Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Protokół ten może rejestrować kinetykę w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki. Możemy mierzyć parametry poszczególnych komórek w odpowiedzi na zakażenie wirusem HIV i kojarzyć wczesne zdarzenia sygnalizacyjne z opóźnionymi etapami cyklu życia wirusa. Jest to zintegrowana, skalowalna alternatywa dla tradycyjnych metod obrazowania, wykorzystująca nowatorską platformę optofluidyczną do sortowania pojedynczych komórek, hodowli, obrazowania i automatyzacji oprogramowania.

Jest to pierwsza uznana metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania. Technika ta może być szeroko stosowana do badania kinetyki sygnalizacji komórkowej i dynamicznych interakcji molekularnych w różnych stanach chorobowych. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, aby przekazać, w jaki sposób eksperyment jest przygotowany, jak komórki są optycznie sortowane do wstrzykiwaczy i jak ustawić infuzje przez chip.

Na początek przygotuj świeży roztwór ładujący Fluo-4 AM, dodając 25 mikrolitrów 100X stężonego rozpuszczalnika detergentowego i 2,5 mikrolitra 1000X Fluo-4 AM do 1,5 mililitrowej probówki, a następnie wiruj, aby wymieszać. Odpipetować 2,5 mililitra pożywki hodowlanej do roztworu ładującego i odwrócić do wymieszania. Odwirować dwa miliony komórek MT-4 przy 500 razy G przez trzy minuty, a następnie usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach przygotowanego roztworu ładującego Fluo-4 AM.

Pipeta ponownie zawiesiła komórki na 35-milimetrowej szalce Petriego. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut, a następnie inkubować przez dodatkowe 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez trzy minuty, a następnie usunąć supernatant.

Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie jednego mililitra pożywki hodowlanej i odwirować przy 500 razy G przez trzy minuty w celu przemycia. Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie w pożywce hodowlanej o stężeniu dwóch milionów komórek na mililitr przez co najmniej 50 mikrolitrów. Aby przygotować chip z roztworem zwilżającym, który ułatwia zaganianie komórek, załaduj probówki wirówkowe zawierające dwa mililitry roztworu zwilżającego i 50 mililitrów wody dejonizowanej na instrument za pomocą nowego chipa optofluidycznego i uruchom funkcję mokrego chipa, która zaleje chip roztworem zwilżającym.

Inkubuj chip w temperaturze 50 stopni Celsjusza i trzykrotnie przepłucz go wodą. Po zakończeniu płukania wodą przepłucz chip trzema cyklami po 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej. Uzupełnij zawiesinę komórek z poprzedniego etapu jedną substancją rozpuszczoną detergentu F127 na 100 części przed załadowaniem, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo przywierania komórek do kanałów chipowych.

Użyj igły do eksportu instrumentu, aby zaimportować komórki z 1.5-mililitrowej probówki wirówkowej z operacją ładowania i importem małej objętości dla objętości opakowania komórek o pojemności pięciu mikrolitrów. Komórki pióra przy użyciu zoptymalizowanego pozycjonowania optoelektronicznego lub napięcia OEP 4,3 V i prędkości klatki pięciu mikrometrów na sekundę za pomocą funkcji automatycznego pióra, która automatycznie wykryje pojedyncze komórki, otoczy je klatką OEP i przeniesie je do pobliskiego pióra. Jeśli interesujące komórki pozostają po automatycznym zapisywaniu, użyj funkcji pióra ręcznego, aby wybrać komórki docelowe i pióro docelowe.

Po zakończeniu wstrzykiwania przepłucz chip trzema cyklami po 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej, aby usunąć z chipa wszelkie pozostałe niezapisane komórki. Po narysowaniu komórek uzyskaj obrazy fluorescencyjne komórek w kanałach FITC, Texas Red i DAPI, aby zmierzyć podstawowe Fluo-4, mCherry i autofluorescencję. Wlej HIV-1 do mikroczipa w stężeniu 13 nanogramów HIV-1 NLCI na dwa miliony komórek, powoli pipetując zawiesinę do chipa przez igłę eksportową.

Natychmiast po dodaniu wirusa HIV-1 należy wielokrotnie uzyskiwać obrazy w kanałach FITC i DAPI w ciągu 10 minut. Uzyskaj obrazy w kanałach Texas Red i DAPI po jednym, dwóch, trzech i czterech dniach po zakażeniu. Metodologia ta została wykorzystana do identyfikacji i grupowania komórek zakażonych i niezakażonych wirusem HIV za pomocą pomiaru mCherry.

Komórki ze zmianą sygnału mCherry większą lub niższą niż 40 000 średniej intensywności fluorescencji zostały zgrupowane odpowiednio w populacji mCherry o wysokiej lub niskiej mCherry. Klastry te analizowano pod kątem kinetyki napływu wapnia poprzez pomiar wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą fluorescencji Fluo-4 wielokrotnie w ciągu dziewięciu minut, co wykazało wczesny napływ wapnia do komórek zakażonych wirusem HIV. Zaobserwowano istotną dodatnią korelację między napływem wapnia a kwiatostanem mCherry.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zacząć od komórek w wykładniczym zakresie wzrostu zarówno dla produkcji wirusa, jak i infekcji, ponieważ przerośnięte komórki spowodują dramatyczny spadek sygnału z tego testu. Praca z HIV-1 może być niebezpieczna. Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować praktyki BSL-2 wskazane w standardzie OSHA dotyczącym patogenów przenoszonych przez krew.

Ta technika jest ekscytująca, ponieważ pozwoli nam badać zmiany fenotypowe lub transkrypcyjne w pojedynczych komórkach w kontrolowanych warunkach. Ma to duży potencjał w zakresie korelacji wpływu bodźców na szlaki molekularne w wielu typach komórek.