Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Protokół ten pomaga zidentyfikować mutacje, które występują podczas naprawy pęknięcia podwójnej nici indukowanego przez jednoprowadnicowy RNA i CAS9. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to opłacalny i niezawodny sposób wykrywania mutacji w określonym locus genomowym. Jako przykładu używamy ludzkich keratynocytów, ale ten protokół można dostosować do dowolnych transfekowalnych linii komórkowych.

Protokół ten zademonstruje Taylor Bugbee, asystent licencjacki z naszego laboratorium. Na początek hoduj komórki HFK LXSN i HFK 8E6 na 10-centymetrowych płytkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w inkubatorze płaszczowym zawierającym pożywki do hodowli keratynocytów z ludzkim suplementem wzrostu keratynocytów i 1% streptomycyną penicyliny. Zastąp pożywkę hodowlaną trzema mililitrami trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Następnie zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki uzupełnionej FBS. Teraz przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przy 300 razy G przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 mililitrów pożywki hodowlanej keratynocytów z ludzkim suplementem wzrostu keratynocytów i określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru.

Następnie wysiewaj dwie płytki dla komórek HFK LXSN i HFK 8E6 w czterech mililitrach pożywki hodowlanej keratynocytów z ludzkim suplementem wzrostu keratynocytów i 1% streptomycyną penicyliny. Po wysianiu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w inkubatorze z płaszczem. W dniu transfekcji zastąp pożywkę trzema mililitrami pożywki uzupełnionej bez antybiotyków i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z płaszczem.

Aby transfekować komórki, podgrzej odczynniki do transfekcji do temperatury pokojowej i delikatnie je odpipetuj przed użyciem. Umieść odpowiednią ilość buforu do transfekcji w dwóch sterylnych 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych dla każdej linii komórkowej i oznacz je jako probówkę pierwszą i pozorowaną transfekcję lub probówkę drugą. Następnie dodaj dwa mikrogramy ludzkiego CD4 CD4 z ekspresją plazmidowego DNA, CAS9, z pojedynczym przewodnikiem, ukierunkowanym na RNA do pierwszej probówki i delikatnie pipetować, aby całkowicie wymieszać.

Dodać równą objętość sterylnej wody do probówki drugiej. Dodać odpowiednią ilość odczynnika do transfekcji do probówki pierwszej z mieszaniną DNA i do probówki pozorowanej lub probówki drugiej. Za pomocą pipety delikatnie wymieszaj je całkowicie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut, aby utworzyć kompleksy.

Dodaj mieszaninę do transfekcji kroplami na płytkę i delikatnie potrząsaj płytką hodowlaną przez jedną minutę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę do transfekcji. Aby zebrać komórki przez trypsynizację, zastąp pożywkę hodowlaną jednym mililitrem trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki uzupełnionej FBS.

Dla każdej płytki komórkowej przenieść zawiesinę komórkową do dwóch probówek mikrowirówek o równych porcjach i odwirować w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy z jednej probówki w jednym mililitrze PBS do sekwencjonowania, a w drugiej probówce z lodowatym PBS do immunoblotu. Test immunoblot przeprowadzono w celu porównania ekspresji CAS9 w nietransfekowanych i transektowanych komórkach HFK.

Wyniki pokazują, że nietransfekowane i transektowane komórki HFK wyrażały podobną ilość CAS9, co wskazuje, że skuteczność transfekcji jest podobna między dwiema liniami komórkowymi. Uzyskano obrazy mikroskopii immunofluorescencyjnej fosforylowanego histonu H2AX S139 w komórkach transfekowanych SgRNA/CAS9 i kontroli nietransfekowanej. Wyniki wskazały, że dwa pęknięcia dwuniciowe zostały wywołane przez CAS9 SgRNA.

Wariacje genomowe pogrupowano według typów zdarzeń mutacyjnych w HFK LXSN i HFK 8E6, gdzie każda grupa wariacji genomowych i całkowita liczba zmian zostały porównane między HFK LXSN i HFK 8E6. Wyniki wykazały, że 8E6 zwiększa zmienność genomu w granicach 200 kilozasad wokół indukowanych przez CAS9 pęknięć dwuniciowych, co wskazuje, że HPV 8E6 dereguluje naprawę pęknięć dwuniciowych i zwiększa niestabilność genomu. Celem immunoblot jest pomiar wydajności transfekcji, która powinna być brana pod uwagę podczas analizy danych.

Oprócz skuteczności transfekcji, mikroskopia immunofluorescencyjna może być wykorzystana do potwierdzenia indukcji pękania dwuniciowego przy użyciu fosfo-H2AX jako markera. Jako przykładu używamy beta HPV 8E6. Technika ta może być stosowana do wykrywania zmian w częstotliwości lub typie mutacji spowodowanych przez inne odczynniki, takie jak inhibitory małocząsteczkowe.