Name: Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania nanociał hamujących transportery elektrogeniczne przy użyciu elektrofizjologii SSM. Technika ta umożliwia oznaczanie stałych hamowania IC50 bez konieczności stosowania znaczonych substratów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Cedricowi A. J. Hutterowi i Markusowi A. Seegerowi z Instytutu Mikrobiologii Medycznej Uniwersytetu w Zurychu oraz Gonzalo Cebrero z Biozentrum Uniwersytetu w Bazylei za współpracę przy tworzeniu syntetycznych nanociał (sybody). Dziękujemy Marii Barthmes i Andre Bazzone'owi z NANION Technologies za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF) (PP00P3_170607 oraz NANION Research Grant Initiative to C.P.).

<ol><li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+an+antibody+molecule%3A+structure%2C+kinetics%2C+thermodynamics%2C+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641(2017).</li>
<li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216(2020).</li>
<li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li>
<li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF%2C+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296(2017).</li>
<li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li>
<li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
<li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li>
<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
<li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li>
<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
<li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li>
<li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+nanobodies+%28VHH-based+single+variable+domains%29+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187(2015).</li>
<li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li>
<li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li>
<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiona technika klasyfikuje nanociała o właściwościach hamujących i niehamujących, ukierunkowane na transportery elektrogeniczne. Ocena transportu substratu jest możliwa dzięki wykryciu ruchu ładunków przez transporter osadzony w błonie proteoliposomów. Niektóre z krytycznych etapów podczas przygotowania eksperymentu to odtworzenie aktywnego białka w liposomach, przygotowanie stabilnych monowarstw na chipach SSM oraz przywrócenie warunków początkowych po zastosowaniu protokołu płukania w celu usunięcia związanych ...

Przeciwciała składają się z dwóch identycznych ciężkich łańcuchów i dwóch lekkich łańcuchów, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Wielbłądowate mają przeciwciała tylko o łańcuchach ciężkich, które wykazują podobne powinowactwo do pokrewnego antygenu w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami1,2. Domena pojedynczej zmiennej (VHH) przeciwciał opartych wyłącznie na łańcuchach ciężkich zachowuje pełny potencjał wiązania antygenu i wykazano, że jest bardzo stabilna1,2. Te wyizolowane cząsteczki VHH lub "nanociała" zostały wdrożone w badaniach związanych z biochemią białek błonowych jako narzędzia do stabilizacji konformacji3,4, jako inhibitory5,6, jako środki stabilizujące7, oraz jako gadżety do określania struktury8,9,10. Nanociała mogą być generowane przez immunizację wielbłądowatych w celu wstępnego wzbogacenia komórek B, które kodują nanociała specyficzne dla celu, a następnie izolację komórek B, a następnie klonowanie biblioteki nanokomórek i selekcję przez fagi display11,12,13. Alternatywny sposób generowania nanociał opiera się na metodach selekcji in vitro, które opierają się na budowie bibliotek i selekcji poprzez wyświetlanie fagów, rybosomów lub drożdży14,15,16,17,18,19,20. Te metody in vitro wymagają dużych rozmiarów bibliotek, ale korzystają z unikania immunizacji zwierząt i faworyzują wybór nanociał ukierunkowanych na białka o stosunkowo niskiej stabilności.
Mały rozmiar nanociał, ich wysoka stabilność i rozpuszczalność, silne powinowactwo antygenowe, niska immunogenność i stosunkowo łatwa produkcja, czynią je dobrymi kandydatami do rozwoju terapii21,22,23. W szczególności nanociała hamujące aktywność wielu białek błonowych są potencjalnymi zasobami do zastosowań klinicznych5,24,25,26. W przypadku transporterów błonowych, aby ocenić, czy nanonik ma aktywność hamującą, konieczne jest opracowanie testu, który pozwala na wykrycie transportowanych substratów i/lub kosubstratów. Takie testy zwykle obejmują znakowane cząsteczki lub projektowanie metod wykrywania specyficznych dla substratu, które mogą nie mieć uniwersalnego zastosowania. Ponadto identyfikacja nanociał hamujących na ogół wymaga badań przesiewowych dużej liczby substancji wiążących. W związku z tym metoda, która może być stosowana w trybie wysokiej przepustowości i która nie opiera się na oznakowanych podłożach, jest niezbędna do tego wyboru.
Elektrofizjologia oparta na SSM jest niezwykle czułą, wysoce rozdzielczą w czasie techniką, która pozwala na wykrywanie ruchu ładunków przez błony (np. wiązanie/transport jonów)27,28. Technika ta została zastosowana do scharakteryzowania transporterów elektrogenicznych, które są trudne do zbadania przy użyciu innych technik elektrofizjologicznych ze względu na stosunkowo niski obrót tych białek29,30,31,32,33,34,35. Elektrofizjologia SSM nie wymaga stosowania znakowanych substratów, nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i można stosować proteoliposomy lub pęcherzyki błonowe zawierające transporter będący przedmiotem zainteresowania. Tutaj pokazujemy, że elektrofizjologia oparta na SSM może być wykorzystana do klasyfikowania nanociał ukierunkowanych na transporter o właściwościach hamujących i niehamujących. Jako dowód słuszności zasady opisujemy rekonstytucję bakteryjnego transportera choliny w liposomach, a następnie szczegółowe kroki w celu unieruchomienia proteoliposomów na czujnikach SSM. Następnie opisujemy, jak wykonywać pomiary elektrofizjologiczne transportu choliny w oparciu o SSM oraz jak wyznaczyć połówkowe maksymalne stężenie efektywne (EC50). Następnie pokazujemy, jak wykorzystać elektrofizjologię opartą na SSM do badań przesiewowych wielu nanociał i identyfikacji inhibitorów transportu choliny. Na koniec opisano, w jaki sposób wyznaczyć połowiczne maksymalne stężenia hamujące (IC50) wybranych nanociał hamujących.

<table><tbody><tr><td>Roztwór 1-oktadekanetiolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent (kulki adsorbentu polistyrenu)</td><td>BioRad</td><td>#152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 Kolumny odsalające</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy 200 nm</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-&szlig;-D-maltozyd (DDM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr> <tr><td>(konfiguracja SSM) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>----- </td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R Chipy z pojedynczym czujnikiem N1</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Polarny ekstrakt lipidowy</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>Egg PC L-&alfa;-fosfatydylocholina </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (ssm)

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Przeciwciała jednodomenowe (nanociała) były szeroko stosowane w badaniach mechanistycznych i strukturalnych białek i mają ogromny potencjał jako narzędzia do rozwoju terapii klinicznych, z których wiele zależy od hamowania białek błonowych, takich jak transportery. Jednak większość metod stosowanych do określania zahamowania aktywności transportowej jest trudna do wykonania w procedurach o wysokiej przepustowości i zależy od dostępności oznakowanych substratów, komplikując w ten sposób badania przesiewowe dużych bibliotek nanotonów. Elektrofizjologia membranowa z solidnym nośnikiem (SSM) jest metodą wysokoprzepustową, stosowaną do charakteryzowania transporterów elektrogenicznych oraz pomiaru ich kinetyki transportu i hamowania. W tym miejscu pokazujemy implementację elektrofizjologii opartej na SSM do selekcji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczny transporter wtórny oraz do obliczania stałych hamujących nanociał. Technika ta może być szczególnie przydatna do selekcji nanociał hamujących ukierunkowanych na transportery, dla których znakowane substraty nie są dostępne.

Elektrofizjologia oparta na SSM jest szeroko stosowana do charakterystyki transporterów elektrogennych. W prezentowanym protokole pokazujemy, jak wykorzystać elektrofizjologię opartą na SSM do klasyfikacji nanociał skierowanych przeciwko transporterowi wtórnemu (w tym przypadku bakteryjnemu symporterowi choliny) na podstawie ich właściwości hamujących i niehamujących. Jedną z najużyteczniejszych cech tej techniki jest możliwość wysokoprzepustowego przesiewu wielu wariantów buforów. Ta konkretna charakterystyka jest korzy...

Nanociała są ważnymi narzędziami w biologii strukturalnej i stanowią ogromny potencjał dla rozwoju terapii. Jednak wybór nanociał o właściwościach hamujących może być wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) do klasyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczne transportery błonowe.

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Prezentowany protokół służy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i identyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na transportery elektrogenne rozpuszczone w proteoliposomach lub obecnych w pęcherzykach błonowych. Projektowanie testów transferowych może być trudne w wielu przypadkach, zwłaszcza jeśli oznakowane podłoża nie są dostępne. Jeśli ta sama elektrofizjologia pozwala na badanie wpływu nanociał na transport dla praktycznie każdego transportera elektrogenicznego, ponieważ elektrofizjologia SSM nie wymaga znakowanych substratów.Nanociała zostały przebadane pod kątem ich zastosowania w zastosowaniach medycznych. Technika ta może pomóc w badaniach przesiewowych potencjalnych inhibitorów ukierunkowanych na określone transportery elektrogenne ludzi lub ludzkie patogeny. Aby rozpocząć, weź 10 czystych probówek i przenieś 10 mililitrów nieaktywującego buforu z membraną stałą lub SSM do każdej probówki.Aby przygotować aktywujące SSM, należy dodać substrat do probówek, stosując serię stężeń wokół oczekiwanej połowy maksymalnego stężenia. Uruchom oprogramowanie SSM i poczekaj, aż komputer zostanie zainicjowany automatycznie. Ustaw ścieżkę zapisu danych.Potwierdź, naciskając przycisk OK. Wybierz standardowy protokół czyszczenia początkowego w opcjach przepływu pracy i kliknij przycisk Uruchom. Następnie zamontuj chip pokryty proteoliposomem na gnieździe.Przesuń ramię, aby zablokować chip. Dołącz zamontowany chip do nasadki. Wybierz program CapCom w przepływie pracy i pozwól mu działać, aby określić przewodność i pojemność.Upewnij się, że przewodność jest poniżej pięciu nanosiemensów, a pojemność wynosi od 15 do 35 nanofaradów przed użyciem jej do pomiaru. Przenieść roztwory aktywujące do fiolek i umieścić w próbniku sondy. Przenieś nieaktywujący się bufor do zbiornika i umieść go obok uchwytu na wióry w miejscu zbiornika po prawej stronie.Utwórz protokół dla przepływu pracy przy użyciu sekwencji nieaktywowanej, aktywującej i nieaktywującej sekwencji roztworu lub sekwencji BAB w pętli, która wykonuje trzy pomiary i przechodzi do następnego buforu aktywującego dla wszystkich 10. Użyj domyślnego natężenia przepływu 200 mikrolitrów na sekundę z jednosekundowym, jednosekundowym, jednosekundowym czasem przepływu dla sekwencji BAB i kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiar. Zapisz protokół i pozwól przepływowi pracy uruchomić, klikając przycisk odtwarzania.Następnie wykonaj ten sam eksperyment przy użyciu liposomów bezbiałkowych. Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu i użyj funkcji do szacowania wysokości piku w zakresie dodania bufora aktywującego. Wykreślić prąd szczytowy w stosunku do stężenia substratu, aby określić połowiczny maksymalny efekt stężenia lub EC50 substratu za pomocą regresji nieliniowej.Przenieść 50 mililitrów nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki. Dodać substrat cholinę do końcowego stężenia pięciu milimoli i użyć go do dodatniego pomiaru kontrolnego. Przenieś 10 mililitrów nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki.Dodaj substrat cholinę do pięciu milimoli i nanobody do końcowego stężenia 500 nanomolowych. Powtórz ten krok dla każdej osoby, aby przygotować roztwory aktywujące, jak pokazano. Uruchom maszynę SSM i zmierz pojemność i przewodność chipa pokrytego proteoliposomem, jak pokazano wcześniej.Przenieść roztwór aktywujący bez nanocząsteczki do fiolki i umieścić bufor w próbniku sondy. Przenieś nieaktywujący się bufor bez nanocząsteczki do zbiornika i umieść go w próbniku sondy. Następnie powtórz ten proces dla wszystkich roztworów zawierających nanociała z roztworem aktywującym i nieaktywującym.Utwórz protokół dla przepływu pracy Korzystanie z sekwencji BAB. Utwórz pętlę, która wykonuje trzy pomiary sekwencji BAB przy użyciu bez nanociał, dwa pomiary sekwencji BAB z zawierającymi nanociało, 120-sekundową inkubację czasu opóźnienia z nanociałem oraz trzy pomiary sekwencji BAB z zawierającymi nanociało. Zapisz przepływ pracy i pozwól mu działać, klikając przycisk odtwarzania.Następnie utwórz nowy protokół przepływu pracy przy użyciu sekwencji BAB i pętli pięciu pomiarów, aby wypłukać odwracalnie związane nanociało. Zapisz przepływ pracy i pozwól mu działać, klikając przycisk odtwarzania. Porównaj ostatni prąd szczytowy z pomiarów z początkowym pomiarem samego substratu.Jeśli prąd szczytowy osiągnie wartość początkową, nanoprąd został pomyślnie wypłukany i warunki początkowe zostały przywrócone. W przeciwnym razie powtórz przepływ pracy lub zmień układ na nowy. Powtórz ten proces, używając indywidualnych chipów dla każdego ekranu nanocząsteczkowego lub powtórz z wieloma nanociałami przy użyciu tego samego chipa.Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu. Następnie oprogramowanie automatycznie dobiera funkcję do szacowania wysokości piku w zakresie dodawania bufora aktywacyjnego. Znormalizuj prąd szczytowy i obecność nanocząsteczki na podstawie postępującego pomiaru samego substratu.Wykreśl prądy szczytowe na histogramie i porównaj prądy szczytowe z pomiarów samych substratów z prądami szczytowymi zmierzonymi w obecności nanociał, aby zidentyfikować nanociała hamujące. Przenieść 50 mililitrów nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki i dodać substrat cholinę do końcowego stężenia pięciu milimoli i użyć go jako roztworu aktywującego do kontroli pozytywnej. Dodać pięć mililitrów roztworu nieaktywującego do ośmiu czystych probówek, a następnie dodać do probówek substrat cholinę i nanobody hamujący w stężeniach w oczekiwanym zakresie IC50.Dodać 10 mililitrów roztworu nieaktywującego do ośmiu probówek i dodać nanobody hamujący do każdej probówki odpowiadającej buforowi nieaktywowanemu. Rozpocznij konfigurację SSM i zmierz pojemność i przewodność chipa pokrytego proteoliposomem. Przenieść roztwór aktywujący bez nanocząsteczki do fiolki i umieścić go w próbniku z sondą.Następnie przenieś nieaktywujący się bufor bez nanobody do zbiornika i umieść go w miejscu zbiornika obok uchwytu na chipy po prawej stronie. Przenieść aktywujące i nieaktywujące roztwory zawierające nanociała do fiolek i umieścić w próbniku sondy. Utwórz protokół dla przepływu pracy przy użyciu sekwencji BAB.Dołącz pętlę, aby dwukrotnie zmierzyć każde stężenie, inkubować przez 120 sekund i zmierzyć jeszcze trzy razy. Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu i wybrać funkcję szacowania wysokości piku w zakresie dodawania bufora aktywacji. Wykreśl prądy szczytowe w stosunku do stężenia nanonu, aby wyznaczyć IC50 za pomocą regresji nieliniowej.W celu określenia stężenia substratu, który ma być użyty podczas badań przesiewowych nanociał, zmierzono transport elektrogeniczny przy różnych stężeniach substratów w celu wyznaczenia EC50. Stężenie substratu odpowiadające warunkom nasycenia, pięciomilimolowe, zostało wybrane i utrzymane na stałym poziomie we wszystkich aktywujących. Wpływ nanociał hamujących na transport elektrogeniczny został uwidoczniony na podstawie spadku amplitud prądów szczytowych.Po uruchomieniu protokołu prania, aby umożliwić odłączenie nano, zaobserwowano odzyskanie od 80 do 95% początkowej szczytowej amplitudy prądu. Podczas zmiany warunków z nieaktywujących na aktywujące, nanociała obecne w tych nie wprowadzały żadnych znaczących prądów artefaktów. Po wytypowaniu nanociał o właściwościach hamujących wyznaczono wartości IC50 dla poszczególnych nanociał.Bardzo ważne jest, aby dać wystarczająco dużo czasu na kalibrację proteoliposomów na chipie z buforem zawierającym nanociało. Ponieważ wiązanie jest odwracalne, nanocząsteczka musi być obecna zarówno w aktywujących, jak i nieaktywujących.

selection-transporter-targeted-inhibitory-nanobodies-solid-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj prezentujemy metodę elektrofizjologiczną opartą na solidnych membranach z naciskiem na jej zastosowania do charakterystyki elektrogenicznych transporterów membranowych.

Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele.  W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Wsteczny transport białek z powierzchni komórki do Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony. W tym miejscu opisujemy metodę biochemicznej analizy transportu białek rekombinowanych z powierzchni komórki do Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał w komórkach HeLa.

Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Opisujemy metodę przygotowania pojedynczych, świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego, stosując dwuetapową procedurę enzymatyczną. Uzyskane żywotne komórki DSM można badać za pomocą różnych technik jednokomórkowych, w tym opisanej elektrofizjologii amfoterycyny-B patch-clamp, w celu ujawnienia właściwości fizjologicznych i farmakologicznych.

Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania nanociał hamujących transportery elektrogeniczne przy użyciu elektrofizjologii SSM. Technika ta umożliwia oznaczanie stałych hamowania IC50 bez konieczności stosowania znaczonych substratów.

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) (Wideo) | JoVE Journal

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

Przeglądaj więcej filmów