Name: Zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Poznaj metodę CRISPRi do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów zakażenia leptospirozą i rozwój skuteczniejszych szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą. Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji mają na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Brazylijska agencja FAPESP (grant 2014/50981-0) wsparła finansowo te prace; LGVF jest finansowany ze stypendium FAPESP (2017/06731-8 i 2019/20302-8). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptów. Autorzy dziękują również Hannah Hill i Alexandrowi Grimesowi z USDA Visual Services za sfilmowanie i montaż protokołu wideo.

1. Definicja protospaceru i budowa plazmidu
UWAGA: W tej sekcji opisano pierwszy krok wyboru odpowiednich protospacerów do budowy sgRNA i dalszej ligacji do pMaOri.dCas9 (Rysunek 1). Ta sekwencja protospacerowa składa się z sekwencji 20 nukleotydów skierowanych przeciwko pożądanemu celowi.
<ol>
	<li>Uzyskaj sekwencję nukleotydową genu będącego przedmiotem zainteresowania do wyciszenia w GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Prześlij go na serwer WWW CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), z parametrami zdefiniowanymi dla Streptococcus pyogenes Cas9 i sąsiadującego z nim motywu protospacerowego NGG po wybraniu opcji "Fasta Target". Zdefiniuj parametry na "CRISPR/Cas9" i PAM (protospacer sąsiedni motyw) NGG.</li>
	<li>Na podstawie uzyskanych wyników wybierz protospacery z najlepszym możliwym wynikiem (zielona strzałka), które znajdują się jak najbliżej końca 5' regionu kodującego i, co najważniejsze, są zawarte w nici matrycowej (ujemnej), ponieważ sgRNA musi sparować się z nicią kodującą genu w celu całkowitego wyciszenia genu. 
	UWAGA: Motyw NGG nie jest uwzględniony w końcowej sekwencji sgRNA.</li>
	<li>Użyj promotora lipL32 do ekspresji pojedynczego przewodnika RNA, który zawiera zmienną sekwencję nukleotydową 20 na końcu 5' i konserwatywną sekwencję rusztowania dCas9. Połącz sekwencję 20-nt, zwaną protospacerem, z promotorem wargi 32(na końcu 5') i rusztowaniem sgRNA (koniec 3') (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Aby uzyskać dobrze zdefiniowany promotor lipL32, użyj regionu promotora składającego się z -334 do TSS (miejsce rozpoczęcia transkrypcji, na podstawie Zhukova et al.9). Sprawdź plik uzupełniający dla końcowej kasety sgRNA.</li>
	<li>Wygeneruj kasetę sgRNA za pomocą sekwencyjnego PCR5 lub zleć jej syntezę komercyjnemu dostawcy.</li>
	<li>Po uzyskaniu kasety należy ją podwiązać do plazmidu pMaOri.dCas9 w miejscu restrykcji XmaI na obu końcach (cccggg)4.
	<ol>
		<li>Trawić zarówno kasetę sgRNA, jak i plazmid pMaOri.dCas9 enzymem restrykcyjnym XmaI i przystąpić do ligacji (<silna klasa = "xfig" >Figura 1B).</li>
		<li>Wykonaj kroki klonowania w dT auksotroficznym szczepie E. coli π110, ze względu na pochodzenie replikacji pMaOri11 (a tym samym pMaOri.dCas9), R6K-gamma. 
		UWAGA: Szczegółowy protokół podwiązania i selekcji klonów można znaleźć w poprzednich publikacjach Fernandesa i Nascimento12. Sterowany przez sgRNA dCas9 zwiąże się z nicią kodującą wybranego genu będącego przedmiotem zainteresowania, a zatem będzie blokować wydłużanie polimerazy RNA (<silna klasa = "xfig" >Figura 1C), powodując wyciszenie genu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transformacja Leptospira przez koniugację
UWAGA: Schemat graficzny tego kroku jest przedstawiony w Rysunek 2. Aby utworzyć nośniki HAN i płyty HAN, zapoznaj się z Hornsby et al.13 i Fernandes et al.5.
<ol>
	<li>Hodować chorobotwórcze komórki Leptospira w temperaturze 29 lub 37 °C w pożywce HAN13 pod mieszaniem, rozcieńczając nasyconą kulturę w świeżym HAN w stosunku 1:100; zazwyczaj L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130 potrzebuje 4-6 dni, aby osiągnąć odpowiednią gęstość komórek.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że kultury osiągną średnicę zewnętrzną 0,2-0,4 przy 420 nm (2 do 5 x 108 komórek/ml) przed użyciem do koniugacji. 
		UWAGA: Ponieważ pożywka HAN zmienia kolor wraz ze wzrostem gęstości komórek (z powodu czerwieni fenolowej zawartej w pożywce DMEM), odwirować (4,000 x g, 15 min, temperatura pokojowa) 1 ml pożywki hodowlanej w celu usunięcia leptospir i zastosować supernatant jako ślepą próbę do pomiaru średnicy zewnętrznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć sprzężony szczep E. coli β2163, auksotroficzny dla kwasu diaminopimelicznego (DAP), z plazmidem pMaOri.dCas9 zawierającym kasetę sgRNA. Dla E. Transformacja coli, użyj protokołów szoku cieplnego lub elektroporacji. Uwzględnij transformację z plazmidem pMaOri.dCas9 bez kasety sgRNA jako kontrolę.
	<ol>
		<li>W celu przemiany w wyniku szoku cieplnego należy zmieszać plazmidowe DNA (100 ng) z chemicznie kompetentnymi komórkami E. coli i inkubować na lodzie przez 30 minut. Przeprowadzić szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 90 s i ponownie umieścić go na lodzie na 5 minut. Odzyskać komórki, dodając 1 ml pożywki LB, inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i przejść do posiewu.</li>
		<li>Do elektroporacji użyj elektrokompetentnych komórek zmieszanych ze 100 ng plazmidowego DNA. Użyj następujących parametrów dla impulsu: 1.8 kV, 100 Ω i 25 μF. Odzyskaj ogniwa, jak wyjaśniono powyżej.</li>
		<li>Umieść przekształcone komórki E. coli dawcy w pożywce agarowej LB uzupełnionej kwasem diaminomelicznym (DAP) (0,3 mM) i spektynomycyną (40 μg / ml) w celu wyselekcjonowania plazmidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do koniugacji wybierz jedną kolonię z każdej płytki na dzień przed dniem koniugacji (który określa się poprzez monitorowanie średnicy zewnętrznej kultur leptospires).
	<ol>
		<li>Wybierz jedną kolonię E. coli β2163 z pustych płytek pMaOri.dCas9 i jedną z pMaOri.dCas9sgRNA. Pozwól im rosnąć przez noc w 10 ml LB plus DAP i spektynomycyny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnego dnia rozcieńczyć nasycone kultury w stosunku 1:100 w 10 ml świeżego LB plus DAP (nie uwzględniaj tutaj antybiotyku) do OD420 nm 0,2-0,4. Zwykle E. coli potrzebuje 2-3 godzin, aby osiągnąć taką gęstość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wewnątrz okapu bezpieczeństwa biologicznego BSL2 zmontuj aparat filtracyjny, umieszczając filtr membranowy z mieszanych estrów celulozy o średnicy 25 mm i wielkości porów 0,1 μm na górze szklanej podstawy. Umieść szklany lejek o pojemności 15 ml na górze i przytrzymaj oba kawałki za pomocą sprężyny clamps. Podłącz szklankę do pompy próżniowej i dodaj kultury do lejka w celu filtracji.</li>
	<li>Dodać 5 ml kultury Leptospira do lejka. Dodaj objętość E. coli, aby uzyskać proporcję 1:1 w oparciu o wartości OD420 nm obu kultur. Włącz pompę próżniową i skoncentruj komórki przez filtrację. Po zagęszczeniu komórek w filtrze membranowym ostrożnie je odzyskaj. Upewnij się, że pożywka jest filtrowana przez membranę. 
	UWAGA: Filtracja trwa od 5 do 10 minut.</li>
	<li>Umieść filtr na dostępnej w handlu płytce EMJH (patrz Tabela materiałów) uzupełnionej DAP (0.3 mM). Upewnij się, że strona z bakteriami jest skierowana do góry. Inkubować płytki w temperaturze 29 °C przez 24 h. 
	UWAGA: Jeśli używane są płytki HAN lub uzupełnione wewnętrzne EMJH14, E. coli może się namnażać i osiągnąć zamierzoną proporcję 1:1, co z kolei może zmniejszyć wydajność koniugacji5.</li>
	<li>Po 24 godzinach wyjmij filtry z płytek i umieść każdy pojedynczy filtr w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Użyj 1 ml ciekłego podłoża HAN, aby uwolnić komórki z powierzchni filtra poprzez intensywne pipetowanie i wirowanie.</li>
	<li>Wizualizacja odzyskanych mieszanych roztworów bakteryjnych za pomocą mikroskopii ciemnego pola w celu sprawdzenia żywotności i ruchliwości komórek oraz proporcji Leptospira:E. coli. 
	UWAGA: Na tym etapie można zaobserwować równoważną liczbę E. coli i Leptospira.</li>
	<li>Rozprowadzić 100-200 μl tej kultury na płytkach HAN zawierających 0,4% inaktywowanej surowicy królika i 40 μg/ml spektynomycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 3%CO2. 
	UWAGA: Zwykle komórki L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130 tworzą kolonie w ciągu 5-7 dni na płytkach kontrolnych i w ciągu 8-10 dni na płytkach spektynomycyny. Na tym etapie E. coli nie będą rosły, ponieważ są auksotroficzne dla DAP.</li>
	<li>Jako kontrolę, rozcieńczyć kultury w stężeniu 104 leptospires/ml i dodać 100 μl na płytki bez antybiotyku, w celu monitorowania wzrostu leptospirali.</li>
</ol>
3. Selekcja kolonii oraz wzrost i walidacja transkoniugantów
UWAGA: Kolonie powinny być widoczne do 10 dnia. Nie są one jednak zbyt łatwe do zwizualizowania. Zwykle w tym momencie płytki HAN są nieco nieprzezroczyste z powodu wysuszonych komórek, które zostały rozprzestrzenione, a kolonie Leptospira mogą wyglądać jak przezroczysta aureola na białawym tle. Zaleca się oglądanie płytek pod różnymi kątami, aby uzyskać różne padanie światła, dzięki czemu kolonie są bardziej widoczne. Przy dłuższym czasie inkubacji kolonie mogą nabrać gęstszego wyglądu, aw tym przypadku prezentują się jako mleczne aureole na ciemnym tle.
<ol>
	<li>Dodać 100 μl płynnej pożywki HAN do każdej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml w celu odzyskania mutantów. Weź co najmniej 3 kolonie z każdej płytki.
	<ol>
		<li>Za pomocą końcówki do mikropipet "wykop" agar, aby pobrać kolonie z płytek, ponieważ kolonie leptospiralne mogą znajdować się pod powierzchnią. 
		UWAGA: Oczekuje się, że na tym etapie zostanie zabrany agar. Kolonie powinny być pobierane z płytek kontrolnych zawierających pusty plazmid pMaOri.dCas9 oraz płytek z leptospirami zawierającymi plazmidy eksprymujące zarówno dCas9, jak i pojedynczy przewodnik RNA, przeznaczone dla genu docelowego.</li>
		<li>Dozować zebraną kolonię w 100 μl pożywki HAN do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i energicznie homogenizować. Na tym etapie należy zapewnić maksymalne naruszenie integralności agaru, aby uwolnić komórki. Wirować zawieszenie przez 10 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwizualizuj odzyskane komórki za pomocą mikroskopii ciemnego pola w powiększeniu 200-400x, dodając kroplę o pojemności 5 μl na szkiełko podstawowe i natychmiast przykryj próbki szkiełkiem nakrywkowym.
	<ol>
		<li>Potwierdź obecność żywych i żywotnych leptospirów odzyskanych z kolonii.</li>
		<li>Po wizualizacji i potwierdzeniu żywotności leptospirów, przenieść 100 μl komórek do płynnej pożywki HAN zawierającej 40 μg/ml spektynomycyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wzroście w płynnych pożywkach HAN oceń kultury pod kątem obecności plazmidu ze starterem pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) i R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACCC), które rozpoznają region flankujący kasetę sgRNA.
	<ol>
		<li>Zebrać 200 μl kultury, odwirować (4 000 x g, 15 min), wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić powstały osad w 20 μl wody.</li>
		<li>Użyj tej zawiesiny jako matrycy do dodatkowego PCR, bez potrzeby ekstrakcji DNA12. 
		UWAGA: Komórki z pMaOri.dCas9 będą renderować amplikon 281 pz, w porównaniu do tych zawierających plazmidy z kasetą sgRNA, która da amplikon 723 pz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu potwierdzenia wyciszenia genów należy wykonać immunoblot z wykorzystaniem ekstraktów komórkowych z transkoniugantów zawierających tylko pMaOri.dCas9 (kontrola ujemna) i pMaOri.dCas9sgRNA.
	<ol>
		<li>Nałożyć odpowiednik 5 x 107 komórek na pas żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu (SDS).</li>
		<li>Białka przenoszące elektroelektronicznie do błony w celu inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami. Oprócz przeciwciała przeciwko genowi docelowemu do wyciszenia, użyj innego do kontroli obciążenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj zmutowane kultury w pożywce HAN plus spektynomycyna w celu utrzymania plazmidu. Jeśli do pożywki nie zostaną zastosowane żadne antybiotyki, można zaobserwować całkowite wyciszenie genów dla co najmniej trzech pasaży5.</li>
</ol>

<ol><li>Bharti, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+A+zoonotic+disease+of+global+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance.</a> Lancet Infectious Disease. 3 (12), 757-771 (2003).</li>
<li>Costa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+morbidity+and+mortality+of+Leptospirosis%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Disease%22%5BJournal%5D)">Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review.</a> PLoS Neglected Tropical Disease. 9 (9), 0003898(2015).</li>
<li>Shapiro, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9-based+gene+drive+platform+for+genetic+interaction+analysis+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans.</a> Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Fernandes, L. G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+based+on+RNA-guided+catalytically+inactive+Cas9+%28dCas9%29%3A+a+new+tool+for+genetic+engineering+in+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira.</a> Science Reports. 9 (1), 1839(2019).</li>
<li>Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+pathogenic+Leptospira%3A+CRISPR+interference+%28CRISPRi%29-mediated+gene+silencing+and+rapid+mutant+recovery+at+37+C%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of pathogenic Leptospira: CRISPR interference (CRISPRi)-mediated gene silencing and rapid mutant recovery at 37 C.</a> Science Reports. 11 (1), 1768(2021).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Choudhary, E., Thakur, P., Pareek, M., Agarwal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+CRISPR+interference+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria.</a> Nature Communication. 6, 6267(2015).</li>
<li>Zhukova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcriptional+start+site+mapping+and+sRNA+identification+in+the+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Infectious+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcriptional start site mapping and sRNA identification in the pathogen.</a> Frontiers in Cell and Infectious Microbiology. 7, 10(2017).</li>
<li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+%28IncW%29+and+RP4+plasmid+%28IncPalpha%29+conjugative+machineries%2C+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPalpha) conjugative machineries, and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Research in Microbiology. 156 (2), 245-255 (2005).</li>
<li>Pappas, C. J., Benaroudj, N., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replicative+plasmid+vector+allows+efficient+complementation+of+pathogenic+Leptospira+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A replicative plasmid vector allows efficient complementation of pathogenic Leptospira strains.</a> Applied Environmental Microbiology. 81 (9), 3176-3181 (2015).</li>
<li>Fernandes, L. G. V., Nascimento, A. L. T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+gene+silencing+in+Leptospira+biflexa+by+RNA-guided+catalytically+inactive+Cas9+%28dCas9%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Specific gene silencing in Leptospira biflexa by RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9).</a> Methods in Molecular Biology. 2134, 109-122 (2020).</li>
<li>Hornsby, R. L., Alt, D. P., Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+leptospires+at+37+%C2%B0C+directly+from+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of leptospires at 37 °C directly from the mammalian host.</a> Science Reports. 10 (1), 9620(2020).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 12, Unit 12E.12 (2006).</li>
<li>Nascimento, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+two+Leptospira+interrogans+serovars+reveals+novel+insights+into+physiology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis.</a> Journal of Bacteriology. 186 (7), 2164-2172 (2004).</li>
<li>Nascimento, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+features+of+Leptospira+interrogans+serovar+Copenhageni%5BTitle%5D)+AND+%22Brazillian+Journal+of+Medical+Biology+Research%22%5BJournal%5D)">Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni.</a> Brazillian Journal of Medical Biology Research. 37 (4), 459-477 (2004).</li>
<li>Ren, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+physiological+and+pathogenic+features+of+Leptospira+interrogans+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).</li>
<li>Bulach, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+reduction+in+Leptospira+borgpetersenii+reflects+limited+transmission+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (39), 14560-14565 (2006).</li>
<li>Picardeau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+saprophyte+Leptospira+biflexa+provides+insights+into+the+evolution+of+Leptospira+and+the+pathogenesis+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis.</a> PLoS One. 3 (2), 1607(2008).</li>
<li>Fernandes, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpL1+is+an+extracellular+matrix-+and+plasminogen-interacting+protein+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">OmpL1 is an extracellular matrix- and plasminogen-interacting protein of Leptospira spp.</a> Infections and Immunity. 80 (10), 3679-3692 (2012).</li>
<li>Fernandes, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+spp.%3A+Novel+insights+into+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Leptospira spp.: Novel insights into host-pathogen interactions.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 176, 50-57 (2016).</li>
<li>Castiblanco-Valencia, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospiral+immunoglobulin-like+proteins+interact+with+human+complement+regulators+factor+H%2C+FHL-1%2C+FHR-1%2C+and+C4BP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP.</a> Journal of Infectious Diseases. 205 (6), 995-1004 (2012).</li>
<li>Choy, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+LigB+adhesin+binds+homeostatic+proteins+with+potential+roles+in+cutaneous+infection+by+pathogenic+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The multifunctional LigB adhesin binds homeostatic proteins with potential roles in cutaneous infection by pathogenic Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 6 (2), 16879(2011).</li>
<li>Siqueira, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+LIC10508+is+a+plasma+fibronectin%2C+plasminogen%2C+fibrinogen+and+C4BP-binding+protein+of+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogen+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">The recombinant LIC10508 is a plasma fibronectin, plasminogen, fibrinogen and C4BP-binding protein of Leptospira interrogans.</a> Pathogen and Diseases. 74 (2), (2016).</li>
<li>Teixeira, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+two+new+proteins+with+OmpA-like+domains+identified+in+the+genome+sequences+of+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of two new proteins with OmpA-like domains identified in the genome sequences of Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 10 (4), 0122762(2015).</li>
<li>Kochi, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+two+novel+putative+proteins+of+Leptospira+interrogans+with+E-cadherin%2C+plasminogen+and+complement+components+with+potential+role+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection.</a> Virulence. 10 (1), 734-753 (2019).</li>
<li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).</li>
<li>Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+insertional+mutagenesis+of+Leptospira+interrogans%2C+the+agent+of+leptospirosis%2C+using+a+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon.</a> Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).</li>
<li>Pětrošová, H., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+Leptospira+biflexa+mutant+library+to+identify+genes+involved+in+ethidium+bromide+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance.</a> Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).</li>
<li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).</li>
<li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%3A+Disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li>
<li>Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+evidence+for+gene+replacement+in+Leptospira+spp.+Inactivation+of+L.+biflexa+flaB+results+in+non-motile+mutants+deficient+in+endoflagella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella.</a> Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).</li>
<li>King, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-temperature+protein+G+is+an+essential+virulence+factor+of+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans.</a> Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).</li>
<li>Lambert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlaA+proteins+in+Leptospira+interrogans+are+essential+for+motility+and+virulence+but+are+not+required+for+formation+of+the+flagellum+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath.</a> Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).</li>
<li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+requires+heme+oxygenase+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis.</a> Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathogens. 3 (7), 97(2007).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospiral+flagellar+sheath+protein+FcpA+interacts+with+FlaA2+and+FlaB1+in+Leptospira+biflexa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa.</a> PLoS One. 13 (4), 0194923(2018).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Cress, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+CRISPR%2FdCas9-regulated%2C+orthogonally+repressible+hybrid+T7-lac+promoters+for+modular%2C+tuneable+control+of+metabolic+pathway+fluxes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).</li>
<li>Zhao, C., Shu, X., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+gene+knockdown+system+based+on+catalytically+inactive+%28%22dead%22%29+Cas9+%28dCas9%29+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FdCas9-mediated+multiplex+gene+repression+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces.</a> Biotechnology Journal. , 1800121(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Po wczesnym sekwencjonowaniu patogennych 15,16,17,18 i saprofitycznych19 gatunków Leptospira, eksploracja danych genomu rzuciła światło na kilka aspektów patogenezy leptospiralnej. W większości przypadków funkcję białek badano przy użyciu rekombinowanego odpowiednika przypuszczalnych białek leptospiralnych eksponowanych na powierzchnię, a następnie spekulacji na temat natywnej funkcji białka 20,21,22,23,24,25,26.
Generowanie mutantów i ocena ich odpowiedniego fenotypu są kluczowymi elementami funkcjonalnej analizy genomowej. Początkowe próby wygenerowania mutantów w Leptospira spp. osiągnięto poprzez losową mutagenezę transpozonów 27,28,29,30; jednak po obszernej i pracochłonnej analizie mającej na celu wywnioskowanie tożsamości zaburzonych genów, zauważono, że tylko 15% wszystkich genów u L. interrogans serowar Manilae było zakłóconych27. Celowany nokaut genów został następnie osiągnięty przez rekombinację homologiczną z wykorzystaniem plazmidów samobójczych w celu dostarczenia kasety oporności na antybiotyki otoczonej homologicznymi ramionami w pożądanym celu31,32.
Stosując te technologie, zbadano kilka aspektów podstawowej biologii i zjadliwości leptospirali 31,33,34,35,36,37. Opracowanie koniugacyjnego wektora wahadłowego E. coli-Leptospira, pMaOri 11, umożliwiło dostarczenie składników do episomalnego wyciszania genów.
Wcześniej wykazano, że wywołane przez Cas9 pęknięcie podwójnej nici jest śmiertelne dla Leptospira spp., a jako alternatywa katalitycznie nieaktywny wariant enzymu, dCas9, może być stosowany do wyciszania genów zarówno u gatunków saprofitycznych, jak i patogennych4, 5. Wykorzystując plazmid pMaOri.dCas9 jako szkielet do ligacji kasetowej sgRNA, można uzyskać specyficzne i stabilne wyciszenie genów dzięki ekspresji zarówno dCas9, jak i sgRNA; sgRNA związane z dCas9 doprowadzi białko do pożądanego celu poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka.
W celu całkowitego wyciszenia genu, protospacer powinien być zaprojektowany w oparciu o nić matrycową pożądanego genu, tak aby parowanie zasad sgRNA zachodziło z nicią kodującą. W oparciu o średnią zawartość C+G wynoszącą 35% w Leptospira spp., PAM 5'-NGG-3' występuje co najmniej 3 razy na 100 pz. Dlatego praktycznie każdy gen w genomie Leptospira będzie zawierał co najmniej jeden PAM. Jeśli jednak motyw NGG nie zostanie znaleziony, można ocenić alternatywny motyw NAG.
Poprzednie techniki wyciszania genów, takie jak palce cynkowe i TALE (efektory podobne do aktywatora transkrypcji), opierały się na budowie jednego innego białka dla każdego celu, co sprawiało, że techniki te były pracochłonne ikosztowne. W przypadku CRISPRi składową zmienną jest sgRNA, co sprawia, że konieczna jest zmiana tylko 20 pz na końcu 5'. Całkowite, stabilne i ukierunkowane wyciszenie genów zaobserwowano nie tylko u Leptospira spp.4,5, ale także u innych bakterii 8,39,40,41.
Rozwój pożywki HAN13 sprzyjał odzyskiwaniu mutantów poprzez drastyczne skrócenie czasu inkubacji w celu utworzenia kolonii i umożliwienie Leptospira wzrostu w temperaturze 37 oC. Jednak na etapie koniugacji jego stosowanie nie jest zalecane, ponieważ E. coli może energicznie namnażać się w tej pożywce i pokonywać zamierzoną proporcję 1:1 między komórkami dawcy i biorcy. Na tym etapie EMJH plus DAP jest lepszym wyborem, ponieważ E. coli słabo się replikują w tym pożywce. Warto wspomnieć, że niektóre laboratoria wytwarzają we własnym zakresie suplementy EMJH, które mogą zawierać dodatkowe składniki, które mogą również wspierać wzrost komórek E. coli .
Przedstawiony tutaj protokół koniugacji został zoptymalizowany dla L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130, a także udowodniono, że jest skuteczny w transformacji niedawno wyizolowanego szczepu chorobotwórczego z próbek gleby5. Wstępne próby z różnymi serowarami z gatunku L. borgpetersenii wskazują na niższą skuteczność koniugacji z opisanym protokołem. W związku z tym, podczas pracy z różnymi gatunkami/serowarami Leptospira, optymalne warunki koniugacji powinny być określone empirycznie, biorąc pod uwagę proporcje komórek dawcy do biorcy, początkową gęstość komórek, pożywkę koniugacyjną i czas (24 i 48 godzin). Rozsądne jest założenie, że różne gatunki Leptospira i serotypy będą zachowywać się inaczej przy różnych protokołach koniugacji.
Mimo że saprofityczne kolonie Leptospira są stosunkowo łatwe do uwidocznienia na płytkach, kolonie chorobotwórcze mogą być trudniejsze do zaobserwowania. Zwykle, stosując pożywkę HAN uzupełnioną 0,4% surowicą króliczą i spektynomycyną, kolonie transkoniugowane można zaobserwować w 10 dniu. Z naszego doświadczenia wynika, że kolonie początkowo prezentują się jako przezroczysta aureola na powierzchni ośrodka. W protokole wideo pokazane są gęstsze kolonie po 14 dniach wzrostu, ponieważ przezroczyste były trudne do sfilmowania. Na tym etapie obracanie płytki w celu uzyskania różnego padania światła i przechodzenie między białym i ciemnym tłem może pomóc w identyfikacji kolonii.
W przypadku walidacji mutantów immunoblotting oferuje proste podejście; Ponieważ jednak przeciwciała przeciwko białkom docelowym nie zawsze są dostępne, można zastosować alternatywne strategie walidacji wyciszania genów. Ilościowa reakcja PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR) przy użyciu starterów dla genu docelowego i kontroli konstytutywnej jest skuteczna w walidacji wyciszania genów, ponieważ dCas9 sterowany przez sgRNA jest odpowiedzialny za blokowanie transkrypcji genu. Jeśli gen docelowy koduje wyraźnie zdefiniowane pasmo białkowe w żelach białkowych, SDS-PAGE może wykazać wyciszenie i zgodnie z lipL32 gen wyciszenia5. Jeśli geny biosyntezy LPS zostaną wyciszone, można zastosować barwienie LPS; w przypadku wyciszania genów kodujących enzymy z dobrze zdefiniowanymi substratami, testy kinetyczne z substratami chromogennymi są odpowiednimi strategiami; Wyciszanie β-galaktozydazy u L. biflexa zwalidowano przy użyciu substratów X-gal i ONPG (orto-nitrofenylo-β-galaktozyd)4.
Po potwierdzeniu wyciszenia genów można zaprojektować eksperymenty w celu dalszej oceny fenotypu. Testy wiązania można wykonać w przypadku wyciszania adhezyn bakteryjnych; Testy prowokacyjne w surowicy potwierdziły rolę LigA i LigB w przeżywalności surowicy wykazywanej przez patogenną Leptospira5. Mutanty mogą być również używane do inokulacji zwierząt w celu oceny osłabienia zjadliwości; w takim przypadku zwierzęta zaszczepione mutantem należy porównać z tymi, które zostały zakażone komórkami zawierającymi tylko pMaOri.dCas9.
Podsumowując, obecny protokół opisuje zastosowanie CRISPRi do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira przy użyciu pożywek HAN w celu ułatwienia odzyskiwania zmutowanych w ciągu 10 dni. Wyciszanie genów w połączeniu z funkcjonalną analizą genomu poprawi nasze zrozumienie mechanizmów patogennych Leptospira i ostatecznie doprowadzi do opracowania lepszych strategii profilaktycznych w celu kontroli choroby.

Leptospiroza to zaniedbana na całym świecie choroba odzwierzęca wywoływana przez chorobotwórcze i zjadliwe gatunki z rodzaju Leptospira. U ludzi choroba odpowiada za ponad milion przypadków i 60 000 zgonów rocznie na całym świecie1,2. Jak dotąd nie ma długotrwałej i skutecznej szczepionki na tę chorobę. Identyfikacja czynników wirulencji i mechanizmów patogennych ma kluczowe znaczenie dla opracowania lepszych strategii terapeutycznych i profilaktycznych. Dlatego zdolność do generowania mutacji genetycznych i oceny wynikowego fenotypu ma kluczowe znaczenie dla funkcjonalnej analizy genomowej3.
Konstrukcja mutantów w patogennej Leptospira była do tej pory uważana za z natury nieefektywną, pracochłonną, kosztowną i trudną do wdrożenia. Ten scenariusz drastycznie się zmienił wraz z zastosowaniem niedawnej interferencji CRISPR (CRISPRi) do leptospiresów saprofitycznych4 i patogenic5 leptospires.
Wyciszanie genów osiąga się poprzez ekspresję dwóch składników: wariantu enzymu CRISPR/Cas (cluster regully interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) ze Streptococcus pyogenes, zwanego katalitycznie martwym Cas9 (dCas9) i jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA), który może być edytowany zgodnie z pożądanym celem6, 7,8. Białko dCas9, po związaniu z sgRNA, jest kierowane do określonych celów DNA przez parowanie zasad Watsona i Cricka, powodując steryczną blokadę wydłużania polimerazy RNA, co skutkuje wyciszeniem genu z powodu zablokowanej transkrypcji genu7 (<silna klasa="xfig">Figura 1).
Ten manuskrypt ma na celu opisanie budowy plazmidu do ekspresji zarówno dCas9, jak i sgRNA, koniugacji między dawcą E. coli β2163 a biorcą komórek Leptospira, odzyskiwania transkoniugantu i wreszcie walidacji wybranych zmutowanych kolonii.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mikro; m wielkość porów mieszana membrana estrów celulozy</td><td>Millipore</td><td>VCWP02500</td><td>Filtracja do koniugacji bakteryjnej</td></tr><tr><td>Kwas 2,6-diaminopimeliczny (DAP)</td><td>Sigma</td><td>D1377</td><td>Wzrost auksotroficznych E. coli &beta; 2163</td></tr><tr><td>Agar Noble</td><td>BD & Firma</td><td>214230</td><td>Służy do przygotowania stałych płytek EMJH i HAN</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD & Firma</td><td>214010</td><td>Służy do przygotowania litych płytek LB</td></tr><tr><td>Przejrzystość Zachodni substrat ECL</td><td>Biorad</td><td>170-5060</td><td>Podłoże chemiluminescencyjne</td></tr><tr><td>zestaw dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>10297-018</td><td>dNTP do reakcji PCR</td></tr><tr><td>Szklany uchwyt filtra do mikroanalizy</td><td>Filtracja XX1012530</td><td></td> do <td>koniugacji bakteryjnej</td></tr><tr><td>System obrazowania</td><td>Biorad</td><td>ChemiDoc MP</td><td>Detekcja chemiluminescencji</td></tr><tr><td>bulion LB, Miller</td><td>BD & Firma</td><td>244620</td><td>Lizogeniczne płynne podłoże dla E. coli hodowla</td></tr><tr><td>Leptospira Wzbogacanie EMJH</td><td>BD & Firma</td><td>279510</td><td>Suplementacja EMJH media</td></tr><tr><td>Leptospira Medium Base EMJH</td><td>BD & Firma</td><td>279410</td><td>Pożywka EMJH dla Leptospira</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels 12%</td><td>Biorad</td><td>4568043</td><td>Używany do eletrorezy żelu poliakrylamidowego</td></tr><tr><td>Czytnik gęstości optycznej</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax M2</td><td>Do pomiarów gęstości optycznej kultur bakteryjnych Sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>buforowana fosforanem 7,4</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td>Roztwór soli do mycia granulek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>S0692</td><td>Wybór plazmidów szkieletowych pMaOri</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza Thermo</td><td>Fisher</td><td>EP0402</td><td>Enyme, bufor i MgCl2 do reakcji PCR</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Zastosowany Biosystem</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Używany do cyklicznych reakcji PCR</td></tr><tr><td>Tymidyna (dT)</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td>Wzrost auksotroficznych E. coli &pi; 1</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny XmaI</td><td>Nowy Englan BioLabs</td><td>R0180L</td><td>Trawienie plazmidów i insertów</td></tr></tbody></table>

zastosowanie interferencji crispr (crispri) do wyciszania genów u patogennych gatunków leptospira

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Leptospiroza to globalnie zaniedbana choroba odzwierzęca, odpowiedzialna za co najmniej 1 milion przypadków rocznie i prawie 60 tysięcy zgonów. Choroba jest wywoływana przez chorobotwórcze i zjadliwe bakterie z rodzaju Leptospira, albo przez bezpośredni kontakt z bakteriami, albo pośrednio przez narażenie na skażoną wodę lub glebę. Zwierzęta domowe i dzikie działają jako żywiciele rezerwuarowi infekcji, wydalając leptospiry ze skolonizowanych kanalików nerkowych nerki za pośrednictwem moczu do środowiska. Wytwarzanie zmutowanych szczepów Leptospira ma kluczowe znaczenie dla oceny i zrozumienia patogennych mechanizmów infekcji. Interferencja CRISPR (CRISPRi) okazała się prostym, niedrogim i specyficznym narzędziem do wyciszania genów u patogennej Leptospira. W związku z tym opisane zostaną szczegóły metodologiczne uzyskiwania konstruktów plazmidowych zawierających zarówno dCas9, jak i przewodnik RNA, dostarczania plazmidów do Leptospira przez koniugację ze szczepem E. coli β2163 oraz odzyskiwania i oceny transkoniugantu. Ponadto niedawno opisana pożywka Hornsby-Alt-Nally (HAN) pozwala na stosunkowo szybką izolację i selekcję zmutowanych kolonii na płytkach agarowych.

Mimo że zawartość CG w genomach Leptospira spp. wynosi zazwyczaj około 35%, niemal każdy gen prawdopodobnie zawiera PAM 5'NGG 3'; motyw ten należy rozważyć w odniesieniu do nici matrycowej. Po wprowadzeniu sekwencji kodującej genu (od kodonu start do kodonu stop), na podstawie wyników CHOPCHOP należy wybrać protospacery na nici minus (-, matrycowej). Ważne jest, aby nie uwzględniać motywu NGG w 20-nt protospacerze sgRNA.
Jeśli koniugację przeprowadzono przy proporcji komórek dawcy do biorcy 1:1 przez 24 h na powierzchni płytek z agarem EMJH z dodatkiem DAP, a następnie 200 μL odzyskanej zawiesiny bakteryjnej wysiano na płytki z agarem HAN z dodatkiem spektynomycyny, kolonie transkonjugantów powinny być widoczne po około 8-10 dniach. Wysianie takiej objętości zazwyczaj skutkuje pojawieniem się 20-40 kolonii na płytce (Rycina 3A). W celu sprawdzenia żywotności komórek po koniugacji można je wysiać na płytki HAN bez selekcji antybiotykowej. W takim przypadku kolonie mogą być obserwowane już po 7 dniach. Płytki HAN zmieniają kolor na bladożółty w atmosferze 3% CO2.
Po wyselekcjonowaniu kolonii i ich namnożeniu w pożywce płynnej z dodatkiem spektynomycyny, w celu wstępnej kontroli jakości transkonjugantów można przeprowadzić PCR z użyciem całych komórek i starterów pMaOri2 (Rysunek 3B). Komórki leptospir zawierające kontrolny plazmid pMaOri.dCas9 powinny przynieść amplikon o długości 281 bp, natomiast komórki zawierające plazmid do wyciszania, czyli zawierające zarówno dCas9, jak i sgRNA, powinny przynieść amplikon o długości 723 bp. Startery pMaOri2 F i R zostały zaprojektowane tak, aby flankowały miejsce restrykcyjne XmaI, które służy do ligacji kasety sgRNA.
Po potwierdzeniu obecności plazmidu komórki można zebrać z pożywki, dwukrotnie przemyć PBS, a następnie wykorzystać do przygotowania ekstraktu z całych komórek do analizy immunoblottingowej. Jeśli doszło do wyciszenia, białka docelowe — w tym przypadku LipL32 lub oba białka LigA i LigB — powinny być widoczne tylko w komórkach typu dzikiego oraz w tych zawierających pMaOri.dCas9; nawet przy dłuższym czasie ekspozycji, odpowiadające im białka nie powinny być widoczne w komórkach zawierających pMaOri.dCas9sgRNA (Rycyna 3C).
Jeśli planowane są eksperymenty mające na celu ocenę wirulencji leptospir po wyciszeniu genów, hodowle wykorzystywane do konjugacji powinny być niskopasażowymi wirulentnymi Leptospira. Po potwierdzeniu wyciszenia genu można zamrozić kilka alikwotów jako zapas. Jeśli wyciszony gen wykazuje mierzalny fenotyp, np. na podstawie wcześniejszych prac z białkami rekombinowanymi, hodowle można wykorzystać do walidacji, a w takim przypadku jako kontrolę negatywną można włączyć komórki zawierające wyłącznie pMaOri.dCas9.
<img alt="Edycja genów CRISPR-Cas9; schemat; kaseta sgRNA i modyfikacja plazmidu; celowanie w DNA; polimeraza RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Opracowanie plazmidu ekspresującego dCas9 i sgRNA. (A) W obrębie nici matrycowej genu docelowego wybierany jest 20-nt protospacer, po którym następuje PAM 5'-NGG-3' dla dCas9 z S. pyogenes, tak aby sgRNA mogło utworzyć pary zasad Watsona i Crickia z odpowiadającą mu nicią kodującą, co prowadzi do całkowitego wyciszenia genu. (B) Kaseta sgRNA składa się z promotora lipL32, 20-nt protospacera i rusztowania (scaffold) dCas9. Plazmid pMaOri.dCas9 służy jako szkielet do ligacji kasety sgRNA w miejscu restrykcyjnym XmaI. Powstały plazmid, nazwany pMaOri.dCas9sgRNA, jest wprowadzany do leptospir, a ekspresja zarówno dCas9, jak i sgRNA odpowiada za wyciszenie genu. (C) Kompleks dCas9 kierowany przez sgRNA działa jako fizyczna bariera dla elongacji polimerazy RNA, hamując tym samym transkrypcję. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat metody hodowli bakterii: kokultura E. coli-Leptospira, proces wizualizacji w ciemnym polu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczna prezentacja protokołu konjugacji. Pożądany gatunek Leptospira jest hodowany w pożywce HAN, z mieszaniem, aż do osiągnięcia O.D. 0,2-0,4 (środkowa faza logarytmiczna) przy 420 nm. Na dzień przed konjugacją, z agarowych płytek LB+DAP+Spc wybierana jest kolonia rekombinowanego donora E. coli β2163 zawierającego interesujący plazmid, a następnie komórki są hodowane przez noc w płynnym LB z tymi samymi dodatkami. Następnego dnia nasycone kultury E. coli są rozcieczane w LB z dodatkiem DAP i hodowane do O.D. 0,2-0,4 przy 420 nm. Zarówno donor E. coli, jak i biorca Leptospira są mieszane w proporcji komórek 1:1 na powierzchni filtra 0,1 μm za pomocą aparatu do filtracji pod ciśnieniem ujemnym. Następnie filtry są umieszczane na płytkach z agarem EMJH uzupełnionym o DAP i inkubowane przez 24 h w 29 °C. Użycie EMJH ogranicza proliferację E. coli, dzięki czemu utrzymana zostaje zamierzona proporcja 1:1. Bakterie są odzyskiwane z filtrów poprzez pipetowanie 1 mL pożywki HAN, a zawiesiny są wizualizowane pod mikroskopem w ciemnym polu. Na koniec 100-200 μL każdej zawiesiny jest wysiewanych na płytki z agarem HAN zawierającym 0,4% surowicy króliczej i inkubowanych w 37 °C w 3% CO2. Na tym etapie pomijany jest DAP, wykonując to, aby auksotroficzna E. coli nie rosła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment edycji genów; żel do elektroforezy DNA; analiza ekspresji białek; schemat projektu plazmidu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62631/62631fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki oceny mutantów. (A) Kolonie z płytek zawierających Leptospira przetransformowane pustym pMaOri.dCas9 (kontrola negatywna dla dalszych eksperymentów) oraz plazmidami pMaOri.dCas9sgRNA (z wyciszonym genem docelowym) są pobierane, intensywnie homogenizowane w płynnym medium HAN i hodowane w płynnym medium HAN zawierającym spectynomycynę. Rekombinowane komórki można zweryfikować za pomocą PCR z użyciem starterów flankujących miejsce XmaI w pMaOri.dCas9. (B) W tym przypadku komórki zawierające tylko pMaOri.dCas9 dały amplikon o długości 281 bp, podczas gdy komórki zawierające plazmid do wyciszania, zawierający zarówno dCas9, jak i sgRNA, wykazały amplikon o długości 723 bp. Po potwierdzeniu obecności plazmidów wyciszenie genów zweryfikowano za pomocą analizy immunoblot. (C) Zaleca się inkubację z przeciwciałami przeciwko białku docelowemu oraz białku kontrolnemu (loading control); na reprezentatywnym immunoblotcie przedstawiono ekstrakty z całych komórek transkonjugantów zawierających sam pMaOri.dCas9 lub kasety sgRNA celujące w gen lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) oraz w oba geny LigA i LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB). Współinkubacja z przeciwciałami anty-LipL32, anty-LigAB i anty-LipL41 (nietargetowa kontrola ładowania) potwierdza, że ekspresja białka LipL32 jest zniesiona w komórkach zawierających pMaOri.dCas9sgRNAlipL32, a ekspresja zarówno LigA, jak i LigB w komórkach zawierających pMaOri.dCas9sgRNAligAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/62631fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający: Sekwencja kasety pojedynczego przewodniego RNA (sgRNA).Transkrypcja sgRNA jest sterowana przez konstytutywny promotor lipL32 (nukleotydy pogrubione). sgRNA składa się z 20 nukleotydów odpowiadających protospacerowi, odpowiedzialnemu za parowanie zasad z nicią kodującą genu docelowego, oraz sekwencji rusztowania dCas9 (nukleotydy podkreślone). Miejsca restrykcyjne XmaI (cccggg) zostały umieszczone po obu stronach w celu ligacji z plazmidem pMaOri.dCas9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62631/Supplementary%20File.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj opisane jest zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do specyficznego wyciszania genów u gatunków Leptospira. Komórki Leptospira są przekształcane przez koniugację z plazmidami eksprymującymi dCas9 (katalitycznie "martwy" Cas9) i jednoprowadnicowym RNA (sgRNA), odpowiedzialnym za parowanie zasad z pożądanym celem genomowym. Przedstawiono metody walidacji wyciszania genów.

Zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

Nazywam się Jarlath Nally i jestem częścią zespołu badawczego w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt w Ames w stanie Iowa i pracujemy nad leptospirozą. Leptospiroza jest chorobą zaniedbaną. Jest to choroba globalna.I tak naprawdę, mamy bardzo ograniczoną wiedzę na temat tego, w jaki sposób ta unikalna grupa bakterii powoduje infekcje. Tak więc dzisiejsza prezentacja ma na celu przedstawienie przeglądu nowego narzędzia, które jest dostępne w celu ułatwienia oceny patogennych mechanizmów leptospirozy poprzez specyficzne wyciszanie określonych genów wyrażanych przez leptospirę, przy użyciu techniki zwanej interferencją CRISPR. Jednak zdolność do selekcji kolonii newtona jest bardzo zależna od zapewnienia najlepszych pożywek wzrostowych dla tych wybrednych leptospiras.Przede wszystkim przedstawimy Wam Ricka Hornsby'ego, który pokrótce przedstawił nowe podłoże do rozmnażania tych wybrednych bakterii. A potem przedstawimy Wam Louisa Fernandeza, który opowie o metodologii interferencji CRISPR w celu wyciszenia docelowych genów w leptospira. Cześć, nazywam się Rick Hornsby.Od czasu ich identyfikacji przez Anada ponad 100 lat temu, leptospiras były zazwyczaj izolowane i rozmnażane w temperaturze 29 stopni Celsjusza, temperaturze, która nie odzwierciedla ani środowiska, ani temperatury ciała gospodarza ssaków. 10 lat temu USDA ERS rozpoczął badania nad ulepszeniami pożywek leptospira i na podstawie tych badań opracowano pożywkę Hornsby-Alt-Nally. Korzystając z tej pożywki, klinicyści i badacze byli w stanie szybciej wyizolować i rozmnożyć leptospiras z przypadków terenowych i badań in vitro w temperaturze i środowisku, które bardziej naśladują gospodarza ssaków.Kontynuujemy optymalizację tej pożywki, ale w obecnej formie HAN wykazał potencjał do znacznej poprawy badań klinicznych nad izolacjami klinicznymi zwierząt i zwierząt in vitro oraz opracowania bardziej skutecznych szczepionek w celu zapobiegania leptospirozie. Cześć, nazywam się Louis Fernandez. Do tej pory patogeneza leptospirozy pozostawała słabo zbadana, głównie ze względu na brak skutecznych i łatwych do wykonania probówek genetycznych.Tutaj opiszemy nową technikę zwaną interferencją CRISPR lub CRISPRi. Ta technika jest bardzo prosta, ponieważ potrzebujemy tylko dwóch składników, jednego białka wiążącego DNA zwanego martwym Cas9 lub dCas9 i chimerycznej cząsteczki RNA zwanej pojedynczym przewodnikiem RNA. A złożony dCas9 i przewodnik RNA będą tworzyć parowanie zasad z naszym docelowym genem, a tym samym zmniejszać lub nawet blokować transkrypcję.Ponadto, korzystając z nowo opisanej pożywki HAN, możemy drastycznie skrócić czas tworzenia kolonii w celu odzyskania zmutowanych zwierząt. Pierwszym krokiem jest zdefiniowanie protospaceru, który będzie zawarty w przewodniku RNA. Sekwencja ta składa się z 20 nukleotydów, które zdefiniują parowanie zasad z pożądanymi celami genów.Prześlij sekwencję nukleotydową do serwera WWW CHOPCHOP, z parametrami zdefiniowanymi dla Streptococcus pyogenes, Cas9 i sąsiadującego z protospacerem motywu, NGG. Na podstawie wyników wybierz protospacery z najlepszymi wynikami w ramach trendu ujemnego. Motyw NGG nie zostanie uwzględniony w końcowej sekwencji.Używaliśmy promotora lipL32 do ekspresji RNA z pojedynczym przewodnikiem, który będzie zawierał zmienne 20 nukleotydów w pięciu liczbach pierwszych na konserwatywnym rusztowaniu dCas9. Po zdobyciu kasety zostanie ona zdegradowana do PMaOri. Plazmid dCas9 w miejscu restrykcji Xma1.W celu koniugacji komórki leptospira są hodowane w temperaturze 29 lub 37 stopni Celsjusza w pożywce HAN. Na dzień przed koniugacją komórki wyrównane przez dawcę są hodowane w pożywce LB uzupełnionej kwasem diaminomelicznym, DAP i spektynomycyną. Następnie, w dniu koniugacji, grilluj nasycone kultury E. coli w LB plus DAP.Wewnątrz okapu bezpieczeństwa biologicznego zmontuj aparat filtracyjny, umieszczając filtr membranowy na szklanej podstawie, a następnie szklany lejek o pojemności 15 ml. Oba elementy są trzymane razem za pomocą tego zacisku sprężynowego. Następnie podłącz szklankę do pompy próżniowej, dodaj pięć ml kultur leptospira do lejka.Następnie dodaj szczep E.Coli beta 2163 zawierający interesujący nas plazmid. Objętość będzie się różnić w zależności od gęstości optycznej kultury. Naszym celem jest pipesja komórkowa jeden do jednego.Przekręć pompę próżniową, teraz płyny, które przedostaniemy się przez membranę, a komórki zostaną skoncentrowane na niej. Weź filtr i umieść go na płytce EMJH plus DAP, bicurier stroną do góry. Inkubuj płytki w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnie wyjmij filtry z płytek i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj jednego ml ciekłego podłoża HAN, aby odzyskać komórki z filtra przez pipetowanie. Wizualizacja odzyskanych komórek za pomocą mikroskopii ciemnego pola.Na tym etapie można zaobserwować równoważną liczbę E. coli i leptospiras. Do rozprowadzenia bakterii na płytkach HAN zawierających spektynomycynę używa się od 100 do 200 mikrolitrów. Na tym etapie DAP jest pomijany, a E.coli nie będzie rosła.Płytki inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 3% CO2. Kolonie powinny być widoczne od ośmiu do 10 dni. Kolonie Leptospira interrogans są trochę trudne do wizualizacji.Tutaj pokazujemy przerośnięte kolonie, aby łatwiej było je zobaczyć. Dodaj 100 mikrolitrów płynnego HAN do probówek o pojemności 1,5 ml w celu odzyskania mutantów. Zaleca się pobranie co najmniej trzech kolonii z każdej płytki.Za pomocą końcówki pipety poszczególne kolonie zostaną pobrane z płytek. Oczekuje się, że Agger zostanie zabrany sam. Kolonie należy pobierać z płytek kontrolnych zawierających MTP PMaOri.Plazmid dCas9. I płytki z leptospiras zawierające plazmid zarówno z dCas9, jak i przewodnikiem RNA, przeznaczone dla docelowego genu. Odzyskane komórki można teraz zwizualizować pod mikroskopią ciemnego pola, aby potwierdzić obecność żyjących leptospir.Po wizualizacji liści leptospiras przenieś komórki do płynnej pożywki HAN zawierającej spektynomycynę. Po wzroście hodowli komórki można teraz odzyskać w celu potwierdzenia wyciszenia i oceny fenotypu. Jeśli dostępne są przeciwciała przeciwko białkom docelowym, immunoblot jest prostą metodologią oceny wyciszania.Leptospiras zawierające pMAOri. dCas9 samodzielnie lub z przewodnikiem RNA Cas są oceniane za pomocą PCR, podkładów flankujących drewno. Plazmid DMT spowoduje powstanie pasma około 300 par zasad, a tylko około 700 zostanie osiągnięte, gdy obecna jest kaseta przewodnika RNA.Immunobloty z użyciem ekstraktów z całych komórek są wykonywane w celu wyciszenia potwierdzenia, ekspresja białka lipL32 jest zniesiona w komórkach zawierających plazmidy ulegające ekspresji w dCas9 i przewodnikowym RNA ukierunkowanym na ten gen. I zarówno wiązanie A, jak i wiązanie B są nieobecne w komórkach zawierających przewodnik RNA, jest specyficzny dla obu genów. Warga sterująca L41 jest widoczna na wszystkich pasach ruchu.Użyliśmy więc interferencji CRISPR na leptospira interrogans, użyliśmy jej również na kilku innych patogennych gatunkach leptospira. Użyliśmy go do wyciszenia określonych genów, a także wyciszenia ekspresji małych niekodujących RNA. Nasze zainteresowania badawcze koncentrują się na zrozumieniu patogennych mechanizmów infekcji, więc zazwyczaj staramy się zidentyfikować czynniki wariancji, ale oczywiście można wyciszyć wybrany przez siebie gen i zgodnie z własnym obszarem badań.Na przykład może to być ruchliwość lub zrozumienie, w jaki sposób leptospiras utrzymują się w środowisku, lub metabolizm. W każdym razie powinieneś być w stanie wygenerować konkretnego mutanta, który pozwoli Ci przeprowadzić genomikę funkcjonalną i zrozumieć biologiczne znaczenie danego genu. Tak więc w imieniu nas wszystkich w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt życzymy Państwu powodzenia w badaniach.

application-crispr-interference-crispri-for-gene-silencing-pathogenic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje wyciszanie genów w patogennym Leptospira za pomocą interferencji CRISPR. Ukierunkowana represja ekspresji genów za pomocą systemu CRISPR/Cas, który blokuje tworzenie mRNA, pomaga zidentyfikować geny kandydujące do badań patologicznych i farmakologicznych.

Wyciszanie genów oparte na interferencji CRISPR: technika ukierunkowanego tłumienia funkcji genów w patogennej Leptospira

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Poznaj metodę CRISPRi do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów zakażenia leptospirozą i rozwój skuteczniejszych szczepionek.

Zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira

Przeglądaj więcej filmów