Rekonstrukcja ludzkiego siatkówczaka in vitro

Siatkówczak ludzki jest najczęstszym rodzajem raka wewnątrzgałkowego w dzieciństwie. Próbki kliniczne są trudne do uzyskania, a modele myszy nie mogą tworzyć siatkówczaka. Dlatego wytwarzanie siatkówczaka in vitro jest niezbędne do obserwacji genezy, proliferacji i wzrostu siatkówczaka oraz do opracowywania nowych środków terapeutycznych.

Skuteczność tego protokołu może osiągnąć około 100%, chociaż czas wytwarzania siatkówczaka jest zmienny od 45 do 120 dnia. W celu utrzymania siatkówczaka jeden lub RB jeden nokaut ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, hoduj gen edytowany H dziewięć komórek w sześciodołkowej płytce pokrytej czynnikiem wzrostu zredukowanej macierzy błony podstawnej i zmieniaj pożywkę codziennie. Aby przejść komórki, inkubuj je w buforze EDTA przez 3,5 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub pięć minut w temperaturze pokojowej.

Hoduj komórki, aż osiągną 80% konfluencji. Następnie, aby zainicjować różnicowanie komórek siatkówki, usuń pożywkę i przepłucz komórki jednym mililitrem DPBS. Następnie podnieś kolonie komórkowe, dodając jeden mililitr buforu Dispase i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Obserwuj kolonie komórkowe pod mikroskopem. Gdy krawędzie kolonii zaczną się rozwijać, odessać bufor Dispase i delikatnie przepłukać komórki raz jednym mililitrem DPBS. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do studzienki i za pomocą standardowej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów pokrój kolonie na kawałki.

Użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać pozostałe komórki w podłożu. Zbierz komórki przez odwirowanie w 15-mililitrowej probówce. Po odwirowaniu pozostawić około 50 mikrolitrów supernatantu w celu rozproszenia komórek w pożywce.

Następnie dodaj 250 mikrolitrów matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu i wymieszaj przez delikatne mieszanie. Po wymieszaniu umieść 15-mililitrową probówkę z zawieszonymi komórkami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 20 minutach inkubacji komórki i czynnik wzrostu zredukowały macierz błony podstawnej powinny utworzyć zestalony żel.

Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do 15-mililitrowej tubki. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra odpipetuj zestalony żel dwa do trzech razy, aby rozproszyć grudkę. Następnie dodaj kolejne dziewięć mililitrów pożywki i przenieś zawiesinę komórek do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórek.

Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Jest to dzień zerowy. Pierwszego dnia zbadaj komórki pod mikroskopem.

Średnio w jednym kawałku żelu obserwuje się od trzech do czterech torbieli. W piątym dniu zmień pożywkę, zbierając supernatant do 15-mililitrowej probówki, pozwalając torbielom osiąść na dnie i zastępując supernatant świeżą pożywką. Rozprowadź torbiele w probówce w dwóch 10-centymetrowych naczyniach, upewniając się, że w każdym naczyniu znajduje się co najmniej 300 torbieli.

Siódmego dnia większość torbieli przyczepionych do naczynia rozprzestrzenia się i tworzy przylegające kolonie. W 10 dniu zmień podłoże na świeże, upewniając się, że wszystkie torbiele pozostają przyczepione do naczynia. Obserwuj komórki pod mikroskopem od 13 do 17 dni, aby upewnić się, że komórki się rozprzestrzeniają.

W 15 dniu, po jednokrotnym przepłukaniu komórek jednym mililitrem DPBS, dodaj jeden mililitr roztworu dyspazy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach usunąć bufor Dispase i delikatnie spłukać kultury jednym mililitrem DPBS. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki, po dwa do każdej 10-centymetrowej potrawy i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po 24 godzinach przylegające kultury spontanicznie odłączają się i łączą w organoidy siatkówki. Trzy dni po oderwaniu zbierz komórki z naczynia do hodowli komórkowej w 15-mililitrowej probówce. Gdy organoidy osiądą, usuń supernatant z probówki i przenieś organoidy na nową, nieprzylegającą szalkę Petriego z 10 mililitrami pożywki numer dwa na następne cztery dni.

Tydzień po oderwaniu zmień pożywkę na pożywkę trzydzieścią i od tego dnia hoduj organoidy w pożywce trzeciej. W 27 dniu hodowli organoidów siatkówki architektura pęcherzyków wzrokowych jest widoczna i około 90% organoidów wykazuje tę strukturę. Pierwsze wykrycie siatkówczaka następuje w 45 dniu i staje się wyczuwalne w 50 dniu.

Kiedy dorasta do 90 dnia, struktury pęcherzyków wzrokowych są głównie otoczone siatkówczakiem. Siatkówczak może być teraz izolowany i dalej hodowany jako linia komórkowa. W 105 dniu ponad 80% organoidów siatkówki jest całkowicie otoczonych siatkówczakiem.

Organoidy te wykazują wysoką ekspresję markera proliferacji Ki67 i markera onkogenu SYK w porównaniu z organoidami siatkówki pochodzącymi z H dziewięć, co wskazuje na nowotworzenie . Ponadto wysoka ekspresja markera prekursorowego czopków ARR3 i markera prekursorowego fotoreceptora CRX w organoidach siatkówczaka pokazuje, że pochodzą one z komórek prekursorowych czopków. Przedstawiono tutaj gorsze i lepsze wyniki podczas trzech etapów morfologicznych powstawania siatkówczaka.

Zróżnicowane i niezróżnicowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste można łatwo odróżnić na podstawie ich morfologii. Niezróżnicowane komórki są wybierane do tworzenia siatkówczaka. Piątego dnia wytworzona kula powinna być raczej pusta niż stała.

Siatkówczak wywodzi się z organoidów siatkówki, które wykazują architekturę pęcherzyków wzrokowych. Z organoidów dolnych nie powstaje siatkówczak. Podczas wykonywania zabiegu wszystkie końcówki powinny być schłodzone, a matryca membrany podstawnej powinna zostać stopiona w temperaturze czterech stopni przed dodaniem jej do probówki.

Jest to kluczowy krok dla tego protokołu różnicowania.