Wieloczynnikowa ocena zachowań motorycznych u szczurów po jednostronnym urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego
31 lipca 2021
Udostępniamy protokół oceny zachowań motorycznych za pomocą baterii testów behawioralnych u szczurów po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego.
Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie procedur związanych z wykonywaniem nieodtwarzalnego zmiażdżenia nerwu kulszowego oraz zapewnienie protokołu oceny zachowań motorycznych po urazie obwodowym. Wybór potężnej i niezawodnej baterii testów behawioralnych jest niezbędny, aby objąć szeroki zakres aspektów behawioralnych i zależy od zastosowanego modelu zwierzęcego i pytania badawczego. Protokół ten opisuje szczegółowo, jak wykonać uraz zmiażdżenia nerwu kulszowego i zapewnia baterię testów behawioralnych do oceny deficytów motorycznych u szczurów, która obejmuje test na otwartym polu, analizę chodu CatWalk, zadanie chodzenia po belce i zadanie chodzenia po szczeblach drabiny.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z obowiązującymi krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Utrzymuj sterylne środowisko podczas całego zabiegu chirurgicznego. Ustaw stół operacyjny z niezbędnym sprzętem.
Głęboko znieczulij szczura w zamkniętej szafce izofluranem i ogol rozległy obszar prawej kończyny tylnej. Następnie umieść szczura w masce anestezjologicznej i kontynuuj głębokie znieczulenie izofluranem. Przymocuj tułów i obie tylne kończyny szczura za pomocą taśmy.
Ustaw obie tylne kończyny w symetrycznej i wyciągniętej pozycji i obróć każdą łapę płasko na stół operacyjny. Zdezynfekuj skórę ogolonego obszaru odpowiednim środkiem antyseptycznym. Poszukaj wcięcia kulszowego jelita krętego.
Wykonaj nacięcie skóry od wcięcia w rwę kulszową w kierunku łapy za pomocą skalpela. Jeśli kończyny tylne są zamocowane, a nacięcie skóry jest wykonane prawidłowo, można zobaczyć jamę w płaszczyźnie powięziowej między mięśniem pośladkowym maksymalnym a mięśniem dwugłowym uda, która przypomina białą linię. Włóż zamknięte, bardzo cienkie kleszcze hemostatyczne do jamy i rozłóż kleszcze.
Płaszczyzna powięziowa powinna się otworzyć bez uszkadzania tkanki mięśniowej. Umieść zwijacze gumowej opaski pod mięśniami, aby nacięcie skóry było otwarte. Delikatnie usuń otaczające tkanki i naczynia krwionośne z nerwu kulszowego, aż nerw zostanie całkowicie odsłonięty.
Ważne jest, aby podczas całego zabiegu nie rozciągać ani nie ciągnąć nerwu. Zmiażdż nerw kulszowy nieząbkowanym zaciskiem o stałym i szybkim użytecznym nacisku. W tym celu otwórz zacisk, umieść nerw na dolnej szczęce zacisku i zamknij zacisk, blokując go w pierwszej pozycji na 3 x 10 sekund.
Po zranieniu zmiażdżeniem ostrożnie otwórz zacisk. Miejsce zmiażdżenia nerwu kulszowego wydaje się półprzezroczyste. Zdejmij zwijacze z gumową opaską.
Zamknij nacięcie płaszczyzny powięziowej szwem wchłanialnym. Zamknij nacięcie skóry zszywkami do skóry ciała. Aktywność lokomotoryczną, a także aktywność behawioralną szczurów można analizować za pomocą testu w otwartym polu.
Ustawienie otwartego pola, które powinno znajdować się w ciemnym i cichym otoczeniu, składa się z automatycznego systemu śledzenia wideo EthoVision XT oraz areny z odporną na zarysowania, nadającą się do czyszczenia czarną powierzchnią. Ustaw arenę i kamerę we właściwej pozycji i zainstaluj oprogramowanie EthoVision XT. Delikatnie umieść szczura na środku areny testowej.
Podczas nagrywania eksperymentator powinien trzymać się z dala od otwartego pola, aby nie rozpraszać szczura. Aby przeprowadzić analizę danych z otwartego testu terenowego, przejdź do sekcji analizy na lewym pasku bocznym i wybierz Śledź wizualizację"pod Wyniki"patka. Następnie wyeksportuj potrzebne parametry do XL.W oprogramowaniu wybierz szereg zmiennych z różnych kategorii do analizy danych.
Analiza chodu za pomocą systemu CatWalk XT może pomóc w ocenie wielu różnych parametrów dotyczących śladów stóp, postawy i chodu modeli zwierzęcych. Szklany chodnik jest oświetlony zielonym światłem, a światło rozproszone przez ślady zwierząt jest rejestrowane za pomocą szybkiej kamery wideo, która znajduje się pod chodnikiem. Sygnały mogą być analizowane za pomocą oprogramowania CatWalk XT.
Eksperyment musi być przeprowadzony w ciemnościach. Zacznij od skonfigurowania systemu CatWalk XT. Wybierz ustawienia eksperymentalne.
Ustaw aparat w odpowiedniej pozycji i wyreguluj ostrość. Skonfiguruj ustawienia wykrywania. Ustaw ściany korytarza systemu CatWalk i upewnij się, że ściany pozostają równoległe do chodnika.
Określ długość chodnika i skalibruj chodnik. Następnie przyciągnij obraz tła. Do obrazu tła potrzebny jest czysty i pusty chodnik.
Szczur powinien przechodzić przez chodnik bez żadnej przerwy. Zgodnie ze zdefiniowanymi kryteriami uruchamiania, do analizy danych potrzebne są trzy zgodne serie na szczura. Trenuj zwierzęta przez co najmniej osiem dni, zanim rozpoczniesz właściwy eksperyment.
CatWalk powinien być wykonywany co najmniej raz w tygodniu, z 6 do 10 biegami, aby zapewnić ciągłe wykonywanie zadań. W przypadku analizy danych oceń tylko zgodne przebiegi. Klasyfikuj odciski łap automatycznie za pomocą oprogramowania CatWalk XT.
Przejrzyj ręcznie etykiety do drukowania łap. Popraw nieprawidłowe etykiety odcisków łap, dodaj etykiety niewykrytych odcisków łap oraz usuń wszelkie szumy i niewłaściwe etykiety. Wyniki numeryczne wyświetlane w arkuszu XL, pokazujące szereg podstawowych parametrów.
Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat każdego odcisku stopy, sklasyfikuj palce tylnych łap. Do analizy tej wymagany jest interaktywny moduł pomiarów śladu węglowego. Ustaw znaczniki do analizy footprintu ręcznie.
Przeanalizuj każdy odcisk tylnej łapy we wszystkich trzech zgodnych przebiegach. Narysuj linię od środka pierwszego palca u nogi do środka piątego palca, aby zmierzyć rozpiętość palców. Narysuj linię od środka drugiego palca do środka czwartego palca, aby zmierzyć pośredni rozstaw palców.
Narysuj linię od środka trzeciego palca u nogi do pięty tylnej łapy, aby zmierzyć długość wydruku ręcznego. Zapoznaj się z numerycznymi wynikami interaktywnych pomiarów footprintów wyświetlanymi w osobnym arkuszu. Deficyty chodu można określić za pomocą zadania chodzenia na belce.
Zadanie chodzenia z belką w tym konkretnym temacie badawczym skupi się na analizie koordynacji ruchowej, a nie na ocenie równowagi ruchowej. Do zadania chodzenia po belce potrzebna jest belka, przekładka, stół, jednolite tło i kamera. Użyj drewnianej belki o długości 90 centymetrów, szerokości 1,7 centymetra i wysokości 2 centymetrów.
Trenuj zwierzęta przez siedem dni. Umieść szczura na platformie startowej belki. Szczur powinien przejść przez belkę trzy razy bez żadnej przerwy.
Nawet jeśli szczur osiągnie trzy zgodne przebiegi w ciągu pierwszych trzech przebiegów, należy przeprowadzić co najmniej 6 do 10 przebiegów w celu ciągłego wykonywania zadania. Wybierz sekwencje wideo z trzech zgodnych przebiegów z nagrania. Zdefiniuj punkt czasowy rozpoczęcia i punkt czasowy końca wybranych trzech zgodnych przebiegów.
W tym przypadku punkt czasowy rozpoczęcia jest oznaczony czarną linią na belce, a umieszczenie pierwszej tylnej kończyny za czarną linią jest zdefiniowane jako punkt czasowy rozpoczęcia biegu. Umieszczenie pierwszej tylnej kończyny na platformie na końcu belki określa punkt czasu końcowego. Następnie oblicz czas potrzebny szczurowi na przejście przez belkę.
Oceń liczbę kroków i błędów z trzech zgodnych przebiegów dla obu kończyn tylnych osobno, korzystając z funkcji powiększania i zwolnionego tempa w oprogramowaniu. Błędy obejmują całkowite poślizgnięcia stóp i połowy stopy. Całkowity poślizg stopy definiuje się jako ułożenie stopy, po którym następuje głęboki poślizg, powodujący utratę kontaktu dotkniętej łapy z belką.
Półpoślizg definiuje się jako zsuwanie się łapy ze ściany bocznej belki bez utraty całkowitego kontaktu. Oblicz procent poślizgnięć stóp w stosunku do liczby stopni do przejścia przez belkę. Zadanie chodzenia na szczeblu drabiny może ocenić funkcje motoryczne, ułożenie zarówno kończyn przednich, jak i tylnych oraz koordynację między kończynami.
Do tego testu behawioralnego potrzebny jest przyrząd do drabiny, przekładka, stół, jednolite tło i kamera. Aparat z poziomymi szczebelkami literowymi składa się z metalowych szczebli i przezroczystych ścianek bocznych z poliwęglanu. Trenuj zwierzęta przez osiem dni.
Umieść szczura w strefie startowej operatorów szczebla drabiny. Szczur musi trzykrotnie bez przerwy przejść przez 100-centymetrowy chodnik drabiny, aby zakwalifikować się jako bieg spełniający wymagania. Wybierz sekwencje wideo z trzech zgodnych przebiegów z nagrania.
Zdefiniuj punkt czasowy rozpoczęcia i punkt czasowy końca wybranych trzech zgodnych przebiegów. Umiejscowienie kończyny tylnej za pierwszą czarną linią na ścianie bocznej aparatu określa punkt czasowy rozpoczęcia biegu. Umieszczenie pierwszej przedniej kończyny za drugą czarną linią na bocznej ścianie aparatu określa punkt czasowy zakończenia biegu.
Następnie oblicz czas trwania biegu w poprzek chodnika. Oceń trzy zgodne biegi za pomocą 7 kategorii kategorii od Mets i współpracowników, korzystając z funkcji zwolnionego tempa lub klatka po klatce oprogramowania. Określić liczbę kroków i liczbę błędów zgodnie z kategoriami skali dla każdej kończyny z osobna.
Skala rozróżnia następujące kategorie. Totalne pudło. Głęboki poślizg.
Lekki poślizg. Wymiana.Korekta. Częściowe umieszczenie. I prawidłowe umieszczenie.
Następnie oblicz błędy na krok. Reprezentatywne wyniki pięciominutowego testu w otwartym polu pokazują, że uraz zmiażdżenia nerwu, pięć tygodni po operacji, nie ma wpływu na aktywność lokomotoryczną. Analiza chodu za pomocą systemu CatWalk XT generuje wiele różnych parametrów.
Znaczące zmiany można było wykryć w średniej prędkości biegu, długości kroku i obszarze odcisku prawej tylnej łapy z uszkodzonym nerwem. Szczury z uszkodzonymi nerwami typu dzikiego wykazywały znacznie wydłużony czas opóźnienia w przekroczeniu wiązki, w porównaniu ze szczurami naiwnymi typu dzikiego pięć tygodni po urazie. Jako dodatkowy odczyt zadania chodzenia na belce, pełne poślizgi i połowiczne poślizgi kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwu zostały policzone i uznane za błąd do analizy statystycznej.
Odsetek błędów na krok prawej kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwów był znacznie zwiększony u szczurów z uszkodzeniem nerwów typu dzikiego w porównaniu ze szczurami nieleczonymi wcześniej typu dzikiego. Reprezentatywne dane dotyczące zadania chodzenia na szczeblu drabiny nie wykazują istotnych zmian w czasie opóźnienia do przejścia przez chodnik aparatu drabinkowego ani w odsetku błędów na krok prawej kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwu. Analiza procentu błędu na krok kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwu uwzględniała tylko wynik od 0 do 2 w skali 7 kategorii od Metsa i współpracowników.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać uraz zmiażdżenia nerwu kulszowego i jak przeprowadzić wieloczynnikową ocenę zachowań motorycznych u szczurów po jednostronnym zmiażdżeniu nerwu kulszowego. Aby osiągnąć spójne, powtarzalne i porównywalne wyniki po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego, niezbędna jest znormalizowana metoda wywoływania zmiażdżenia nerwu, a także ustandaryzowana charakterystyka fenotypowa. Odpowiednie przeszkolenie do konkretnego testu behawioralnego daje korzyści w postaci oszczędności czasu podczas oceny eksperymentu i uzyskania lepszych wyników.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół oceny zachowań motorycznych u szczurów po urazie zmiażdżeniowym nerwu kulszowego. Metodologia obejmuje kompleksowy zestaw testów behawioralnych zaprojektowanych w celu oceny zakresu deficytów motorycznych, z wykorzystaniem różnych zwalidowanych testów w celu zapewnienia wiarygodnych wyników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Zachowanie zwierząt
- Uszkodzenie nerwów obwodowych
Wstęp
- Uszkodzenia nerwu kulszowego mogą prowadzić do znacznych deficytów motorycznych.
- Niezawodne oceny behawioralne są kluczowe dla zrozumienia procesu rekonwalescencji po urazie.
- Różne testy mogą uwydatnić różne aspekty funkcji motorycznych.
- Utrzymanie sterylnego środowiska chirurgicznego jest niezbędne dla rzetelności eksperymentu.
Cel badania
- Dostarczenie powtarzalnego protokołu zmiażdżenia nerwu kulszowego.
- Przedstawienie kompleksowego zestawu testów do oceny zachowań motorycznych.
- Zwiększenie zrozumienia deficytów motorycznych po urazach obwodowych.
Zastosowane Metody
- Protokół obejmuje procedury chirurgiczne w celu wykonania zmiażdżenia nerwu kulszowego u szczurów.
- Oceny behawioralne obejmują test otwartego pola, analizę chodu CatWalk, próbę chodzenia po belce oraz próbę chodzenia po szczeblach drabiny.
- Szczegółowo opisano rygorystyczne etapy znieczulenia, operacji oraz pozabiegowych ocen behawioralnych.
- W celu zapewnienia wiarygodnych wyników konieczne jest przeprowadzenie wielokrotnych prób treningowych w poszczególnych testach.
Główne wyniki
- Ocena ta dostarcza szczegółowych informacji na temat koordynacji ruchowej i deficytów po uszkodzeniu nerwu kulszowego.
- Wyniki testów behawioralnych mogą wskazywać na postępy w rekonwalescencji oraz stopień uszkodzenia nerwu.
- Analizy zwierząt umożliwiają ilościowy pomiar aktywności lokomotorycznej i parametrów chodu.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje, że znormalizowany protokół może skutecznie oceniać deficyty motoryczne w modelach szczurzych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia skutków uszkodzeń nerwu kulszowego oraz procesu regeneracji.
- Badania te mogą pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych mających na celu poprawę funkcji motorycznych po uszkodzeniach nerwów obwodowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Znormalizowana charakterystyka fenotypowa jest kluczowa dla wiarygodnej oceny deficytów motorycznych w przedklinicznych modelach uszkodzenia nerwów obwodowych. Niniejszy protokół umożliwia powtarzalną ocenę behawioralną w wielu domenach, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad bólem neuropatycznym i zaburzeniami ruchowymi. Podejście wieloczynnikowe zwiększa pewność prognostyczną w zakresie ciągłości translacyjnej od etapu odkryć do faz przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościową ocenę deficytów koordynacji ruchowej po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie powtarzalnego modelu urazu do spójnych badań nad zaangażowaniem celu terapeutycznego.
- Wartość prognostyczna: Umożliwienie biologicznej redukcji ryzyka dzięki standaryzowanemu fenotypowaniu motorycznemu w ramach zestawów testowych.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do przesiewania związków z wykorzystaniem punktów końcowych dotyczących chodu i lokomocji.
- Wyniki ilościowe: Generuje mierzalne parametry, takie jak długość kroku, powierzchnia odcisku oraz procentowy poślizg stopy, do analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wspiera skalowalne, zestandaryzowane przepływy pracy w zespołach zajmujących się odkrywaniem leków i badaniami przedklinicznymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje fenotypy przypominające dystonię w układach predysponowanych genetycznie, co jest zgodne z translacyjnymi strategiami biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez spójną ocenę funkcji motorycznych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Wspiera kryteria go/no-go w oparciu o wskaźniki błędów i latencji w zgodnych seriach pomiarowych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta integruje proces odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w odniesieniu do wskazań nerwowo-mięśniowych i neurodegeneracyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących integralności szlaków ruchowych oraz funkcjonalną walidację celów.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów poprzez standaryzowaną analizę chodu i śledzenie lokomocji.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów długości kroku, powierzchni odcisku, rozstawu palców oraz wskaźników błędów do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez analizę istotnych dla choroby fenotypów ruchowych w modelach DYT-TOR1A.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę fenotypowania behawioralnego do wielokrotnego wykorzystania w modelach uszkodzeń nerwów obwodowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie deficytów motorycznych poprzez wieloparametryczne profilowanie behawioralne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w różnych ośrodkach badawczych i pomiędzy operatorami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację trajektorii regeneracji i ograniczanie ryzyka biologicznego w późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o wskaźniki regeneracji motorycznej oraz stopień uszkodzenia nerwu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii gryzoni, anestezjologii oraz opieki pooperacyjnej.
- Zależność od specjalistycznego sprzętu, w tym systemu CatWalk XT, oprogramowania EthoVision XT oraz skalibrowanej aparatury behawioralnej.
- Konieczność standaryzacji protokołów szkoleniowych, kryteriów przeprowadzania prób oraz potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Uwzględnienie kwestii adaptacyjnych w zależności od szczepów szczurów i modeli urazów w celu zapewnienia spójnego fenotypowania.
- Ograniczenie wynikające z osobniczej zmienności w zakresie regeneracji motorycznej, co wymaga zastosowania odpowiedniej liczebności grup oraz oceny metodą ślepej próby.
