Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

Prezentowany protokół służy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i identyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na transportery elektrogenne rozpuszczone w proteoliposomach lub obecnych w pęcherzykach błonowych. Projektowanie testów transferowych może być trudne w wielu przypadkach, zwłaszcza jeśli oznakowane podłoża nie są dostępne. Jeśli ta sama elektrofizjologia pozwala na badanie wpływu nanociał na transport dla praktycznie każdego transportera elektrogenicznego, ponieważ elektrofizjologia SSM nie wymaga znakowanych substratów.

Nanociała zostały przebadane pod kątem ich zastosowania w zastosowaniach medycznych. Technika ta może pomóc w badaniach przesiewowych potencjalnych inhibitorów ukierunkowanych na określone transportery elektrogenne ludzi lub ludzkie patogeny. Aby rozpocząć, weź 10 czystych probówek i przenieś 10 mililitrów nieaktywującego buforu z membraną stałą lub SSM do każdej probówki.

Aby przygotować aktywujące SSM, należy dodać substrat do probówek, stosując serię stężeń wokół oczekiwanej połowy maksymalnego stężenia. Uruchom oprogramowanie SSM i poczekaj, aż komputer zostanie zainicjowany automatycznie. Ustaw ścieżkę zapisu danych.

Potwierdź, naciskając przycisk OK. Wybierz standardowy protokół czyszczenia początkowego w opcjach przepływu pracy i kliknij przycisk Uruchom. Następnie zamontuj chip pokryty proteoliposomem na gnieździe.

Przesuń ramię, aby zablokować chip. Dołącz zamontowany chip do nasadki. Wybierz program CapCom w przepływie pracy i pozwól mu działać, aby określić przewodność i pojemność.

Upewnij się, że przewodność jest poniżej pięciu nanosiemensów, a pojemność wynosi od 15 do 35 nanofaradów przed użyciem jej do pomiaru. Przenieść roztwory aktywujące do fiolek i umieścić w próbniku sondy. Przenieś nieaktywujący się bufor do zbiornika i umieść go obok uchwytu na wióry w miejscu zbiornika po prawej stronie.

Utwórz protokół dla przepływu pracy przy użyciu sekwencji nieaktywowanej, aktywującej i nieaktywującej sekwencji roztworu lub sekwencji BAB w pętli, która wykonuje trzy pomiary i przechodzi do następnego buforu aktywującego dla wszystkich 10. Użyj domyślnego natężenia przepływu 200 mikrolitrów na sekundę z jednosekundowym, jednosekundowym, jednosekundowym czasem przepływu dla sekwencji BAB i kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiar. Zapisz protokół i pozwól przepływowi pracy uruchomić, klikając przycisk odtwarzania.

Następnie wykonaj ten sam eksperyment przy użyciu liposomów bezbiałkowych. Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu i użyj funkcji do szacowania wysokości piku w zakresie dodania bufora aktywującego. Wykreślić prąd szczytowy w stosunku do stężenia substratu, aby określić połowiczny maksymalny efekt stężenia lub EC50 substratu za pomocą regresji nieliniowej.

Przenieść 50 mililitrów nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki. Dodać substrat cholinę do końcowego stężenia pięciu milimoli i użyć go do dodatniego pomiaru kontrolnego. Przenieś 10 mililitrów nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki.

Dodaj substrat cholinę do pięciu milimoli i nanobody do końcowego stężenia 500 nanomolowych. Powtórz ten krok dla każdej osoby, aby przygotować roztwory aktywujące, jak pokazano. Uruchom maszynę SSM i zmierz pojemność i przewodność chipa pokrytego proteoliposomem, jak pokazano wcześniej.

Przenieść roztwór aktywujący bez nanocząsteczki do fiolki i umieścić bufor w próbniku sondy. Przenieś nieaktywujący się bufor bez nanocząsteczki do zbiornika i umieść go w próbniku sondy. Następnie powtórz ten proces dla wszystkich roztworów zawierających nanociała z roztworem aktywującym i nieaktywującym.

Utwórz protokół dla przepływu pracy Korzystanie z sekwencji BAB. Utwórz pętlę, która wykonuje trzy pomiary sekwencji BAB przy użyciu bez nanociał, dwa pomiary sekwencji BAB z zawierającymi nanociało, 120-sekundową inkubację czasu opóźnienia z nanociałem oraz trzy pomiary sekwencji BAB z zawierającymi nanociało. Zapisz przepływ pracy i pozwól mu działać, klikając przycisk odtwarzania.

Następnie utwórz nowy protokół przepływu pracy przy użyciu sekwencji BAB i pętli pięciu pomiarów, aby wypłukać odwracalnie związane nanociało. Zapisz przepływ pracy i pozwól mu działać, klikając przycisk odtwarzania. Porównaj ostatni prąd szczytowy z pomiarów z początkowym pomiarem samego substratu.

Jeśli prąd szczytowy osiągnie wartość początkową, nanoprąd został pomyślnie wypłukany i warunki początkowe zostały przywrócone. W przeciwnym razie powtórz przepływ pracy lub zmień układ na nowy. Powtórz ten proces, używając indywidualnych chipów dla każdego ekranu nanocząsteczkowego lub powtórz z wieloma nanociałami przy użyciu tego samego chipa.

Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu. Następnie oprogramowanie automatycznie dobiera funkcję do szacowania wysokości piku w zakresie dodawania bufora aktywacyjnego. Znormalizuj prąd szczytowy i obecność nanocząsteczki na podstawie postępującego pomiaru samego substratu.

Wykreśl prądy szczytowe na histogramie i porównaj prądy szczytowe z pomiarów samych substratów z prądami szczytowymi zmierzonymi w obecności nanociał, aby zidentyfikować nanociała hamujące. Przenieść 50 mililitrów nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki i dodać substrat cholinę do końcowego stężenia pięciu milimoli i użyć go jako roztworu aktywującego do kontroli pozytywnej. Dodać pięć mililitrów roztworu nieaktywującego do ośmiu czystych probówek, a następnie dodać do probówek substrat cholinę i nanobody hamujący w stężeniach w oczekiwanym zakresie IC50.

Dodać 10 mililitrów roztworu nieaktywującego do ośmiu probówek i dodać nanobody hamujący do każdej probówki odpowiadającej buforowi nieaktywowanemu. Rozpocznij konfigurację SSM i zmierz pojemność i przewodność chipa pokrytego proteoliposomem. Przenieść roztwór aktywujący bez nanocząsteczki do fiolki i umieścić go w próbniku z sondą.

Następnie przenieś nieaktywujący się bufor bez nanobody do zbiornika i umieść go w miejscu zbiornika obok uchwytu na chipy po prawej stronie. Przenieść aktywujące i nieaktywujące roztwory zawierające nanociała do fiolek i umieścić w próbniku sondy. Utwórz protokół dla przepływu pracy przy użyciu sekwencji BAB.

Dołącz pętlę, aby dwukrotnie zmierzyć każde stężenie, inkubować przez 120 sekund i zmierzyć jeszcze trzy razy. Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu i wybrać funkcję szacowania wysokości piku w zakresie dodawania bufora aktywacji. Wykreśl prądy szczytowe w stosunku do stężenia nanonu, aby wyznaczyć IC50 za pomocą regresji nieliniowej.

W celu określenia stężenia substratu, który ma być użyty podczas badań przesiewowych nanociał, zmierzono transport elektrogeniczny przy różnych stężeniach substratów w celu wyznaczenia EC50. Stężenie substratu odpowiadające warunkom nasycenia, pięciomilimolowe, zostało wybrane i utrzymane na stałym poziomie we wszystkich aktywujących. Wpływ nanociał hamujących na transport elektrogeniczny został uwidoczniony na podstawie spadku amplitud prądów szczytowych.

Po uruchomieniu protokołu prania, aby umożliwić odłączenie nano, zaobserwowano odzyskanie od 80 do 95% początkowej szczytowej amplitudy prądu. Podczas zmiany warunków z nieaktywujących na aktywujące, nanociała obecne w tych nie wprowadzały żadnych znaczących prądów artefaktów. Po wytypowaniu nanociał o właściwościach hamujących wyznaczono wartości IC50 dla poszczególnych nanociał.

Bardzo ważne jest, aby dać wystarczająco dużo czasu na kalibrację proteoliposomów na chipie z buforem zawierającym nanociało. Ponieważ wiązanie jest odwracalne, nanocząsteczka musi być obecna zarówno w aktywujących, jak i nieaktywujących.