Name: Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metodę znakowania immunofluorescencyjnego białek wirusów roślinnych i wektorów owadów w jelitach pluskwiaka. Ta technika umożliwia wizualizację struktur jelit i badanie mechanizmów transmisji wirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31630058 dla X.W. i 31772134 dla W.L.).

1. Hodowla owadów niewirusowatych
<ol>
	<li>Zebrać WBPH z pól ryżowych i wyhodować z sadzonkami ryżu w szklanych zlewkach o pojemności 1 litra pokrytych siatką przeciw owadom w inkubatorze w temperaturze 28 °C, przy 16 godzinach światła i 8 godzinach ciemności. Ponieważ SRBSDV nie jest przenoszony przez jaja, nowo wyklute nimfy nie są zjadliwe.</li>
	<li>Za pomocą pisaka do szczotek delikatnie zetrzyj owady ze zlewki hodującej owady do nowej zlewki ze świeżymi sadzonkami ryżu co tydzień, aż wyklują się nimfy WBPH. Kontynuuj hodowlę tych wyklutych, niewirusowatych nimf do stadium 2- lub 3-calowego. 
	UWAGA: Ostrożnie szczotkować, aby WBPH nie wylatywały ze zlewki ani nie uszkadzały ich.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie wirusów i zbieranie wirusowych owadów
<ol>
	<li>Przenieść owady niewirusożerne ze szklanych zlewek na świeże rośliny ryżu zakażone SRBSDV pokryte siatką odporną na owady przez 2-dniowy okres dostępu do nabycia wirusa (AAP) poprzez żerowanie na roślinach. Następnie zbierz owady w szklanych zlewkach zawierających świeże sadzonki ryżu.</li>
	<li>Po 2 dniach zebrać owady ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora w celu wypreparowania i wycięcia jelita. 
	UWAGA: Minimalny AAP SRBSDV wynosi 5 minut zarówno dla nimf WBPH, jak i dorosłych, ale owady powinny mieć możliwość żerowania na świeżych roślinach ryżu zakażonych SRBSDV przez 2 dni, aby osiągnąć skuteczność pozyskiwania do 80%.</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Rozpuścić 8,5 g NaCl, 3,5 g Na2HPO4·12H2O i 0,25 g NaH2PO4 w 1 ml ddH2O, aby przygotować 0,01 M roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Dodać 4 g paraformaldehydu do 100 ml PBS, aby otrzymać 4% (m/v) paraformaldehydu w PBS.</li>
	<li>Dodaj 2 ml Triton X-100 do 98 ml PBS, aby przygotować 2% (v/v) Triton X-100.</li>
</ol>
4. Sekcja dorosłych i wycięcie wnętrzności
<ol>
	<li>Za pomocą pipety umieścić 100 μl PBS na szkiełku podstawowym (PBS). Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.</li>
	<li>Zebrać dorosłe osobniki zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora i umieścić je w probówkach o pojemności 1,5 ml. Umieść rurki na lodzie, aby sparaliżować owady, a następnie przenieś sparaliżowaną osobę dorosłą do 100 μl PBS na szkiełku z brzuchem do góry. 
	UWAGA: Owady zostaną całkowicie sparaliżowane po 5 minutach na lodzie.</li>
	<li>Użyj pęsety w jednej ręce, aby zacisnąć ciało, a następnie zdejmij głowę za pomocą innego zestawu pęsety w drugiej ręce.</li>
	<li>Zaciśnij boki brzucha jednym zestawem pęsety i zaciśnij pokładełko lub narząd kopulacyjny ogona drugim zestawem. Następnie ostrożnie odciągnij błonę międzysegmentową jednego segmentu brzusznego i powoli odsłaniaj jelito w jamie brzusznej.</li>
	<li>Kontynuuj odrywanie błony i stopniowo wyciągaj całe jelito z brzucha. Delikatnie oderwij ogon, który jest połączony z końcem jelita, aby usunąć całe jelito. 
	UWAGA: Pociągnij bardzo ostrożnie, w przeciwnym razie jelito zostanie uszkodzone.</li>
	<li>Umieść wycięte wnętrzności w probówce wirówkowej o pojemności 200 μl, dodaj 200 μl PBS do probówki i delikatnie odsysaj-uwalniaj roztwór za pomocą pipety, aby dokładnie umyć wnętrzności.</li>
</ol>
5. Sekcja nimf i wycięcie wnętrzności
UWAGA: Ciała nimf są bardziej kruche niż ciała dorosłych, a jelita łatwo ulegają uszkodzeniu, gdy są ściągane z ogona. Dlatego najbardziej niezawodną metodą wycięcia jelita nimfy jest pociągnięcie od głowy.
<ol>
	<li>Za pomocą pipety umieścić 100 μl PBS na szkiełku podstawowym (PBS). Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.</li>
	<li>Zebrać nimfy zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora i umieścić je w probówkach o pojemności 1,5 ml. Umieść rurki na lodzie, aby sparaliżować owady. Następnie przenieś sparaliżowaną nimfę do 100 μl buforu na szkiełku z brzuchem skierowanym do góry.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby odczepić ogon nimfy. Następnie zaciśnij ciało owada, aby delikatnie przymocować i użyj drugiego zestawu, aby zacisnąć głowę. Delikatnie odciągnij głowę od ciała, nadal utrzymując jej przyczepienie do jelita, tak aby głowa była odłączona od ciała, ale jelito było nadal przyczepione do klatki piersiowej i brzucha. 
	UWAGA: Po oderwaniu głowy ciało adiposum nimfy wypłynie, powodując zmętnienie PBS. Usunąć mętny roztwór PBS i zastąpić go 100 μl świeżego PBS.</li>
	<li>Gdy pęseta nadal zaciska ciało, użyj drugiego zestawu, aby ostrożnie przesunąć głowę i stopniowo wyciągaj jelito.</li>
	<li>Delikatnie odłącz jelito od głowy za pomocą pęsety i ostatecznie uzyskaj nienaruszone jelito bez uszkadzania ciała skoczka.</li>
	<li>Wycięte wnętrzności umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 200 μl, dodać 200 μl PBS do probówki i delikatnie odssać roztwór za pomocą pipety, aby dokładnie umyć wnętrzności. 
	UWAGA: Wycięte jelita należy dobrze oczyścić PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające ciała tłuszczowe z jamy brzusznej; Mogą zakłócać protokół barwienia.</li>
</ol>
6. Protokoły znakowania wirionów SRBSDV i białka owada
<ol>
	<li>Przygotować przeciwciała i pożywkę montażową używane w tym teście. Przeciwciała to przeciwciało anty-SRBSDV znakowane Dylight 549 (czerwony) przeciwko wirionom SRBSDV 18, przeciwciało anty-VAMP7 znakowane Dylight 488 (zielony) przeciwko białku owadziemu VAMP716,19, Dylight 633 falloidyna (niebieska) i pożywka montażowa zawierająca 4,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI, niebieski).</li>
	<li>Świeżo wycięte i umyte PBS wnętrzności WBPH należy natychmiast umieścić w 100 μl 4% (m/v) paraformaldehydu w probówce wirówkowej o pojemności 200 μl i trzymać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Świeżo wycięte jelita WBPH nie powinny być moczone w PBS przez dłuższy czas, w przeciwnym razie komórki nabłonkowe zostaną uszkodzone.</li>
	<li>Usunąć 4% (m/v) paraformaldehydu za pomocą pipetora, a następnie dodać 200 μl PBS do probówki wirówkowej o pojemności 200 μl. Po 10 minutach usunąć PBS za pomocą pipety, aby wyeliminować wszelkie paraformaldehydy.</li>
	<li>Powtórz ten krok prania PBS dwukrotnie.</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj 200 μl niejonowego detergentu Triton X-100 (2%, v/v). Próbki należy przepuszczać w niejonowym detergencie przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 2% (v/v) Triton X-100 za pomocą pipetora, a następnie zmyć pozostały detergent trzema 10-minutowymi płukaniami z użyciem 200 μl PBS (patrz kroki 6.3 i 6.4).</li>
	<li>Rozcieńczone przeciwciało anty-SRBSDV znakowane Dylight 549 (czerwony) i przeciwciało anty-VAMP7 znakowane Dylight 488 (zielony) 1:50 z 50 μl albuminy surowicy byka (3%, m/v).</li>
	<li>Dodać rozcieńczone przeciwciała do probówki i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczalnik przeciwciał za pomocą pipetora, a następnie zmyć pozostały rozcieńczalnik przeciwciał trzema 10-minutowymi płukaniami z 200 μl PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl falloidyny Dylight 633 z 50 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonej falloidyny do probówki i inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczalnik falloidyny za pomocą pipetora, a następnie zmyć pozostałą falloidynę trzema 10-minutowymi płukaniami 200 μl PBS. 
	UWAGA: Dokładne pranie ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia tła i niespecyficznego wiązania.</li>
	<li>Umieść kroplę podłoża montażowego zawierającego DAPI na szkiełku mikroskopowym i przenieś wnętrzności do podłoża. 
	UWAGA: Delikatnie rozłóż każde jelito pęsetą i unikaj tworzenia bąbelków. Na jednym slajdzie przypada około 15 wnętrzności.</li>
	<li>Delikatnie umieść szkło nakrywkowe na próbkach, nie tworząc pęcherzyków. 
	UWAGA: Szkiełko należy trzymać w temperaturze 4 °C w ciemności, aby zahamować wygaszanie fluorescencji przed obserwacją za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Zobacz wszystkie próbki za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Uchwyć obrazy za pomocą niebieskiego światła i zapisz pliki na komputerze.</li>
</ol>

<ol><li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+transmission+of+plant+viruses%3A+a+new+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li>
<li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Neotropical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li>
<li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector%3A+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069(2020).</li>
<li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+%28Geminiviridae%3B+Begomovirus%29+by+its+whitefly+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li>
<li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li>
<li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+black-streaked+dwarf+virus%3A+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li>
<li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262(2021).</li>
<li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li>
<li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201(2018).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li>
<li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+fluorescence+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591(2017).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909(2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728(2020).</li>
<li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445(2016).</li>
<li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li>
<li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li>
<li>Ammar, E. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmmar%2C+ED+%22Internal+morphology+and+ultrastructure+of+leafhoppers+and+planthoppers%22">Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers</a>. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1(1985).</li>
<li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+%28Homoptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fla+Entomology%22%5BJournal%5D)">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563(1996).</li>
<li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+reoviruses+in+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li>
<li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining%27omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531(2017).</li>
<li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych punktów. Po pierwsze, konieczny jest wysoki stosunek owadów zjadliwych w całej populacji. Chociaż minimalny AAP dla SRBSDV przez nimfy WBPH i dorosłe osobniki wynosi 5 min17, owadom należy pozwolić na żerowanie na świeżych roślinach ryżu zakażonych SRBSDV przez 2 dni, aby osiągnąć wydajność pozyskiwania do 80%. Ponieważ wiriony SRBSDV można wykryć w 80% jelit środkowych18, wycięliśmy i oznaczyliśmy zjadli...

Najbardziej opisane wirusy roślinne są przenoszone przez owady z rzędu Hemiptera, który obejmuje mszyce, mączliki, skoczki, skoczki i wciornastki1,2. Przeszywająco-ssące aparaty gębowe owadów pluskwiaków przebijają tkankę roślinną w celu odżywiania i wydzielania śliny, jednocześnie skutecznie przenosząc wirusa2. Opisano różne mechanizmy przenoszenia wirusów roślinnych przez owady wektorowe. Należą do nich nietrwałe, półtrwałe i trwałe. Trwały typ to albo niepropagacyjny, albo propagacyjny3,4, ale w przypadku obu tych typów przenoszony wirus musi przemieszczać się po całym ciele owada. W trybie uporczywego rozmnażania wirusy początkowo infekują i replikują się w komórkach nabłonka jelita owada, a następnie rozprzestrzeniają się do różnych tkanek, a ostatecznie do gruczołów ślinowych, skąd mogą być następnie wprowadzane do rośliny przez ślinę podczas żerowania owadów5,6. Uporczywie przenoszone wirusy przemieszczają się przez różne narządy i replikują się w swoich owadach wektorach, co wymaga określonych interakcji między komponentami wirusa i wektora na różnych etapach7,8.
Białka wirusowe i białka owadów muszą ze sobą współdziałać, aby ułatwić krytyczne procesy rozpoznawania, infekcji, replikacji lub rozprzestrzeniania się wirusa u owadów wektorowych9,10. Chociaż mikroskopia optyczna może być używana do obserwacji struktur komórkowych owadów, nie może pokazać rozmieszczenia wirionów, lokalizacji komórkowej lub kolokalizacji białek wirusowych i białek owadów ani ultrastruktury tkanek i komórek owadów. Znakowanie immunofluorescencyjne zostało po raz pierwszy przeprowadzone przez Coonsa i wsp. w komórkach fagocytarnych myszy za pomocą znakowania specyficznych przeciwciał fluoresceinowych, a obecnie jest szeroko stosowane11. Technika immunofluorescencji, znana również jako technika przeciwciał fluorescencyjnych, jest jedną z najwcześniejszych opracowanych technik znakowania immunologicznego i opiera się na specyficznej reakcji wiązania między antygenem a przeciwciałem11,12. Znane przeciwciało jest najpierw znakowane fluoresceiną, która jest używana jako sonda do wykrywania odpowiednich antygenów w komórkach lub tkankach13,14. Po tym, jak przeciwciało znakowane fluoresceiną zwiąże się z odpowiednim antygenem w komórkach lub tkankach, sonda będzie emitować jasną fluorescencję, gdy zostanie naświetlana długościami fal wzbudzenia i oglądana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu zlokalizowania antygenu15.
Większość owadów wektorowych wirusów roślinnych to pluskwiaki. Większe zagęszczenie populacji owadów-wektorów, które mają wysoką skuteczność transmisji wirusa roślinnego, może prowadzić do epidemii wirusów5. Wirus czarnej karłowatości ryżu południowego (SRBSDV, rodzaj Fijivirus, rodzina Reoviridae), jeden z najpoważniejszych patogenów ryżu, szybko rozprzestrzenił się na obszarach uprawy ryżu w Azji Wschodniej i Południowo-Wschodniej i spowodował poważne straty w plonach od 2010 roku16,17. Dorosłe osobniki i nimfy skoczka białogrzbietego (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) przenoszą SRBSDV na ryż w sposób trwale rozmnażający się z wysoką wydajnością. Badania terenowe wykazały, że ogniska choroby karłowatej z czarnymi smugami ryżu wywołanej przez SRBSDV zwykle zbiegają się z masową migracją WBPH na duże odległości, co jest kluczowym czynnikiem epidemii SRBSDV7,8,18. Białko błonowe 7 związane z pęcherzykami (VAMP7) jest rozpuszczalnym receptorem białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE), który może pośredniczyć w transporcie substancji poprzez fuzję pęcherzyków. VAMP7 oddziałuje z zewnętrznym głównym białkiem kapsydu SRBSDV in vitro, co wskazuje, że VAMP7 może być ściśle związany z transmisją wirusa16.
W przedstawionym tutaj protokole wycięliśmy jelito z wiruliferycznego WBPH jako przykład do oznaczania wirionów SRBSDV i VAMP7 w komórkach nabłonka jelita środkowego16. Jako początkowe miejsce inwazji wirusa, nabłonek jelita środkowego odgrywa istotną rolę w infekcji, replikacji i przenoszeniu wirusa. Po pierwsze, szczegółowo opisaliśmy kroki, które należy wykonać, aby wyciąć jelita od nimf i dorosłych osobników WBPH. Po drugie, użyliśmy specyficznych przeciwciał znakowanych fluoresceiną do znakowania wirionów SRBSDV i VAMP7 w komórkach nabłonka jelitowego. Następnie obserwowaliśmy komórki nabłonkowe i lokalizację komórkową wirionów i VAMP7 za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Wyniki wykazały, że wiriony SRBSDV i VAMP7 mogą kolokalizować się w cytoplazmie komórek nabłonka jelita środkowego, co sugeruje, że specyficzna funkcja VAMP7 może być związana z rozprzestrzenianiem się wirionów z komórek nabłonka jelita środkowego.

<table><tbody><tr><td>3% albumina surowicy byka (BSA)</td><td>Coolaber</td><td>SL1331</td><td>Rozcieńczone przeciwciała</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Solarbio</td><td>YA0771-18*18mm</td><td>Do produkcji szkiełek</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Beitja</td><td>XTL-7045B1</td><td>Do rozwarstwiania owadów</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM880</td><td>Obserwuj sygnał fluorescencji</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Solarbio</td><td>ZBP-7105</td><td>Do produkcji szkiełek</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe z 4'6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI)</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td>Etykieta necleus</td></tr><tr><td>komórkowy Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Do utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>Falloidyna</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A22284</td><td>Etykieta aktyna epitieli jelita środkowego</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0290C484</td><td>Do przenikania tkanek</td></tr><tr><td>Pęseta (5-SA)</td><td>AsOne</td><td>6-7905-40</td><td>Do preparacji owadów</td></tr></tbody></table>

znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Większość wirusów roślinnych w naturze jest przenoszona z jednej rośliny na drugą przez owady pluskwiaków. Duże zagęszczenie populacji owadów-wektorów, które są bardzo skuteczne w przenoszeniu wirusa, odgrywa kluczową rolę w epidemiach wirusów na polach. Badanie interakcji wirus-owad może pogłębić naszą wiedzę na temat przenoszenia wirusów i epidemii w celu opracowania nowych strategii zwalczania wirusów roślinnych i ich owadów-wektorów. Znakowanie immunofluorescencyjne jest szeroko stosowane do analizy interakcji między patogenami a gospodarzami i jest stosowane w tym przypadku u skoczka białogrzbietego (WBPH, Sogatella furcifera), który skutecznie przenosi wirusa karłowatego czarnego pasma ryżu południowego (SRBSDV, rodzaj Fijivirus, rodzina Reoviridae), w celu zlokalizowania wirionów i białek owadów w komórkach nabłonka jelita środkowego. Za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej badaliśmy cechy morfologiczne komórek nabłonka jelita środkowego, lokalizację komórkową białek owadów oraz kolokalizację wirionów i białka owada. Protokół ten może być wykorzystany do badania aktywności wirusa u owadów, funkcji białek owadów oraz interakcji między wirusem a owadem wektorem.

Rysunek 1 przedstawia wszystkie etapy niniejszego protokołu: hodowlę owadów, pozyskanie wirusa, wycięcie jelita, znakowanie immunofluorescencyjne oraz przygotowanie preparatu.
Wycięte jelita dorosłych WBPH utrwalono w 4% (m/v) paraformaldehydzie, poddano permeabilizacji przy użyciu 2% (v/v) Triton X-100, a następnie inkubowano z faloidyną Dylight 63310,18. Mikrografia konfokalna z laserowym skanowaniem na ...

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Protokół ten może być wykorzystany do badania różnych ruchów owadów, funkcji białek owadów oraz interakcji między wirusem a owadem wektorem in vivo. Ta metoda jest skuteczna i pouczająca. Struktury jelita owada i komórek pomocniczych są wyraźnie uwidocznione, gdy ogląda się je za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.Procedurę zademonstruje dr Lu Zhang z naszego laboratorium. Na początek przenieś niewirusożerne owady ze szklanych zlewek na świeży wirus karłowatych czarnych pręgowanych smug południowego ryżu, SRBSDV, zainfekowane rośliny ryżu pokryte siatką odporną na owady na dwudniowy okres dostępu do nabycia wirusa. Następnie zbierz owady w szklanych zlewkach zawierających świeże sadzonki ryżu.Po dwóch dniach zbierz owady ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora do wypreparowania i wycięcia jelita. Przygotować 0,01 mola PBS, 4% paraformaldehydu i 2% Triton X-100 zgodnie z opisem w manuskrypcie. Za pomocą pipetera umieść 100 mikrolitrów PBS na szklanym szkiełku podstawowym i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.Użyj ręcznego aspiratora, aby zebrać dorosłe osoby zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek i umieść je w 1,5-mililitrowej tubce na lodzie, aby sparaliżować owady. Przenieś sparaliżowaną osobę dorosłą do 100 mikrolitrów PBS na szkiełku z brzuchem do góry. Użyj pęsety, aby zacisnąć korpus i zdejmij głowę innym zestawem pęsety.Za pomocą jednego zestawu pęsety zaciśnij boki brzucha i zaciśnij pokładełko lub narząd kopulacyjny ogona drugim zestawem, a następnie ostrożnie pociągnij błonę międzysegmentową jednego segmentu brzusznego, aby powoli odsłonić jelito w jamie brzusznej. Kontynuuj odrywanie błony i stopniowo wyciągaj całe jelito z brzucha. Delikatnie oderwij ogon, który jest połączony z końcem jelita, aby usunąć całe jelito.Umieść wycięte wnętrzności w probówce wirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów. Dodaj 200 mikrolitrów PBS do probówki i za pomocą pipety dokładnie umyj wnętrzności. Za pomocą pipetera umieść 100 mikrolitrów PBS na szklanym szkiełku podstawowym i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.Użyj ręcznego aspiratora, aby zebrać nimfy zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek i umieść je w 1,5-mililitrowej probówce umieszczonej na lodzie, aby sparaliżować owady. Przenieś sparaliżowaną nimfę do 100 mikrolitrów buforu na szkiełku z brzuchem skierowanym do góry. Odczep ogon nimfy, a następnie zaciśnij ciało owada, aby delikatnie go przymocować i użyj drugiej pary do zaciśnięcia głowy.Delikatnie odciągnij głowę od ciała, nadal utrzymując jej przyczepienie do jelita, tak aby głowa była odłączona od ciała, ale jelito było nadal przyczepione do klatki piersiowej i brzucha. Gdy pęseta nadal zaciska ciało, użyj drugiej pary, aby ostrożnie przesunąć głowę i stopniowo wyciągać jelito. Odłącz jelito od głowy, aby uzyskać nienaruszone jelito bez uszkadzania ciała.Umieść wycięte wnętrzności w probówce. Dodaj PBS do probówki i delikatnie zassaj, uwolnij roztwór pipetą, aby dokładnie umyć wnętrzności. Przygotować przeciwciała i pożywkę montażową zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.Umieść świeżo wycięte i umyte PBS wnętrzności WBPH w 100 mikrolitrach 4% paraformaldehydu w probówce wirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów w temperaturze pokojowej. Po dwóch godzinach zastąp roztwór paraformaldehydu 200 mikrolitrami PBS. Po 10 minutach usuń PBS, aby wyeliminować paraformaldehyd i powtórz etap prania PBS dwukrotnie.Po dwóch płukaniach PBS dodaj 200 mikrolitrów niejonowego detergentu Triton X-100, aby przepuszczalność próbek w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach wyjmij Triton X-100 i zmyj pozostały detergent trzema 10-minutowymi praniami PBS. Rozcieńczyć znakowane przeciwciała w stosunku jeden do 50 50 mikrolitrami albuminy surowicy byka.Dodaj rozcieńczone przeciwciała do probówki i inkubuj próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka po usunięciu przeciwciała zmyć pozostały rozcieńczalnik z przeciwciałami trzema 10-minutowymi płukaniami PBS. Rozcieńczyć jeden mikrolitr DyLight 633-Phalloidin z 50 mikrolitrami PBS i dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonej falloidyny do probówki na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.Po usunięciu falloidyny dokładnie zmyj pozostałą falloidynę trzema 10-minutowymi płukaniami PBS. Umieścić kroplę podłoża montażowego zawierającego DAPI na szkiełku mikroskopowym. Przenieś wnętrzności do pożywki i delikatnie umieść szkło nakrywkowe na próbce, nie tworząc pęcherzyków.Reprezentatywny skaningowy mikroskop konfokalny z laserowym wyciętym jelitem WBPH od dorosłych po znakowaniu falloidyną wykazał trzy sekcje: jelito przednie, jelito środkowe i jelito tylne. Wśród nich jelito środkowe jest początkowym miejscem zakażenia SRBSDV. Jednowarstwowa struktura komórek nabłonka jelita ułatwia badanie lokalizacji komórkowej białek owadów oraz kolokalizacji białek wirusowych i owadzich.Wycięte jelita WBPH z anty-VAMP-7 znakowane DyLight 488 i wiriony SRBSDV z przeciwciałem anty-SRBSDV znakowanym DyLight 549 są pokazane tutaj. Wykazano, że wiriony VAMP-7 i SRBSDV kolokalizują się w cytoplazmie, co sugeruje, że VAMP-7 może odgrywać rolę w przenoszeniu wirusa in vivo. Permeabilizowane jelita należy dokładnie oczyścić po inkubacji z przeciwciałami sprzężonymi z lucyferyną, aby zmniejszyć tło i niespecyficzne wiązanie.Jest to niezawodna metoda sprawdzania lokalizacji wirusa, innych patogenów i białek owadów u owadów. Stanowi ona podstawę do dalszych badań nad relacjami między patogenami a owadami.

immunofluorescent-labeling-plant-virus-insect-vector-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mszyce są skutecznymi wektorami wirusów roślinnych. Mikroiniekcja wirusa do mszycy, procedura którą zaprezentujemy dzisiaj, jest techniką pozwalającą badaczom na wstrzykiwanie wirusa bezpośrednio do hemocelu mszycy, z pominięciem jelita, które stanowi jedną z dwóch głównych barier w cyrkulacyjnym przekazywaniu wirusa. Ta sama technika jest również stosowana do wstrzykiwania dsRNA w celu wywołania RNAi.

Badanie fizjologicznych barier transmisji wirusów u mszyc z wykorzystaniem mikroiniekcji

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Opisujemy metodę immunofluorescencji i ilościowego PCR do lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach owadów. Protokół immunofluorescencji może być stosowany do kolokalizacji białek wirusowych i wektorowych. Ilościowy protokół PCR można rozszerzyć w celu ilościowego oznaczania wirusów w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem.

Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

Ten protokół pokazuje, jak używać gospodarza roślinnego do wykrywania białek ślinowych skoczka i wirusów roślinnych uwalnianych przez wektory skoczków.

Wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Poznaj metodę znakowania immunofluorescencyjnego białek wirusów roślinnych i wektorów owadów w jelitach pluskwiaka. Ta technika umożliwia wizualizację struktur jelit i badanie mechanizmów transmisji wirusów.

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Przeglądaj więcej filmów