Name: Rekonstrukcja ludzkiego siatkówczaka in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj metodę generowania ludzkiego siatkówczaka in vitro poprzez wprowadzenie mutacji RB1 w komórkach macierzystych H9. To podejście umożliwia badanie genezy nowotworu i testowanie nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zespołowi 502 za wszelką pomoc. Prace te są częściowo wspierane przez Miejską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (Z200014) oraz Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFA0105300).

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Tongren w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. ESC H9 są pozyskiwane z Instytutu Badawczego WiCell.
1. Generacja zmutowanego RB1 hESC
<ol>
	<li>Wektor celowania CRISPR/Cas9 dla nokautu (KO) RB1.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj parę sgRNA. W celu ablacji RB1 należy celować w pierwszy ekson tego genu. Sekwencja startera do przodu to CACCGCGGTGGGGGGGTTTTTCGG, a odwrotna sekwencja startera to AAACCCGAAAACGGGCCCCACCGC. 
		UWAGA: W przypadku konkretnej mutacji RB1 wymagany jest również naprawiony szablon. W tym protokole jako przykład użyto linii komórkowej RB1-KO.</li>
		<li>Trawić 1 μg pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro z enzymami restrykcyjnymi BbsI (patrz tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Oczyść strawione plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Reakcje enzymatyczne można bezpośrednio oczyścić bez żelu agarozowego za pomocą zestawu do oczyszczania (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Fosforylować i wyżarzać każdą parę oligonukleotydów za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) (tabela materiałów) z reakcją obejmującą 1 μl oligo1 (100 μM), 1 μl oligo2 (100 μM), 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 6,5 μl ddH2O i 0,5 μl T4 PNK. 
		UWAGA: Startery do przodu i do tyłu w kroku 1.1.1 to para oligonukleotydów. Fosforylować i wyżarzać oligonukleotydy w termocyklerze, stosując następujące parametry: 37 °C przez 30 min; 95 °C przez 5 min; obniżyć do 25 °C przy 5 °C na minutę.</li>
		<li>Rozcieńczyć ufosforylowane i wyżarzane oligonukleotydy 200 razy, dodając 1 μl odczynnika oligokrygonukleostatycznego do 199 μl wody wolnej od nukleaz w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Ustawić reakcję ligacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, mieszając następujące elementy: 50 ng plazmidu strawionego przez Bbs1 z etapu 1.1.3, 1 μl oligoduplexu z kroku 1.1.5, 5 μl buforu ligacyjnego 2x, 1 μl ligazy i uzupełnić do 10 μl wodą bez nukleaz.</li>
		<li>Przekształć mieszaninę ligacyjną i zsekwencjonuj dodatnie kolonie do następnego kroku. 
		UWAGA: Do sekwencjonowania użyj startera U6 do przodu lub do tyłu.
		<ol>
			<li>Rozmrozić właściwe komórki na lodzie.</li>
			<li>Pobrać 50 μl właściwych komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Dodać 1 μl mieszaniny ligacyjnej z kroku 1.1.6 do właściwych komórek.</li>
			<li>Delikatnie wymieszać, trzykrotnie pipetując rurkę w górę i w dół. 
			UWAGA: Nie wirować.</li>
			<li>Umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.</li>
			<li>Szok cieplny mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 90 s.</li>
			<li>Do probówki dodać 950 μl bulionu Luria-Bertani (LB) o temperaturze pokojowej bez antybiotyku.</li>
			<li>Umieścić probówkę w wytrząsarce przy 300 obr./min w temperaturze 37 °C na 60 min.</li>
			<li>Uprzednio ogrzać płytki LB (pepton, pepton z kazeiny, chlorek sodu, agar-agar i ampicylina) do temperatury 37 °C.</li>
			<li>Rozprowadzić 50-100 μl komórek i mieszaniny ligacji na płytkach w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Zbierz 12 kolonii z płytki i przenieś je na pożywkę LB z ampicyliną. Umieść pożywkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min na 60 minut.</li>
			<li>Użyj 1 μl roztworu bakterii (z kroku 1.1.7.12) jako matrycy do PCR i wybierz dodatnie kolonie.</li>
			<li>Zsekwencjonuj dodatnie kolonie za pomocą starterów U6, w następnym kroku użyj kolonii z zaprojektowanymi sekwencjami sgRNA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyodrębnij plazmid za pomocą zestawu midi (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Jakość i ilość plazmidu przy użyciu mini zestawu nie są wystarczające do przeprowadzenia kolejnego eksperymentu z nukleofekcją. Zestaw midi lub maxi jest bardziej odpowiedni niż zestaw mini.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla HESC i nukleofekcja. 
	UWAGA: Podgrzej wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
	<ol>
		<li>Rozmrozić 1 x 106 komórek H9 na wstępnie powlekanej płytce 6-dołkowej z 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK) i 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC. 
		UWAGA: Przed użyciem pokryć 6-dołkową płytkę matrycą membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu o 1% przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnego dnia usuń supernatant, przepłucz komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS), a następnie dodaj 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę codziennie z 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC w ciągu następnych 3-5 dni, aż komórki osiągną około 80% zbieżności.</li>
		<li>Przejście raz lub dwa razy, aby dostosować stan hESC. 
		UWAGA: Najprostszym sposobem identyfikacji stanu hESC jest morfologia.</li>
		<li>Hoduj niezróżnicowane komórki H9 na 6-dołkowej płytce, aż osiągną 80% zgrywu.</li>
		<li>Zmienić pożywkę na 2 godziny przed nukleofekcją za pomocą 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC zmieszanej z 10 μM Y-27632 i wstępnie pokryć jedną studzienkę 12-dołkowej płytki przy użyciu 1% matrycy błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu.</li>
		<li>Odessać pożywkę i spłukać 1 ml podgrzanego DPBS.</li>
		<li>Wyjąć DPBS i inkubować z 1 ml enzymu dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przez 3,5 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 1 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC do komórek i dwukrotnie pipetować, aby komórki H9 stały się zawiesiną pojedynczej komórki.</li>
		<li>Wyjąć 100 μl mieszaniny do zliczania komórek i przenieść pozostałą część do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej kolejne 2 ml pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić około 2 x 106 komórek w objętości reakcyjnej 100 μl. Zgodnie z protokołem producenta zoptymalizuj objętość komórek, plazmidów, nukleofektora i warunków reakcji. Patrz tabela materiałów dla systemu nukleofekcji używanego w tym protokole. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, pęcherzyki nie są dozwolone podczas nukleofekcji.</li>
		<li>Po transfekcji przenieść komórki na wstępnie powlekaną płytkę 12-dołkową, uzupełnić 1,5 ml pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC i 10 μM Y-27632, a następnie hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj medium codziennie. Po 48 godzinach dodać 2 μg/ml puromycyny do selekcji komórek około tygodnia. 
		UWAGA: Wiele komórek umiera w ciągu pierwszych 3 dni. Pozostałe komórki mogą się namnażać i przekształcać w kolonie w następnym tygodniu po selekcji puromycyny. W tygodniu selekcji upewnij się, że podłoże zawsze zawiera 2 μg/ml puromycyny.</li>
		<li>Wybierz kolonie ręcznie pod mikroskopem. 
		UWAGA: Morfologia kolonii jest taka sama jak kolonii hES. Pokrój kolonie na kawałki (2-6 sztuk na kolonię) za pomocą 10 μl białej/normalnej końcówki pipety w pożywce i przenieś jedną kolonię do jednego wstępnie powlekanego dołka na 12-dołkowej płytce.</li>
		<li>Najpierw zidentyfikuj mutacje RB1 i sytuacje poza celem (Tabela 1), a następnie pluripotencję, aby scharakteryzować linię komórkową H9 z nokautem RB1. 
		UWAGA: Wykryj mutacje RB1 i sytuacje poza celem za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera. Zidentyfikuj markery pluripotencji za pomocą RT-PCR i immunofluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generacja ludzkiego siatkówczaka
<ol>
	<li>Utrzymanie RB1-KO hESC.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki H9 z edytowanym genem na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu z 2 ml pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC i zmieniaj pożywkę codziennie.</li>
		<li>Pasaż z użyciem buforu EDTA przez 3,5 min w temperaturze 37 °C lub 5 min w temperaturze RT. 
		UWAGA: Bufor EDTA jest mieszaniną 1x DPBS, 5 mM EDTA i 0,9 mg/ml NaCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie komórek siatkówki. 
	UWAGA: Przygotować pożywkę I przed różnicowaniem. Aby przygotować pożywkę I, wymieszaj 24,5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle Medium (DMEM)/mieszanki składników odżywczych F-12(F12)-Glutaminy (1x), 24,5 ml pożywki Neuronal basenal, 250 μl 100x suplementu A, 500 μL 50x suplementu B, 0,1 mM ß-merkaptoetanolu i 250 μl 100x L-glutaminy. Przed użyciem podgrzej wszystkie mieszanki do RT.
	<ol>
		<li>Wyhoduj RB1-KO hESC do 80% konfluencji w jednym dołku na 6-dołkowej płytce.</li>
		<li>Usuń pożywkę i przepłucz komórki 1 ml 1x DPBS.</li>
		<li>Podnieść kolonie komórkowe za pomocą 1 ml buforu dyspazy (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Sprawdź kolonie komórkowe pod mikroskopem. Zwykle rozwinięcie się krawędzi kolonii zajmuje 5 minut.</li>
		<li>Odessać bufor do depazy i delikatnie przepłukać komórki raz 1 ml 1x DPBS.</li>
		<li>Dodaj 1 ml pożywki I do dołka.</li>
		<li>Pokrój kolonie na kawałki (6-9 sztuk na kolonię) za pomocą 10 μl białej/normalnej końcówki pipety w podłożu. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, około 60%-70% komórek odłącza się od studni. Użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać pozostałe komórki w podłożu.</li>
		<li>Zbierz wszystkie komórki, odwirowując w probówce o pojemności 15 ml o pojemności 200 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Pozostawić około 50 μl supernatantu do rozproszenia komórek w pożywce, a następnie wymieszać komórki z 250 μl matrycy błony podstawnej zredukowanej przez czynnik wzrostu przez delikatne mieszanie. 
		UWAGA: Przed użyciem należy przechowywać matrycę membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Jeżeli lek jest porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C, należy go umieścić w temperaturze 4 °C na noc lub co najmniej 1 godzinę przed użyciem.</li>
		<li>Probówkę o pojemności 15 ml z zawieszonymi komórkami należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20 minut 
		UWAGA: Upewnij się, że komórki i macierz błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu tworzą zestalony żel.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki I do probówki o pojemności 15 ml, a następnie lekko odpipetować zestalony żel dwa do trzech razy, aby rozproszyć grudkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Dodać 9 ml pożywki I i przenieść zawiesinę komórek do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i ustaw dzień jako dzień 0.</li>
		<li>Zbadaj komórki pod mikroskopem w dniu 1. 
		UWAGA: W naczyniu można było zaobserwować tysiące pustych torbieli. Średnio w jednym kawałku żelu obserwuje się od 3 do 4 torbieli.</li>
		<li>Zmień podłoże w 5 dniu. Zebrać supernatant do probówki o pojemności 15 ml, poczekać, aż torbiele osiądą na dnie, a następnie usunąć pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką I. 
		UWAGA: Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty w 4 dniu, zmień pożywkę w 4 dniu, w przeciwnym razie w 5 dniu. Dodaj 10 ml świeżego podłoża I do oryginalnego naczynia. Setki torbieli przyczepiły się już do powierzchni hodowli; Trzymaj je tam.</li>
		<li>Rozprowadź torbiele w probówce w dwóch 10-centymetrowych szalkach. 
		UWAGA: Upewnij się, że w naczyniu znajduje się co najmniej 300 torbieli. Jeśli torbiele nie zlewają się, nie rozdzielaj torbieli na inne naczynia; Włóż je z powrotem do oryginalnego naczynia o średnicy 10 cm.</li>
		<li>W 7 dniu większość torbieli (powyżej 95%) przyczepia się do naczynia, rozprzestrzenia się i tworzy przylegające kolonie. 
		UWAGA: Już w 3 dniu można zaobserwować przylegające kolonie.</li>
		<li>W 10 dniu zmień pożywkę na świeżą pożywkę I. Upewnij się, że wszystkie torbiele są przyczepione do naczynia.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę II przed następnym krokiem, mieszając następujące elementy: 36 ml DMEM, 12 ml F12, 2% suplementu B (v/v), 0,1 mM roztworu aminokwasów endogennych MEM (NEAA).</li>
		<li>Upewnij się, że komórki są rozłożone do 13-17 dnia. Następny krok wykonaj w 15 dniu, kiedy komórki są rozproszone, ale nie wchodzą w interakcję z sąsiednimi koloniami.</li>
		<li>Przepłukać komórki raz 1 ml DPBS i dodać 1 ml roztworu do dyspazy przez 5 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: W ciągu 5 minut krawędź komórek podnosi się.</li>
		<li>Usunąć bufor do dypazy i delikatnie przepłukać kultury 1 ml 1x DPBS.</li>
		<li>Dodać 10 ml pożywki II do każdego 10 cm naczynia i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Przylegające kultury samoistnie odrywają się po 24 godzinach i łączą się w organoidy siatkówki. 
		UWAGA: Wiele komórek, które nie tworzą organoidów, umrze w ciągu następnych 2 dni.</li>
		<li>Trzy dni po odłączeniu należy pobrać komórki z naczynia do hodowli komórkowych i pozwolić organoidom osiąść w probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Usunąć supernatant z probówki i przenieść organoidy do nowej, nieprzylegającej szalki (szalki Petriego) z 10 ml pożywki II na następne cztery dni.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę III, mieszając DMEM: F12 w stosunku 3:1 (v/v), 2% suplement B (v/v), 0,1 mM roztworu aminokwasów endogennych MEM (NEAA), 8% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v/v), 100 μM tauryny i 2 mM glutaminy.</li>
		<li>Tydzień po odłączeniu zmień pożywkę na Średnią III.</li>
		<li>Od tego dnia hoduj organoidy w pożywce III i odświeżaj podłoże dwa razy w tygodniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustanowienie linii komórkowej RB. 
	UWAGA: Wszystkie odczynniki są wstępnie podgrzewane w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>W 90 dniu RB (80%-90%) obejmują organoidy siatkówki. Dlatego wybierz 90-dniowe organoidy RB do wytworzenia linii komórek RB.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę 1640, mieszając pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 z 10% FBS.</li>
		<li>Pokrój RB na kawałki (20-25 sztuk na RB) za pomocą noża mikrochirurgicznego pod mikroskopem w pożywce RPMI-1640.</li>
		<li>Usuń pożywkę RPMI-1640 i potraktuj kawałki 0,25% trypsyną/EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodaj pożywkę RPMI-1640, aby zakończyć reakcję i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce 1640 w naczyniu nieprzylegającym.</li>
		<li>Linia komórkowa RB to pływająca kultura. Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu i przechodź komórki RB w ciągu 2 tygodni. 
		UWAGA: Tempo proliferacji pierwotnych komórek RB jest dość powolne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+organoid+retinoblastoma+reveals+a+cancerous+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).</li>
<li>Singh, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+proliferation+and+retinoblastoma+genesis+in+RB-deficient+human+but+not+mouse+cone+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).</li>
<li>Xu, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb+suppresses+human+cone-precursor-derived+retinoblastoma+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours.</a> Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).</li>
<li>Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The biology of retinoblastoma.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).</li>
<li>Benavente, C. A., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+epigenetics+of+human+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetics and epigenetics of human retinoblastoma.</a> Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+MYCN-driven+retinoblastoma+reveals+MYCN-independent+tumor+reemergence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).</li>
<li>Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+generating+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors.</a> Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+rock-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RB1+in+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).</li>
<li>Dimaras, H., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma%2C+the+visible+CNS+tumor%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).</li>
<li>Xu, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+has+properties+of+a+cone+precursor+tumor+and+depends+upon+cone-specific+MDM2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling.</a> Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).</li>
<li>Qi, D. L., Cobrinik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDM2+but+not+MDM4+promotes+retinoblastoma+cell+proliferation+through+p53-independent+regulation+of+MYCN+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation.</a> Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie są świadomi żadnych powiązań, członkostwa, finansowania lub udziałów finansowych, które mogłyby wpłynąć na obiektywność tego badania.

Ludzki siatkówczak (RB) jest spowodowany inaktywacją RB1 i dysfunkcją białka Rb. W tym protokole hESC RB1-KO jest kluczowym krokiem w wytwarzaniu RB w naczyniu. Chociaż nawet w przypadku RB1-/- hESC możliwe jest, że nie dochodzi do tworzenia RB ze względu na metody różnicowania organoidów siatkówki10. W tym protokole przejście od kultury przylegającej do kultury pływającej jest niezbędne w procesie różnicowania. Gęstość torbieli, rodzaje pluripotencjalnych kom...

Ludzki siatkówczak (RB) jest rzadkim, śmiertelnym nowotworem wywodzącym się z prekursorów stożków siatkówki1,2,3, jest najczęstszym typem nowotworu wewnątrzgałkowego w dzieciństwie4. Homozygotyczna inaktywacja genu RB1 jest inicjującą zmianą genetyczną w RB5. Jednak myszy z mutacjami RB1 nie tworzą guza siatkówki2. Chociaż guzy myszy mogą być generowane przez kombinację mutacji Rb1 i innych modyfikacji genetycznych, nadal brakuje im cech ludzkiego RB6. Dzięki rozwojowi różnicowania organoidów siatkówki udało się uzyskać RB pochodzącego z hESC, wyświetlającego cechy ludzkiego RB1.
W ciągu ostatniej dekady ustanowiono liczne protokoły różnicowania organoidów siatkówki, w tym 2D7, 3D8, oraz kombinację 2D i 3D9. Metoda użyta tutaj do wygenerowania ludzkiego RB to konsolidacja kultury przylegającej i kultury pływającej9. Poprzez różnicowanie hESC z mutacją RB1 w organoidy siatkówki, tworzenie RB jest wykrywane około 45 dnia, a następnie szybko się namnaża około 60 dnia. W 90 dniu możliwa jest izolacja RB i wytworzenie linii komórkowej RB; ponadto RB otacza prawie wszystkie organoidy siatkówki w 120 dniu.
hESC RB jest innowacyjnym modelem do badania pochodzenia, nowotworzenia i leczenia RB. W tym protokole szczegółowo opisano wytwarzanie hESC z edycją genów, różnicowanie RB i charakterystykę RB.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td>anty-ARR3</td><td>Sigma</td><td>HPA063129</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CRX (M02)</td><td>Abnove</td><td>ABN-H00001406-M02</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab15580</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-Syk (D3Z1E)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>13198</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R3539S</td><td>Enzymy restrykcyjne</td></tr><tr><td>Dyspaza (1U / mL)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo 15575020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), zakwalifikowana do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza szynki F-12 (szynki F12)</td> <td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100X)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>P3 Zestaw 4D-Nucleofector X Primary Cell S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>Zestaw do nukleofekcji</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Operacja genu</td><td>Puromycyny</td><td>ISY1130-0025MG</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>pożywka hodowlana ncEpic-hiPSC/hESC</td> Pożywka hodowlana <td>Nuwacell</td><td>RP01001</td><td>ncEpic-hiPSC/hESC w 1.2.1</td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel w 1.2.1</td></tr><tr><td>Enzym dysocjacji komórek</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express w 1.2.8</td></tr><tr><td>Zestaw</td> <td>RNeasy MidiQIAGEN</td><td>75144</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Suplement A</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Suplement N-2 (100X), płyn, suplement w medum I</td></tr><tr><td>Suplement B</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td>B-27 Suplement (50X), płyn, suplement w medum I,II,III</td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td> Life <td>Technologies</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>pX330-U6- Chimeryczny BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 4D</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja ludzkiego siatkówczaka in vitro

Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro

Ludzki RB to rak dziecięcy, który jest śmiertelny, jeśli nie stosuje się leczenia. Ponieważ RB wywodzi się z prekursorów czopków, co jest stosunkowo rzadkie w modelach gryzoni, tymczasem jeśli chodzi o różnice międzygatunkowe między ludźmi a gryzoniami, model choroby pochodzący od ludzi jest bardziej korzystny dla odkrycia mechanizmów ludzkiego RB i poszukiwania celów terapii. W niniejszym dokumencie protokół opisuje generowanie dwóch linii hESC z edytowanymi genami z bialleliczną mutacją punktową RB1 (RB1Mut/Mut) i mutacją nokautującą RB1 (RB1-/-). Podczas procesu rozwoju siatkówki obserwuje się powstawanie RB. Linie komórkowe RB są również ustanawiane przez segregację od organoidów RB. W sumie, różnicując edytowane genowo linie hESC w organoidy siatkówki przy użyciu połączonego protokołu różnicowania 2D i 3D, udało nam się zrekonstruować ludzki RB w naczyniu i zidentyfikować jego pochodzenie jako prekursora stożka. Stanowiłoby to pomocny model choroby do obserwacji genezy, proliferacji i wzrostu siatkówczaka, a także do dalszego opracowywania nowych środków terapeutycznych.

Procedura generowania RB została wyjaśniona na Ryc. 1, która łączy kulturę adherentną i zawiesinową. Możliwe było odzyskanie ludzkich RB z hESC-KO RB1 oraz uzyskanie linii komórkowej RB poprzez izolację organoidów RB.
W niniejszym protokole przedstawiono szczegóły różnicowania na różnych etapach (Rycina 2). W ciągu pierwszych 3 dni tworzą się puste sfery, które przylegają do powierzchni hodowli, a następnie powiększają się (<...

Opisujemy metodę generowania ludzkiego siatkówczaka (RB) poprzez wprowadzanie biallelicznych mutacji RB1 w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC). Linie komórkowe RB mogą być również z powodzeniem hodowane przy użyciu wyizolowanego RB w naczyniu.

Rekonstrukcja ludzkiego siatkówczaka in vitro

Human RB is pediatric cancer, which is lethal if no treatment is administered. As RB originates from cone precursors, which is relatively rare in rodent ...

Siatkówczak ludzki jest najczęstszym rodzajem raka wewnątrzgałkowego w dzieciństwie. Próbki kliniczne są trudne do uzyskania, a modele myszy nie mogą tworzyć siatkówczaka. Dlatego wytwarzanie siatkówczaka in vitro jest niezbędne do obserwacji genezy, proliferacji i wzrostu siatkówczaka oraz do opracowywania nowych środków terapeutycznych.Skuteczność tego protokołu może osiągnąć około 100%, chociaż czas wytwarzania siatkówczaka jest zmienny od 45 do 120 dnia. W celu utrzymania siatkówczaka jeden lub RB jeden nokaut ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, hoduj gen edytowany H dziewięć komórek w sześciodołkowej płytce pokrytej czynnikiem wzrostu zredukowanej macierzy błony podstawnej i zmieniaj pożywkę codziennie. Aby przejść komórki, inkubuj je w buforze EDTA przez 3,5 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub pięć minut w temperaturze pokojowej.Hoduj komórki, aż osiągną 80% konfluencji. Następnie, aby zainicjować różnicowanie komórek siatkówki, usuń pożywkę i przepłucz komórki jednym mililitrem DPBS. Następnie podnieś kolonie komórkowe, dodając jeden mililitr buforu Dispase i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Obserwuj kolonie komórkowe pod mikroskopem. Gdy krawędzie kolonii zaczną się rozwijać, odessać bufor Dispase i delikatnie przepłukać komórki raz jednym mililitrem DPBS. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do studzienki i za pomocą standardowej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów pokrój kolonie na kawałki.Użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać pozostałe komórki w podłożu. Zbierz komórki przez odwirowanie w 15-mililitrowej probówce. Po odwirowaniu pozostawić około 50 mikrolitrów supernatantu w celu rozproszenia komórek w pożywce.Następnie dodaj 250 mikrolitrów matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu i wymieszaj przez delikatne mieszanie. Po wymieszaniu umieść 15-mililitrową probówkę z zawieszonymi komórkami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 20 minutach inkubacji komórki i czynnik wzrostu zredukowały macierz błony podstawnej powinny utworzyć zestalony żel.Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do 15-mililitrowej tubki. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra odpipetuj zestalony żel dwa do trzech razy, aby rozproszyć grudkę. Następnie dodaj kolejne dziewięć mililitrów pożywki i przenieś zawiesinę komórek do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórek.Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Jest to dzień zerowy. Pierwszego dnia zbadaj komórki pod mikroskopem.Średnio w jednym kawałku żelu obserwuje się od trzech do czterech torbieli. W piątym dniu zmień pożywkę, zbierając supernatant do 15-mililitrowej probówki, pozwalając torbielom osiąść na dnie i zastępując supernatant świeżą pożywką. Rozprowadź torbiele w probówce w dwóch 10-centymetrowych naczyniach, upewniając się, że w każdym naczyniu znajduje się co najmniej 300 torbieli.Siódmego dnia większość torbieli przyczepionych do naczynia rozprzestrzenia się i tworzy przylegające kolonie. W 10 dniu zmień podłoże na świeże, upewniając się, że wszystkie torbiele pozostają przyczepione do naczynia. Obserwuj komórki pod mikroskopem od 13 do 17 dni, aby upewnić się, że komórki się rozprzestrzeniają.W 15 dniu, po jednokrotnym przepłukaniu komórek jednym mililitrem DPBS, dodaj jeden mililitr roztworu dyspazy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach usunąć bufor Dispase i delikatnie spłukać kultury jednym mililitrem DPBS. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki, po dwa do każdej 10-centymetrowej potrawy i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po 24 godzinach przylegające kultury spontanicznie odłączają się i łączą w organoidy siatkówki. Trzy dni po oderwaniu zbierz komórki z naczynia do hodowli komórkowej w 15-mililitrowej probówce. Gdy organoidy osiądą, usuń supernatant z probówki i przenieś organoidy na nową, nieprzylegającą szalkę Petriego z 10 mililitrami pożywki numer dwa na następne cztery dni.Tydzień po oderwaniu zmień pożywkę na pożywkę trzydzieścią i od tego dnia hoduj organoidy w pożywce trzeciej. W 27 dniu hodowli organoidów siatkówki architektura pęcherzyków wzrokowych jest widoczna i około 90% organoidów wykazuje tę strukturę. Pierwsze wykrycie siatkówczaka następuje w 45 dniu i staje się wyczuwalne w 50 dniu.Kiedy dorasta do 90 dnia, struktury pęcherzyków wzrokowych są głównie otoczone siatkówczakiem. Siatkówczak może być teraz izolowany i dalej hodowany jako linia komórkowa. W 105 dniu ponad 80% organoidów siatkówki jest całkowicie otoczonych siatkówczakiem.Organoidy te wykazują wysoką ekspresję markera proliferacji Ki67 i markera onkogenu SYK w porównaniu z organoidami siatkówki pochodzącymi z H dziewięć, co wskazuje na nowotworzenie . Ponadto wysoka ekspresja markera prekursorowego czopków ARR3 i markera prekursorowego fotoreceptora CRX w organoidach siatkówczaka pokazuje, że pochodzą one z komórek prekursorowych czopków. Przedstawiono tutaj gorsze i lepsze wyniki podczas trzech etapów morfologicznych powstawania siatkówczaka.Zróżnicowane i niezróżnicowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste można łatwo odróżnić na podstawie ich morfologii. Niezróżnicowane komórki są wybierane do tworzenia siatkówczaka. Piątego dnia wytworzona kula powinna być raczej pusta niż stała.Siatkówczak wywodzi się z organoidów siatkówki, które wykazują architekturę pęcherzyków wzrokowych. Z organoidów dolnych nie powstaje siatkówczak. Podczas wykonywania zabiegu wszystkie końcówki powinny być schłodzone, a matryca membrany podstawnej powinna zostać stopiona w temperaturze czterech stopni przed dodaniem jej do probówki.Jest to kluczowy krok dla tego protokołu różnicowania.

reconstruct-human-retinoblastoma-in-vitro

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Siatkówka nerwowa myszy w wieku 8 dni znajduje się na 4% bloku żelatyny. Po wyizolowaniu warstwy fotoreceptorów (200 μm) za pomocą wibratomu, fotoreceptory są wysiewane po dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej do hodowli. Warstwa fotoreceptorowa może być wykorzystana do analiz molekularnych, biochemicznych lub transplantacji.

Cięcie wibratomem siatkówki myszy w celu przygotowania kultur fotoreceptorowych

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Woda to wysokowydajna płynna biopsja w leczeniu retinoblastomy, czyli raka wewnątrzgałkowego, którego nie można pobrać in vivo ze względu na ryzyko rozprzestrzeniania się przez zewnątrzoczne. Przedstawiono tutaj metodę bezpiecznego wyodrębniania wody za pomocą przezroczystej paracentezy rogówki oraz kroki analizy genomowej w celu identyfikacji prognostycznych biomarkerów.

Humor wodny jako biopsja płynna w leczeniu retinoblastomy: przezroczysta paracenteza rogówki i analiza genomowa

Poznaj metodę generowania ludzkiego siatkówczaka in vitro poprzez wprowadzenie mutacji RB1 w komórkach macierzystych H9. To podejście umożliwia badanie genezy nowotworu i testowanie nowych terapii.

Rekonstrukcja ludzkiego siatkówczaka in vitro

Przeglądaj więcej filmów