Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu
9 lipca 2021
Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.
Nasz protokół oferuje 3D model bioinżynieryjny, który w bliski sposób wpływa na tkankę macierzystą. Może to potencjalnie być wykorzystane do odkrywania nowych terapii i biomarkerów w leczeniu i diagnozie neuroblastoma. Główną zaletą jest to, że tworzy bardziej fizjologicznie odpowiednie warunki eksperymentalne do badania mikrośrodowiska nowotworowego z wykorzystaniem reproduktybilnej techniki, która zapewnia jednorodność między partiami.
Nasza metoda szkieletowa może być wykorzystana po pierwsze, do zidentyfikowania nowych terapii dla neuroblastoma, a po drugie, do włączenia komórek pochodzących od pacjenta dla lepszego przewidywania indywidualnej reakcji pacjenta. Na początek umieść szkielet przechowywany w PBS w komorze przepływowej. Użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie podnieść szkielet z rogu i docisnąć do ścianki, aby usunąć nadmiar PBS.
Następnie umieść szkielet z błyszczącą warstwą w dół w centrum dołka nieprzywierającej płytki 24-dołkowej. Oznaku płytkę szczegółami linii komórkowej, gęstości wysiewu i punktów czasowych. Pracuj z komórkami jednej gęstości wysiewu na raz i przechowuj pozostałe komórki w 37 stopniach Celsjusza w inkubatorze, do momentu użycia.
Do przyczepienia komórek w szkieletach użyj pipety P20 z bezpośrednimi końcówkami, aby dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową i dodaj 20 mikrolitrów odpowiedniej zawiesiny komórkowej na środek każdego szkieletu, upewniając się, że zawiesina komórkowa pozostaje na szczycie szkieletu, a nie na ściance bocznej lub dnie dołka. Pozostaw komórki do przyczepienia na trzy do pięciu godzin w 37 stopniach Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności. Pod koniec inkubacji, użyj pipety P1000, aby powoli dodać jeden mililitr przegrzanego pożywka wzrostowa do każdego dołka, zapobiegając przemieszczaniu się szkieletu i inkubować płytkę przez noc.
Obserwuj szkielety, początkowo, co dwa do trzech dni pod kątem zmiany koloru pożywki wzrostowej, gdy komórki się mnożą w środku szkieletu. Użyj pipety 10 mililitrowej z trybem wolnym, aby usunąć i wyrzucić jeden mililitr wykorzystanego pożywka z dołka. Kiedy pożywka warunkowana jest używana do eksperymentu, zbierz wykorzystaną pożywkę z biologicznych replikat w 15-mililitrowej eprufetce i osadz szczątki komórkowe przez wirowanie.
Przenieś nadstan do świeżej eprufetki i przechowuj eprufetkę w minus 80 stopniach Celsjusza. Po ustawieniu pipety w trybie kroplowania, delikatnie dodaj dwa mililitry przegrzanego pożywka wzrostowa do szkieletu. Inkubować płytkę zawierającą szkielet i uzupełnić świeże pożywka przez żądany okres wzrostu, jak pokazano.
W komorze przepływowej, wysterylizuj odpowiedni reagent testu żywotności komórkowej przez filtrację przez 0,2-mikrometrową sterylną filtr do eprufetki. Podgrzej sterylny roztwór, pełny pożywka wzrostowa i sterylny PBS w kąpieli wodnej, w 37 stopniach Celsjusza. Używając sterylnych kleszczy, przenieś szkielety do analizy na świeżą płytkę 24-dołkową i oznaku płytkę ze wszystkimi istotnymi szczegółami.
Dodaj 900 mikrolitrów przegrzanego pożywka wzrostowa do każdego dołka. Następnie dodaj 100 mikrolitrów sterylnego reagentu żywotności komórkowej do każdego dołka. Dla kontroli ujemnej, dodaj 900 mikrolitrów pożywki i 100 mikrolitrów sterylnego reagentu żywotności komórkowej w dołku bez szkieletu.
Nakryj płytkę pokrywką i delikatnie kołysz płytkę przez około trzy minuty, aby rozprowadzić rozcieńczony reagent żywotności komórkowej na całym dołku. Inkubować płytkę w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności. Po wyjęciu płytki z inkubatora, delikatnie kołysz płytkę przez kilka sekund i stwórz tryplikaty, jak pokazano w manuskrypcie tekstowym.
Stwórz tryplikaty techniczne, przenosząc 100 mikrolitrów inkubowanego pożywka i reagent z jednego dołka płytki 24-dołkowej do jednego dołka przezroczystej płytki 96-dołkowej i wykonaj ten krok łącznie trzy razy dla jednego dołka. Pokryj płytkę 96-dołkową folią aluminiową, aby chronić reagent żywotności komórek przed światłem. Usuń i wyrzuć pozostałe 700 mikrolitrów pożywka i reagent z szkieletu w płytce 24-dołkowej.
Umyj każdy szkielety dwa razy jednym mililitr sterylnego PBS. Użyj czytnika płytek mikro do zmierzenia absorbancji przy 570 i 600 nanometrach i oblicz procentowe zmniejszenie reagent żywotności komórek zgodnie z zaleceniami producenta. Statystycznie przeanalizuj wyniki żywotności komórek, używając odpowiedniego oprogramowania.
Wprowadź wartości biologiczne tryplikatów, aby wygenerować paski błędów i wskazać zmienność testu. Przeprowadź jednokierunkową analizę wariancji, aby zbadać zmiany w żywotności komórek w ciągu czasowym eksperymentu, używając odpowiedniego oprogramowania biostatystycznego. Wskaż znaczące różnice między punktami czasowymi na wykresach, jak opisano w manus
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia trójwymiarowy bioinżynieryjny model do badań nad neuroblastoma, który zwiększa istotność fizjologiczną warunków eksperymentalnych. Metoda ta umożliwia identyfikację nowych środków terapeutycznych oraz lepsze przewidywanie odpowiedzi pacjentów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Onkologia
Wprowadzenie
- Neuroblastoma to częsty nowotwór dziecięcy.
- Obecne modele nie wykazują odpowiedniej istotności fizjologicznej.
- Rusztowania 3D mogą naśladować mikrośrodowisko guza.
- Udoskonalone modele mogą prowadzić do lepszych strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnej metody tworzenia rusztowań 3D.
- Ocena zachowania i wzrostu komórek w odpowiednim środowisku.
- Ocena skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Wysiewanie linii komórkowych neuroblastoma na rusztowaniach kolagenowych.
- Monitorowanie adhezji i wzrostu komórek w czasie.
- Wykorzystanie testów żywotności w celu oceny stanu komórek.
- Analiza statystyczna wyników żywotności komórek.
Główne wyniki
- Wzrost i żywotność komórek różniły się pomiędzy poszczególnymi liniami komórkowymi neuroblastoma.
- Komórki IMR32 wykazały zwiększony wzrost w porównaniu z komórkami KellyLuc.
- Skład rusztowania wpływał na morfologię i rozkład komórek.
- W czasie obserwacji odnotowano istotne różnice w żywotności komórek.
Wnioski
- Model rusztowania 3D jest skuteczny w badaniach nad neuroblastoma.
- Ta metoda może pomóc w identyfikacji nowych terapii.
- Komórki pochodzące od pacjentów mogą usprawnić modelowanie predykcyjne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Neuroblastoma pozostaje główną przyczyną śmiertelności z powodu nowotworów u dzieci, a dostępne opcje terapeutyczne są ograniczone ze względu na słabą translacyjność modeli. Ten 3D biomimetyczny model rusztowania wypełnia krytyczną lukę na etapie odkrywania leków, zapewniając powtarzalny, fizjologicznie istotny system, który lepiej odzwierciedla oddziaływania w mikrośrodowisku guza in vivo. Umożliwiając bardziej predykcyjne oceny przedkliniczne odpowiedzi na leki oraz ekspresji biomarkerów, model ten wspiera ograniczanie ryzyka w procesach walidacji celów terapeutycznych i identyfikacji wiodących związków w potokach badawczych onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie interakcji między guzem a zrębem w określonym kontekście macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wyjaśnienia mechanizmów patogennych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójne przygotowanie rusztowań z partii na partię, co pozwala na wiarygodne badania oddziaływania z celem oraz modulacji szlaków.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do istotności celu poprzez modelowanie zachowania komórek w trójwymiarowym mikrośrodowisku, które wpływa na wrażliwość i oporność na leki.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowaną platformę do ilościowej oceny cytotoksyczności oraz zmian w ekspresji genów w odpowiedzi na zastosowane terapie.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalne testy żywotności i sekrecji (np. chromograniny A) przy użyciu odczytów spektrofotometrycznych kompatybilnych z formatami wysokoprzepustowymi.
- Wartość translacyjna: Pozwala na manipulację składnikami ECM (nHA, GAGs) w celu modelowania nisz przerzutniczych i oceny skuteczności związków w mikrośrodowiskach istotnych dla przebiegu choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Utrzymuje wyższą gęstość komórek i sprzyja tworzeniu morfologii istotnych fizjologicznie, co poprawia korelację z zachowaniem guza in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwia długotrwałe monitorowanie wzrostu komórek, ich żywotności oraz sekrecji biomarkerów w czasie trwania eksperymentów.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia ocenę wydzielanych biomarkerów, takich jak chromogranina A, które korelują z potencjałem nowotworowym i odpowiedzią terapeutyczną w neuroblastoma.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka i umożliwiając identyfikację wiodących związków za pomocą przesiewu substancji o istotności fizjologicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu mikrośrodowiska guza na proliferację, migrację komórek oraz odpowiedź na leki.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty żywotności i biomarkerów, co umożliwia porównywanie związków i potwierdzanie hitów.
- Analityka: Generuje znormalizowane dane z kwantyfikacji DNA, testów metabolicznych i pomiarów sekrecji kompatybilnych z metodą ELISA w celu porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Modeluje warunki niszy przerzutniczej (kość/szpik kostny) przy użyciu suplementacji nHA i GAG w celu zwiększenia istotności przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modułową platformę opartą na rusztowaniach, którą można dostosować do wielu linii komórkowych neuroblastoma oraz próbek pochodzących od pacjentów do zastosowań podłużnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez modelowanie wpływów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na zachowanie komórek nowotworowych i podatność na terapię.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom przygotowania rusztowania, wysiewania komórek i wymiany pożywki.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji go/no-go, dostarczając dane odzwierciedlające złożone odpowiedzi na poziomie tkankowym, a nie sztuczne warunki 2D.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wyniki w systemie imitującym chorobę ze specyfiką miejsca przerzutowania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sterylnych hodowlach tkankowych, pracy z biomateriałami oraz technikach trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych.
- Zależne od dostępu do rusztowań kolagenowych, nanohydroksyapatytu, glikozaminoglikanów oraz standardowego sprzętu do hodowli komórkowych.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania rusztowań, optymalizacji gęstości zasiewu komórek oraz wymiany pożywki w celu zapewnienia powtarzalności.
- Konieczna jest adaptacja testów żywotności i analiz biomarkerów w celu dostosowania ich do pobierania próbek z rusztowań oraz uwzględnienia potencjalnych zakłóceń wywołanych przez macierz.
- Ograniczone przez konieczność optymalizacji gęstości zasiewu w zależności od czasu trwania eksperymentu i pożądanego rozkładu komórek wewnątrz rusztowań.
