Aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (CDAP)

Polisacharydy są słabo immunogenne, chyba że są połączone z białkiem i muszą być aktywowane w celu derywatyzacji lub koniugacji z białkami. W tej metodzie CDAP jest używany jako odczynnik do załadunku piasku. CDAP aktywuje hydroksyle polisacharydowe do derywatyzacji lub do połączenia z białkami do stosowania w szczepionkach lub odczynnikach diagnostycznych.

CDAP w dużej mierze zastąpił bromek cyjanu jako polisacharydowy odczynnik do załadunku piasku. CDAP jest prostszy w użyciu, bardziej wydajny i może być stosowany przy niższym pH niż bromek cyjanu. Jest to znacznie lepszy odczynnik aktywujący.

CDAP może być stosowany z większością polisacharydów, w przeciwieństwie do np. aminacji redukcyjnej, która wymaga hydroksyli vicinal. Chemia może być używana zarówno do bezpośredniego, jak i pośredniego sprzężenia z białkami i może być używana do wytwarzania odczynników diagnostycznych. Reakcja aktywacji CDAP, zgodnie z pierwotnym opisem, była bardzo szybka i trudna do kontrolowania.

Dostarczony tutaj protokół sprawia, że chemia jest znacznie łatwiejsza do wykonania i znacznie bardziej powtarzalna. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy dostosować pH roztworu polisacharydów do 9, dodając 200 mikrolitrów roztworu podstawowego dimetyloaminopirydyny kroplami, mieszając. Przechowywać reakcję schłodzoną w lodowatej łaźni wodnej przez cały proces aktywacji.

Kontynuować aktywację cyjano-dimetyloamirydyno-tetrafluoroboranu lub CDAP, przenosząc 100 mikrolitrów CDAP do roztworu polisacharydów, mieszając. Uruchom timer i monitoruj zmianę pH podczas całej aktywacji przez 15 minut. Utrzymuj reakcję na docelowym pH, niezwłocznie dodając 10 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu.

Po osiągnięciu optymalnego czasu aktywacji dodaj jednocześnie dwa mililitry 0,5 molowego dihydrazydu adypinowego do aktywowanego polisacharydu. Sprawdź, czy pH mieści się w wymaganym zakresie do funkcjonalizacji wodorotlenków. Po ciągłym mieszaniu mieszaniny reakcyjnej przez co najmniej jedną godzinę, przenieść mieszaninę reakcyjną do czterech stopni Celsjusza.

Aby zmniejszyć stężenie ADH w produkcie, należy dializować surowy derywatyzowany roztwór polisacharydów za pomocą urządzenia do dializy. Odzyskać derywatyzowany polisacharyd z dializy i określić stężenie polisacharydów i hydrazydu, aby obliczyć stosunek hydrazydu do polisacharydu. Przygotować jeden miligram na mililitr niemodyfikowanego roztworu polisacharydów, który ma być stosowany jako wzorzec.

Rozgrzej blok grzewczy do 140 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby uzyskać stabilną, jednolitą temperaturę. Użyj podkładki ochronnej pod spodem i wokół bloku grzewczego na wypadek rozlania kwasu. Dodaj różne objętości jednego miligrama na mililitr wzorca węglowodanów do oznaczonych trzech razy probówek borokrzemianowych o wymiarach 13 na 100 i uzupełnij objętość do 100 mikrolitrów wodą, aby osiągnąć pożądane standardowe stężenia.

Podobnie należy skonfigurować testy próbek, dodając objętość zawierającą pięć mikrogramów derywatyzowanego polisacharydu do trzech probówek z próbkami. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanych sześciu miligramów na mililitr rezorcyny do każdej probówki. Używając powtarzalnego pipetera, dodaj 300 mikrolitrów przygotowanego 75% kwasu siarkowego do każdej probówki, energicznie wiruj rurki, kierując rurkę na zewnątrz, a następnie umieść wszystkie probówki w bloku grzejnym w stałym tempie w kolejności sekwencyjnej i natychmiast ustaw minutnik na trzy minuty.

Po trzech minutach wyjmij rurki w tej samej kolejności i umieść je bezpośrednio na stojaku w lodowatej kąpieli wodnej. Wyjmij lodowate rurki, aby umożliwić im wyrównanie do temperatury pokojowej przez pięć minut. Odczytaj absorbancję wszystkich probówek na spektrofotometrze UV-Vis przy 430 nanometrach przy użyciu kuwety o długości ścieżki 10 milimetrów.

Aby skonfigurować reakcje testowe, posortuj i ułóż oznakowane probówki wzorcowe w stojaku na probówki w kolejności rosnącego stężenia. Za pomocą skalibrowanej mikropipety dodaj 100 mikrolitrów wzorców do każdej odpowiedniej probówki. Dla wzorca zerowego należy użyć 100 mikrolitrów buforu próbki.

Podobnie przygotuj i ułóż probówki z próbkami. Następnie za pomocą skalibrowanej mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj 875 mikrolitrów buforu testowego do wszystkich probówek. Aby rozpocząć reakcję testową, dodaj 25 mikrolitrów 1% kwasu trinitrobenzenosulfonowego do każdej probówki testowej w ustalonej kolejności w ciągu pięciu minut.

Wiruj probówki testowe przez dwie sekundy z dużą prędkością, upewniając się, że ciecz wiruje na wysokość pół cala od otworu probówki. Zapisz czas rozpoczęcia testu i ustaw timer na dwie godziny. Następnie umieść stojak na probówki testowe w ciemności w temperaturze pokojowej na dwie godziny.

Gdy czas się skończy, przekręć rurki i przystąp do zbierania danych. Dekstran ADH oznaczano na obecność dekstranu za pomocą testu kwasu siarkowego rezorcyny. Wykreślono typową rurkę wzorcową wykorzystującą glukozę jako wzorzec cukru.

Zawartość hydrazydu w derywatyzowanym polisacharydzie lub dekstranie oznaczono za pomocą testu TNBS. Poziom derywatyzacji obliczono w postaci wodorków na 100 kilodaltonów dekstranu, aby ułatwić porównanie polimerów o różnych średnich masach cząsteczkowych. Opisany tutaj protokół może wymagać dostosowania do określonego polisacharydu.

Chemia CDAP może być stosowana do funkcjonalizacji polisacharydów do stosowania z szeroką gamą odczynników koniugacyjnych. Może być stosowany na przykład do biotynylowania polisacharydów do stosowania w testach ELISA. Białka mogą być bezpośrednio połączone z polisacharydami aktywowanymi przez CDAP, ale zwykle wymaga to pewnej optymalizacji dla określonego polisacharydu.

Wydajność koniugacji może wynosić ponad 75%Zastosowanie chemii CDAP umożliwiło opracowanie tanich szczepionek skoniugowanych, takich jak te wyprodukowane na przykład przez Serum Institute of India.