Zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira

Nazywam się Jarlath Nally i jestem częścią zespołu badawczego w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt w Ames w stanie Iowa i pracujemy nad leptospirozą. Leptospiroza jest chorobą zaniedbaną. Jest to choroba globalna.

I tak naprawdę, mamy bardzo ograniczoną wiedzę na temat tego, w jaki sposób ta unikalna grupa bakterii powoduje infekcje. Tak więc dzisiejsza prezentacja ma na celu przedstawienie przeglądu nowego narzędzia, które jest dostępne w celu ułatwienia oceny patogennych mechanizmów leptospirozy poprzez specyficzne wyciszanie określonych genów wyrażanych przez leptospirę, przy użyciu techniki zwanej interferencją CRISPR. Jednak zdolność do selekcji kolonii newtona jest bardzo zależna od zapewnienia najlepszych pożywek wzrostowych dla tych wybrednych leptospiras.

Przede wszystkim przedstawimy Wam Ricka Hornsby'ego, który pokrótce przedstawił nowe podłoże do rozmnażania tych wybrednych bakterii. A potem przedstawimy Wam Louisa Fernandeza, który opowie o metodologii interferencji CRISPR w celu wyciszenia docelowych genów w leptospira. Cześć, nazywam się Rick Hornsby.

Od czasu ich identyfikacji przez Anada ponad 100 lat temu, leptospiras były zazwyczaj izolowane i rozmnażane w temperaturze 29 stopni Celsjusza, temperaturze, która nie odzwierciedla ani środowiska, ani temperatury ciała gospodarza ssaków. 10 lat temu USDA ERS rozpoczął badania nad ulepszeniami pożywek leptospira i na podstawie tych badań opracowano pożywkę Hornsby-Alt-Nally. Korzystając z tej pożywki, klinicyści i badacze byli w stanie szybciej wyizolować i rozmnożyć leptospiras z przypadków terenowych i badań in vitro w temperaturze i środowisku, które bardziej naśladują gospodarza ssaków.

Kontynuujemy optymalizację tej pożywki, ale w obecnej formie HAN wykazał potencjał do znacznej poprawy badań klinicznych nad izolacjami klinicznymi zwierząt i zwierząt in vitro oraz opracowania bardziej skutecznych szczepionek w celu zapobiegania leptospirozie. Cześć, nazywam się Louis Fernandez. Do tej pory patogeneza leptospirozy pozostawała słabo zbadana, głównie ze względu na brak skutecznych i łatwych do wykonania probówek genetycznych.

Tutaj opiszemy nową technikę zwaną interferencją CRISPR lub CRISPRi. Ta technika jest bardzo prosta, ponieważ potrzebujemy tylko dwóch składników, jednego białka wiążącego DNA zwanego martwym Cas9 lub dCas9 i chimerycznej cząsteczki RNA zwanej pojedynczym przewodnikiem RNA. A złożony dCas9 i przewodnik RNA będą tworzyć parowanie zasad z naszym docelowym genem, a tym samym zmniejszać lub nawet blokować transkrypcję.

Ponadto, korzystając z nowo opisanej pożywki HAN, możemy drastycznie skrócić czas tworzenia kolonii w celu odzyskania zmutowanych zwierząt. Pierwszym krokiem jest zdefiniowanie protospaceru, który będzie zawarty w przewodniku RNA. Sekwencja ta składa się z 20 nukleotydów, które zdefiniują parowanie zasad z pożądanymi celami genów.

Prześlij sekwencję nukleotydową do serwera WWW CHOPCHOP, z parametrami zdefiniowanymi dla Streptococcus pyogenes, Cas9 i sąsiadującego z protospacerem motywu, NGG. Na podstawie wyników wybierz protospacery z najlepszymi wynikami w ramach trendu ujemnego. Motyw NGG nie zostanie uwzględniony w końcowej sekwencji.

Używaliśmy promotora lipL32 do ekspresji RNA z pojedynczym przewodnikiem, który będzie zawierał zmienne 20 nukleotydów w pięciu liczbach pierwszych na konserwatywnym rusztowaniu dCas9. Po zdobyciu kasety zostanie ona zdegradowana do PMaOri. Plazmid dCas9 w miejscu restrykcji Xma1.

W celu koniugacji komórki leptospira są hodowane w temperaturze 29 lub 37 stopni Celsjusza w pożywce HAN. Na dzień przed koniugacją komórki wyrównane przez dawcę są hodowane w pożywce LB uzupełnionej kwasem diaminomelicznym, DAP i spektynomycyną. Następnie, w dniu koniugacji, grilluj nasycone kultury E. coli w LB plus DAP.

Wewnątrz okapu bezpieczeństwa biologicznego zmontuj aparat filtracyjny, umieszczając filtr membranowy na szklanej podstawie, a następnie szklany lejek o pojemności 15 ml. Oba elementy są trzymane razem za pomocą tego zacisku sprężynowego. Następnie podłącz szklankę do pompy próżniowej, dodaj pięć ml kultur leptospira do lejka.

Następnie dodaj szczep E.Coli beta 2163 zawierający interesujący nas plazmid. Objętość będzie się różnić w zależności od gęstości optycznej kultury. Naszym celem jest pipesja komórkowa jeden do jednego.

Przekręć pompę próżniową, teraz płyny, które przedostaniemy się przez membranę, a komórki zostaną skoncentrowane na niej. Weź filtr i umieść go na płytce EMJH plus DAP, bicurier stroną do góry. Inkubuj płytki w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnie wyjmij filtry z płytek i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj jednego ml ciekłego podłoża HAN, aby odzyskać komórki z filtra przez pipetowanie. Wizualizacja odzyskanych komórek za pomocą mikroskopii ciemnego pola.

Na tym etapie można zaobserwować równoważną liczbę E. coli i leptospiras. Do rozprowadzenia bakterii na płytkach HAN zawierających spektynomycynę używa się od 100 do 200 mikrolitrów. Na tym etapie DAP jest pomijany, a E.coli nie będzie rosła.

Płytki inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 3% CO2. Kolonie powinny być widoczne od ośmiu do 10 dni. Kolonie Leptospira interrogans są trochę trudne do wizualizacji.

Tutaj pokazujemy przerośnięte kolonie, aby łatwiej było je zobaczyć. Dodaj 100 mikrolitrów płynnego HAN do probówek o pojemności 1,5 ml w celu odzyskania mutantów. Zaleca się pobranie co najmniej trzech kolonii z każdej płytki.

Za pomocą końcówki pipety poszczególne kolonie zostaną pobrane z płytek. Oczekuje się, że Agger zostanie zabrany sam. Kolonie należy pobierać z płytek kontrolnych zawierających MTP PMaOri.

Plazmid dCas9. I płytki z leptospiras zawierające plazmid zarówno z dCas9, jak i przewodnikiem RNA, przeznaczone dla docelowego genu. Odzyskane komórki można teraz zwizualizować pod mikroskopią ciemnego pola, aby potwierdzić obecność żyjących leptospir.

Po wizualizacji liści leptospiras przenieś komórki do płynnej pożywki HAN zawierającej spektynomycynę. Po wzroście hodowli komórki można teraz odzyskać w celu potwierdzenia wyciszenia i oceny fenotypu. Jeśli dostępne są przeciwciała przeciwko białkom docelowym, immunoblot jest prostą metodologią oceny wyciszania.

Leptospiras zawierające pMAOri. dCas9 samodzielnie lub z przewodnikiem RNA Cas są oceniane za pomocą PCR, podkładów flankujących drewno. Plazmid DMT spowoduje powstanie pasma około 300 par zasad, a tylko około 700 zostanie osiągnięte, gdy obecna jest kaseta przewodnika RNA.

Immunobloty z użyciem ekstraktów z całych komórek są wykonywane w celu wyciszenia potwierdzenia, ekspresja białka lipL32 jest zniesiona w komórkach zawierających plazmidy ulegające ekspresji w dCas9 i przewodnikowym RNA ukierunkowanym na ten gen. I zarówno wiązanie A, jak i wiązanie B są nieobecne w komórkach zawierających przewodnik RNA, jest specyficzny dla obu genów. Warga sterująca L41 jest widoczna na wszystkich pasach ruchu.

Użyliśmy więc interferencji CRISPR na leptospira interrogans, użyliśmy jej również na kilku innych patogennych gatunkach leptospira. Użyliśmy go do wyciszenia określonych genów, a także wyciszenia ekspresji małych niekodujących RNA. Nasze zainteresowania badawcze koncentrują się na zrozumieniu patogennych mechanizmów infekcji, więc zazwyczaj staramy się zidentyfikować czynniki wariancji, ale oczywiście można wyciszyć wybrany przez siebie gen i zgodnie z własnym obszarem badań.

Na przykład może to być ruchliwość lub zrozumienie, w jaki sposób leptospiras utrzymują się w środowisku, lub metabolizm. W każdym razie powinieneś być w stanie wygenerować konkretnego mutanta, który pozwoli Ci przeprowadzić genomikę funkcjonalną i zrozumieć biologiczne znaczenie danego genu. Tak więc w imieniu nas wszystkich w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt życzymy Państwu powodzenia w badaniach.