Trójwymiarowy biomimetyczny model nerwiaka zarodkowego in vitro z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiania linii komórkowych nerwiaka zarodkowego na wcześniej opisanych trójwymiarowych rusztowaniach opartych na kolagenie, utrzymania wzrostu komórek przez z góry określony przedział czasowy, oraz pobrania rusztowań do kilku analiz wzrostu i zachowania komórek oraz dalszych zastosowań, które można dostosować do spełnienia szeregu celów eksperymentalnych.

Nasz protokół oferuje bioinżynieryjny model 3D, który ściśle wpływa na natywną tkankę. Może to potencjalnie zostać wykorzystane do odkrycia nowych metod leczenia i biomarkerów w leczeniu i diagnostyce nerwiaka zarodkowego. Główną zaletą jest to, że stwarza bardziej fizjologicznie istotne warunki eksperymentalne do badania mikrośrodowiska guza przy użyciu powtarzalnej techniki, która osiąga spójność między partiami.

Nasza metoda rusztowania może być wykorzystana po pierwsze do zidentyfikowania nowych metod leczenia nerwiaka zarodkowego, a po drugie, do włączenia komórek pochodzących od pacjenta w celu lepszego przewidywania indywidualnej reakcji pacjenta. Na początek umieść rusztowanie przechowywane w PBS w okapie z przepływem laminarnym. Użyj sterylnej pęsety, aby delikatnie podnieść rusztowanie z rogu i dociśnij do ściany bocznej, aby usunąć nadmiar PBS.

Następnie umieść rusztowanie z błyszczącą warstwą skierowaną w dół na środku dołka nieprzylegającej płytki 24-dołkowej. Oznacz płytkę szczegółami linii komórkowej, gęstości wysiewu i punktów czasowych. Pracuj z komórkami o jednej gęstości wysiewu na raz, a pozostałe komórki utrzymuj w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia.

Do przyłączenia komórek w rusztowaniu należy użyć pipety P20 ze sterylnymi końcówkami, aby dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i dodać 20 mikrolitrów odpowiedniej zawiesiny komórek na środku każdego rusztowania, upewniając się, że zawiesina komórek pozostaje na rusztowaniu, a nie na ścianie bocznej lub podstawie studzienki. Pozwól komórkom przyczepić się przez trzy do pięciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności. Pod koniec inkubacji użyj pipety P1000, aby powoli dodać jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej do każdej studzienki, zapobiegając przemieszczaniu się rusztowań, i inkubuj płytkę przez noc.

Obserwuj rusztowania, początkowo, co dwa do trzech dni pod kątem zmian koloru pożywki wzrostowej, gdy komórki namnażają się w rusztowaniu. Użyj 10-mililitrowego pistoletu do pipet z trybem wolnym, aby usunąć i wyrzucić jeden mililitr zużytego podłoża ze studzienki. Gdy kondycjonowana pożywka jest używana do eksperymentu, zbierz zużytą pożywkę z kontrprób biologicznych w 15-mililitrowej probówce wirówkowej i rozpuść resztki komórkowe przez odwirowanie.

Przenieść supernatant do świeżej probówki i przechowywać probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po ustawieniu pistoletu do pipet w trybie kroplówki, delikatnie dodaj dwa mililitry podgrzanej pożywki wzrostowej do rusztowań. Inkubować płytkę zawierającą rusztowanie i uzupełniać świeżą pożywkę przez czas trwania pożądanego okresu wzrostu, jak pokazano.

W okapie z przepływem laminarnym wysterylizować odpowiedni odczynnik do oznaczania żywotności komórek przez filtrację przez sterylny filtr o średnicy 0,2 mikrometra do probówki wirówkowej. Podgrzej sterylny roztwór, kompletną pożywkę wzrostową i sterylny PBS w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś rusztowania do analizy na świeżej 24-dołkowej płytce i oznacz płytkę wszystkimi istotnymi szczegółami.

Dodaj 900 mikrolitrów podgrzanej pożywki do każdej studzienki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów odczynnika do żywotności sterylnych komórek do każdej studzienki. W celu kontroli ujemnej dodać 900 mikrolitrów pożywki i 100 mikrolitrów odczynnika żywotności sterylnych komórek w studzience bez rusztowania.

Załóż pokrywkę na płytkę i delikatnie kołysz płytką przez około trzy minuty, aby rozprowadzić rozcieńczony odczynnik żywotności komórek w całej studzience. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 95% wilgotnością. Po wyjęciu płytki z inkubatora, delikatnie kołysz płytką przez kilka sekund i wygeneruj trzy próbki, jak pokazano w rękopisie tekstowym.

Wykonać techniczne triplikaty, przenosząc 100 mikrolitrów inkubowanego podłoża i odczynnika z jednego dołka płytki 24-dołkowej do jednego dołka półprzezroczystej płytki 96-dołkowej i wykonać ten krok w sumie trzy razy dla jednego dołka. Przykryj 96-dołkową płytkę folią aluminiową, aby chronić odczynnik żywotności komórek przed światłem. Usunąć i wyrzucić pozostałe 700 mikrolitrów pożywki i odczynnika z rusztowań na płytce 24-dołkowej.

Umyj każde rusztowanie dwukrotnie jednym mililitrem sterylnego PBS. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję przy 570 i 600 nanometrach i oblicz procentową redukcję odczynników żywotności komórek zgodnie z zaleceniami producenta. Przeanalizuj statystycznie wyniki żywotności komórek przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.

Wprowadzić biologiczne potrójne wartości, aby utworzyć słupki błędów i wskazać zmienność testu. Wykonaj jednoczynnikową analizę testu wariancji, aby zbadać zmiany żywotności komórek w ramach eksperymentu przy użyciu odpowiedniego oprogramowania biostatystycznego. Wskaż znaczące różnice między punktami czasowymi na wykresach, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.

Oceniono żywotność dwóch linii komórkowych nerwiaka zarodkowego, KellyLuc i IMR32, hodowanych na rusztowaniach. Zwiększona gęstość komórek skutkowała z czasem większym zmniejszeniem odczynnika żywotności komórek. Wzrost komórek na rusztowaniach mierzono pośrednio poprzez ilościowe określanie DNA wyekstrahowanego z rusztowań, a następnie obliczono liczbę komórek na próbkę.

Komórki IMR32 wykazywały zwiększony wzrost, a następnie komórki KellyLuc, z czasem. Wzrost, morfologia i rozmieszczenie komórek na rusztowaniach zostały wizualnie ocenione za pomocą barwienia hematoksyliną, eozyną i immunohistochemią. Komórki KellyCis83 rosły szybciej i infiltrowały głębiej do obu kompozycji rusztowań niż mniej inwazyjna linia komórkowa Kelly'ego.

IMR32 wyhodowany na nano-hydroksyapatycie wykazał kontrastujący wzorzec wzrostu z dużymi, gęsto upakowanymi skupiskami przez 14 dni. Cechy specyficzne dla komórki monitorowano za pomocą barwienia immunohistochemicznego, a następnie barwienia falloidyną i DAPI, a obfitość aktyny zaobserwowano w komórkach Kelly'ego i Kelly'egoCis83 na rusztowaniach kolagenowo-glikozaminoglikańskich. W celu oceny aktywności komórkowej in vitro zmierzono wydzielane poziomy chromograniny A, a komórki wyhodowane na rusztowaniach kolagenowo-glikozaminoglikanu i nano-hydroksyapatytu kolagenu wytwarzały więcej chromograniny A w porównaniu ze wzrostem na konwencjonalnej hodowli 2D.

Oporna na chemię linia komórkowa KellyCis83 wydzielała więcej chromograniny A niż linia komórkowa Kelly'ego. Po przyłączeniu komórek komórki mogą być leczone różnymi terapiami. Dostarczyłoby to bardziej istotnych fizjologicznie wyników dla odpowiedzi komórek na leki niż konwencjonalna hodowla 2D.

Technika ta pozwala naukowcom lepiej zbadać, w jaki sposób komórki nowotworowe zachowują się i reagują na bodziec w mikrośrodowisku guza, począwszy od odpowiedzi na terapie lub interakcji z innymi typami komórek.