Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Opisana w niniejszym protokole budowa dwuwarstwowych błon lipidowych może być wykorzystana do uzyskania kluczowych informacji na temat interakcji błony z czynnikami farmaceutycznymi, toksynami środowiskowymi, a nawet związkami biologicznymi. Techniki te mogą być stosowane do wytwarzania membran o różnej złożoności cieczy oraz do oceny przepuszczalności, absorpcji i osadzania związków w membranach. Na początek dodaj odpowiednią objętość roztworu podstawowego lipidów do czystego szklanego podłogi, aby osiągnąć końcowe stężenie pęcherzyków 2,5 miligrama na mililitr po ponownym uwodnieniu.

Usunąć chloroform z roztworu lipidowego za pomocą strumienia gazowego azotu. Aby zapewnić całkowite usunięcie chloroformu, należy podłączyć wysuszony film lipidowy do próżni na co najmniej cztery godziny. Ponownie uwodnić wysuszony film lipidowy wymaganą objętością buforu chlorku sodu Tris, aby uzyskać końcowe stężenie pęcherzyków 2,5 miligrama na mililitr i wirować przez około 15 do 30 sekund.

Przenieść zawiesinę pęcherzyków do pojemnika z suchym lodem do momentu zamrożenia na około 30 minut. Po całkowitym zamrożeniu próbki zawiesinę rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze od 30 do 40 stopni Celsjusza. Odwiruj rozmrożoną zawiesinę pęcherzyków.

Aby zrobić jeden mililitr lub mniej pęcherzyków, zaopatrz się w mini wytłaczarkę. Wstępnie zwilż wspornik filtra ultra czystą wodą, a następnie umieść go na powierzchni nośnej membrany wewnątrz O-ringu. Powtórz tę czynność dla drugiego wewnętrznego wspornika membrany.

Umieść jeden wewnętrzny wspornik membrany w zewnętrznej obudowie wytłaczarki. Umieść jedną membranę poliwęglanową o grubości 100 nanometrów na wewnętrznym wsporniku membrany bezpośrednio nad wspornikiem filtra. Umieść drugi wewnętrzny wspornik membrany w zewnętrznej obudowie ekstrudera tak, aby O-ring i strona wspornika filtra były skierowane w stronę membrany poliwęglanowej.

Przymocuj łożysko z politetrafluoroetylenu do węzła ustalającego i przykręć je do zewnętrznej obudowy ekstrudera. Wpiąć ekstruder w blok grzewczy. Załaduj zawiesinę pęcherzyków lipidowych do jednej ze strzykawek i umieść strzykawkę w bloku grzewczym ekstrudera, całkowicie wkładając igłę do jednego końca wytłaczarki.

Włożyć drugą pustą strzykawkę po przeciwnej stronie i zablokować obie strzykawki za pomocą zacisków na ramieniu bloku grzewczego. Powoli wepchnąć zawiesinę pęcherzyków do pustej strzykawki, a następnie z powrotem do oryginalnej strzykawki. Powtórz jeszcze 20 razy, w sumie 21 przejść przez membranę poliwęglanową.

Przenieś pęcherzyki lipidowe do czystego szkła w celu przechowywania. Aby wytłoczyć od pięciu do 50 mililitrów pęcherzyków, zmontuj dużą wytłaczarkę, umieszczając wspornik sita z dużym otworem, wyśrodkowaną tarczę, tarcze odpływowe i membranę poliwęglanową w przestrzeni w dolnym wsporniku wytłaczarki. Połącz górne i dolne wsporniki ekstrudera za pomocą czterech i dokręć.

Przymocuj ekstruder do cylindra próbki, szorując go do dna i dokręcając kluczem w celu zabezpieczenia. Napełnij cylinder próbki ultraczystą wodą i wytłacz wodę przez wytłaczarkę przed dodaniem próbki do cylindra z próbką. Dodaj zawiesinę pęcherzyków lipidowych do cylindra z próbką i zakręć górną część.

Powoli zwiększaj ciśnienie, aż próbka zacznie kapać z wytłaczarki z szybkością około dwóch do trzech kropli na sekundę do czystego szkła. Po wytłoczeniu całej próbki wyłącz dopływ azotu i zwolnij ciśnienie w cylindrze z próbką, powoli otwierając zawór bezpieczeństwa. Wlej pęcherzyki lipidowe z powrotem do cylindra z próbką i powtórz poprzedni krok jeszcze dziewięć razy, co daje w sumie 10 wytłoczeń.

Załaduj zawiesinę pęcherzyków do odpowiedniej kuwety i włóż do przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła, wprowadź szczegóły próbki i wykonaj pomiar za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Umieść celę zeta w komorze na próbkę, upewniając się, że elektrody się stykają, i zamknij pokrywę uchwytu próbki. W powiązanym oprogramowaniu wprowadź szczegóły próbki i zbierz pomiary.

Włóż czujnik kwarcowy oznaczony krzemionką do modułu przepływu, upewniając się, że kształt litery T na krysztale jest wyrównany z kształtem litery T na module i przykręć moduł przepływu. W instrumentach z wieloma komorami można równolegle formować dodatkowe dwuwarstwy. Podłącz rurkę wlotową i wylotową do modułu przepływowego i pompy.

Umieść rurkę w osłonach przytrzymujących i zamknij pokrywę systemu analizatora. Umieść pojemnik na odpady na wylocie pompy, aby zebrać zużyte roztwory. Aby wykonać czyszczenie, najpierw włącz pompę i ustaw prędkość przepływu na 400 mikrolitrów na minutę.

Włóż rurkę wlotową do ultra czystej wody i przepuść od pięciu do 10 mililitrów przez moduł. Zamień rurkę na SDS i przepuść od pięciu do 10 mililitrów przez moduł. Zamień rurkę z powrotem na ultra czystą wodę i przepuść od 10 do 20 mililitrów przez moduł.

Na koniec przepuść powietrze przez moduł, aż nie zostanie zebrany żaden pozostały roztwór. Wyjmij czujnik z modułu przepływu i przepłucz czujnik ultra czystą wodą. Napędzaj czujnik i moduł przepływu strumieniem azotu gazowego, upewniając się, że elektroda zawsze pozostaje wolna od jakichkolwiek cieczy.

W dygestorium chemicznym włóż czujnik kwarcowy pokryty krzemionką do przyrządu do czyszczenia ultrafioletem lub ozonem. Włącz instrument i pozwól na leczenie przez co najmniej dwie minuty. Ostrożnie wyjmij czujniki i włóż je z powrotem do modułu przepływowego.

Włącz analizator, aby podłączyć powiązane oprogramowanie i ustawić temperaturę na żądaną wartość w celu utworzenia podporowej dwuwarstwy lipidowej. Poczekaj, aż temperatura ustabilizuje się do żądanego wejścia. Skonfiguruj pomiar i znajdź wszystkie częstotliwości rezonansowe czujnika oraz rozproszenie dla alikwotów trzech, pięciu, siedmiu, dziewięciu, 11 i 13 przed rozpoczęciem pomiaru.

Pozwól, aby chlorek sodu Tris przepływał przez moduł przez pięć do 10 minut, upewniając się, że zmiana częstotliwości podstawowej lub Delta F i zmiana rozpraszania lub wartości Delta D w cieczy pozostają stabilne. Zatrzymać pompę, wyjąć rurkę wlotową z roztworu chlorku sodu Tris i ostrożnie włożyć ją do roztworu pęcherzyków lipidowych. Przepływ wsteczny przez pięć sekund, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z rurki dolotowej, a następnie kontynuuj przepływ do przodu.

Uruchom ponownie pomiar w oprogramowaniu, aby wyzerować linię bazową. Przepływaj pęcherzyki lipidowe do momentu powstania dwuwarstw w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu do akwizycji danych. Następnie powtórz ten krok, aby zmienić rurkę wlotową z pęcherzyków lipidowych z powrotem na bufor chlorku sodu Tris.

Dodaj pięć mikrolitrów roztworu lipidowego do komory dawcy, która jest porowatą, 96-dołkową wielositową płytką filtracyjną z polifluorku winylidenu o wielkości porów 0,45 mikrometra. Natychmiast zanurz płytkę filtracyjną w komorze akceptora, która jest transportową płytką odbiorczą zawierającą 300 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Dodać 200 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do komory donora transportowego.

Postępuj zgodnie z poprzednimi krokami zatrzymywania pompy i zmiany rurki wlotowej na roztwór pęcherzyków lipidowych i obserwowania tworzenia się dwuwarstw, a następnie zmień rurkę wlotową na roztwór peptydu alfa helisowego lub AH. Wprowadzaj roztwór do modułu przepływowego, aż zaobserwuje się zmianę częstotliwości i zmianę rozpraszania po dodaniu nowego roztworu. Zatrzymać pompę i pozwolić peptydowi AH inkubować się z pęcherzykami przez 10 minut.

Zamień rurkę wlotową na chlorek sodu Tris i rozpocznij przepływ, aby usunąć peptyd AH z pękniętych pęcherzyków, co prowadzi do pomyślnego utworzenia dwuwarstwy lipidowej. Najpierw przelej cząsteczkę rozpuszczalnika, a następnie zamień rurkę wlotową do roztworu zawierającego cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania i przepływaj przez co najmniej pięć minut. W razie potrzeby zatrzymaj przepływ i pozwól, aby ciecz zawierająca pożądaną cząsteczkę inkubowała się z dwuwarstwą.

Wymień rurkę wlotową z powrotem na sam rozpuszczalnik cząsteczkowy. Przepływaj przez co najmniej pięć minut, a następnie zmień rurkę doprowadzającą na chlorek sodu Tris i przepływaj przez co najmniej pięć minut. W oprogramowaniu zatrzymaj pomiar, zapisz file i zatrzymaj pompę.

Bezpośrednio po poprzednich krokach dla dwuwarstwy zawieszonej jednolipidowej lub dwuwarstwy zawieszonej wielolipidowo, usuń PBS z komory płytki filtra donorowego i zastąp 200 mikrolitrami roztworu testowego. Natychmiast zanurz w nowej transportowej płycie odbiorczej z 300 mikrolitrami PBS. Po inkubacji z delikatnym kołysaniem przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza należy pobrać 150 mikrolitrów roztworu z komory dawcy i akceptora.

Zmierzyć stężenie cząsteczki w obu próbkach przy użyciu odpowiedniej metody opartej na właściwościach tej cząsteczki. Porównano wielkość, polidyspersyjność i potencjał Zeta jednolipidowych pęcherzyków PC jaj oraz dwóch kompozycji pęcherzyków wielolipidowych. Rozkład wielkości pęcherzyków PC jaja i pęcherzyków wielolipidowych był prawie identyczny.

Zarówno pęcherzyki wielolipidowe jaja, jak i PC były naładowane ujemnie, podczas gdy dwa pęcherzyki wielolipidowe były naładowane dodatnio. Jednolipidowe pęcherzyki PC jaj łatwo wchłaniają się na powierzchnię, o czym świadczy spadek zmiany częstotliwości i wzrost zmiany rozpraszania, po której następuje spontaniczne pęknięcie. Pęcherzyki wielolipidowe wchłaniają się na powierzchnię, ale wymagają dodania peptydu AH do pęknięcia pęcherzyków, co powoduje utworzenie dwuwarstwy lipidowej.

Dzięki obsługiwanym dwuwarstwom lipidowym zmiana częstotliwości i zmiana rozpraszania mogą być analizowane przed i po wprowadzeniu interesującego związku. Na przykład badano interakcje DEHP i toksyny środowiskowej z podpartymi uni i wielowarstwowymi warstwami. Podobne poziomy wchłaniania DEHP zaobserwowano dla obu typów dwuwarstw lipidowych.

Zaobserwowano jednak różnice w zmianie dyssypacji między dwuwarstwami, przy czym większą zmianę rozpraszania zaobserwowano dla dwuwarstwy PC jaja w porównaniu z dwuwarstwą wielolipidową. Niewielką przenikalność zaobserwowano zarówno dla jedno-, jak i wielolipidowych dwuwarstw jednoosobowych. W wyniku tej procedury można opracować różne dwuwarstwy lipidowe naśladujące komórki, aby umożliwić bezkomórkowe badania przesiewowe interakcji molekularnych ze związkami od farmaceutyków po toksyny środowiskowe.