Test aktywacji bazofili do diagnozy alergii

Test aktywacji bazofili jest uzupełniającym testem diagnostycznym in vitro do oceny reakcji alergicznych IgE-zależnych, które okazały się przydatne w reakcjach wywołanych przez leki, żywność lub środki wziewne, a także w niektórych postaciach przewlekłej pokrzywki. Test ten opiera się na określeniu odpowiedzi bazofili na aktywację IgE sieciującą alergen lub lek poprzez pomiar markerów aktywacji za pomocą cytometrii przepływowej. Test aktywacji bazofili może być użytecznym i uzupełniającym narzędziem do unikania kontrolowanych testów prowokacyjnych w celu potwierdzenia diagnozy alergii, szczególnie u osób doświadczających ciężkich reakcji zagrażających życiu.

Co więcej, test ten ma tę zaletę, że jest w stanie przeanalizować odpowiedź na dowolny lek lub alergen w porównaniu z innymi metodami in vitro, które są dostępne tylko dla kilku leków i alergenów. Główne ograniczenia testu są związane z nieoptymalną czułością, zwłaszcza w przypadku alergii na leki. Konieczność wykonania badania nie później niż 24 godziny po pobraniu próbki oraz brak standaryzacji między laboratoriami i algorytmami diagnostycznymi.

Zacznij od zebrania krwi obwodowej w dziewięciomililitrowych probówkach z heparyną i umieść próbki w wirniku, aby utrzymać je w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą wymagane w protokole eksperymentalnym. Oznacz dwie pięciomililitrowe probówki cytometru każda dla kontroli ujemnej i kontroli pozytywnej. Oznacz również po jednej probówce dla różnych stężeń alergenów lub leków, które są testowane.

Następnie umieść rurki w stojaku, aby rurki idealnie pasowały bez poślizgu. Do pierwszej kontroli pozytywnej przygotuj czteromikromolowy roztwór N-formylometylo-leucylo-fenyloalaniny lub fMLP w 0,05% PBS-T Aby potwierdzić jakość bazofili. Do drugiej kontroli pozytywnej należy przygotować roztwór anty-IgE o stężeniu 0,05 miligrama na mililitr przy użyciu PBS-T.

Przygotować mieszaninę barwiącą, dodając po jednym mikrolitrze przeciwciał CCR3-APC, CD203c-PE i CD63-FITC na 20 mikrolitrów buforu stymulacyjnego. Następnie dodaj 23 mikrolitry tej mieszanki barwiącej do każdej probówki. Dodać 100 mikrolitrów PBS-T do probówek kontroli ujemnej.

Dodać 100 mikrolitrów fMLP do jednej z probówek kontroli pozytywnej i dodać 100 mikrolitrów anty-IgE E do drugiej do pozostałych probówek. Dodaj 100 mikrolitrów różnych stężeń alergenu lub leku i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji delikatnie dodaj 100 mikrolitrów krwi do każdej probówki, aby uniknąć hemolizy.

Następnie delikatnie wirować rurki i inkubować je przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem. Utrzymuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej pięć minut, aby zatrzymać degranulację. Do każdej probówki dodaj dwa mililitry buforu lizującego w celu lizy erytrocytów.

Wirować każdą probówkę, a następnie inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odwirować probówki o masie 300 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie przewróć stojak do zlewu, aby zdekantować supernatant, podczas gdy komórki pozostaną na dnie rurek.

Dodaj trzy mililitry PBS-T do każdej probówki, aby umyć komórki i wymieszać probówki. Wykonaj drugą rundę wirowania przy użyciu tego samego zestawu parametrów i zdekantuj supernatant, przewracając stojak do zlewu. Następnie utrzymuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem do czasu cytometrii przepływowej.

Podłącz cytometr przepływowy do oprogramowania komputerowego i poczekaj, aż cytometr będzie gotowy. Załaduj ustawienia szablonu i instrumentu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Rozpocznij proces pobierania próbki.

Aby wybrać aktywowane bazofile, najpierw bramkują limfocyty z wykresu rozproszenia bocznego i do przodu. Następnie bramkują bazofile z populacji limfocytów jako komórki CCR3 + CD203c + i uzyskują co najmniej 500 bazofili na probówkę. Ustaw próg CD63 na około 2,5% za pomocą probówek kontroli ujemnej i przeanalizuj próbki.

Reakcje nadwrażliwości IgE-zależnej badano, wykonując test aktywacji bazofili (BAT) z użyciem alergenów i leków. Wrażliwość bazofili analizowano, mierząc reaktywność przy wielokrotnie malejących stężeniach alergenów, które pomagają określić stężenie alergiczne, które indukuje odpowiedź 50% bazofili lub EC50. Po pierwsze, limfocyty bramkowano z bocznego wykresu rozproszenia do przodu.

Następnie bazofile bramkowano z populacji limfocytów jako komórki CCR3 + CD203c +. Następnie wykorzystano wykres CCR3-CD63 do analizy aktywacji bazofili przy użyciu CD63 jako markera aktywacji dla dwóch leków i różnych stężeń alergenu. Test jest wykonywany na świeżej krwi pełnej i musi być wykonany nie później niż 24 godziny po pobraniu krwi.

Bodziec zastosowany w badaniu nie powinien zawierać żadnych substancji pomocniczych i należy wziąć pod uwagę charakterystykę chemiczną leków. Inne dodatkowe metody in vitro do diagnozowania reakcji alergicznych IgE-zależnych lub oznaczania sIgE lub testu uwalniania histaminy.