Name: Test aktywacji bazofili do diagnozy alergii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj test aktywacji bazofili do diagnozy alergii IgE-zależnych metodą cytometrii przepływowej. Ta technika pozwala uniknąć prób prowokacyjnych u pacjentów z ciężkimi reakcjami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Claudii Corazzie za jej nieocenione wsparcie w języku angielskim. Prace te były wspierane przez Instytut Zdrowia "Carlos III" (ISCIII) MINECO (grant współfinansowany przez EFRR: "Una manera de hacer Europa"; Dotacje nr PI20/01715; Numer identyfikacyjny PI18/00095; Numer identyfikacyjny PI17/01410; Numer identyfikacyjny PI17/01318; PI17/01237 oraz RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Regionalne Ministerstwo Zdrowia Andaluzji (dotacje nr PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID jest badaczem klinicznym (B-0001-2017), a AA posiada kontrakt na staż podoktorski (RH-0099-2020), oba wspierane przez Andaluzyjskie Regionalne Ministerstwo Zdrowia (współfinansowane przez EFS: "Andalucía se mueve con Europa").

Wykonanie protokołu zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyki (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Hiszpania). Wszyscy uczestnicy zostali poinformowani ustnie o badaniu naukowym i podpisali odpowiedni formularz świadomej zgody.
UWAGA: Obecny protokół szczegółowo opisuje procedurę BAT, której autorzy używają codziennie. Nie jest to jednak metoda ustandaryzowana i istnieją różnice w stosunku do procedur opublikowanych przez innych autorów. Główne modyfikacje protokołu są związane ze stosowaniem IL-3 w buforze stymulacyjnym, czasem inkubacji z bodźcem, metodą zatrzymania degranulacji bazofili oraz strategiami cytometrii przepływowej. Ponadto różne dostępne na rynku zestawy BAT zawierają określone protokoły zalecane przez producenta.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Zebrać krew obwodową do probówek z heparyną o pojemności 9 ml i utrzymywać próbkę w temperaturze pokojowej (RT) w wirniku do czasu, gdy będzie to wymagane w protokole eksperymentalnym.</li>
	<li>Oznaczyć probówki cytometryczne o pojemności 5 ml dla kontroli ujemnych (2 probówki), kontroli pozytywnych (2 probówki) i różnych stężeń alergenu/leku (1 probówka na każde badane stężenie alergenu/leku). Umieść rurki w stojaku, w którym rurki idealnie pasują bez poślizgu.</li>
	<li>Przygotować bufor stymulacyjny w wodzie podwójnie destylowanej zawierającej 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3,7 mg/L KCl, 7,8 mg/L CaCl2, 3,3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA. Dostosuj pH do 7,4 i dodaj IL-3 w stężeniu 2 ng/ml. Zwykle przygotowuje się 100 ml i dzieli na 2,5 ml porcji do zamrożenia w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować kontrole dodatnie w PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Kontrola pozytywna 1, N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP) (4 μM), w celu potwierdzenia jakości bazofili; Kontrola pozytywna 2, anty-IgE (0,05 mg / ml) jako kontrola pozytywna za pośrednictwem IgE.</li>
	<li>Przygotować alergen/lek w PBS-T w stężeniu 2x większym niż pożądane stężenie końcowe. 
	UWAGA: Optymalne stężenia alergenów/leków, które należy zastosować, muszą być wcześniej określone przy użyciu szerokiego zakresu stężeń, za pomocą krzywych dawka-odpowiedź oraz przez badania cytotoksyczności zgodnie z tymi samymi krokami protokołu139.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszanki barwiącej
<ol>
	<li>Dodać przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem do buforu stymulacyjnego zgodnie z zalecanym przez producenta stężeniem przeciwciał lub przez wcześniejsze miareczkowanie przeciwciał. W tym protokole dodajemy 1 μL każdego przeciwciała (CCR3-APC i CD203c-PE do identyfikacji bazofilów; CD63-FITC do aktywacji bazofili)140 na 20 μL buforu stymulacyjnego. 
	UWAGA: Preparat do barwienia należy chronić przed światłem.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 23 μl mieszanki barwiącej.</li>
</ol>
3. Stymulacja krwi
<ol>
	<li>Dodać 100 μl PBS-T do probówek 1 i 2 (kontrola ujemna), 100 μl fMLP do probówki 3, 100 μl anty-IgE do probówki 4 i 100 μl różnych stężeń alergenu/leku do kolejnych probówek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem w celu podgrzania odczynników.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 100 μl krwi do każdej probówki, aby uniknąć hemolizy. Delikatnie przetrząsnąć rurki i inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem.</li>
	<li>Zatrzymaj degranulację, utrzymując probówki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 5 minut 
	UWAGA: W razie potrzeby protokół można zatrzymać w temperaturze 4 °C na 30-45 minut141,142,143.</li>
</ol>
4. Erytrocyty poddawane lizie
<ol>
	<li>Dodaj 2 ml 1x buforu lizującego do każdej probówki, aby lizować erytrocyty. Wirować każdą probówkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Na tym etapie komórki są utrwalane za pomocą środków utrwalających (formaldehydu) zawartych w buforze.</li>
	<li>Odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zdekantować supernatant, przewracając stojak do zlewu. Komórki pozostają na dnie probówek.</li>
	<li>Dodaj 3 ml PBS-T do każdej probówki, aby przepłukać komórki. Wiruj każdą rurkę.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Zdekantować supernatant, przewracając stojak do zlewu. 
	UWAGA: Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu akwizycji cytometru przepływowego.</li>
</ol>
5. Akwizycja cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Pobieranie próbek za pomocą cytometru przepływowego (np. cytometru przepływowego BD FACSCalibur). Podłącz cytometr przepływowy do oprogramowania komputerowego i poczekaj, aż cytometr będzie gotowy. Załaduj ustawienia szablonu i przyrządu (Tabela 1).</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie próbki.</li>
	<li>Użyj następujących strategii cytometru do wyboru aktywowanych bazofilów139.
	<ol>
		<li>Bramka limfocytów z wykresu Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).</li>
		<li>Bramka bazofili z populacji limfocytów jako komórki CCR3 + CD203c +. Zdobądź co najmniej 500 bazofili na probówkę.</li>
		<li>Pokaż wykres CCR3 - CD63, aby przeanalizować aktywację przy użyciu CD63 jako znacznika aktywacji. Ustawić ujemny próg CD63 na około 2.5% za pomocą probówek kontroli ujemnej.</li>
		<li>Zbierz wszystkie próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

BAT to uzupełniający test diagnostyczny in vitro służący do oceny reakcji alergicznych IgE-zależnych, który okazał się przydatny w diagnostyce reakcji wywołanych przez różne czynniki wyzwalające, takie jak leki, żywność lub środki wziewne, a także w niektórych postaciach przewlekłej pokrzywki. Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność BAT należy rozważyć, jeżeli: i) alergen/lek daje fałszywie dodatnie wyniki w ST; ii) alergen/lek nie jest dostępny do wykorzystania do oznaczania ilościowego ST lub sIgE; iii) istnieje nie...

Diagnoza alergii zależnej od IgE opiera się na wywiadzie klinicznym, testach skórnych (STs), ilościowym określeniu swoistych IgE (sIgE) w surowicy oraz, jeśli jest to wymagane i wskazane, kontrolowanych testach obciążeniowych (CCTs)1,2,3,4,5,6. Jednak historia kliniczna może być niewiarygodna, ponieważ może brakować dokładnych informacji, a ST i CCT nie są procedurami wolnymi od ryzyka, które mogą być przeciwwskazane u osób doświadczających ciężkich reakcji zagrażających życiu1,2,3,4,5,6. Kwestie te, wraz z faktem, że oznaczanie sIgE za pomocą zwalidowanych i komercyjnych testów immunologicznych fluoroenzymów jest dostępne tylko dla kilku alergenów i leków, podkreśliły ważną rolę innych funkcjonalnych testów in vitro, takich jak test aktywacji bazofili (BAT).
Bazofile są kluczowymi komórkami efektorowymi zaangażowanymi w reakcje alergiczne zależne od IgE, które są aktywowane po usieciowaniu sąsiednich sIgE związanych z receptorami o wysokim powinowactwie (FcεRI) na powierzchni komórki po ekspozycji na alergen/lek. Aktywacja bazofili wyzwala degranulację komórek i uwalnianie wstępnie uformowanych i nowo zsyntetyzowanych mediatorów stanu zapalnego zawartych w granulkach wydzielania docytoplazmatycznego7,8,9. BAT to metoda in vitro, która próbuje naśladować aktywację bazofili w obecności bodźca (alergenu lub leku) i określa zmiany w ekspresji markerów aktywacji bazofili za pomocą cytometrii przepływowej7,10. Istnieją różne strategie identyfikacji bazofili (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) oraz pomiaru aktywacji komórek (głównie regulacji w górę CD63 i CD203c) przy użyciu kombinacji przeciwciał znakowanych fluorochromem7,10. CD63, najlepiej potwierdzony klinicznie marker aktywacji11,12,13,14, jest białkiem błonowym zakotwiczonym w granulkach wydzielniczych zawierających histaminę, która po aktywacji komórki i fuzji granulek z błoną ulega ekspresji na powierzchni bazofili class15,16,17,18,19,20,21. CD203c jest markerem powierzchniowym, który ulega konstytutywnej ekspresji na bazofilach i jest regulowany w górę po stymulacji FcεRI, co również wykazało wiarygodne wyniki w BAT15,22,23,24,25. Poza tym, wydaje się, że współwyraża się z CD6326.
W ostatnich dziesięcioleciach, BAT okazał się przydatny w diagnozowaniu reakcji alergicznych wywołanych przez różne czynniki wyzwalające, takie jak leki, jedzenie lub środki wziewne, a także w niektórych formach przewlekłej pokrzywki, jak opisano poniżej. Pozycja tej techniki w algorytmach diagnostycznych jest jednak bardzo zmienna i nie jest dobrze określona.
Nadwrażliwość na leki 
Wykazano, że BAT jest przydatny jako test uzupełniający dla wybranych leków i pacjentów, szczególnie dla tych, którzy doświadczają ciężkich reakcji ze względu na fakt, że wartość diagnostyczna ST nie jest dobrze ustalona dla większości leków, ponieważ są one walidowane i standaryzowane dla ograniczonej liczby leków27,28,29,30. Ponadto oznaczanie ilościowe sIgE jest dostępne tylko dla ograniczonej liczby leków, o niższej czułości niż ST27,28,29,30,31,32. Dlatego diagnoza nadwrażliwości na lek zwykle opiera się na teście prowokacji narkotykowej, który może być przeciwwskazany u osób doświadczających ciężkich reakcji zagrażających życiu33.
Obiecujące wyniki zostały zgłoszone dla stosowania BAT u wybranych pacjentów zgłaszających natychmiastowe reakcje nadwrażliwości na różne leki, takie jak betalaktamy (BLs)20,34,35,36,37,38,39, środki blokujące nerwowo-mięśniowe ( NMBAs)19,22,40,41,42,43,44,45, fluorochinolony (FQs)46,47,48,49, pyrazolones50,51,52, radiokontrastowe (RCM)53,54,55,56, oraz związki platyny57,58,59. Zgłoszono, że BAT mają czułość i swoistość odpowiednio między 51,7–66,9 % i 89,2–97,8 %; a dodatnie i ujemne wartości predykcyjne są opisane w zakresie odpowiednio od 93,4% do 66,3%27,31. Co więcej, BAT został zaproponowany jako biomarker predykcyjny dla przełomowych reakcji podczas odczulania związkami platyny, ponieważ ekspresja CD203c jest zwiększona w porównaniu z CD63 u pacjentów z wysokim ryzykiem wystąpienia działań niepożądanych podczas odczulania leku57.
Warto zauważyć, że BAT jest przydatny tylko w przypadku nadwrażliwości na leki, gdy reakcja obejmuje degranulację bazofilów; dlatego nie jest przydatny w reakcjach wynikających z enzymatycznego hamowania cyklooksygenazy <klasa sup="xref">142.
Alergia pokarmowa 
BAT stał się potencjalnym narzędziem diagnostycznym w przypadku alergii pokarmowej, ponieważ oznaczanie stężenia sIgE w surowicy dla całego ekstraktu alergenu lub pojedynczych alergenów jest często niejednoznaczne, co wymaga doustnego prowokacji pokarmem w celu potwierdzenia diagnozy, co, podobnie jak nadwrażliwość na lek, jest procedurą kosztowną i niepozbawioną ryzyka60. Kilka badań wykazało odpowiednie wyniki z mlekiem krowim61,62, egg61,63, pszenica64,65,66,67,68, peanut63,69, 70,71,72, orzech laskowy73,74,75,76,77, shellfish78, peach79,80,81, jabłko21, seler i marchew82,83.
Główną wartością dodaną BAT w diagnostyce alergii pokarmowej w porównaniu do STs i sIgE w surowicy jest to, że wykazuje wyższą specyficzność i podobną czułość. W związku z tym BAT jest użytecznym narzędziem do odróżniania pacjentów z klinicznie alergiczną od uczulonych, ale tolerancyjnych osób, które mają zarówno wysoką swoistość (75-100%), jak i wrażliwość (77-98%)63,69,84. Wartości czułości i swoistości zależą od alergenu i innych czynników, takich jak fenotypy (np. zespół alergii jamy ustnej kontra anafilaksja), wiek i wzorce uczuleń związane z geografią63,85.
BAT wykorzystujący pojedyncze składniki alergenowe może potencjalnie poprawić dokładność diagnostyczną niektórych alergenów pokarmowych61,80. Istnieją badania z użyciem białek magazynujących nasiona (np. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 i Ara h 6 z orzeszków ziemnych)86; białka przenoszące lipidy (np. Pru p 3 z brzoskwini i Ara h 9 z orzeszków ziemnych)80,86; i homologi Bet v 1 (np. Ara h 8 od orzeszka ziemnego)87. Inne potencjalne zastosowania są związane z identyfikacją alergenu winowajcy w przypadkach zespołu alergii pyłkowo-pokarmowej21,87,88, alergia na czerwone mięso89, lub anafilaksja wywołana wysiłkiem fizycznym zależnym od pokarmu66.
Interesujące, BAT może dostarczyć informacji o nasileniu i progu reakcji alergicznych, ponieważ pacjenci z cięższymi reakcjami wykazują większy odsetek aktywowanych bazofili, co zaobserwowano w badaniach pacjentów z alergią na orzeszki ziemne i mleko krowie84,90,91; a pacjenci reagujący na śladowe ilości alergenu wykazują większą wrażliwość bazofilów84,90,92. Dane te sugerują, że BAT może być przydatny do identyfikacji pacjentów alergicznych wysokiego ryzyka, którzy wymagają dokładniejszej obserwacji i bardziej zintensyfikowanej edukacji93. Co więcej, doniesiono, że BAT może przewidywać odpowiedzi na wyzwania związane z jedzeniem70,91,92,94 i progi reaktywności90,95, aby pomóc określić, kiedy żywność może być bezpiecznie (ponownie) wprowadzona84. Jednak te wyniki są kontrowersyjne w niektórych badaniach63,96 i wymagane są dalsze badania.
Z drugiej strony, BAT był używany do monitorowania ustąpienia alergii pokarmowej, zarówno naturalnie, jak i pod wpływem leczenia immunomodulującego, w czasie, które do tej pory było oceniane tylko na podstawie doustnego prowokacji pokarmowej, wraz z powiązanym ryzykiem i kosztami84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108. Co więcej, był on również stosowany do monitorowania wpływu omalizumabu na alergię pokarmową, ponieważ aktywacja bazofili zmniejsza się podczas leczenia omalizumabem, ale zwiększa się po zaprzestaniu leczenia109.
Alergia wziewna 
BAT rzadko jest korzystny w przypadku alergii wziewnej, ponieważ diagnozę można rutynowo ustalić na podstawie kwantyfikacji sIgE i ST. Jednak w przypadkach miejscowego alergicznego nieżytu nosa (niewykrywalne poziomy sIgE i ujemne ST z dodatnimi testami prowokacji nosa), BAT pozwolił na diagnozę w 50% przypadków110. Ponadto stwierdzono korelację między wrażliwością bazofili a odpowiedzią na testy prowokacji nosa/oskrzeli, a także między ciężkością astmy a skutecznością leczenia omalizumabem111,112.
BAT był również używany do monitorowania immunoterapii alergenowej roztoczy kurzu domowego i pyłków, ponieważ czułość bazofili zmniejsza się podczas immunoterapii, prawdopodobnie z powodu interferencji blokujących przeciwciał IgG113,114,115,116,117.
alergia na jad błonkoskrzydłych 
Rozpoznanie alergii na jad błonkoskrzydłych rutynowo opiera się na ST i sIgE w surowicy. BAT wykazał wysoką czułość (85-100%) i swoistość (83-100%) i stwierdzono, że jest przydatny w przypadkach, które dają niejednoznaczne wyniki lub u pacjentów z sugestywną historią kliniczną alergii na jad, ale niewykrywalną sIgE i ujemnym ST118,119. Wydaje się jednak, że BAT nie jest w stanie przewidzieć nasilenia tych reakcji120,121.
Do 60% pacjentów wykazuje sIgE zarówno na jad osy jak i pszczoły, a identyfikacja dominującego alergenu jest kluczowa dla odpowiedniego leczenia immunoterapią. W takich przypadkach stwierdzono, że BAT jest przydatny w identyfikacji dominującego alergenu119,122,123,124. Chociaż sIgE do głównych alergenów jadów pszczół i os może zmniejszać użyteczność BAT u pacjentów z podwójnie dodatnim wynikiem obu jadów, dostarcza użytecznych informacji głównie u osób z ujemnymi wynikami w oznaczaniu sIgE123.
Niektóre badania sugerują, że BAT może być użyteczny jako biomarker predykcyjny dla skutków ubocznych podczas fazy narastania immunoterapii jadem, ponieważ doniesiono, że ta opcja leczenia zmniejsza wrażliwość bazofilów. Jednak reaktywność nie maleje, a to narzędzie BAT jest obecnie kontrowersyjne13,120,125,126,127,128,129,130.
Pokrzywka i obrzęk naczynioruchowy 
Podgrupa pacjentów z przewlekłą pokrzywką ma autoinmuzyjną patofizjologię, spowodowaną autoprzeciwciałami IgE przeciwko autoalergenom i autoprzeciwciałom IgG, które są skierowane przeciwko kompleksom FcεRI lub IgE-FcεRI obecnym na powierzchni komórek tucznych131,132. W praktyce klinicznej rozpoznanie tego typu przewlekłej pokrzywki opiera się na dodatnim autologicznym odcinku ST surowicy, co wiąże się z ryzykiem przypadkowego zakażenia. BAT zaproponowano jako test in vitro do diagnozowania i monitorowania pacjentów z podejrzeniem przewlekłej pokrzywki. Doniesiono, że ekspresja zarówno CD63, jak i CD203c na powierzchni bazofili została zwiększona po stymulacji surowicami od pacjentów z przewlekłą pokrzywką, co wskazuje na wykrycie aktywnych autoprzeciwciał133,134,135,136,137. Ostatnio doniesiono, że pacjenci z dodatnim BAT często doświadczają najbardziej aktywnego stanu chorobowego, ocenianego na podstawie oceny aktywności pokrzywki, i wymagają wyższych dawek leków przeciwhistaminowych wraz z leczeniem trzeciego rzutu (cyklosporyna A lub omalizumab), w porównaniu z osobami z ujemnym BAT138.

<table><tbody><tr><td>5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, bez nakrętki, niesterylna</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD193 (CCR3) APC</td><td>BioLegend</td><td>310708</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy BD FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzkie przeciwciało CD63</td><td>BioLegend</td><td>353006</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>roztwór lizujący 10x skoncentrowane</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-ludzkie przeciwciało CD203c (E-NPP3)</td><td>BioLegend</td><td>324606</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony mysi anty-ludzki IgE</td><td>BD Biosciences</td><td>555857</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>Płyn osłonowy</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PROBÓWKA 9 ml LH Heparyna litowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455084</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

test aktywacji bazofili do diagnozy alergii

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Test aktywacji bazofili (BAT) jest uzupełniającym testem diagnostycznym in vitro, który może być stosowany jako dodatek do historii klinicznej, testu skórnego (ST) i oznaczania swoistych IgE (sIgE) w ocenie reakcji alergicznych IgE-zależnych od żywności, jadu owadów, leków, a także niektórych form przewlekłej pokrzywki. Rola tej techniki w algorytmach diagnostycznych jest jednak bardzo zmienna i nie jest dobrze określona.
BAT opiera się na określeniu odpowiedzi bazofili na aktywację IgE sieciowania alergenu/leku poprzez pomiar markerów aktywacji (takich jak CD63, CD203c) za pomocą cytometrii przepływowej. Test ten może być użytecznym i uzupełniającym narzędziem do unikania kontrolowanych testów prowokacyjnych w celu potwierdzenia diagnozy alergii, szczególnie u osób doświadczających ciężkich reakcji zagrażających życiu. Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność BAT należy rozważyć, jeżeli: i) alergen/lek daje fałszywie dodatnie wyniki w ST; ii) nie ma źródła alergenu/leku, które można by wykorzystać do oznaczania ST lub sIgE; iii) występuje niezgodność między wywiadem z pacjentem a oznaczeniem ST lub sIgE; iv) objawy sugerują, że ST może powodować odpowiedź ogólnoustrojową; v) przed rozważeniem CCT w celu potwierdzenia winowajcy alergenu/leku. Główne ograniczenia testu związane są z nieoptymalną czułością, zwłaszcza w przypadku alergii na leki, koniecznością wykonania badania nie dłużej niż 24 godziny po ekstrakcji próbki oraz brakiem standaryzacji między laboratoriami w zakresie procedur, stężeń i markerów komórkowych.

BAT przeprowadzany z użyciem alergenów lub leków umożliwia badanie reakcji nadwrażliwości zależnych od IgE. Aby uzyskać najlepsze wyniki, reaktywność bazofilów powinna być mierzona w co najmniej dwóch optymalnych stężeniach34, a aktywację wizualizuje się poprzez zwiększenie ekspresji CD63 na powierzchni komórki. W przypadku alergenów, w celu potwierdzenia reaktywności bazofilów, należy dodatkowo przeanalizować ich wrażliwość poprzez pomiar reaktywności przy wielu malejących stężeniach alergenu<sup...

Test aktywacji bazofili jest uzupełniającym testem diagnostycznym in vitro do oceny reakcji alergicznych zależnych od IgE, opartym na wykryciu aktywacji bazofili w obecności określonego bodźca poprzez pomiar markerów aktywacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Test aktywacji bazofili do diagnozy alergii

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Test aktywacji bazofili jest uzupełniającym testem diagnostycznym in vitro do oceny reakcji alergicznych IgE-zależnych, które okazały się przydatne w reakcjach wywołanych przez leki, żywność lub środki wziewne, a także w niektórych postaciach przewlekłej pokrzywki. Test ten opiera się na określeniu odpowiedzi bazofili na aktywację IgE sieciującą alergen lub lek poprzez pomiar markerów aktywacji za pomocą cytometrii przepływowej. Test aktywacji bazofili może być użytecznym i uzupełniającym narzędziem do unikania kontrolowanych testów prowokacyjnych w celu potwierdzenia diagnozy alergii, szczególnie u osób doświadczających ciężkich reakcji zagrażających życiu.Co więcej, test ten ma tę zaletę, że jest w stanie przeanalizować odpowiedź na dowolny lek lub alergen w porównaniu z innymi metodami in vitro, które są dostępne tylko dla kilku leków i alergenów. Główne ograniczenia testu są związane z nieoptymalną czułością, zwłaszcza w przypadku alergii na leki. Konieczność wykonania badania nie później niż 24 godziny po pobraniu próbki oraz brak standaryzacji między laboratoriami i algorytmami diagnostycznymi.Zacznij od zebrania krwi obwodowej w dziewięciomililitrowych probówkach z heparyną i umieść próbki w wirniku, aby utrzymać je w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą wymagane w protokole eksperymentalnym. Oznacz dwie pięciomililitrowe probówki cytometru każda dla kontroli ujemnej i kontroli pozytywnej. Oznacz również po jednej probówce dla różnych stężeń alergenów lub leków, które są testowane.Następnie umieść rurki w stojaku, aby rurki idealnie pasowały bez poślizgu. Do pierwszej kontroli pozytywnej przygotuj czteromikromolowy roztwór N-formylometylo-leucylo-fenyloalaniny lub fMLP w 0,05% PBS-T Aby potwierdzić jakość bazofili. Do drugiej kontroli pozytywnej należy przygotować roztwór anty-IgE o stężeniu 0,05 miligrama na mililitr przy użyciu PBS-T.Przygotować mieszaninę barwiącą, dodając po jednym mikrolitrze przeciwciał CCR3-APC, CD203c-PE i CD63-FITC na 20 mikrolitrów buforu stymulacyjnego. Następnie dodaj 23 mikrolitry tej mieszanki barwiącej do każdej probówki. Dodać 100 mikrolitrów PBS-T do probówek kontroli ujemnej.Dodać 100 mikrolitrów fMLP do jednej z probówek kontroli pozytywnej i dodać 100 mikrolitrów anty-IgE E do drugiej do pozostałych probówek. Dodaj 100 mikrolitrów różnych stężeń alergenu lub leku i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji delikatnie dodaj 100 mikrolitrów krwi do każdej probówki, aby uniknąć hemolizy.Następnie delikatnie wirować rurki i inkubować je przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem. Utrzymuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej pięć minut, aby zatrzymać degranulację. Do każdej probówki dodaj dwa mililitry buforu lizującego w celu lizy erytrocytów.Wirować każdą probówkę, a następnie inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odwirować probówki o masie 300 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie przewróć stojak do zlewu, aby zdekantować supernatant, podczas gdy komórki pozostaną na dnie rurek.Dodaj trzy mililitry PBS-T do każdej probówki, aby umyć komórki i wymieszać probówki. Wykonaj drugą rundę wirowania przy użyciu tego samego zestawu parametrów i zdekantuj supernatant, przewracając stojak do zlewu. Następnie utrzymuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem do czasu cytometrii przepływowej.Podłącz cytometr przepływowy do oprogramowania komputerowego i poczekaj, aż cytometr będzie gotowy. Załaduj ustawienia szablonu i instrumentu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Rozpocznij proces pobierania próbki.Aby wybrać aktywowane bazofile, najpierw bramkują limfocyty z wykresu rozproszenia bocznego i do przodu. Następnie bramkują bazofile z populacji limfocytów jako komórki CCR3 + CD203c + i uzyskują co najmniej 500 bazofili na probówkę. Ustaw próg CD63 na około 2,5% za pomocą probówek kontroli ujemnej i przeanalizuj próbki.Reakcje nadwrażliwości IgE-zależnej badano, wykonując test aktywacji bazofili (BAT) z użyciem alergenów i leków. Wrażliwość bazofili analizowano, mierząc reaktywność przy wielokrotnie malejących stężeniach alergenów, które pomagają określić stężenie alergiczne, które indukuje odpowiedź 50% bazofili lub EC50. Po pierwsze, limfocyty bramkowano z bocznego wykresu rozproszenia do przodu.Następnie bazofile bramkowano z populacji limfocytów jako komórki CCR3 + CD203c +. Następnie wykorzystano wykres CCR3-CD63 do analizy aktywacji bazofili przy użyciu CD63 jako markera aktywacji dla dwóch leków i różnych stężeń alergenu. Test jest wykonywany na świeżej krwi pełnej i musi być wykonany nie później niż 24 godziny po pobraniu krwi.Bodziec zastosowany w badaniu nie powinien zawierać żadnych substancji pomocniczych i należy wziąć pod uwagę charakterystykę chemiczną leków. Inne dodatkowe metody in vitro do diagnozowania reakcji alergicznych IgE-zależnych lub oznaczania sIgE lub testu uwalniania histaminy.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test aktywacji bazofilów jest potężnym narzędziem do wykrywania alergii zależnych od IgE in vitro. W niniejszej pracy zoptymalizowany protokół testu aktywacji bazofilów został wykorzystany do badania nadwrażliwości na leki. Opisano metodę wydajnej produkcji kowalencyjnych koniugatów lek-białko oraz ich charakterystykę fizykochemiczną.

Test aktywacji bazofili w badaniu mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

W tym filmie opisujemy metodę in vitro do oceny potencjału alergicznego antygenu do wywołania degranulacji bazofilów. β-heksosaminidaza jest używana jako wskaźnik uwalniania chemicznego mediatora, a aktywność enzymatyczna β-heksosaminidazy jest mierzona za pomocą substratu fluorogenicznego.

Humanizowany test uwalniania enzymu mediatorowego: immunochemiczna metoda badania potencjału alergicznego antygenu testowego poprzez monitorowanie odpowiedzi degranulacji bazofili in vitro

W tym filmie pokazujemy test do oceny aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu mikroprzepływowym. IgE w surowicy oddziałują z odrębnymi alergenami unieruchomionymi w strefie reakcji wkładu, które są następnie wykrywane za pomocą przeciwciał anty-IgE sprzężonych z peroksydazą i substratu chemiluminescencyjnego, co pozwala na jednoczesne wykrywanie wielu IgE specyficznych dla alergenu.

Oparty na kartridżu mikroprzepływowym system wykrywania swoistej dla alergenu E immunoglobuliny E

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania cząstek obciążonych alergenami za pomocą cytometrii przepływowej. Cząstki pyłu zawieszonego w otoczeniu mogą pełnić rolę nośników zaadsorbowanych alergenów. Pokazujemy tutaj, że cytometria przepływowa, metoda szeroko stosowana do charakteryzowania zawieszonych ciał stałych o średnicy &gt;0,5 μm, może być stosowana do pomiaru tych cząstek obciążonych alergenami.

Analiza cytometryczna przepływowa alergenu związanego z cząstkami bet v 1 w PM10

Ta praca opisuje protokół, który wykorzystuje podejście komponentowe do badania wrażliwości na alergeny pyłków traw w kohorcie pacjentów z południowych Chin z alergicznym nieżytem nosa i/lub astmą.

Podejście diagnostyczne z rozdzielczością komponentową w badaniu alergenów pyłków traw u mieszkańców Chin z południa z alergicznym nieżytem nosa i/lub astmą

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą mikroprzepływowego systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu oraz ocenę jego przydatności w diagnostyce alergii.

Zastosowanie technologii mikroprzepływowej Biochip do wykrywania immunoglobuliny E (sIgE) swoistej dla alergenu w surowicy

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

Przedstawiono protokół przeprowadzania wyzwania w komorze do ekspozycji na alergeny (AEC). Udowodniono, że AEC są bezpiecznymi i skutecznymi narzędziami do wywoływania objawów alergicznych lub jako punkt końcowy w testowaniu skuteczności immunoterapii alergenowej ze względu na ich zdolność do utrzymywania stabilnych stężeń cząstek i warunków środowiskowych.

Ocena objawów u pacjentów z alergicznym nieżytem nosa przy użyciu komory do ekspozycji na alergeny

Poznaj test aktywacji bazofili do diagnozy alergii IgE-zależnych metodą cytometrii przepływowej. Ta technika pozwala uniknąć prób prowokacyjnych u pacjentów z ciężkimi reakcjami.

Test aktywacji bazofili do diagnozy alergii

Przeglądaj więcej filmów