Name: Zastosowanie techniki patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj technikę patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów poprzez pomiar upływu protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Metoda umożliwia identyfikację mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za termogenezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękuję doktorowi Jurijowi Kirichokowi za wspaniałą naukę, której byłem częścią w jego laboratorium oraz członkom laboratorium Kirichoka za pomocne dyskusje. Dziękuję również dr Douglasowi C. Wallace'owi za dostarczenie myszy z nokautem AAC1. Finansowanie: A.M.B było wspierane przez American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach, które zostały przeprowadzone, są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
UWAGA: Procedura izolacji mitochondriów opiera się na wirowaniu różnicowym i różni się nieznacznie w zależności od tkanki. Na przykład, ponieważ brunatna tkanka tłuszczowa jest niezwykle bogata w lipidy, wymaga dodatkowego etapu, aby oddzielić resztki komórek i organelle od fazy lipidowej przed zbiorem mitochondriów. Aby uniknąć nieporozumień, dwie procedury izolacji mitochondriów (jedna z brązowego tłuszczu, a druga z serca) są szczegółowo opisane poniżej.
1. Izolacja mitochondrialna z brązowego tłuszczu międzyłopatkowego myszy (zmodyfikowana z Bertholet et al. 2020)15
<ol>
	<li>Eutanazja samca myszy C57BL/6 przy użyciu uduszenia CO2 i późniejszego zwichnięcia szyjki macicy, zgodnie z zaleceniami Panelu Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i Komitetu IACUC.</li>
	<li>Po ustawieniu myszy brzuchem skierowanym w stronę stołu, spryskaj włosy alkoholem, aby je oczyścić i zwilżyć (zmodyfikowane z Mann et al., 2014)16.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o długości 2 cm w górnej części pleców po uchwyceniu skóry pęsetą.</li>
	<li>Wyodrębnij brązowy tłuszcz międzyłopatkowy myszy, który odpowiada dwupłatowemu narządowi o kształcie motyla16.</li>
	<li>Przenieść brązowy tłuszcz na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną 5 ml zimnego buforu izolacyjnego (tabela 1) uprzednio umieszczonego na lodzie.</li>
	<li>Oczyść brązowy tłuszcz z białego tłuszczu pod lornetką.</li>
	<li>Przenieś brązowy tłuszcz do 10 ml zlewki z 5 ml zimnego buforu izolacyjnego (Tabela 1), aby posiekać go na cienkie kawałki. Przenieść do chłodzonego lodem homogenizatora szklanego o pojemności 10 ml (tłuczek z tworzywa sztucznego z politetrafluoroetylenu (PTFE)).</li>
	<li>Użyj mieszadła górnego, aby homogenizować wstępnie przyciętą tkankę na lodzie sześcioma delikatnymi ruchami z kontrolowaną prędkością 275 obrotów/min.</li>
	<li>Odwirować homogenat o stężeniu 8 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w lodowatej probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Odrzucić sklarowany nad osadem zawierający fazę lipidową.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml lodowatego buforu izolacyjnego (tabela 1) i homogenizować zawiesinę na lodzie po raz drugi sześcioma powolnymi ruchami z prędkością 275 obrotów/min.</li>
	<li>Przenieść homogenat do lodowatej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować go przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wszystkich jąder i nieuszkodzonych komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml i umieścić go na lodzie.</li>
	<li>Odwirować sklarowany osad o stężeniu 8 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadu zawierającego mitochondria.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający mitochondria w 3,8 ml lodowatego buforu hipertonicznego mannitolu (Tabela 2) i inkubować zawiesinę mitochondrialną na lodzie przez 10-15 minut.</li>
</ol>
2. Izolacja mitochondrialna od serca myszy (zmodyfikowana z Garg et al. 2019)17
<ol>
	<li>Eutanazja samca myszy C57BL/6 przy użyciu uduszenia CO2 i późniejszego zwichnięcia szyjki macicy, zgodnie z zaleceniami Panelu Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i Komitetu IACUC.</li>
	<li>Po ułożeniu myszy na grzbiecie spryskaj ją alkoholem, aby oczyścić i zwilżyć włosy. Następnie wykonaj 2 cm nacięcie na klatce piersiowej po uchwyceniu skóry pęsetą.</li>
	<li>Wyciąć serce z klatki piersiowej zwierzęcia i wypłukać je w celu usunięcia całej krwi w zlewce o pojemności 10 ml z 5 ml roztworu do izolacji zimna (Tabela 1).</li>
	<li>Gdy serce zostanie oczyszczone ze śladów krwi, przenieś je do innej zlewki o pojemności 10 ml zawierającej 5 ml zimnego buforu izolacyjnego (Tabela 1), aby posiekać je na cienkie kawałki. Następnie przenieść do chłodzonego lodem szklanego homogenizatora o pojemności 10 ml (tłuczek z PTFE).</li>
	<li>Użyj mieszadła górnego, aby homogenizować wstępnie przyciętą tkankę na lodzie sześcioma delikatnymi ruchami z kontrolowaną prędkością 275 obrotów/min.</li>
	<li>Przenieść homogenat do lodowatej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować go przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadzaków jąder i nieuszkodzonych komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml i umieścić go na lodzie.</li>
	<li>Odwirować sklarowany osad o stężeniu 8 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadu zawierającego mitochondria.</li>
	<li>Zawiesić osad mitochondrialny w 3,8 ml lodowatego buforu hipertonicznego mannitolu (Tabela 2) i inkubować zawiesinę mitochondrialną na lodzie przez 10-15 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mitoplastów za pomocą prasy francuskiej do mechanicznego pęknięcia OMM.
UWAGA: Procedura francuskiego pressingu pozwala na zwolnienie IMM z OMM z zachowaniem jego integralności, w tym matrycy i crista (Rysunek 2)18. Mitochondria są wstępnie inkubowane w buforze hipertonicznym mannitolu (Tabela 2) i poddawane niższemu ciśnieniu podczas procedury tłoczenia francuskiego, aby uniknąć drastycznego rozciągnięcia IMM po pęknięciu OMM.
<ol>
	<li>Napełnij zawiesinę mitochondrialno-hipertoniczno-mannitolową do chłodzonej mini komory ciśnieniowej (średnica tłoka 3/8") prasy francuskiej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Wybierz tryb Medium French Press i skompresuj zawiesinę przez mini komórkę ciśnieniową pod kątem 110 na tarczy French Press dla mitochondriów brązowego tłuszczu i pod 140 dla mitochondriów serca (~ 2,000 psi). Upewnij się, że zawiesina wydostaje się z mini komory ciśnieniowej z szybkością około 1 kropli / s.</li>
	<li>Zbierz krople w stożkowej probówce o pojemności 15 ml chłodzonej lodem.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 10 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad mitoplastów w 0,5-2 ml lodowatego buforu Hypertonic-KCl (Tabela 3) i przechowywać zawiesinę na lodzie. 
	UWAGA: Brązowe mitoplasty tłuszczu i serca są gotowe do zapisów typu patch-clamp i powinny pozostać użyteczne przez około 3-6 godzin.</li>
</ol>
4. Zapisy elektrofizjologiczne H+ przeciekają przez UCP1 i AAC5,7,15
UWAGA: Użyj następującej konfiguracji elektrofizjologicznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B): odwrócony mikroskop z różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC), 60-krotny obiektyw zanurzeniowy w wodzie, stół do izolacji drgań i klatka Faradaya, standardowy wzmacniacz obsługujący nagrania o niskim poziomie szumów, standardowy digitizer używany do konfiguracji elektrofizjologicznej, pClamp 10, mikromanipulator, elektroda referencyjna do kąpieli (3 M mostek solny KCl-agar umieszczony w uchwycie mikroelektrody zawierający granulkę srebra/chlorku srebra uformowaną w korpusie uchwytu (opisaną w Liu et al. 2021)19, komora perfuzyjna z dnem ze szkła nakrywkowego o grubości 0,13 mm, podłączona do grawitacyjnego systemu perfuzyjnego.
<ol>
	<li>Wyciągnij włókna ze szkła borokrzemianowego w dniu nagrywania za pomocą ściągacza do mikropipet. Ustaw program na ściągaczu używanym do generowania pipet o wysokim stopniu odtwarzalności20. 
	UWAGA: Ten projekt programu wymaga kilku prób uzyskania pipet zoptymalizowanych pod kątem zacisku krosowego IMM. Standardowa pipeta ma cienkie końcówki o progresywnym stożkowym kształcie.</li>
	<li>Włóż jeden szklany filament do ściągacza i pociągnij, aby uzyskać prawie dwie identyczne pipety do plastrów z jednego włókna borokrzemianowego.</li>
	<li>Dostosuj program, gdy pipety stają się niespójne między cyklami ciągnięcia z powodu starzenia się żarnika skrzynki grzewczej ściągacza.</li>
	<li>Umieść pipetę wewnątrz polerki do pipet i umieść końcówkę w pobliżu filamentu pod 100-krotnym powiększeniem, aby ją wypolerować.</li>
	<li>Naciśnij pedał nożny kilka razy, aby podgrzać filament bez zatykania lub uszkadzania krzywizny końcówki.</li>
	<li>Polerować do momentu uzyskania pipet o rezystancji od 25 do 35 MΩ po napełnieniu roztworem do pipet na bazie TMA (TMA dla wodorotlenku tetrametyloamonu, tabela 4).</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy wstępnie inkubować (o średnicy 5 mm, grubości 0,1 mm) z 0,1% żelatyną w celu zmniejszenia adhezji mitoplastów i przepłukać je roztworem kąpieli KCl (Tabela 5) przed nałożeniem zawiesiny mitoplastu.</li>
	<li>Przygotować surowe rozcieńczenie, mieszając ~35 μl stężonej zawiesiny mitoplastu z 500 μl roztworu kąpieli KCl (tabela 5) i umieścić go na szkiełkach nakrywkowych uprzednio umieszczonych w studzience na płytce 4-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 15 do 20 minut, aby mitoplasty osiadły na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Napełnić całkowicie komorę kąpieli ~50 μl roztworu do kąpieli KCl (tabela 5).</li>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe z mitoplastami w komorze za pomocą cienkiej pęsety do mikrodysekcji z zagiętą końcówką.</li>
	<li>Ułóż szkiełko nakrywkowe na dnie komory. Nie należy perfować komory, aby mitoplasty były stabilne na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Wybierz indywidualny nieprzywierny mitoplast w kształcie 8, skanując szkiełko nakrywkowe pod mikroskopem za pomocą obiektywu 60x.</li>
	<li>Załadować pipetę roztworem do pipet (~50 μl) i umieścić ją w uchwycie na pipety.</li>
	<li>Wprowadzić pipetę do roztworu kąpieli za pomocą mikromanipulatora i zbliżyć się do niej tuż nad wybranym mitoplastem, aby zbliżyć się do IMM. Program wzmacniacza podaje rezystancję pipety, gdy znajdzie się ona w roztworze kąpieli. Utrzymuj potencjał membrany na poziomie 0 mV i stosuj impulsy 10 mV za pomocą polecenia testu membrany w programie wzmacniacza.</li>
	<li>Zastosuj lekkie podciśnienie, aby szybko utworzyć gigaseal za pomocą IMM (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Podnieś pipetę z dołączonym mitoplastem, aby trzymać ją z dala od szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć pęknięcia uszczelki z powodu dryftu pipety podczas eksperymentu.</li>
	<li>Skompensuj stany przejściowe pojemności błądzącej za pomocą polecenia "test membrany" w programie wzmacniacza przed przetestowaniem konfiguracji całego mitoplastu, aby uzyskać prawidłowy pomiar pojemności (Cm) dla membrany mitoplastu po włamaniu.</li>
	<li>Zastosuj krótkotrwałe (5-15 ms) impulsy napięciowe (250-600 mV) za pomocą programu wzmacniacza, aby rozerwać łatkę membranową pod szklaną pipetą i uzyskać konfigurację całego mitoplastu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Udane włamanie znajduje odzwierciedlenie w ponownym pojawieniu się stanów przejściowych pojemności.</li>
	<li>Po włamaniu dopasuj stany przejściowe pojemności do opcji testu membrany programu wzmacniacza, aby ocenić pojemność membrany (odzwierciedlającą rozmiar mitoplastu) i jej rezystancję dostępu Ra (odzwierciedlającą jakość konfiguracji całego mitoplastu). Po włamaniu Ra powinno wynosić od 40 do 80 MΩ. Mitopasty (o wielkości 2-6 μm) używane do eksperymentów z zaciskiem krosowym mają zwykle pojemność membrany 0,5-1,1 pF.</li>
	<li>Natychmiast po włamaniu zastąpić roztwór do kąpieli KCl (tabela 5) roztworem do kąpieli HEPES (tabela 6), rozpoczynając perfuzję.</li>
	<li>Zastosuj protokół rampy 850 ms zaprojektowany za pomocą programu wzmacniacza, od -160 mV do +100 mV w odstępie 5 s, utrzymując mitoplast na poziomie 0 mV. Ten protokół działa dla UCP16,7,15 i AAC5 studies (Rysunek 4 i Rysunek 5). 
	UWAGA: Zaleca się, aby do pomiarów prądu H+ zależnych od UCP1 i AAC uzyskać wszystkie dane elektrofizjologiczne przy 10 kHz i filtrować przy 1 kHz za pomocą odpowiedniego oprogramowania sterującego wzmacniaczem i digitizerem.</li>
</ol>

<ol><li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li>
<li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+advances+in+adaptive+thermogenesis%3A+UCP1+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li>
<li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP%2FATP+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li>
<li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li>
<li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li>
<li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li>
<li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317(2012).</li>
<li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704(2013).</li>
<li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca%282%2B%29+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li>
<li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMRE+is+a+matrix+Ca%282%2B%29+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca%282%2B%29+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li>
<li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCUR1%2C+CCDC90A%2C+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li>
<li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca%282%2B%29+and+Mn%282%2B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li>
<li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H%28%2B%29+leak+in+brown+and+beige+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326(2020).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174(2014).</li>
<li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li>
<li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li>
<li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+puller+design%3A+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li>
<li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+and+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów.

Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie techniki patch-clamp zastosowanej ostatnio do mitochondriów, nowego podejścia do bezpośredniego badania wycieku H+ przez IMM odpowiedzialnego za termogenezę mitochondriów 5,6,7,15. Technika ta nie ogranicza się do tkanek i może być również stosowana do analizy przecieku H+ i innych przewodnictw IMM w różnych standardowych modelac...

Mitochondria słyną z tego, że są siłą napędową komórki. Rzeczywiście, są one głównym źródłem energii chemicznej, ATP. Mniej znane jest to, że mitochondria również wytwarzają ciepło. W rzeczywistości każde mitochondrium stale generuje dwa rodzaje energii (ATP i ciepło), a delikatna równowaga między tymi dwiema formami energii definiuje homeostazę komórek metabolicznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). To, w jaki sposób mitochondria rozprowadzają energię między ATP a ciepłem, jest z pewnością najbardziej fundamentalnym pytaniem w dziedzinie bioenergetyki, choć nadal jest w dużej mierze nieznane. Wiemy, że zwiększenie produkcji ciepła w mitochondriach (zwanej termogenezą mitochondrialną), a w konsekwencji zmniejszenie produkcji ATP zwiększa wydatek energetyczny i jest to jeden z najlepszych sposobów walki z zespołem metabolicznym1.
Termogeneza mitochondrialna wywodzi się z przecieku H+ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną (IMM), co prowadzi do rozłączenia utleniania substratu i syntezy ATP, a w konsekwencji do produkcji ciepła, stąd nazwa "rozprzęganie mitochondriów"1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ten wyciek H+ zależy od transporterów mitochondrialnych zwanych białkami rozprzęgającymi (UCP). UCP1 był pierwszym zidentyfikowanym UCP. Wyraża się tylko w tkankach termogenicznych, brunatnym tłuszczu i beżowym tłuszczu, w których mitochondria są wyspecjalizowane w produkcji ciepła2,3,4. Tożsamość UCP w tkankach nietłuszczowych, takich jak mięśnie szkieletowe, serce i wątroba, pozostaje kontrowersyjna. Mitochondria w tych tkankach mogą mieć około 25% całkowitej energii mitochondrialnej zamienionej na ciepło, co może znacząco wpłynąć na fizjologię całego ciała1. Oprócz utrzymywania temperatury głębokiej ciała, termogeneza mitochondrialna zapobiega również otyłości wywołanej dietą poprzez redukcję kalorii. Ponadto zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) przez mitochondria w celu ochrony komórek przed uszkodzeniem oksydacyjnym1. Tak więc termogeneza mitochondrialna bierze udział w normalnym starzeniu się, zaburzeniach zwyrodnieniowych związanych z wiekiem i innych stanach związanych ze stresem oksydacyjnym, takich jak niedokrwienie-reperfuzja. Dlatego termogeneza mitochondrialna jest potężnym regulatorem metabolizmu komórkowego, a mechanistyczne zrozumienie tego podstawowego procesu będzie sprzyjać rozwojowi strategii terapeutycznych w celu zwalczania wielu patologii związanych z dysfunkcją mitochondriów.
Oddychanie mitochondrialne było pierwszą techniką, która ujawniła kluczową rolę termogenezy mitochondrialnej w metabolizmie komórkowym i nadal jest najpopularniejsze w społeczności1. Technika ta opiera się na pomiarze zużycia tlenu przez mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC), który zwiększa się, gdy aktywowany jest mitochondrialny wyciek H+. Technika ta, choć kluczowa, nie może bezpośrednio badać mitochondrialnego wycieku H+ przez IMM1, co utrudnia precyzyjną identyfikację i charakterystykę białek odpowiedzialnych za to, szczególnie w tkankach nietłuszczowych, w których produkcja ciepła jest wtórna w porównaniu z produkcją ATP. Niedawny rozwój techniki patch-clamp zastosowanej do mitochondriów zapewnił pierwsze bezpośrednie badanie wycieku H+ przez cały IMM w różnych tkankach5,6,7.
Mitochondrialny patch-clamp całego IMM został po raz pierwszy ustanowiony w powtarzalny sposób przez Kirichoka i wsp.8. Opisali oni pierwszy bezpośredni pomiar mitochondrialnych prądów uniportera wapnia (MCU) w 2004 roku przy użyciu mitoplastów z linii komórkowych COS-78. Później laboratorium Kirichok wykazało prądy wapnia z IMM mouse9 i Drosophila tissues9. Inne laboratoria rutynowo używają tej techniki do badania właściwości biofizycznych MCU10,11,12,13,14. Możliwa jest również pełna analiza IMM patch-clamp przewodnictwa potasu i chlorków, o której wspomniano w kilku artykułach, ale nie była jeszcze głównym tematem publikacji6,7,9. Pierwszy pomiar prądów H+ w IMM został zgłoszony w 2012 r. z mitochondriów brązowego tłuszczu myszy6, a z mitochondriów mysiego beżowego tłuszczu w 2017 r.7. Prąd ten jest spowodowany specyficznym białkiem rozprzęgającym tkanki termogeniczne, UCP16,7. Ostatnie prace opublikowane w 2019 roku scharakteryzowały AAC jako główne białko odpowiedzialne za mitochondrialny wyciek H+ w tkankach nietłuszczowych, takich jak serce i mięśnie szkieletowe5.
To unikalne podejście pozwala teraz na bezpośrednią, funkcjonalną analizę mitochondrialnych kanałów jonowych i transporterów odpowiedzialnych za termogenezę mitochondriów w wysokiej rozdzielczości. Aby ułatwić rozszerzenie metody i uzupełnić inne badania, takie jak oddychanie mitochondrialne, poniżej opisano szczegółowy protokół pomiaru prądów H+ przenoszonych przez UCP1 i AAC. Opisano trzy ważne kroki: 1) izolację mitochondriów z brunatnego tłuszczu myszy w celu analizy prądu H+ zależnego od UCP1 i izolację mitochondriów od serca w celu analizy prądu H+ zależnego od AAC, 2) przygotowanie mitoplastów za pomocą prasy francuskiej do mechanicznego pęknięcia zewnętrznej błony mitochondrialnej (OMM), 3) zapisy patch-clamp prądów H+ zależnych od UCP1 i AAC na całym IMM.

<table><tbody><tr><td>0,1% żelatyny</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>60X obiektyw zanurzeniowy w wodzie, apertura numeryczna 1,20</td><td>Wzmacniacz Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B</td><td>Urządzenia molekularne Kapilary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B Digitizer</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Domowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>francuska prasa</td><td>Glen Mills</td><td>5500-000011</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td></td><td></td><td></td>laboratoryjne IKA Eurostar PWR CV S1</tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX71 lub IX73</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td> <td>(Narishige)</td> <td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanupulator MPC-385</td><td>Sutter Instrumenty</td><td>FG-MPC325</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikroelektrody do mostu agarowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3F4515</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td> <td>(Sutter Instruments)</td> <td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Mini komórka do prasy francuskiej</td><td>Glen Mills</td><td>5500-FA-004</td><td></td></tr><tr><td>MIXER IKA 6-2000RPM</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-50705-50</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 100-krotne powiększenie</td><td>Obiektyw Nikon</td><td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 10</td><td>Urządzenia molekularne Komora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-24E</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Potter-Elvehjem 10 ml</td><td>Wheaton</td><td>358039</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem SORVALL X4R PRO-MD</td><td>Thermo Scientific</td><td>75 009 521</td><td></td></tr><tr><td>Małe okrągłe szkiełka nakrywkowe: średnica 5 mm, grubość 0,1 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>640700</td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>Newport</td><td>VIS3036-SG2-325A</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-glukonowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&</td><td>nbsp; Sigma Aldrich</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&</td><td>nbsp; Sigma Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TMA&</td><td>nbsp; Sigma Aldrich</td><td>331635</td><td></td></tr><tr><td>TrisBase</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TrisCl</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie techniki patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Termogeneza mitochondrialna (znana również jako rozprzęganie mitochondriów) jest jednym z najbardziej obiecujących celów dla zwiększenia wydatku energetycznego w celu zwalczania zespołu metabolicznego. Tkanki termogeniczne, takie jak tłuszcze brązowe i beżowe, rozwijają wysoce wyspecjalizowane mitochondria do produkcji ciepła. Mitochondria innych tkanek, które przede wszystkim produkują ATP, również przekształcają do 25% całkowitej produkcji energii mitochondrialnej w ciepło i dlatego mogą mieć znaczący wpływ na fizjologię całego organizmu. Termogeneza mitochondrialna jest nie tylko niezbędna do utrzymania temperatury ciała, ale także zapobiega otyłości wywołanej dietą i zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) w celu ochrony komórek przed uszkodzeniem oksydacyjnym. Ponieważ termogeneza mitochondriów jest kluczowym regulatorem metabolizmu komórkowego, mechanistyczne zrozumienie tego podstawowego procesu pomoże w opracowaniu strategii terapeutycznych w celu zwalczania wielu patologii związanych z dysfunkcją mitochondriów. Co ważne, dokładne mechanizmy molekularne, które kontrolują ostrą aktywację termogenezy w mitochondriach, są słabo poznane. Ten brak informacji wynika w dużej mierze z braku metod bezpośredniego pomiaru białek rozprzęgających. Niedawny rozwój metodologii patch-clamp zastosowanej do mitochondriów umożliwił po raz pierwszy bezpośrednie zbadanie zjawiska leżącego u podstaw termogenezy mitochondriów, wycieku H+ przez IMM oraz pierwszą biofizyczną charakterystykę odpowiedzialnych za to transporterów mitochondrialnych, białka rozprzęgającego 1 (UCP1), specyficznego dla tłuszczów brunatnych i beżowych, oraz transportera ADP/ATP (AAC) dla wszystkich innych tkanek. To unikalne podejście dostarczy nowych informacji na temat mechanizmów kontrolujących wyciek H+ i termogenezę mitochondriów oraz tego, w jaki sposób można je ukierunkować w walce z zespołem metabolicznym. W artykule opisano metodologię patch-clamp zastosowaną do mitochondriów w celu zbadania ich zdolności termogenicznej poprzez bezpośredni pomiar prądów H+ przez IMM.

Opracowanie metodyki patch-clamp w zastosowaniu do mitochondriów umożliwiło pierwsze bezpośrednie badanie przecieku H+ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną (IMM) oraz transportery mitochondrialne, UCP1 i AAC, które za niego odpowiadają. Analiza elektrofizjologiczna przecieków H+ zależnych od UCP1 i AAC może dostarczyć wstępnych informacji o zdolności termogenicznej mitochondriów. Sekcja z wynikami opisuje standardowe procedury pomiaru przecieku H+ za pośrednictwem UCP1 i AAC.
<p cla...

Ten artykuł o metodzie szczegółowo opisuje główne etapy pomiaru przecieku H+ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pomocą techniki patch-clamp, nowego podejścia do badania termogenicznej zdolności mitochondriów.

Zastosowanie techniki patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób technika patch clamp może być wykorzystana do badania termogenicznej zdolności mitochondriów poprzez bezpośredni pomiar mitochondrialnego wycieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Bezpośredni pomiar prądu protonowego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną pomaga zidentyfikować i precyzyjnie scharakteryzować mechanizmy molekularne odpowiedzialne za termogenezę mitochondriów. Technika ta pozwala nie tylko na pomiar prądu protonowego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, ale także na badanie innych przewodnictw ważnych dla funkcji mitochondriów, takich jak wapń lub metabolity, takie jak nukleotydy adeninowe.Umieść uśpioną mysz na plecach i spryskaj ją alkoholem, aby oczyścić i zwilżyć włosy. Następnie wykonaj dwucentymetrowe nacięcie na klatce piersiowej. Po uchwyceniu skóry pęsetą wypreparuj serce z klatki piersiowej zwierzęcia i opłucz je, aby usunąć całą krew do 10-mililitrowej zlewki z pięcioma mililitrami zimnego roztworu izolacyjnego.Gdy serce zostanie oczyszczone ze śladów krwi, przenieś je do innej 10-mililitrowej zlewki zawierającej pięć mililitrów zimnego buforu izolacyjnego i posiekaj na cienkie kawałki. Następnie przenie

the-use-patch-clamp-technique-to-study-thermogenic-capacity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Opisano metodę izolacji pęcherzyków submitochondrialnych wzbogaconych w kompleksy syntazy ATP F1FO z mózgu szczura. Pęcherzyki te umożliwiają badanie aktywności kompleksu ATP-azy F1FO oraz jego modulacji z wykorzystaniem techniki patch clamp.

Przygotowanie pęcherzyków F1FO ATPase oraz technika rejestracji patch-clamp błon pęcherzyków submitochondrialnych

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Myszy i szczury są chirurgicznie wszczepiane za pomocą zdalnych transponderów temperatury, a następnie przyzwyczajane do środowiska testowego i procedury. Zmiany temperatury mięśni są mierzone w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne lub kontekstowe w klatce domowej lub podczas zalecanej aktywności fizycznej (np. chodzenie na bieżni ze stałą prędkością).

Pomiar termogenezy mięśni szkieletowych u myszy i szczurów

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia fizjologicznego znaczenia wpływu aktywności brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) na metabolizm człowieka. Osiąga się to poprzez połączenie obciążenia węglowodanami i kalorymetrii pośredniej z pomiarami zmian temperatury nadobojczykowej. To nowatorskie podejście może pomóc w opracowaniu celu farmakologicznego dla termogenezy BAT u ludzi.

Wykorzystanie kombinacji kalorymetrii pośredniej, termografii w podczerwieni i poziomu glukozy we krwi do pomiaru termogenezy brunatnej tkanki tłuszczowej u ludzi

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Poznaj technikę patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów poprzez pomiar upływu protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Metoda umożliwia identyfikację mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za termogenezę.

Zastosowanie techniki patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów

Przeglądaj więcej filmów