Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

W protokole przedstawiono szybką metodę identyfikacji białek bakteryjnych za pomocą indukcji antybiotyków i spektrometrii mas. Główną zaletą tej techniki jest jej szybkość i prostota. Przygotowanie próbki jest nieskomplikowane.

Technikę tę można rozszerzyć o charakterystykę wszelkich bakterii chorobotwórczych, takich jak czynniki wirulencji lub oporność na antybiotyki, aby lepiej informować o odpowiednim leczeniu infekcji bakteryjnej. Na początek użyj sterylnej pętli o pojemności jednego mikrolitra, aby zebrać bakterie z pojedynczych kolonii wyhodowanych na płycie agarowej LB. I przenieś do dwumililitrowej rurki mikrowirówki z pierścieniem O-ring zawierającej 300 mikrolitrów wody klasy HPLC.

Następnie krótko zawirować probówkę i granulować komórki przez odwirowanie, w 0,75 mikrolitra wody reliktowej próbki supernatantu na tarczy MALDI ze stali nierdzewnej i pozostawić do wyschnięcia. Na wysuszoną próbkę należy nałożyć 0,75 mikrolitra nasyconego roztworu kwasu synapinowego przygotowanego w 33% acetonitrylu, 67% wodzie i 0,2% kwasie trifluorooctowym i pozostawić plamkę do wyschnięcia. Po wysuszeniu plamki załaduj cel do spektrometru masowego.

Otwórz oprogramowanie do akwizycji i kliknij MS Linear Mode Acquisition Lub zakres masy do ładunku i masa do ładunku dolnej i górnej granicy w odpowiednich polach. Kliknij miejsce próbki, które ma zostać przeanalizowane w szablonie docelowym MALDI. Następnie naciśnij lewy przycisk myszy i przeciągnij kursor nad miejsce próbki, aby określić prostokątny obszar, który ma zostać pobrany do ablacji lub jonizacji laserowej.

Zwolnij przycisk myszy, aby rozpocząć akwizycję i zebrać 1000 strzałów laserowych dla każdego miejsca próbki. Jeśli jony nie zostaną wykryte, zwiększ intensywność lasera, regulując przesuwaną skalę pod intensywnością lasera, aż do wykrycia sygnału jonów białkowych. Po zakończeniu akwizycji w trybie liniowym MS kliknij przycisk Akwizycja w trybie MS/MS Reflectron.

Wprowadź masę prekursora, która ma zostać poddana analizie, w polu Masa prekursora. Następnie wprowadź szerokość izolacji w daltonach w oknie Masa prekursora dla strony o niskiej i dużej masie masy prekursora. Kliknij przycisk CID Off.

Następnie kliknij przycisk Metastable Suppressor On. Dostosuj intensywność lasera do co najmniej 90% jego maksymalnej wartości, regulując przesuwaną listwę podziałki, jak pokazano. Kliknij miejsce próbki do analizy na szablonie docelowym MALDI, a następnie naciśnij lewy przycisk myszy i przeciągnij kursor nad miejsce próbki, aby określić prostokątny obszar, który ma być próbkowany do ablacji lub jonizacji laserowej, zwolnij przycisk myszy, aby rozpocząć akwizycję i zbierz 10 000 strzałów laserowych dla każdego miejsca próbki, jak pokazano.

Kliknij dwukrotnie plik wykonywalny Protein Biomarker Seeker, a pojawi się okno graficznego interfejsu użytkownika. Wprowadź masę biomarkera białka w polu Masa dojrzałego białka oraz błąd pomiaru masy w polu Tolerancja masy. Opcjonalnie kliknij przycisk Bezpłatny kalkulator masy białkowej jonów b/y, aby obliczyć masę białka na podstawie przypuszczalnej komplementarnej pary jonów fragmentowych, a pojawi się wyskakujące okienko narzędzia Kalkulator masy białka.

Wprowadź stosunek masy do ładunku przypuszczalnej komplementarnej pary jonów fragmentowych, kliknij przycisk Dodaj parę, a pojawi się kalkulator masy białkowej. Skopiuj i wklej tę wartość w polu Dojrzała masa białkowa i zamknij okno narzędzia Kalkulator masy białkowej. Kliknij pole Ustaw ograniczenie pozostałości.

Wybierz długość peptydu sygnału terminala końcowego, a pojawi się wyskakujące okienko z przesuwaną skalą i kursorem, a następnie przesuń kursor na żądaną długość peptydu sygnałowego. Jeśli długość peptydu sygnału nie zostanie wybrana, oprogramowanie wykona nieograniczone obcinanie sekwencji. W warunku jonów fragmentu wybierz pozostałości do rozszczepienia szkieletu polipeptydowego, klikając pola jednej lub więcej pozostałości, DEN i / lub P.A następnie kliknij przycisk Wprowadź jony fragmentu plus jeden do wyszukiwania, a pojawi się wyskakująca strona z fragmentami.

Następnie kliknij przycisk Dodaj jon fragmentu, a pojawi się pole rozwijane dla każdego jonu fragmentu, który chcesz wprowadzić. Wprowadź stosunek masy do ładunku jonów fragmentacyjnych i związaną z nimi masę według tolerancji ładunku. Następnie kliknij przycisk Zapisz i zamknij.

W polu po prawej stronie Ile jonów fragmentacyjnych należy dopasować, przewiń, aby wybrać minimalną liczbę jonów fragmentacyjnych, które muszą być dopasowane do identyfikacji, i wybierz reszty cysteiny w stanie utlenionym. Jeśli białka nie zostaną zidentyfikowane po przeszukaniu, powtórz wyszukiwanie z cysteinami w ich zredukowanym stanie. W obszarze Ustawienia pliku kliknij ikonę Wybierz plik FAPSA, aby przeglądać i wybierać plik FASTA zawierający sekwencje białek in silico wcześniej skonstruowanego szczepu bakteryjnego.

Następnie wybierz folder wyjściowy i utwórz nazwę pliku wyjściowego. Kliknij ikonę Uruchom wyszukiwanie wpisów plików. Pojawi się wyskakujące okienko zatytułowane Potwierdź parametry wyszukiwania, wyświetlające parametry wyszukiwania przed rozpoczęciem wyszukiwania.

A jeśli parametry wyszukiwania są poprawne, kliknij Rozpocznij wyszukiwanie. Jeśli parametry są nieprawidłowe, kliknij przycisk Anuluj i ponownie wprowadź poprawne parametry. Po zainicjowaniu wyszukiwania okno parametrów zostanie zamknięte i pojawi się nowe wyskakujące okienko z paskiem postępu, pokazujące postęp wyszukiwania i bieżące podsumowanie liczby znalezionych identyfikatorów.

Po zakończeniu wyszukiwania pasek postępu zostanie automatycznie zamknięty, a podsumowanie wyszukiwania zostanie wyświetlone w polu dziennika graficznego interfejsu użytkownika wraz z nowym wyskakującym okienkiem wyświetlającym znalezione identyfikatory białek. W obecnym badaniu kultury bakterii hodowano w LB z dwoma różnymi stężeniami mytomycyny-C. Spektrum masowe kultur bakteryjnych wyhodowanych ze stężeniem mytomycyny-C.

Zidentyfikowano białko szoku zimnego C, białko szoku zimnego E oraz białko plazmidowe o nieznanej funkcji. Nieznany jon białkowy w 9780 był analizowany przez MS / MS, a jon prekursorowy został wyizolowany za pomocą okna wyboru jonów czasowych około 100 daltonów. Jon fragmentacyjny o masie do ładunku 9675.9 rozlewa się w wyniku dysocjacji metastabilnego jonu białkowego w 9655.

Sekwencja białka odporności na kolicynę E3 zawiera podstawowe pozostałości możliwych miejsc jonizacji. Jony fragmentacyjne wykryte w wyniku rozszczepienia szkieletu polipeptydowego, gdy podczas poszukiwań użyto zredukowanej formy cysteiny. N-końcowa metionina jest usuwana jako modyfikacja po translacji.

Gdy kultura bakteryjna była hodowana przy wysokim stężeniu mytomycyny-C, zidentyfikowano białko odpornościowe bakteriocyny. Nieznany pik na 9651 został przeanalizowany przez MS/MS, a jon prekursorowy został wyizolowany za pomocą węższego i asymetrycznego okna TIS wynoszącego minus 75 plus 60 daltonów. Sekwencja białka odpornościowego bakteriocyny zawiera podstawowe reszty możliwych miejsc jonizacji.

Jony fragmentacyjne wykryte w wyniku rozszczepienia szkieletu polipeptydowego, gdy podczas poszukiwań użyto zredukowanej formy cysteiny. Przy różnych stężeniach antybiotyków względna obfitość białka może się różnić. Zostały one przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas.

Podczas pobierania komórek bakteryjnych należy obserwować morfologię kolonii i wzrost bakterii w odniesieniu do antybiotyków i stężenia. Do wykrycia białek niezbędna jest pętla komórek o pojemności jednego mikrolitra.