Zastosowanie techniki patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów
3 maja 2021
Ten artykuł o metodzie szczegółowo opisuje główne etapy pomiaru przecieku H+ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pomocą techniki patch-clamp, nowego podejścia do badania termogenicznej zdolności mitochondriów.
Protokół ten opisuje, w jaki sposób technika patch clamp może być wykorzystana do badania termogenicznej zdolności mitochondriów poprzez bezpośredni pomiar mitochondrialnego wycieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Bezpośredni pomiar prądu protonowego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną pomaga zidentyfikować i precyzyjnie scharakteryzować mechanizmy molekularne odpowiedzialne za termogenezę mitochondriów. Technika ta pozwala nie tylko na pomiar prądu protonowego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, ale także na badanie innych przewodnictw ważnych dla funkcji mitochondriów, takich jak wapń lub metabolity, takie jak nukleotydy adeninowe.
Umieść uśpioną mysz na plecach i spryskaj ją alkoholem, aby oczyścić i zwilżyć włosy. Następnie wykonaj dwucentymetrowe nacięcie na klatce piersiowej. Po uchwyceniu skóry pęsetą wypreparuj serce z klatki piersiowej zwierzęcia i opłucz je, aby usunąć całą krew do 10-mililitrowej zlewki z pięcioma mililitrami zimnego roztworu izolacyjnego.
Gdy serce zostanie oczyszczone ze śladów krwi, przenieś je do innej 10-mililitrowej zlewki zawierającej pięć mililitrów zimnego buforu izolacyjnego i posiekaj na cienkie kawałki. Następnie przenieś go do chłodzonego lodem 10-mililitrowego szklanego homogenizatora. Użyj mieszadła górnego, aby homogenizować wstępnie pociętą tkankę na lodzie za pomocą sześciu delikatnych ruchów z kontrolowaną prędkością 275 obrotów na minutę.
Przenieś homogenat do 15-mililitrowej, lodowatej stożkowej probówki i odwiruj go w temperaturze 700 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać jądra i nieuszkodzone komórki. Zbierz supernatant do świeżej 15-mililitrowej probówki i umieść go na lodzie. Odwirować supernatant w temperaturze 8 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać osad zawierający mitochondria.
Ponownie zawiesić osad mitochondrialny w 3,8 mililitra lodowatego hipertonicznego buforu mannitolu i inkubować zawiesinę mitochondrialną na lodzie przez 10 do 15 minut. Napełnij mitochondrialną hipertoniczną zawiesinę mannitolu do chłodzonej mini-komory ciśnieniowej prasy francuskiej. Następnie umieść komórkę na prasie francuskiej.
Następnie wybierz niski tryb prasy francuskiej i skompresuj zawiesinę przez mini-komórkę ciśnieniową pod kątem 110 na tarczy dla mitochondriów brązowego tłuszczu i pod 140 dla mitochondriów serca, upewniając się, że zawiesina wydostaje się z komórki ciśnieniowej w tempie około jednej kropli na sekundę. Zbierz krople w 15-mililitrowej, chłodzonej lodem stożkowej probówce. Odwirować zawiesinę w temperaturze 10 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zawiesić osad mitoplastów w 0,5 do 2 mililitrach lodowatego hipertonicznego buforu chlorku potasu i przechowywać zawiesinę na lodzie. Za pomocą ściągacza do mikropipet należy wyciągnąć włókna ze szkła borokrzemianowego w dniu rejestracji, ustawiając program na ściągaczu służącym do generowania pipet o wysokim stopniu odtwarzalności. Włóż jeden szklany filament do ściągacza i pociągnij, aby uzyskać prawie dwie identyczne pipety do plastrów z jednego włókna borokrzemianowego.
Dostosuj program, gdy pipety stają się niespójne między cyklami ciągnięcia z powodu starzenia się żarnika skrzynki grzewczej ściągacza. Umieść pipetę w polerce do pipet i umieść końcówkę w pobliżu filamentu pod 100-krotnym powiększeniem, aby ją wypolerować. Naciśnij pedał nożny kilka razy, aby podgrzać filament bez zatykania lub uszkadzania krzywizny końcówki.
Polerować do momentu, aż pipety osiągną rezystancję od 25 do 35 megaomów, po napełnieniu roztworem do pipet na bazie TMA. Wstępnie inkubować szkiełka nakrywkowe z 0,1% żelatyną w celu zmniejszenia adhezji mitoplastów i przepłukać je roztworem kąpieli chlorku potasu przed złożeniem zawiesiny mitoplastu. Przygotować surowe rozcieńczenie, mieszając około 35 mikrolitrów stężonej zawiesiny mitoplastu z 500 mikrolitrami roztworu kąpieli chlorku potasu i umieścić go na szkiełkach nakrywkowych uprzednio umieszczonych w studzience na płytce czterodołkowej.
Inkubować na lodzie przez 15 do 20 minut, aby mitoplasty osiadły na szkiełku nakrywkowym. Napełnić całkowicie komorę kąpieli około 50 mikrolitrami roztworu do kąpieli z chlorkiem potasu i przenieść szkiełko nakrywkowe z mitoplastami do wnętrza komory za pomocą cienkiej pęsety do mikrodysekcji z zagiętą końcówką. Ułóż szkiełko nakrywkowe na dnie komory, nie przetapiając komory, aby mitoplasty były stabilne na szkiełku nakrywkowym.
Wybierz indywidualny mitoplast nieprzylepny, skanując szkiełko nakrywkowe pod mikroskopem za pomocą obiektywu 60X. Załaduj do pipety roztwór pipety i umieść ją w uchwycie na pipety. Wprowadzić pipetę do roztworu kąpieli za pomocą mikromanipulatora i przesunąć ją tuż nad wybranym mitoplastem, aby zbliżyć się do IMM.
Utrzymuj potencjał membrany na poziomie zero miliwoltów i zastosuj impulsy 10 miliwoltów za pomocą polecenia testu membrany w programie wzmacniacza. Zastosuj lekkie podciśnienie, aby szybko utworzyć gigaseal za pomocą IMM. Podnieś pipetę z dołączonym mitoplastem, aby trzymać ją z dala od szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć pęknięcia uszczelki z powodu dryftu pipety podczas eksperymentu.
Skompensuj stany przejściowe pojemności błądzącej za pomocą polecenia testu membrany w programie wzmacniacza przed przetestowaniem konfiguracji całego mitoplastu, aby uzyskać prawidłowy pomiar pojemności membrany mitoplastu po włamaniu. Zastosuj krótkotrwałe impulsy napięciowe za pomocą programu wzmacniacza, aby rozerwać łatkę membranową pod szklaną pipetą i uzyskać konfigurację całego mitoplastu. Po włamaniu dopasuj stany przejściowe pojemności do opcji testu membrany programu wzmacniacza, aby ocenić pojemność membrany i jej rezystancję dostępu.
Natychmiast po dotarciu zastąpić roztwór do kąpieli chlorku potasu roztworem do kąpieli HEPES przez perfuzję. Zastosuj 850-milisekundowy protokół rampy z programem wzmacniacza. Zastosowanie protokołu rampy napięcia indukuje prąd protonowy o dużej amplitudzie przez IMM brunatnego tłuszczu bez dodatku egzogennych kwasów tłuszczowych, wymaganych aktywatorów UCP.
Po perfuzji przez inhibitor UCP1 difosforan guanozyny lub 10-milimolową betacyklodekstrynę metylową do ekstrakcji endogennych błonowych kwasów tłuszczowych, prąd resztkowy jest używany do określenia amplitudy prądów UCP1, które całkowicie znikają w IMM myszy z niedoborem UCP1. W przeciwieństwie do brunatnej tkanki tłuszczowej, IMM tkanek nietłuszczowych, takich jak mięśnie szkieletowe i serce, nie wytwarza mierzalnego prądu protonowego bezpośrednio po włamaniu. Aby indukować mierzalny prąd protonowy przez AAC, konieczne jest zastosowanie roztworu do kąpieli HEPES zawierającego od jednego do dwóch mikromolów egzogennych kwasów tłuszczowych.
Aby potwierdzić, że zmierzony prąd protonowy jest przenoszony przez AAC, ważne jest zastosowanie specyficznych inhibitorów, karboksyatraktylozydu, które prawie całkowicie hamują prąd protonowy wykazywany w IMM myszy z niedoborem AAC1. Stałe, ale nigdy całkowite zahamowanie wycieku protonów osiąga się tylko wtedy, gdy ADP jest obecny po obu stronach błony, aby wytworzyć aktywną wymianę nukleotydów za pośrednictwem AAC. Jakość preparatu mitoplastu będzie miała wpływ na wskaźnik sukcesu w osiągnięciu konfiguracji całego mitoplastu.
Niezbędna jest jego optymalizacja. Po przeanalizowaniu molekularnego mechanizmu termogenezy mitochondriów za pomocą techniki patch clamp, pomiar zużycia tlenu w mitochondriach wykaże znaczenie prądu protonowego i termogenezy w nienaruszonych mitochondriach. Technika ta otwiera naukowcom drogę do badania wszelkiego rodzaju przewodnictwa, jonów i metabolitów ważnych dla funkcjonowania mitochondriów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł metodyczny opisuje technikę patch-clamp jako nowatorskie podejście do pomiaru wycieku protonów przez wewnętrzną membranę mitochondriów, co jest kluczowe dla oceny zdolności termogennych mitochondriów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Funkcja mitochondriów
- Termogeneza
- Przewodnictwo jonowe
Tło
- Mitochondria odgrywają kluczową rolę w metabolizmie energii.
- Zrozumienie wycieku protonów jest istotne dla badań nad termoregulacją.
- Technika patch clamp pozwala na bezpośrednie pomiary prądów jonowych.
Stosowane metody
- Technika patch-clamp do pomiaru prądu protonów
- Mitochondria serca i tłuszczu brązowego jako systemy biologiczne
- Protokoły do izolacji mitochondriów i przeprowadzania pomiarów elektro fizjologicznych
Główne wyniki
- Pomiar prądu protonowego wskazuje na efektywność termogenezy mitochondriów.
- Metoda pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych zaangażowanych w procesy termogenne.
- Dogłębne charakteryzowanie przewodnictw takich jak Ca2+ i transport nukleotydów adeninowych.
Wnioski
- To badanie wykazuje użyteczność techniki patch-clamp do badania funkcji mitochondriów.
- Wyniki te zwiększą zrozumienie metabolizmu energii i termogenezy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct measurement of proton leak via mitochondrial patch-clamp provides mechanistic insight into thermogenic capacity, a key determinant of energy expenditure and metabolic health. This approach enables target validation of uncoupling proteins and adenine nucleotide translocase as regulators of mitochondrial uncoupling, supporting de-risking in early discovery programs aimed at modulating metabolic syndrome. By quantifying H+ flux through the inner mitochondrial membrane, the method delivers biophysical data that informs structure-function relationships critical for lead identification and predictive modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of UCP1 and AAC as molecular mediators of proton leak, clarifying their role in thermogenic activation.
- Operational Value: Provides a direct biophysical readout to distinguish UCP1-dependent from AAC-dependent proton conductance in native mitoplasts.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular inhibition (e.g., GDP, carboxyatractyloside) to loss of proton current, validating mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative proton current measurements that serve as a functional readout for screening modulators of mitochondrial uncoupling.
- Reproducibility: Standardized mitoplast preparation and voltage ramp protocols enable consistent detection of proton flux across experimental runs.
- Scalability: Method accommodates tissue-specific mitochondrial isolation (brown fat, heart) to assess thermogenic capacity across relevant models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links proton leak measurements to thermogenic capacity, a pathway implicated in obesity and metabolic syndrome.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed thermogenic effects are mediated via UCP1 or AAC, reducing ambiguity in target engagement.
- Translational Continuity: Enables progression from isolated mitoplast physiology to intact mitochondrial function via correlated oxygen consumption assays.
Pipeline & Workflow Integration
The mitochondrial patch-clamp technique fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, offering a biophysical assay to evaluate compounds that modulate proton leak and thermogenic capacity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by directly measuring H+ leak as a functional output of UCP1 or AAC activity.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative proton current data to evaluate dose-dependent effects of inhibitors or activators.
- Analytics: Provides membrane capacitance and access resistance metrics to ensure mitoplast integrity and data quality.
- Translational Research: Connects proton current measurements to mitochondrial oxygen consumption, bridging reductionist and physiologic readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing mitochondrial conductance across disease-relevant tissues and models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of thermogenic targets through direct correlation of molecular inhibition with loss of proton current.
- Operational Value: Standardized preparation of mitoplasts and voltage ramp protocols ensure reproducible proton current measurements.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on target-specific modulation of proton leak, reducing late-stage attrition in metabolic programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of UCP1 vs. AAC-directed strategies by clarifying their relative contribution to thermogenesis.
Implementation Considerations
- Expertise in mitochondrial isolation, mitoplast formation, and electrophysiology is required to achieve stable gigaseals and whole-mitoplast configuration.
- Instrumentation includes a patch-clamp amplifier, micropipette puller, French press, and perfusion system for solution exchange.
- Standardization across teams requires consistent mitoplast yield, access resistance monitoring, and voltage protocol execution.
- Adaptation to other tissues (e.g., skeletal muscle, liver) necessitates optimization of isolation and permeabilization steps to preserve inner mitochondrial membrane integrity.
- Success depends on mitoplast quality; damaged or low-yield preparations reduce the probability of obtaining stable recordings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Mitochondrial Isolation from the Mouse Heart
3:01
Preparation of Mitoplasts with a French Press for Mechanical Rupture of the OMM
4:07
Electrophysiological Recordings of H+ Leak Through UCP1 and AAC
8:20
Results: The Analysis of FA-Dependent Proton Current via UCP1 in Brown Fat and via AAC in Heart Mitoplast
10:05
Conclusion
