Name: Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Poznaj metodę tworzenia dwuwarstwowych modeli lipidowych do badania oddziaływań z lekami i toksykantami środowiskowymi. Protokół umożliwia ocenę przenikania oraz wbudowywania związków w błony komórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr 1942418 przyznanego A.S., oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship przyznanego C.M.B.H., w ramach grantu nr 1644760. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation. Autorzy dziękują dr Noelowi Vera-Gonzálezowi za zebranie danych charakterystyki pęcherzyków lipidowych. Autorzy dziękują profesorowi Robertowi Painowi (Brown University) za użycie jego Zetasizera. Autorzy dziękują Ośrodkowi Spektrometrii Mas Uniwersytetu Browna, a w szczególności dr Tun-Li Shenowi za pomoc w ilościowym określeniu składu lipidów.

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów ani konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten pozwala na tworzenie pęcherzyków lipidowych, podpartych dwuwarstw lipidowych i zawieszonych dwuwarstw lipidowych. Tutaj przedstawiono krytyczne kroki tworzące każdą z tych struktur. Podczas tworzenia pęcherzyków lipidowych ważne jest, aby wytłaczać lipid powyżej temperatury przejścia39. Gdy lipid jest poniżej temperatury przejścia, jest fizycznie obecny w uporządkowanej fazieżelu 39. W tej uporządkowanej fazie ogony lipidowe węglowodorów są w pełni rozciągnięte...

Błona komórkowa, składająca się głównie z fosfolipidów, cholesterolu i białek, jest kluczowym składnikiem wszystkich żywych komórek1. Dzięki organizacji opartej na amfifilowości lipidów, błona komórkowa działa jako bariera ochronna i reguluje sposób, w jaki komórka wchodzi w interakcje z otaczającym ją środowiskiem2. Kilka procesów komórkowych jest zależnych od składu lipidów i białek błony1,2. Na przykład interakcje błony komórkowej są ważne dla skutecznego dostarczania leków3. Farmaceutyki, produkty biologiczne, nanomateriały, toksyny biologiczne i toksyny środowiskowe mogą wpływać na integralność błony komórkowej, wpływając w ten sposób na funkcję komórki4. Budowa in vitro modeli błon naśladujących komórki w oparciu o skład lipidowy błon komórkowych może dostarczyć łatwych narzędzi, które znacznie usprawnią badania potencjalnego wpływu tych materiałów na komórki.
Model dwuwarstw lipidowych obejmuje pęcherzyki lipidowe, wspierane dwuwarstwy lipidowe i zawieszone dwuwarstwy lipidowe. Dwuwarstwy lipidowe są modelem fosfolipidowej błony komórkowej powszechnie stosowanym w zastosowaniach biotechnologicznych, w których pęcherzyki lipidowe są pękane na podpartym materiale podłoża5,6,7,8,9. Jedną z powszechnych technik stosowanych do monitorowania tworzenia dwuwarstw jest mikrowaga kryształów kwarcu z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D), która bada adsorpcję pęcherzyków w porównaniu z właściwościami cieczy masowej in situ8,10,11,12,13,14. Wcześniej QCM-D był używany do wykazania, że w warunkach przepływu, po osiągnięciu krytycznego pokrycia pęcherzykami lipidowymi fosfatydylocholiny (PC) na powierzchni, spontanicznie pękają one na sztywne dwuwarstwy lipidowe15. Wcześniejsze prace dotyczyły również wspieranego tworzenia dwuwarstw lipidowych o różnym składzie lipidowym16, włączenie białek lipidowych17,18,19, oraz wykorzystując poduszki polimerowe20, uzyskując wspierane dwuwarstwy lipidowe zdolne do naśladowania różnych aspektów funkcji błony komórkowej.
Dwuwarstwy lipidowe zostały użyte do naśladowania różnych barier biologicznych od poziomu subkomórkowego do narządowego, w tym mitochondriów, czerwonych krwinek i błon komórkowych wątroby, poprzez zmianę składników fosfolipidów, cholesterolu i glikolipidów21. Te bardziej złożone pęcherzyki wielolipidowe mogą wymagać dodatkowych metod w celu uzyskania pęknięcia pęcherzyków, w zależności od składu lipidowego. Na przykład w poprzednich badaniach wykorzystano peptyd α-helisowy (AH) pochodzący z niestrukturalnego białka 5A wirusa zapalenia wątroby typu C w celu wywołania tworzenia dwuwarstw poprzez destabilizację zaadsorbowanych pęcherzyków lipidowych22,23. Korzystając z tego peptydu AH, wcześniej utworzono dwuwarstwy lipidowe naśladujące komórki łożyska24. Ogromny potencjał dwuwarstw lipidowych do zastosowań biomedycznych został zademonstrowany w badaniach obejmujących transport molekularny i nanocząsteczkowy25, 26, environmental toxicant interactions27, Składanie i funkcja białek17,18,19, układ peptydów i insercja28, 29, badanie przesiewowe leków30 oraz platformy mikroprzepływowe31.
Zawieszone dwuwarstwy lipidowe zostały wykorzystane do badań przesiewowych w farmacji za pomocą równoległego testu przepuszczalności sztucznej błony (PAMPA), gdzie dwuwarstwa lipidowa jest zawieszona na porowatej wkładzie hydrofobowym32,33,34,35. Modele lipidowe PAMPA zostały opracowane dla różnych interfejsów biologicznych, w tym interfejsów krew-mózg, policzkowych, jelitowych i przezskórnych36. Łącząc zarówno podpartą dwuwarstwę lipidową, jak i techniki PAMPA, można dokładnie zbadać adsorpcję, przepuszczalność i osadzanie związków w składnikach lipidowych pożądanej tkanki lub typu komórki.
Ten protokół opisuje wytwarzanie i zastosowanie modeli dwuwarstwowych lipidów błony komórkowej in vitro do badania kilku interakcji molekularnych. Szczegółowo opisano przygotowanie zarówno jednolipidowych, jak i wielolipidowych oraz zawieszonych dwuwarstw lipidowych. Aby utworzyć podpartą dwuwarstwę lipidową, pęcherzyki lipidowe są najpierw opracowywane przy użyciu metod cienkowarstwowego nawilżania i wytłaczania, a następnie charakterystyki fizykochemicznej. Omówiono tworzenie podpartej dwuwarstwy lipidowej przy użyciu monitorowania QCM-D i wytwarzania zawieszonych błon lipidowych do stosowania w PAMPA. Na koniec badane są pęcherzyki wielolipidowe do rozwoju bardziej złożonych błon naśladujących komórki. Wykorzystując oba typy wytwarzanych błon lipidowych, protokół ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać to narzędzie do badania interakcji molekularnych. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta konstruuje dwuwarstwy lipidowe naśladujące komórki o wysokiej powtarzalności i wszechstronności.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina&nbsp; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-seryna (sól sodowa) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina (16:0-18:1 PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glycero-2-phospho-L-seryna (DOPS, 18:1 PS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC, 18:1 (&Delta; 9-Cis) PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE, 18:1 (&Delta; 9-Cis) PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-etylofosfocholina (sól chlorkowa) (18:0 EPC (sól Cl)))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890703</td><td></td></tr><tr><td>3 mL strzykawki Luer-Loc</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>40 ml fiolka na próbkę, bursztynowa z politetrafluoroetylenem (PTFE)/gumową wkładką</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>W224605</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-821-781</td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSAC70221</td><td></td></tr><tr><td>C18, kolumna 3,5 um x 50 mm, SunFire</td><td>Waters</td><td>&nbsp; </td><td></td>186002551</tr><tr><td>Chloroform</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSAC288306</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td><td>Sarstedt</td><td>67.758.001</td><td></td></tr><tr><td>Ftalan di(2-etyloheksylu) (DEHP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>36735</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Milipore Sigma</td><td>LSAC472301</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Wsporniki filtrów, 10 mm</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td>Rozmiar do mini ekstrudera</td></tr><tr><td>Składana kapilarna komórka zeta</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764-4L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34256</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyloinozytol (soja) (soja PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td>840044</tr><tr><td>L-&alfa;-fosfitydylocholina (jaja, kurczak)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051</td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast &reg; LF-50</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337 -</td> Zestaw mini-ekstrudera 4L <td></td></tr><tr><td>z uchwytem/blokiem grzewczym</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen-IP Płyta filtracyjna, 0,45&nbsp; &mikro; m, przezroczysty, sterylny</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAIPS4510</td><td>do badań PAMPA</td></tr><tr><td>Gazowy azot, ultraczysty</td><td>TechAir</td><td>NI T5.0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofilowe membrany nuklepowe, poliwęglan, 19 mm, 0,1 um</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td>Rozmiar do mini wytłaczarki</td></tr><tr><td>Hydrofilowe membrany nukleporowe, poliwęglan, 25 mm, 0,1 um</td><td>Whatman</td><td>110605</td><td>Rozmiar do dużego wytłaczarki</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS), 10x</td><td>Genesee Scienfitic</td><td>25-507X</td><td>Rozcieńczony do 1x</td></tr><tr><td>oprogramowanie Qsoft 401</td><td>Biolin Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowaga kwarcowa z dysprosacją Analizator Q-Sense</td> Fiolki scyntylacyjne <td>Biolin Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, fiolki ze szkła borokrzemianowego, 20 ml</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>986561</td><td></td></tr><tr><td>Dwutlenek krzemu, cienki QSensors</td><td>Biolin Scientific</td><td>QSX 303</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSACS5886</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczny rozpuszczalnik Końcówki do pipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8064</td><td></td></tr><tr><td>Sfingomielina (jaja, kurczak)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td>860061</tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSACT1503</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trypsynowo-etylenodiaminooctowy</td><td>Kesons Labs</td><td>TRL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tarcza spustowa Whatman, 25 mm</td><td>Whatman</td><td>230600</td><td>Rozmiar do dużej wytłaczarki</td></tr><tr><td>Zetasizer ZS90</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zetasizer 7.01</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Modelowe błony komórkowe są użytecznym narzędziem przesiewowym o różnych zastosowaniach, od wczesnego odkrywania leków po badania toksyczności. Błona komórkowa jest kluczową barierą ochronną dla wszystkich typów komórek, oddzielającą wewnętrzne składniki komórkowe od środowiska zewnątrzkomórkowego. Błony te składają się w dużej mierze z dwuwarstwy lipidowej, która zawiera zewnętrzne hydrofilowe grupy głowy i wewnętrzne hydrofobowe grupy ogonowe, a także różne białka i cholesterol. Skład i struktura samych lipidów odgrywają kluczową rolę w regulacji funkcji biologicznych, w tym interakcji między komórkami a mikrośrodowiskiem komórkowym, które może zawierać farmaceutyki, toksyny biologiczne i toksyny środowiskowe. W pracy opisano metody formułowania jedno- i wielolipidowych oraz zawieszonych dwuwarstw lipidowych naśladujących komórki naśladujące dwuwarstwy. Wcześniej opracowano jednolipidowe dwuwarstwy lipidowe fosfatydylocholiny (PC), a także wielolipidowe dwuwarstwy lipidowe inspirowane trofoblastami łożyska do wykorzystania w zrozumieniu interakcji molekularnych. W tym miejscu zostaną przedstawione metody uzyskiwania obu typów modeli dwuwarstwowych. W przypadku dwuwarstw wielowarstwowych naśladujących komórki, pożądany skład lipidowy jest najpierw określany poprzez ekstrakcję lipidów z komórek pierwotnych lub linii komórkowych, a następnie chromatografię cieczową ze spektrometrią mas (LC-MS). Korzystając z tej kompozycji, pęcherzyki lipidowe są wytwarzane metodą cienkowarstwowej hydratacji i ekstruzji, a ich średnica hydrodynamiczna i potencjał zeta są charakteryzowane. Dwuwarstwy lipidowe podparte i zawieszone mogą być następnie formowane za pomocą mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem rozpraszania (QCM-D) oraz na porowatej membranie do zastosowania odpowiednio w równoległym teście przepuszczalności sztucznej błony (PAMPA). Reprezentatywne wyniki podkreślają powtarzalność i wszechstronność dwuwarstwowych modeli lipidowych błon komórkowych in vitro. Przedstawione metody mogą pomóc w szybkiej, łatwej ocenie mechanizmów interakcji, takich jak przenikanie, adsorpcja i osadzanie różnych cząsteczek i makrocząsteczek w błonie komórkowej, pomagając w badaniach przesiewowych kandydatów na leki i przewidywaniu potencjalnej toksyczności komórkowej.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metody tworzenia wspieranych i zawieszonych dwuwarstw lipidowych (Rycina 1). Pierwszym krokiem w tworzeniu wspieranej dwuwarstwy lipidowej jest opracowanie pęcherzyków lipidowych. Mini ekstruder umożliwia przygotowanie małych objętości pęcherzyków lipidowych (1 mL lub mniej), natomiast duży ekstruder pozwala na przygotowanie od 5-50 mL pęcherzyków lipidowych w jednej partii. Rozkłady rozmiarów pęcherzyków jednopowłokowych utworzonych za pomocą mini lub ...

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Opisana w niniejszym protokole budowa dwuwarstwowych błon lipidowych może być wykorzystana do uzyskania kluczowych informacji na temat interakcji błony z czynnikami farmaceutycznymi, toksynami środowiskowymi, a nawet związkami biologicznymi. Techniki te mogą być stosowane do wytwarzania membran o różnej złożoności cieczy oraz do oceny przepuszczalności, absorpcji i osadzania związków w membranach. Na początek dodaj odpowiednią objętość roztworu podstawowego lipidów do czystego szklanego podłogi, aby osiągnąć końcowe stężenie pęcherzyków 2,5 miligrama na mililitr po ponownym uwodnieniu.Usunąć chloroform z roztworu lipidowego za pomocą strumienia gazowego azotu. Aby zapewnić całkowite usunięcie chloroformu, należy podłączyć wysuszony film lipidowy do próżni na co najmniej cztery godziny. Ponownie uwodnić wysuszony film lipidowy wymaganą objętością buforu chlorku sodu Tris, aby uzyskać końcowe stężenie pęcherzyków 2,5 miligrama na mililitr i wirować przez około 15 do 30 sekund.Przenieść zawiesinę pęcherzyków do pojemnika z suchym lodem do momentu zamrożenia na około 30 minut. Po całkowitym zamrożeniu próbki zawiesinę rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze od 30 do 40 stopni Celsjusza. Odwiruj rozmrożoną zawiesinę pęcherzyków.Aby zrobić jeden mililitr lub mniej pęcherzyków, zaopatrz się w mini wytłaczarkę. Wstępnie zwilż wspornik filtra ultra czystą wodą, a następnie umieść go na powierzchni nośnej membrany wewnątrz O-ringu. Powtórz tę czynność dla drugiego wewnętrznego wspornika membrany.Umieść jeden wewnętrzny wspornik membrany w zewnętrznej obudowie wytłaczarki. Umieść jedną membranę poliwęglanową o grubości 100 nanometrów na wewnętrznym wsporniku membrany bezpośrednio nad wspornikiem filtra. Umieść drugi wewnętrzny wspornik membrany w zewnętrznej obudowie ekstrudera tak, aby O-ring i strona wspornika filtra były skierowane w stronę membrany poliwęglanowej.Przymocuj łożysko z politetrafluoroetylenu do węzła ustalającego i przykręć je do zewnętrznej obudowy ekstrudera. Wpiąć ekstruder w blok grzewczy. Załaduj zawiesinę pęcherzyków lipidowych do jednej ze strzykawek i umieść strzykawkę w bloku grzewczym ekstrudera, całkowicie wkładając igłę do jednego końca wytłaczarki.Włożyć drugą pustą strzykawkę po przeciwnej stronie i zablokować obie strzykawki za pomocą zacisków na ramieniu bloku grzewczego. Powoli wepchnąć zawiesinę pęcherzyków do pustej strzykawki, a następnie z powrotem do oryginalnej strzykawki. Powtórz jeszcze 20 razy, w sumie 21 przejść przez membranę poliwęglanową.Przenieś pęcherzyki lipidowe do czystego szkła w celu przechowywania. Aby wytłoczyć od pięciu do 50 mililitrów pęcherzyków, zmontuj dużą wytłaczarkę, umieszczając wspornik sita z dużym otworem, wyśrodkowaną tarczę, tarcze odpływowe i membranę poliwęglanową w przestrzeni w dolnym wsporniku wytłaczarki. Połącz górne i dolne wsporniki ekstrudera za pomocą czterech i dokręć.Przymocuj ekstruder do cylindra próbki, szorując go do dna i dokręcając kluczem w celu zabezpieczenia. Napełnij cylinder próbki ultraczystą wodą i wytłacz wodę przez wytłaczarkę przed dodaniem próbki do cylindra z próbką. Dodaj zawiesinę pęcherzyków lipidowych do cylindra z próbką i zakręć górną część.Powoli zwiększaj ciśnienie, aż próbka zacznie kapać z wytłaczarki z szybkością około dwóch do trzech kropli na sekundę do czystego szkła. Po wytłoczeniu całej próbki wyłącz dopływ azotu i zwolnij ciśnienie w cylindrze z próbką, powoli otwierając zawór bezpieczeństwa. Wlej pęcherzyki lipidowe z powrotem do cylindra z próbką i powtórz poprzedni krok jeszcze dziewięć razy, co daje w sumie 10 wytłoczeń.Załaduj zawiesinę pęcherzyków do odpowiedniej kuwety i włóż do przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła, wprowadź szczegóły próbki i wykonaj pomiar za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Umieść celę zeta w komorze na próbkę, upewniając się, że elektrody się stykają, i zamknij pokrywę uchwytu próbki. W powiązanym oprogramowaniu wprowadź szczegóły próbki i zbierz pomiary.Włóż czujnik kwarcowy oznaczony krzemionką do modułu przepływu, upewniając się, że kształt litery T na krysztale jest wyrównany z kształtem litery T na module i przykręć moduł przepływu. W instrumentach z wieloma komorami można równolegle formować dodatkowe dwuwarstwy. Podłącz rurkę wlotową i wylotową do modułu przepływowego i pompy.Umieść rurkę w osłonach przytrzymujących i zamknij pokrywę systemu analizatora. Umieść pojemnik na odpady na wylocie pompy, aby zebrać zużyte roztwory. Aby wykonać czyszczenie, najpierw włącz pompę i ustaw prędkość przepływu na 400 mikrolitrów na minutę.Włóż rurkę wlotową do ultra czystej wody i przepuść od pięciu do 10 mililitrów przez moduł. Zamień rurkę na SDS i przepuść od pięciu do 10 mililitrów przez moduł. Zamień rurkę z powrotem na ultra czystą wodę i przepuść od 10 do 20 mililitrów przez moduł.Na koniec przepuść powietrze przez moduł, aż nie zostanie zebrany żaden pozostały roztwór. Wyjmij czujnik z modułu przepływu i przepłucz czujnik ultra czystą wodą. Napędzaj czujnik i moduł przepływu strumieniem azotu gazowego, upewniając się, że elektroda zawsze pozostaje wolna od jakichkolwiek cieczy.W dygestorium chemicznym włóż czujnik kwarcowy pokryty krzemionką do przyrządu do czyszczenia ultrafioletem lub ozonem. Włącz instrument i pozwól na leczenie przez co najmniej dwie minuty. Ostrożnie wyjmij czujniki i włóż je z powrotem do modułu przepływowego.Włącz analizator, aby podłączyć powiązane oprogramowanie i ustawić temperaturę na żądaną wartość w celu utworzenia podporowej dwuwarstwy lipidowej. Poczekaj, aż temperatura ustabilizuje się do żądanego wejścia. Skonfiguruj pomiar i znajdź wszystkie częstotliwości rezonansowe czujnika oraz rozproszenie dla alikwotów trzech, pięciu, siedmiu, dziewięciu, 11 i 13 przed rozpoczęciem pomiaru.Pozwól, aby chlorek sodu Tris przepływał przez moduł przez pięć do 10 minut, upewniając się, że zmiana częstotliwości podstawowej lub Delta F i zmiana rozpraszania lub wartości Delta D w cieczy pozostają stabilne. Zatrzymać pompę, wyjąć rurkę wlotową z roztworu chlorku sodu Tris i ostrożnie włożyć ją do roztworu pęcherzyków lipidowych. Przepływ wsteczny przez pięć sekund, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z rurki dolotowej, a następnie kontynuuj przepływ do przodu.Uruchom ponownie pomiar w oprogramowaniu, aby wyzerować linię bazową. Przepływaj pęcherzyki lipidowe do momentu powstania dwuwarstw w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu do akwizycji danych. Następnie powtórz ten krok, aby zmienić rurkę wlotową z pęcherzyków lipidowych z powrotem na bufor chlorku sodu Tris.Dodaj pięć mikrolitrów roztworu lipidowego do komory dawcy, która jest porowatą, 96-dołkową wielositową płytką filtracyjną z polifluorku winylidenu o wielkości porów 0,45 mikrometra. Natychmiast zanurz płytkę filtracyjną w komorze akceptora, która jest transportową płytką odbiorczą zawierającą 300 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Dodać 200 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do komory donora transportowego.Postępuj zgodnie z poprzednimi krokami zatrzymywania pompy i zmiany rurki wlotowej na roztwór pęcherzyków lipidowych i obserwowania tworzenia się dwuwarstw, a następnie zmień rurkę wlotową na roztwór peptydu alfa helisowego lub AH. Wprowadzaj roztwór do modułu przepływowego, aż zaobserwuje się zmianę częstotliwości i zmianę rozpraszania po dodaniu nowego roztworu. Zatrzymać pompę i pozwolić peptydowi AH inkubować się z pęcherzykami przez 10 minut.Zamień rurkę wlotową na chlorek sodu Tris i rozpocznij przepływ, aby usunąć peptyd AH z pękniętych pęcherzyków, co prowadzi do pomyślnego utworzenia dwuwarstwy lipidowej. Najpierw przelej cząsteczkę rozpuszczalnika, a następnie zamień rurkę wlotową do roztworu zawierającego cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania i przepływaj przez co najmniej pięć minut. W razie potrzeby zatrzymaj przepływ i pozwól, aby ciecz zawierająca pożądaną cząsteczkę inkubowała się z dwuwarstwą.Wymień rurkę wlotową z powrotem na sam rozpuszczalnik cząsteczkowy. Przepływaj przez co najmniej pięć minut, a następnie zmień rurkę doprowadzającą na chlorek sodu Tris i przepływaj przez co najmniej pięć minut. W oprogramowaniu zatrzymaj pomiar, zapisz file i zatrzymaj pompę.Bezpośrednio po poprzednich krokach dla dwuwarstwy zawieszonej jednolipidowej lub dwuwarstwy zawieszonej wielolipidowo, usuń PBS z komory płytki filtra donorowego i zastąp 200 mikrolitrami roztworu testowego. Natychmiast zanurz w nowej transportowej płycie odbiorczej z 300 mikrolitrami PBS. Po inkubacji z delikatnym kołysaniem przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza należy pobrać 150 mikrolitrów roztworu z komory dawcy i akceptora.Zmierzyć stężenie cząsteczki w obu próbkach przy użyciu odpowiedniej metody opartej na właściwościach tej cząsteczki. Porównano wielkość, polidyspersyjność i potencjał Zeta jednolipidowych pęcherzyków PC jaj oraz dwóch kompozycji pęcherzyków wielolipidowych. Rozkład wielkości pęcherzyków PC jaja i pęcherzyków wielolipidowych był prawie identyczny.Zarówno pęcherzyki wielolipidowe jaja, jak i PC były naładowane ujemnie, podczas gdy dwa pęcherzyki wielolipidowe były naładowane dodatnio. Jednolipidowe pęcherzyki PC jaj łatwo wchłaniają się na powierzchnię, o czym świadczy spadek zmiany częstotliwości i wzrost zmiany rozpraszania, po której następuje spontaniczne pęknięcie. Pęcherzyki wielolipidowe wchłaniają się na powierzchnię, ale wymagają dodania peptydu AH do pęknięcia pęcherzyków, co powoduje utworzenie dwuwarstwy lipidowej.Dzięki obsługiwanym dwuwarstwom lipidowym zmiana częstotliwości i zmiana rozpraszania mogą być analizowane przed i po wprowadzeniu interesującego związku. Na przykład badano interakcje DEHP i toksyny środowiskowej z podpartymi uni i wielowarstwowymi warstwami. Podobne poziomy wchłaniania DEHP zaobserwowano dla obu typów dwuwarstw lipidowych.Zaobserwowano jednak różnice w zmianie dyssypacji między dwuwarstwami, przy czym większą zmianę rozpraszania zaobserwowano dla dwuwarstwy PC jaja w porównaniu z dwuwarstwą wielolipidową. Niewielką przenikalność zaobserwowano zarówno dla jedno-, jak i wielolipidowych dwuwarstw jednoosobowych. W wyniku tej procedury można opracować różne dwuwarstwy lipidowe naśladujące komórki, aby umożliwić bezkomórkowe badania przesiewowe interakcji molekularnych ze związkami od farmaceutyków po toksyny środowiskowe.

assembly-cell-mimicking-supported-suspended-lipid-bilayer-models-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.<br...

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

W tym filmie demonstrujemy procedurę badania organizacji septyny na dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Planarny dwuwarstwowy test lipidowy: oparta na mikroskopii technika in vitro do badania składania septyny na mimikach błon biologicznych

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Różnorodność lipidów błony pod względem struktury i składu jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do procesów komórkowych i może być markerem choroby. Symulacje dynamiki molekularnej pozwalają nam badać błony i ich interakcje z biomolekułami w rozdzielczości atomowej. W tym miejscu udostępniamy protokół do budowania, uruchamiania i analizowania złożonych systemów membranowych.

Realistyczne modelowanie błon z wykorzystaniem złożonych mieszanin lipidowych w badaniach symulacyjnych

Poznaj metodę tworzenia dwuwarstwowych modeli lipidowych do badania oddziaływań z lekami i toksykantami środowiskowymi. Protokół umożliwia ocenę przenikania oraz wbudowywania związków w błony komórkowe.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Przeglądaj więcej filmów