Badania przesiewowe chromosomów ludzkich zarodków przedimplantacyjnych przy użyciu zużytej pożywki hodowlanej: pobieranie próbek i analiza ploidalności chromosomów

Protokół ma na celu normalizację kolekcji pożywki hodowlanej i analizy ploidalności chromosomowej w oparciu o nieinwazyjne badania przesiewowe chromosomów NICS ludzkich zarodków przed implantacją. Główną zaletą NICS jest łatwość obsługi, a nie mikromanipulacja TiDieR, oszczędność czasu i skuteczne zmniejszanie inwazyjnej utraty próbki biopsji. Metoda pobierania próbek jest bardzo elastyczna.

Tutaj oferujemy dwie różne opcje, jedną do rutynowej sekwencyjnej hodowli zarodków, a drugą do jednego etapu. Są to główni koledzy z naszego zespołu, dr Yaxin Yao i dr Xiaohui Zhu są głównie odpowiedzialni za przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie regeneracji NICS. Dr Jialin Jia i ja kończymy prace embriologiczne i pobieramy próbki.

Profesor Liu jest liderem naszej grupy. Jest również autorką korespondencyjną tego artykułu. Na początek przygotuj odczynniki i narzędzia.

Przed użyciem podgrzej i zrównoważ od 20 do 30 mikrolitrów pożywki hodowlanej i hialuronidazy. Następnie umieścić pożywkę hodowlaną i hialuronidazę na powierzchni roboczej w dygestorium. Szybko przenieś strawione OCCC do naczynia hodowlanego w celu obsługi oocytów i przykryj olejem mineralnym w każdym dołku.

Delikatnie odessaj i uwolnij oocyty od pięciu do 10 razy, aby usunąć resztki komórek ziarnistych wokół oocytów. Powtórz ten krok w pozostałych trzech dołkach, aby całkowicie usunąć komórki ziarniste. Oceń kompletność usuwania komórek ziarnistych za pomocą mikroskopu.

Następnie wykonaj docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika, zwane również ICSI i przenieś zarodek do pożywki hodowlanej. Przygotuj od 20 do 30 mikrolitrów mikrokropelek pożywki hodowlanej blastocysty dla każdego zarodka. Drugiego dnia przykryj zarodki olejem mineralnym w naczyniu do hodowli tkankowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 5% tlenu.

Po przeniesieniu zarodka trzeciego dnia do mikrokropelki do mycia, delikatnie odessać i uwolnić zarodek w mikrokropli w trzech kropelkach szeregowo za pomocą pipet. Następnie przenieś zarodek do pożywki hodowlanej blastocysty. Przygotuj mikrokropelki do mycia i mikrokropelki do hodowli.

Po południu czwartego dnia przenieść zarodek do wstępnie podgrzanych mikrokropelek pożywki hodowlanej i delikatnie umyć każdy zarodek kolejno w trzech mikrokropelkach za pomocą pipet. Przenieś każdy zarodek do unikalnej, wstępnie podgrzanej pojedynczej mikrokropli pożywki hodowlanej w celu pobrania próbki. Posiewaj zarodek blastocysty przed krioprezerwacją.

W celu przeprowadzenia witryfikacji przed kriokonserwacją zarodków należy przygotować mikrokropelki hodowlane i przenieść zarodek do wstępnie podgrzanych mikrokropelek o objętości od 10 do 15 mikrolitrów pożywki hodowlanej. I delikatnie umyj każdy zarodek kolejno w trzech mikrokropelkach, pipetując rano piątego dnia. Jak wykazano wcześniej, przenieś każdy zarodek do unikalnej, wstępnie podgrzanej pojedynczej mikrokropli pożywki hodowlanej w celu pobrania próbki.

I hoduj zarodek blastocysty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przed kriokonserwacją. Następnie delikatnie wyreguluj ICM w znacznej odległości od docelowego punktu wiązki laserowej, która skupia się na połączeniu komórkowym trofektodermy, aby wygenerować mały otwór w trofektodermie, aby uwolnić płyn z jamy blastocoelu. Aby pobrać próbkę, należy rozmrozić bufor w zestawie w temperaturze pokojowej i krótko odwirować.

Następnie przenieś pożywkę hodowlaną z każdego hodowanego zarodka do probówki PCR wolnej od RNazy-DNaz zawierającej pięć mikrolitrów buforu do lizy komórek. Przygotuj odczynniki i narzędzia. Po ilościowym określeniu genomowego DNA rozcieńczyć do stężenia 50 pikogramów na mikrolitr za pomocą pożywki hodowlanej.

Po dokładnym wymieszaniu należy krótko odwirować probówkę o stężeniu 200 G przez pięć sekund. Po odwirowaniu pożywki hodowlanej w mikrowirówce przez 30 do 60 sekund, należy odpipetować 10 mikrolitrów pożywki hodowlanej z dna probówki rozcieńczonej kontroli dodatniej i świeżej pożywki hodowlanej do nowej probówki do PCR o pojemności 0,2 mililitra. Dodać jeden mikrolitr mieszanki enzymów MT i dokładnie wymieszać pipetując.

Następnie natychmiast odwiruj przez dwie do trzech sekund. Umieść probówkę PCR w wstępnie podgrzanej stacji przygotowania próbki mieszanej i uruchom program lizy. Po rozmrożeniu i wymieszaniu buforu pre-lib należy go natychmiast odwirować przez dwie do trzech sekund przy 200 G. Przygotuj mieszankę wzorcową do reakcji przed biblioteką, dodając dwa mikrolitry mieszanki enzymów przed biblioteką do 60 mikrolitrów buforu przedbibliotecznego.

Dokładnie wymieszaj reakcję i krótko odwiruj. Dodać 60 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej z biblioteki wstępnej do próbki pożywki poddanej obróbce. Po dokładnym wymieszaniu przez pipetowanie należy natychmiast odwirować przez dwie do trzech sekund w temperaturze 200 G. Umieścić probówkę do PCR w wstępnie podgrzanej stacji przygotowania próbki.

Uruchom program przedbiblioteczny i utrzymuj temperaturę czterech stopni Celsjusza. Przygotuj mieszankę wzorcową do reakcji bibliotecznej, dodając 1,6 mikrolitra mieszanki enzymów bibliotecznych do 60 mikrolitrów bufora bibliotecznego. Dokładnie wymieszać reakcję i odwirować, jak pokazano wcześniej.

Dodać 60 mikrolitrów biblioteki mieszaniny reakcyjnej i dwa mikrolitry startera kodów kreskowych do każdego produktu przed biblioteką. Następnie dokładnie wymieszaj reakcję i odwiruj, jak pokazano. Po odwirowaniu umieść probówkę PCR w termocyklerze.

Uruchom program przygotowania biblioteki, a następnie utrzymuj temperaturę czterech stopni Celsjusza. Przygotuj odczynniki i narzędzia. Dodaj przygotowane 1X przygotowane mega koraliki do próbki biblioteki.

Określ ilościowo oczyszczone biblioteki zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i użyj 10 nanogramów z każdej próbki bibliotecznej do łączenia. Zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika sekwencjonowania i przeprowadź analizę danych po zakończeniu sekwencjonowania. Wprowadź nazwę użytkownika i hasło na stronie logowania do analizy danych w ChromGo.

Po zalogowaniu kliknij przycisk Create Submission (Utwórz zgłoszenie) na karcie NICS (NICS). Następnie wybierz NGS dla platformy, Illumina dla korporacji i NICSInst dla odczynnika. Wprowadź informacje o projekcie w polu w obszarze Identyfikator projektu.Ustaw preferencje analizy i prześlij pliki.

Po pomyślnym przesłaniu wszystkich plików sekwencjonowania kliknij przycisk Prześlij, aby rozpocząć analizę. Zgłoszone projekty znajdują się w zakładce Wyświetl zgłoszenia. Kliknij przycisk Pokaż w polu Raport, aby wyświetlić tabelę podsumowania analizy NICS.

Kliknij przycisk Eksportuj raport, aby zapisać raporty. Od pacjentów uzyskano sześć blastocyst i przeprowadzono NICS na wszystkich sześciu zarodkach od czwartego do piątego dnia. Nieprawidłowości chromosomowe spowodowane zrównoważoną translokacją rodziców wykryto w pięciu chromosomach za pomocą testu NICS i dlatego nie wykorzystano ich do transferu.

Wyniki NICS obu zarodków wykazały ten sam kariotyp 45 XN i delecję chromosomu 18 były delecjami chromosomu 18. Krótkie ramię XN kariotypu 46 delecji jednego regionu chromosomu było tylko krótkim ramieniem delecji regionu chromosomu. Wyniki NICS wykazały kariotyp 46 XN z długim ramieniem delecji regionu chromosomu 18 i krótkim ramieniem duplikacji chromosomu pierwszego.

Chociaż kariotypy były duplikacjami chromosomu piątego i wykazywały osiem różnic w mozaice, test NICS mógł przebadać wszystkie 24 chromosomy pod kątem aneuploidii. Proces ten zapewnia nową metodę przenoszenia pojedynczych blastocyst o normalnym kariotypie. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o całkowitym usunięciu komórek cumularnych, aby uniknąć zanieczyszczenia pochodzenia matczynego i zebrać pożywkę hodowlaną i wyeksponowaną stadium blastocysty, gdy zawartość DNA jest wystarczająca do amplifikacji.

Dzięki zastosowaniu technologii NICS w niniejszym badaniu usprawniono etapy przygotowania WGA i biblioteki WGS w ciągu około trzech godzin, a wynik CCS uzyskano w sposób nieinwazyjny w ciągu około dziewięciu godzin. Po opracowaniu technika ta zapewniła klinicystom specjalizującym się w ART nowatorski sposób łączenia oceny morfologicznej z NICS w celu przeniesienia zarodka aploidalnego o dobrej morfologii do macicy, co może poprawić bieżący wskaźnik ciąż i odsetek żywych urodzeń.