Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Protokół ten może być wykorzystany do badania różnych ruchów owadów, funkcji białek owadów oraz interakcji między wirusem a owadem wektorem in vivo. Ta metoda jest skuteczna i pouczająca. Struktury jelita owada i komórek pomocniczych są wyraźnie uwidocznione, gdy ogląda się je za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Procedurę zademonstruje dr Lu Zhang z naszego laboratorium. Na początek przenieś niewirusożerne owady ze szklanych zlewek na świeży wirus karłowatych czarnych pręgowanych smug południowego ryżu, SRBSDV, zainfekowane rośliny ryżu pokryte siatką odporną na owady na dwudniowy okres dostępu do nabycia wirusa. Następnie zbierz owady w szklanych zlewkach zawierających świeże sadzonki ryżu.

Po dwóch dniach zbierz owady ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora do wypreparowania i wycięcia jelita. Przygotować 0,01 mola PBS, 4% paraformaldehydu i 2% Triton X-100 zgodnie z opisem w manuskrypcie. Za pomocą pipetera umieść 100 mikrolitrów PBS na szklanym szkiełku podstawowym i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.

Użyj ręcznego aspiratora, aby zebrać dorosłe osoby zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek i umieść je w 1,5-mililitrowej tubce na lodzie, aby sparaliżować owady. Przenieś sparaliżowaną osobę dorosłą do 100 mikrolitrów PBS na szkiełku z brzuchem do góry. Użyj pęsety, aby zacisnąć korpus i zdejmij głowę innym zestawem pęsety.

Za pomocą jednego zestawu pęsety zaciśnij boki brzucha i zaciśnij pokładełko lub narząd kopulacyjny ogona drugim zestawem, a następnie ostrożnie pociągnij błonę międzysegmentową jednego segmentu brzusznego, aby powoli odsłonić jelito w jamie brzusznej. Kontynuuj odrywanie błony i stopniowo wyciągaj całe jelito z brzucha. Delikatnie oderwij ogon, który jest połączony z końcem jelita, aby usunąć całe jelito.

Umieść wycięte wnętrzności w probówce wirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów. Dodaj 200 mikrolitrów PBS do probówki i za pomocą pipety dokładnie umyj wnętrzności. Za pomocą pipetera umieść 100 mikrolitrów PBS na szklanym szkiełku podstawowym i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.

Użyj ręcznego aspiratora, aby zebrać nimfy zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek i umieść je w 1,5-mililitrowej probówce umieszczonej na lodzie, aby sparaliżować owady. Przenieś sparaliżowaną nimfę do 100 mikrolitrów buforu na szkiełku z brzuchem skierowanym do góry. Odczep ogon nimfy, a następnie zaciśnij ciało owada, aby delikatnie go przymocować i użyj drugiej pary do zaciśnięcia głowy.

Delikatnie odciągnij głowę od ciała, nadal utrzymując jej przyczepienie do jelita, tak aby głowa była odłączona od ciała, ale jelito było nadal przyczepione do klatki piersiowej i brzucha. Gdy pęseta nadal zaciska ciało, użyj drugiej pary, aby ostrożnie przesunąć głowę i stopniowo wyciągać jelito. Odłącz jelito od głowy, aby uzyskać nienaruszone jelito bez uszkadzania ciała.

Umieść wycięte wnętrzności w probówce. Dodaj PBS do probówki i delikatnie zassaj, uwolnij roztwór pipetą, aby dokładnie umyć wnętrzności. Przygotować przeciwciała i pożywkę montażową zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

Umieść świeżo wycięte i umyte PBS wnętrzności WBPH w 100 mikrolitrach 4% paraformaldehydu w probówce wirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów w temperaturze pokojowej. Po dwóch godzinach zastąp roztwór paraformaldehydu 200 mikrolitrami PBS. Po 10 minutach usuń PBS, aby wyeliminować paraformaldehyd i powtórz etap prania PBS dwukrotnie.

Po dwóch płukaniach PBS dodaj 200 mikrolitrów niejonowego detergentu Triton X-100, aby przepuszczalność próbek w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach wyjmij Triton X-100 i zmyj pozostały detergent trzema 10-minutowymi praniami PBS. Rozcieńczyć znakowane przeciwciała w stosunku jeden do 50 50 mikrolitrami albuminy surowicy byka.

Dodaj rozcieńczone przeciwciała do probówki i inkubuj próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka po usunięciu przeciwciała zmyć pozostały rozcieńczalnik z przeciwciałami trzema 10-minutowymi płukaniami PBS. Rozcieńczyć jeden mikrolitr DyLight 633-Phalloidin z 50 mikrolitrami PBS i dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonej falloidyny do probówki na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu falloidyny dokładnie zmyj pozostałą falloidynę trzema 10-minutowymi płukaniami PBS. Umieścić kroplę podłoża montażowego zawierającego DAPI na szkiełku mikroskopowym. Przenieś wnętrzności do pożywki i delikatnie umieść szkło nakrywkowe na próbce, nie tworząc pęcherzyków.

Reprezentatywny skaningowy mikroskop konfokalny z laserowym wyciętym jelitem WBPH od dorosłych po znakowaniu falloidyną wykazał trzy sekcje: jelito przednie, jelito środkowe i jelito tylne. Wśród nich jelito środkowe jest początkowym miejscem zakażenia SRBSDV. Jednowarstwowa struktura komórek nabłonka jelita ułatwia badanie lokalizacji komórkowej białek owadów oraz kolokalizacji białek wirusowych i owadzich.

Wycięte jelita WBPH z anty-VAMP-7 znakowane DyLight 488 i wiriony SRBSDV z przeciwciałem anty-SRBSDV znakowanym DyLight 549 są pokazane tutaj. Wykazano, że wiriony VAMP-7 i SRBSDV kolokalizują się w cytoplazmie, co sugeruje, że VAMP-7 może odgrywać rolę w przenoszeniu wirusa in vivo. Permeabilizowane jelita należy dokładnie oczyścić po inkubacji z przeciwciałami sprzężonymi z lucyferyną, aby zmniejszyć tło i niespecyficzne wiązanie.

Jest to niezawodna metoda sprawdzania lokalizacji wirusa, innych patogenów i białek owadów u owadów. Stanowi ona podstawę do dalszych badań nad relacjami między patogenami a owadami.