Name: Aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (CDAP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę aktywacji polisacharydów za pomocą CDAP do produkcji szczepionek i odczynników diagnostycznych. Ten protokół zapewnia kontrolowaną cyjanację z wydajnością koniugacji przekraczającą 75%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisana tutaj praca została sfinansowana przez Fina Biosolutions LLC.

<ol><li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEllis%2C+RW+%22Development+and+clinical+uses+of+Haemophilus+B+conjugate+vaccines%22">Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines</a>. , CRC Press. (1994).</li>
<li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li>
<li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+independent+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Conjugate+Vaccines%22">Conjugate Vaccines</a>. Cruse, J. M., Lewis, R. E. 10, Karger. Basel. (1989).</li>
<li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li>
<li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+%28CDAP%29+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li>
<li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization%2C+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li>
<li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+%28CDAP%29+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777(2020).</li>
<li>Qi, X. -Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+determination+of+hydrazine%2C+hydrazides%2C+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li>
<li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li>
<li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+G+%22Bioconjugate+Techniques.+3rd+ed%22">Bioconjugate Techniques. 3rd ed</a>. , Academic Press. (2013).</li>
</ol>

Andrew Lees jest założycielem i właścicielem Fina Biosolutions. Posiada kilka patentów związanych z chemią CDAP i korzysta z licencjonowania know-how w zakresie chemii i koniugacji CDAP.

CDAP jest wygodnym odczynnikiem do derywatyzacji i koniugacji polisacharydów. W tym artykule opisano ogólną metodę wykorzystania CDAP do wyprowadzania polisacharydów z hydrazydami (PS-ADH) i uwzględniono ostatnio opublikowane ulepszenia8. Po pierwsze, technika ta podkreśla znaczenie utrzymania docelowego pH w celu kontrolowania procesu aktywacji. Odkryliśmy, że podczas gdy wiele popularnych zakłóca reakcję aktywacji CDAP, DMAP może być z powodzeniem stosowany jako bufor do zarządzania pH8. Co więcej, DMAP jest już produktem ubocznym reakcji aktywacji CDAP. Wreszcie, buforowanie roztworu polisacharydowego za pomocą DMAP przed dodaniem CDAP ułatwia precyzyjne ukierunkowanie i utrzymanie pH reakcji. Jak opisujemy, przydatne jest dostosowanie pH stężonego roztworu podstawowego DMAP w taki sposób, aby po rozcieńczeniu osiągnął docelowe pH. Po drugie, przeprowadzenie procesu na zimno spowolniło czas reakcji, dzięki czemu proces aktywacji był mniej szalony i bardziej wyrozumiały. Niższa temperatura zmniejszyła szybkość hydrolizy CDAP, a optymalny czas aktywacji przy pH 9 wzrasta z ~3 min do ~15 min. Ponadto do osiągnięcia tego samego poziomu aktywacji potrzeba mniej CDAP niż w przypadku wykonywania w temperaturze pokojowej. 
Polisacharydy derywatyzowane ADH mogą być sprzężone z białkami za pomocą karbodimidów (np. EDAC)7. Na przykład kilka licencjonowanych szczepionek przeciwko Haemophilus influenzae b (Hib) wykorzystuje polirybozylorybicytolfosforan (PRP) derywatyzowany z ADH do koniugacji z toksoidem tężcowym za pomocą EDAC. Początkowo stosowano CNBr, ale CDAP jest znacznie łatwiejszym odczynnikiem do wykorzystania w tym celu. Z naszego doświadczenia wynika, że dobry zakres docelowy dla derywatyzacji ADH to 10-30 hydrazydów na 100 kDa polisacharydu lub ~1-3% ADH wagowo. 
Ten sam proces można zastosować do pochodnej polisacharydów aminami pierwszorzędowymi poprzez zastąpienie ADH diaminą. Zaleca się stosowanie heksanodiaminy do pochodnej polisacharydów z aminami8. Aminowany polisacharyd (PS-NH2) może być sprzężony przy użyciu odczynników opracowanych do koniugacji białek11. Zazwyczaj PS-NH2 jest derywatyzowany maleimidem (np. 4-[N-maleimidometylo]cykloheksano-1-karboksylan sukcynimidylu (SMCC) lub ester N-γ-maleimidobutyryl-oksysukcynimidu (GMBS)), a białko jest tiolowane (np. 3-(2-pirydyloditionio)propionianem sukcynimidylu (SPDP)). Chemia tiolowo-maleimidowa jest bardzo wydajna.
Białka mogą być również bezpośrednio sprzężone z polisacharydami aktywowanymi przez CDAP za pośrednictwem ɛ-aminy na lizynach. Chociaż zastosowany protokół aktywacji jest ogólnie podobny do opisanego tutaj, konieczne jest zoptymalizowanie poziomu aktywacji, stężenia polisacharydów i białka, a także stosunku białka do polisacharydu 5,6,8.
Dekstran jest jednym z najłatwiejszych do aktywacji polisacharydów za pomocą CDAP ze względu na stosunkowo dużą gęstość grup hydroksylowych, ale niektóre polisacharydy, takie jak antygen Vi, mogą stanowić wyzwanie. W związku z tym nie ma jednego "najlepszego" protokołu dla koniugacji CDAP bezpośrednio z białkami. Sugerujemy najpierw opracowanie protokołu w celu osiągnięcia odpowiednich poziomów aktywacji, określonych na podstawie zakresu derywatyzacji hydrazydu, a następnie przystąpienie do bezpośredniego sprzężenia białek z polisacharydem aktywowanym CDAP.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Hydrazide standard curve, resorcinol assay graphs, tabulated data for glucose and dextran analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Resorcinol/sulfuric acid assay graph and table; hydrazide TNBS standard; data comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Szczepionki skoniugowane, takie jak te składające się z polisacharydów kowalencyjnie połączonych z białkiem nośnikowym, należą do niezwykłych osiągnięć w wakcynologii1,2. Polisacharydy, jako antygeny niezależne od limfocytów T, są słabo immunogenne u niemowląt i nie wywołują pamięci, zmiany klas ani dojrzewania powinowactwa przeciwciał3. Niedociągnięcia te zostały przezwyciężone w skoniugowanych szczepionkach polisacharydowych4. Ponieważ większość polisacharydów nie ma wygodnego uchwytu chemicznego do koniugacji, muszą one najpierw stać się reaktywne lub "aktywowane". Aktywowany polisacharyd jest następnie łączony bezpośrednio z białkiem (lub białkiem zmodyfikowanym) lub jest funkcjonalizowany w celu dodatkowej derywatyzacji przed koniugacją4. Większość licencjonowanych skoniugowanych szczepionek polisacharydowych wykorzystuje aminację redukcyjną lub cyjanilację do aktywacji hydroksylów polisacharydowych. Bromek cyjanu (CNBr), odczynnik, który wcześniej był używany do aktywacji żywic chromatograficznych, był początkowo używany do derywatyzacji polisacharydów. Jednak CNBr wymaga wysokiego pH, zwykle ~ pH 10,5 lub wyższego, aby częściowo zdeprotonować hydroksyli polisacharydów, tak aby były wystarczająco nukleofilowe, aby zaatakować grupę cyjano. Wysokie pH może być szkodliwe dla labilnych polisacharydów, a ani CNBr, ani początkowo utworzony aktywny ester cyjanowy nie są wystarczająco stabilne przy tak wysokim pH.
CDAP (tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny; <silna klasa="xfig">Rysunek 1) został wprowadzony przez Lees et al. do stosowania jako środek cyjanylujący do aktywacji polisacharydów5,6. Stwierdzono, że CDAP, który jest krystaliczny i łatwy w obsłudze, aktywuje polisacharydy przy niższym pH niż CNBr i przy mniejszej liczbie reakcji ubocznych. W przeciwieństwie do CNBr, polisacharydy aktywowane CDAP mogą być bezpośrednio sprzężone z białkami, co upraszcza proces syntezy. Polisacharydy aktywowane CDAP mogą być funkcjonalizowane diaminą (np. Heksanodiaminą) lub dihydrazydem (np. dihydrazydem adypinowym, ADH) w celu wytworzenia polisacharydów pochodnych amino- lub hydrazydów. Wysokie stężenie odczynnika homobifunkcyjnego służy do tłumienia sieciowania polisacharydów. Polisacharydy aminowe mogą być następnie sprzężone przy użyciu dowolnej z niezliczonych technik stosowanych do koniugacji białek. Polisacharydy derywatyzowane hydrazydem są często sprzężone z białkami za pomocą odczynnika karbodimidowego (np. 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDAC))7. Dalsza optymalizacja aktywacji polisacharydów CDAP została opisana przez Lees et al.8 i jest włączona do opisanego tutaj protokołu.
Przegląd koniugacji CDAP 
Protokół CDAP można skonceptualizować jako dwie fazy: (1) aktywacja polisacharydu i (2) koniugacja aktywowanego polisacharydu z białkiem lub ligandem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Celem pierwszego kroku jest skuteczna aktywacja polisacharydu, podczas gdy celem drugiego jest efektywna koniugacja z aktywowanym polisacharydem. Aktywowany polisacharyd łączy ze sobą te dwa etapy. Ta konceptualizacja pomaga skupić się na krytycznych elementach każdego kroku. Rysunek 2 rozwija tę konceptualizację, pokazując pożądane reakcje aktywacji i sprzężenia, wraz z reakcjami hydrolizy i reakcjami ubocznymi.
Podczas fazy aktywacji, trzy główne problemy to stabilność CDAP, reakcja CDAP z hydroksylami polisacharydowymi oraz stabilność aktywowanego polisacharydu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Hydroliza CDAP wzrasta wraz z pH, podobnie jak hydroliza aktywowanego polisacharydu i reakcje uboczne. Jednak reakcja CDAP z polisacharydem jest ułatwiona przez zwiększenie pH. Skuteczna aktywacja polisacharydów za pomocą CDAP wymaga równowagi między 1) reaktywnością polisacharydu i CDAP oraz 2) hydrolizą i reakcjami ubocznymi zarówno odczynnika, jak i aktywowanego polisacharydu.
W oryginalnym protokole aktywacji CDAP opisanym przez Lees et al.5, aktywacja polisacharydów CDAP została przeprowadzona w temperaturze pokojowej w niebuforowanym roztworze pH 9. Stwierdzono, że szybkość aktywacji była szybka w tych warunkach, a aktywacja byłaby zakończona w ciągu 3 minut. Reakcjom towarzyszyła również szybka hydroliza CDAP, powodująca gwałtowny spadek pH niebuforowanego roztworu reakcyjnego. Wyzwaniem było szybkie podniesienie i utrzymanie pH reakcji na docelowym poziomie w tak krótkim czasie. W opisanym protokole aktywację przeprowadzono poprzez dodanie CDAP z roztworu podstawowego o stężeniu 100 mg/ml do niebuforowanego roztworu polisacharydowego. pH zostało podniesione 30 s później przy "równej objętości 0,2 M trietyloaminy". Białko, które miało być sprzężone, dodawano następnie po 2,5 minuty do reakcji aktywacji. Warto zauważyć, że pH etapu aktywacji nie było dobrze kontrolowane i najprawdopodobniej początkowo przekroczyło docelowe pH. Szybka reakcja, wymagająca natychmiastowej regulacji pH, sprawiła, że proces aktywacji był trudny do kontrolowania i trudny do skalowania.
W przeciwieństwie do oryginalnego protokołu, opisany tutaj zmodyfikowany protokół ma dwie główne ulepszenia. Po pierwsze, pH roztworu polisacharydowego jest wstępnie dostosowywane do docelowego pH aktywacji, przy użyciu DMAP jako bufora, przed dodaniem CDAP. DMAP ma pKa 9,5, a zatem ma dobrą moc buforową wokół pH 9, a w przeciwieństwie do wielu innych, nie stwierdzono, aby DMAP promował hydrolizę CDAP8. Co więcej, DMAP jest już produktem pośrednim procesu i dlatego nie dodaje nowego składnika do mieszaniny reakcyjnej. Wstępna regulacja pH przed dodaniem CDAP eliminuje duże wahania pH na początku reakcji i pozwala na bardziej efektywne utrzymanie docelowego pH podczas reakcji. Drugą poprawą jest przeprowadzenie reakcji aktywacji w temperaturze 0 °C, gdzie szybkość hydrolizy CDAP jest znacznie wolniejsza niż w temperaturze pokojowej. Dzięki dłuższemu okresowi półtrwania odczynnika w temperaturze 0 °C, czas aktywacji wydłuża się z 3 minut do 15 minut, aby zrekompensować wolniejszą szybkość aktywacji w niższej temperaturze. Dłuższy czas reakcji z kolei ułatwia utrzymanie pH reakcji. Zastosowanie temperatury 0 °C spowalnia również degradację polisacharydów wrażliwych na pH, umożliwiając przygotowanie koniugatów tego typu polisacharydów. Ulepszenia w protokole sprawiają, że proces aktywacji jest mniej szalony, łatwiejszy do kontrolowania, bardziej powtarzalny i bardziej podatny na skalowanie.
Ten artykuł opisuje ulepszony protokół przeprowadzania kontrolowanej aktywacji polisacharydów CDAP w temperaturze 0 °C i przy określonym docelowym pH oraz przeprowadzania późniejszej derywatyzacji aktywowanych polisacharydów za pomocą ADH. Opisano również test kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS), oparty na metodzie Qi et al.9, do oznaczania poziomu hydrazydu na zmodyfikowanym polisacharydzie. Opisano również zmodyfikowany test dla heksoz na bazie rezorcyny i kwasu siarkowego10, który może być stosowany do oznaczania szerszego zakresu polisacharydów. Więcej informacji na temat aktywacji i koniugacji CDAP można znaleźć we wcześniejszych publikacjach5,6,8 autorstwa Lees et al.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrazyd kwasu adypinowego</td><td>Sigma</td><td>A0638</td><td>MW 174</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td><td>Milipore</td><td>UFC901008</td><td>MW granica może wynosić 30 kDa dla 200 kDa PS</td></tr><tr><td>Waga</td><td></td><td></td><td></td>analityczna</tr><tr><td>Autotitrator lub elektroniczna zlewka</td><td></td><td></td><td></td>do pipetowania</tr><tr><td>&nbsp; 2-4 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDAP</td><td>SAFC</td><td>RES1458C</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>107700</td><td>MW 122.2</td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td>płatkowy</tr><tr><td>HCl 1 M</td><td>VWR</td><td>BDH7202-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikromieszadło</td><td>VWR</td><td>76001-878</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do mikrofuge (do CDAP)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td></td><td></td>BDH9286</tr><tr><td>NaOH 1 M</td><td>Sigma</td><td>1099130001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 10 M</td><td>Miernik pH Sigma</td><td>SX0607N-6</td><td></td></tr><tr><td>Sonda pH</td><td>Cole Parmer</td><td>55510-22</td><td>6 mm x 110 mm Epoksydowa</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonda</td><td></td><td></td><td></td>temperatury pH</tr> z pojedynczym złączem <tr><td>Pipety i końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna lub PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mała zlewka 5-20 ml</td><td>VWR</td><td>10754-696</td><td>Zlewka 10 ml zapewnia miejsce na sondę pH i pipetę</td></tr><tr><td>Małe wiaderko</td><td></td><td></td><td></td>na lód</tr><tr><td>Mała szpatułka Płytka</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>mieszająca</td></tr><tr><td><mocny>Test rezorcyny</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówka Combitip</td><td>Eppendorf</td><td>10 ml</td><td></td></tr><tr><td>DI rurka</td> do dializy wody <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Repligen</td><td>132650T</td><td>Spectra/Por 6-8kDa</td></tr><tr><td>Klipsy do przewodów dializacyjnych</td><td>Repligen</td><td>142150</td><td></td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td><td></td>grzewczy</tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repeat pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>M4</td><td></td></tr><tr><td>Rezorcynol</td><td>Sigma</td><td>398047</td><td></td></tr><tr><td>Cukier standard</td><td></td><td>W stosownych przypadkach</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kwas siarkowy 75%</td><td>VWR</td><td>BT126355-1L</td><td></td></tr><tr><td>Test czasowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adipinowy dihydrazyd</td><td>Sigma</td><td>A0638</td><td>MW 174</td></tr><tr><td>Probówki borokrzemianowe 12 x 75</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>Boran sodu, 0,5 M pH 9</td><td>Boston Biologicals</td><td>BB-160</td><td></td></tr><tr><td>TNBS 5% z V/V</td><td>Sigma</td><td>P2297</td><td>MW 293.17</td></tr></tbody></table>

aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (cdap)

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Szczepionki skoniugowane są niezwykłym postępem w wakcynologii. W celu przygotowania skoniugowanych szczepionek polisacharydowych polisacharydy mogą być wygodnie funkcjonalizowane i łączone z białkami nośnikowymi szczepionki za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), łatwego w obsłudze odczynnika cyjanulowego. CDAP aktywuje polisacharydy w reakcji z grupami hydroksylowymi węglowodanów o pH 7-9. Stabilność i reaktywność CDAP są w dużym stopniu zależne od pH. pH reakcji zmniejsza się również podczas aktywacji z powodu hydrolizy CDAP, co sprawia, że dobra kontrola pH jest kluczem do powtarzalnej aktywacji. Oryginalny protokół aktywacji CDAP przeprowadzono w temperaturze pokojowej w niebuforowanych roztworach o pH 9.
Ze względu na szybką reakcję w tym stanie (<3 min) i towarzyszący jej szybki spadek pH spowodowany szybką hydrolizą CDAP, wyzwaniem było szybkie dostosowanie i utrzymanie docelowego pH reakcji w krótkim czasie. Opisany tutaj ulepszony protokół jest wykonywany w temperaturze 0 °C, co spowalnia hydrolizę CDAP i wydłuża czas aktywacji z 3 min do ~15 min. Dimetyloaminopirydyna (DMAP) była również używana jako bufor do wstępnego dostosowania roztworu polisacharydów do docelowego pH aktywacji przed dodaniem odczynnika CDAP. Dłuższy czas reakcji, w połączeniu z wolniejszą hydrolizą CDAP i zastosowaniem buforu DMAP, ułatwia utrzymanie pH aktywacji przez cały czas trwania procesu aktywacji. Ulepszony protokół sprawia, że proces aktywacji jest mniej szalony, bardziej powtarzalny i bardziej podatny na skalowanie.

Aby zilustrować aktywację i derywatyzację polisacharydu z wykorzystaniem chemii CDAP, przeprowadzono aktywację dekstranu przy zastosowaniu 0,25 i 0,5 mg CDAP/mg dekstranu. Dla każdej reakcji roztwór dekstranu o stężeniu 10 mg/ml w wodzie schłodzono na lodzie, a następnie 1/10th dodano objętość 2,5 M roztworu zapasowego DMAP (przygotowanego zgodnie z opisem w sekcji 3). pH końcowego roztworu doprowadzono do wartości 9 poprzez dodanie 0,1 M NaOH w 10 µL alikwoty. Roztwór schłodzono i mieszano, dodając CDAP, a pH utrzymywano na poziomie 9 poprzez dodawanie 10 µL alikwoty 0,1 M NaOH przez 15 min. Dodano jedynie 0,25 ml 0,5 M ADH o pH 9 (mniej niż zwykle), a reakcję pozostawiono na noc w 4 °C.
Oznaczony dekstran poddano następnie sekwencyjnej dializie przeciwko 1 M NaCl, 0.15 M NaCl oraz wodzie, zgodnie z opisem w sekcji 6. Następnie w próbce ADH-dekstranu oznaczono zawartość dekstranu za pomocą testu z rezorcynolem i kwasem siarkowym (sekcja 7.2). Typową krzywą wzorcową z użyciem glukozy jako standardu cukru przedstawiono na Rysunku 4A. Zawartość hydrazydów określono za pomocą testu TNBS opisanego w sekcji 7.3. Typową krzywą wzorcową dla hydrazydów z użyciem ADH jako standardu przedstawiono na Rysunku 4B.
Reprezentatywne obliczenia z aktywacji dekstranu przy dwóch poziomach aktywacji przedstawiono na Rysunku 4A,B. Dane przedstawiono zarówno jako liczbę hydrazydów na 100 kDa polimeru dekstranu, jak i jako procent wagowy ADH względem dekstranu, zgodnie z opisem w sekcjach 7.9.3.4 i 7.9.3.5 odpowiednio, na Rysunku 4C. Stopień pochodnowania wzrósł niemal dwukrotnie po dwukrotnym zwiększeniu stosunku CDAP.
<img alt="Schemat struktury chemicznej [Chemical Name]; związek organiczny, jon, obecność grupy metylowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Struktura chemiczna CDAP. CDAP = tetrafluoroboran 1-cyano-4-dimetylaminopirydyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat reakcji aktywacji polisacharydu z użyciem CDAP, DMAP, izomorecznika; metoda sieciowania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Proces aktywacji CDAP i konjugacji. Proces ten jest koncepcyjnie podzielony na dwie fazy, przy czym w obu występuje aktywowany polisacharyd. W warunkach zasadowych CDAP aktywuje grupy hydroksylowe polisacharydu, uwalniając DMAP (reakcja 1). Hydroliza CDAP również uwalnia DMAP (reakcja 3). Choć przedstawiono cyjanoester, może on nie być rzeczywistym produktem pośrednim. Produkt pośredni określany jest zatem jako „aktywowany” (CDAP) polisacharyd. Podczas pierwszej fazy aktywacji aktywowany polisacharyd może ulec hydrolizie (reakcja 4) lub reakcjom ubocznym (reakcja 5). W drugiej fazie konjugacji (reakcja 2), aktywowany polisacharyd reaguje z aminą, tworząc stabilną wiązana izomorecznikową, oprócz reakcji 4 i 5. Skróty: CDAP = tetrafluoroboran 1-cyjanu-4-dimetyloaminopirydyny; DMAP = 4-dimetyloaminopirydyna; R-NH2 = amina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat aktywacji CDAP; wpływ pH na równowagę między stabilnością a reaktywnością w polisacharydach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Aktywacja i koniugacja CDAP. Proces ten wymaga zrównoważenia reaktywności CDAP względem polisacharydu, stabilności CDAP i aktywowanego polisacharydu, a także reaktywności aktywowanego polisacharydu względem aminy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy kwasem siarkowym z rezorcynolem, wykres standardu hydrazydy dla TNBS oraz tabele danych dla glukozy/dekstranu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki aktywacji dekstranu za pomocą CDAP.Typowe krzywe wzorcowe dla analiz (A) rezorcynol/kwas siarkowy oraz (B) TNBS. Przedstawiono wyniki analiz dla dekstranu aktywowanego przy użyciu 0,25 oraz 0,5 mg CDAP/mg dekstranu. Jako standard w analizie z rezorcynolem zastosowano glukozę. Wartość dekstranu w mg/mL podzielono przez 100 kDa, aby uzyskać stężenie molowe. Stężenie hydrazydy określono, stosując ADH jako standard, a wyniki wyrażono w µM Hz. (C) Obliczenie stosunku hydrazydy do dekstranu. Stopień derywatyzacji obliczono jako liczbę grup hydrazydowych na 100 kDa dekstranu, aby ułatwić porównanie polimerów o różnych średnich masach cząsteczkowych. Procentowy stosunek wagowy g ADH/g dekstranu obliczono, przyjmując masę cząsteczkową ADH równą 174 g/mole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Białka i ligandy zawierające aminy mogą być kowalencyjnie połączone z polisacharydami aktywowanymi przez odczynnik cyjanelacyjny, tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), tworząc kowalencyjne koniugaty białkowe (ligand)-polisacharydy. W artykule opisano ulepszony protokół przeprowadzania kontrolowanej aktywacji CDAP w temperaturze 0 °C i zmiennym pH oraz przeprowadzania późniejszej koniugacji aktywowanych polisacharydów.

Aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polisacharydy są słabo immunogenne, chyba że są połączone z białkiem i muszą być aktywowane w celu derywatyzacji lub koniugacji z białkami. W tej metodzie CDAP jest używany jako odczynnik do załadunku piasku. CDAP aktywuje hydroksyle polisacharydowe do derywatyzacji lub do połączenia z białkami do stosowania w szczepionkach lub odczynnikach diagnostycznych.CDAP w dużej mierze zastąpił bromek cyjanu jako polisacharydowy odczynnik do załadunku piasku. CDAP jest prostszy w użyciu, bardziej wydajny i może być stosowany przy niższym pH niż bromek cyjanu. Jest to znacznie lepszy odczynnik aktywujący.CDAP może być stosowany z większością polisacharydów, w przeciwieństwie do np. aminacji redukcyjnej, która wymaga hydroksyli vicinal. Chemia może być używana zarówno do bezpośredniego, jak i pośredniego sprzężenia z białkami i może być używana do wytwarzania odczynników diagnostycznych. Reakcja aktywacji CDAP, zgodnie z pierwotnym opisem, była bardzo szybka i trudna do kontrolowania.Dostarczony tutaj protokół sprawia, że chemia jest znacznie łatwiejsza do wykonania i znacznie bardziej powtarzalna. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy dostosować pH roztworu polisacharydów do 9, dodając 200 mikrolitrów roztworu podstawowego dimetyloaminopirydyny kroplami, mieszając. Przechowywać reakcję schłodzoną w lodowatej łaźni wodnej przez cały proces aktywacji.Kontynuować aktywację cyjano-dimetyloamirydyno-tetrafluoroboranu lub CDAP, przenosząc 100 mikrolitrów CDAP do roztworu polisacharydów, mieszając. Uruchom timer i monitoruj zmianę pH podczas całej aktywacji przez 15 minut. Utrzymuj reakcję na docelowym pH, niezwłocznie dodając 10 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu.Po osiągnięciu optymalnego czasu aktywacji dodaj jednocześnie dwa mililitry 0,5 molowego dihydrazydu adypinowego do aktywowanego polisacharydu. Sprawdź, czy pH mieści się w wymaganym zakresie do funkcjonalizacji wodorotlenków. Po ciągłym mieszaniu mieszaniny reakcyjnej przez co najmniej jedną godzinę, przenieść mieszaninę reakcyjną do czterech stopni Celsjusza.Aby zmniejszyć stężenie ADH w produkcie, należy dializować surowy derywatyzowany roztwór polisacharydów za pomocą urządzenia do dializy. Odzyskać derywatyzowany polisacharyd z dializy i określić stężenie polisacharydów i hydrazydu, aby obliczyć stosunek hydrazydu do polisacharydu. Przygotować jeden miligram na mililitr niemodyfikowanego roztworu polisacharydów, który ma być stosowany jako wzorzec.Rozgrzej blok grzewczy do 140 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby uzyskać stabilną, jednolitą temperaturę. Użyj podkładki ochronnej pod spodem i wokół bloku grzewczego na wypadek rozlania kwasu. Dodaj różne objętości jednego miligrama na mililitr wzorca węglowodanów do oznaczonych trzech razy probówek borokrzemianowych o wymiarach 13 na 100 i uzupełnij objętość do 100 mikrolitrów wodą, aby osiągnąć pożądane standardowe stężenia.Podobnie należy skonfigurować testy próbek, dodając objętość zawierającą pięć mikrogramów derywatyzowanego polisacharydu do trzech probówek z próbkami. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanych sześciu miligramów na mililitr rezorcyny do każdej probówki. Używając powtarzalnego pipetera, dodaj 300 mikrolitrów przygotowanego 75% kwasu siarkowego do każdej probówki, energicznie wiruj rurki, kierując rurkę na zewnątrz, a następnie umieść wszystkie probówki w bloku grzejnym w stałym tempie w kolejności sekwencyjnej i natychmiast ustaw minutnik na trzy minuty.Po trzech minutach wyjmij rurki w tej samej kolejności i umieść je bezpośrednio na stojaku w lodowatej kąpieli wodnej. Wyjmij lodowate rurki, aby umożliwić im wyrównanie do temperatury pokojowej przez pięć minut. Odczytaj absorbancję wszystkich probówek na spektrofotometrze UV-Vis przy 430 nanometrach przy użyciu kuwety o długości ścieżki 10 milimetrów.Aby skonfigurować reakcje testowe, posortuj i ułóż oznakowane probówki wzorcowe w stojaku na probówki w kolejności rosnącego stężenia. Za pomocą skalibrowanej mikropipety dodaj 100 mikrolitrów wzorców do każdej odpowiedniej probówki. Dla wzorca zerowego należy użyć 100 mikrolitrów buforu próbki.Podobnie przygotuj i ułóż probówki z próbkami. Następnie za pomocą skalibrowanej mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj 875 mikrolitrów buforu testowego do wszystkich probówek. Aby rozpocząć reakcję testową, dodaj 25 mikrolitrów 1% kwasu trinitrobenzenosulfonowego do każdej probówki testowej w ustalonej kolejności w ciągu pięciu minut.Wiruj probówki testowe przez dwie sekundy z dużą prędkością, upewniając się, że ciecz wiruje na wysokość pół cala od otworu probówki. Zapisz czas rozpoczęcia testu i ustaw timer na dwie godziny. Następnie umieść stojak na probówki testowe w ciemności w temperaturze pokojowej na dwie godziny.Gdy czas się skończy, przekręć rurki i przystąp do zbierania danych. Dekstran ADH oznaczano na obecność dekstranu za pomocą testu kwasu siarkowego rezorcyny. Wykreślono typową rurkę wzorcową wykorzystującą glukozę jako wzorzec cukru.Zawartość hydrazydu w derywatyzowanym polisacharydzie lub dekstranie oznaczono za pomocą testu TNBS. Poziom derywatyzacji obliczono w postaci wodorków na 100 kilodaltonów dekstranu, aby ułatwić porównanie polimerów o różnych średnich masach cząsteczkowych. Opisany tutaj protokół może wymagać dostosowania do określonego polisacharydu.Chemia CDAP może być stosowana do funkcjonalizacji polisacharydów do stosowania z szeroką gamą odczynników koniugacyjnych. Może być stosowany na przykład do biotynylowania polisacharydów do stosowania w testach ELISA. Białka mogą być bezpośrednio połączone z polisacharydami aktywowanymi przez CDAP, ale zwykle wymaga to pewnej optymalizacji dla określonego polisacharydu.Wydajność koniugacji może wynosić ponad 75%Zastosowanie chemii CDAP umożliwiło opracowanie tanich szczepionek skoniugowanych, takich jak te wyprodukowane na przykład przez Serum Institute of India.

activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Synteza asymetrycznych gatunków ferrocenu jest wyzwaniem przy użyciu technik rozwiązań.  Niniejszy raport koncentruje się na metodach przeprowadzonych w celu wytworzenia biokoniugatu ferrocen-biotyna przy użyciu łatwych i czystych reakcji przeprowadzanych w drodze syntezy w fazie stałej.  Wykazano, że włączenie ugrupowania tiolanowego nadaje zdolność do unieruchamiania na powierzchniach złota.

Metodologia syntezy asymetrycznych układów biosprzężonych pochodzących z ferrocenu za pomocą metodologii opartej na żywicy w fazie stałej

Wykazano wydajną, trzyetapową syntezę fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie RAFT, składającą się z przygotowania glikomonomeru, kopolimeryzacji i późniejszej modyfikacji. Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania statystycznych glikopolimerów na bazie tratwy o pożądanych strukturach.

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Tutaj prezentujemy protokół do przygotowania i wizualizacji struktur drugorzędnych (np. włókien, architektur toroidalnych i nanosfer) pochodzących z polikarmidów spiralnych. Wykazano, że morfologia charakteryzująca się zarówno mikroskopią sił atomowych (AFM), jak i skaningową mikroskopią elektronową (SEM) zależy od struktury molekularnej, stężenia i wybranego rozpuszczalnika.

Samoorganizujące się morfologie otrzymane z helikalnych kopolimerów polikarbodimidu i ich pochodnych triazolowych

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Ester 2-azydo-1-azotanu może zostać przekształcony w odpowiadający mu 2-azydo-1-trichloroacetimidian w procedurze jednoetapowej. Celem pracy jest wykazanie przydatności reaktora mikrofalowego w syntezie węglowodanów.

Jednodomowa konwersja anomerycznych estrów azotanów do trichloroacetimidianów w jednym garnku wspomagana mikrofalami

Tutaj prezentujemy procedurę fluorescencyjnej funkcjonalizacji dwusiarczków na Qβ VLP za pomocą dibromomaleimidu. Opisujemy ekspresję i oczyszczanie Qβ, syntezę cząsteczek funkcjonalizowanych dibromomaleimidem oraz reakcję koniugacji między dibromomaleimidem a Qβ. Powstała w ten sposób żółta fluorescencyjna sprzężona cząstka może być używana jako sonda fluorescencyjna wewnątrz komórek.

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Tutaj prezentujemy protokoły syntezy nukleozydów disacharydowych metodą regioselektywnej O-glikozylacji rybonukleozydów poprzez tymczasową ochronę ich ugrupowań 2',3'-diolu za pomocą cyklicznego estru boronowego. Metoda ta ma zastosowanie do kilku niezabezpieczonych nukleozydów, takich jak adenozyna, guanozyna, cytydyna, urydyna, 5-metylurydyna i 5-fluorourydyna, aby uzyskać odpowiednie nukleozydy disacharydowe.

Regioselektywna O-glikozylacja nukleozydów poprzez tymczasową ochronę 2',3'-diolem przez ester boronowy do syntezy nukleozydów disacharydowych

Ten protokół pokazuje, jak używać oprogramowania Auto-CHO do hierarchicznej i programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów. Opisano w nim również ogólną procedurę eksperymentów z oznaczaniem RRV i jednogarnkową glikozylacją SSEA-4.

Hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów

Opracowanie dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) jest nowatorskie dla eliminacji szkodliwych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół syntezy cząsteczki DCAF1, która może selektywnie blokować przeciwciało 4G2 w celu wyeliminowania efektu wzmocnienia zależnego od przeciwciał podczas infekcji wirusem dengi.

Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF)

W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)

Poznaj metodę aktywacji polisacharydów za pomocą CDAP do produkcji szczepionek i odczynników diagnostycznych. Ten protokół zapewnia kontrolowaną cyjanację z wydajnością koniugacji przekraczającą 75%.

Aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (CDAP)

Przeglądaj więcej filmów