty w surowicę dorosłego bydła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4646</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stem Cell Technologie</td><td>#07801</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka erytropoetyna (EPO)</td><td>&nbsp; R& D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&trade;</td><td>PHC2115</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka trombopoetyna (TPO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&trade;</td><td></td><td>Agoniści receptora PHC9514 lub TPO</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Analizy</td><td></td><td></td><td></td>cytometrii przepływowej</tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Merck</td><td>A7906-100G</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD</td><td>552843</td><td>Przeciwciała dla komórek ludzkich pochodzą na ogół od myszy.</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>BD FACS Koraliki Accudrop</td><td>BD</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>CD31 AF-647</td><td>BD</td><td>561654</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>Immunostep</td><td>31F-100T</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD</td><td>555821</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD41 PE</td><td>BD 555467</td><td></td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD41 PerCP-Cy5.5</td><td>BD</td><td>333148</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD42A APC</td><td>Immunostep</td><td>42AA-100T</td><td>Zaobserwowaliśmy niespecyficzne wiązanie... które należy ocenić</td></tr><tr><td>CD42A PE</td><td>BD</td><td></td> 558819 <td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD42B PerCP</td><td>Biolegend</td><td>303910</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD49B PE</td><td>BD</td> 555669 <td></td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD61 FITC</td><td>BD</td><td>555753</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>CD71 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>334109</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki blok BD Fc Blok</td><td>BD</td><td>564219</td><td>Fc - zestaw kontrolny</td></tr><tr><td>PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>313212</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>Lineage Cocktail 2 FITC</td><td>BD</td><td>643397</td><td>Mysz anty-ludzka</td></tr><tr><td>RNAza</td><td>Merck</td><td>R6513</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Triton X-500</td><td>Merck</td><td>93443-500ML</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Sitka do komórek do sortowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrics Filtry 100 mikrometrów</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2328</td><td>Sitka do komórek</td></tr><tr><td>Uwaga: nie określamy ogólnych odczynników/chemikaliów (PBS, EDTA itp.) ani jednorazowych (probówki itp.), ani odczynników określonych w poprzednich opublikowanych i standardowych protokołach&nbsp; - chyba że określono inaczej.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich mk ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Różnicowanie megakariocytów (MK) obejmuje szereg cykli endomitotycznych, które skutkują wysoce poliploidalną (sięgającą nawet >64N) i niezwykle dużą komórką (40-60 μm). W przeciwieństwie do szybko rozwijającej się wiedzy na temat megakariopoezy na poziomie biologii komórki i molekularnym, charakterystyka megakariopoezy za pomocą cytometrii przepływowej ogranicza się do identyfikacji dojrzałych MK za pomocą markerów powierzchniowych specyficznych dla linii, podczas gdy wcześniejsze etapy różnicowania MK pozostają niezbadane. W tym miejscu przedstawiamy strategię immunofenotypowania, która pozwala na identyfikację kolejnych etapów różnicowania MK, wraz z rosnącym statusem ploidalności, w ludzkich źródłach pierwotnych lub >hodowlach in vitro z panelem integrującym specyficzne i niespecyficzne markery powierzchniowe MK. Pomimo swoich rozmiarów i kruchości, MK mogą być immunofenotypowane za pomocą wyżej wymienionego panelu i wzbogacone o sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w określonych warunkach ciśnienia i średnicy dyszy. Takie podejście ułatwia badania multiomiczne, których celem jest lepsze zrozumienie złożoności megakariopoezy i produkcji płytek krwi u ludzi. Lepsza charakterystyka megakariopoezy może mieć fundamentalne znaczenie w diagnostyce lub prognozowaniu patologii związanych z linią i nowotworów złośliwych.

Szpik kostny i ploidia 
W Rysunek 4, Przedstawiamy reprezentacyjną analizę immunofenotypową megakariopoezy w próbkach szpiku kostnego (aspirat) pobranych od pacjentów. Podczas wykreślania frakcji komórkowej w funkcji CD71 i CD31, wyodrębniono sześć głównych populacji: CD31- CD71- (czerwony), CD31- CD71+ (niebieski), CD31+ CD71- (pomarańczowy), CD31+ CD71środek (jasno...

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Cześć.Nazywam się Andrea Acebes Huerta.Doktor habilitowany w Laboratorium Badań nad Płytkami Krwi w Instytucie Badań nad Zdrowiem Księstwa Asturii, ISPA. Który znajduje się w Oviedo w Hiszpanii.Cześć.Nazywam się Laura Guti

immunophenotyping-cell-sorting-human-mks-from-human-primary-sources

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Poznaj zaawansowaną strategię immunofenotypowania megakariocytów ludzkich z próbek pierwotnych i kultur in vitro. Ta metoda umożliwia identyfikację kolejnych etapów różnicowania MK oraz sortowanie FACS do badań multi-omowych.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych (Wideo) | JoVE Journal

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Przeglądaj więcej filmów