Name: Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj metodę jednokomórkowej analizy napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu platformy optofluidycznej. Technika umożliwia obserwację kinetyki sygnałowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za naukowe dyskusje z dr Benjaminem Chenem. Praca ta została sfinansowana przez K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS i KB) oraz R21AI152833 (THS i KB).

1. Przygotowanie komórek do obrazowania
<ol>
	<li>Przygotuj świeży roztwór ładujący Fluo-4 AM: Dodaj 25 μl 100x stężonego rozpuszczalnika detergentowego, a następnie dodaj 2,5 μl Fluo-4 AM 1000x do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować do mieszania.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 2,5 ml pożywki hodowlanej do roztworu ładującego i odwrócić do wymieszania. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Odwirować 2 x 106 komórek MT-4 przy 500 x g przez 3 min.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w 2 ml przygotowanego roztworu ładującego Fluo-4 AM. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Pipetą zawiesić komórki na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15-30 minut, a następnie inkubować przez dodatkowe 15-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Odwirować komórki o sile 500 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant składający się z roztworu ładującego.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie w 1 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 500 x g przez 3 minuty w celu przemycia.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie w pożywce hodowlanej o stężeniu 2 x 106 komórek/ml (minimum 50 μl). Chronić przed światłem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu optofluidycznego, ładowanie komórek i zapisywanie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj chip z roztworem zwilżającym, który ułatwia zagrodowanie komórek.
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, załaduj probówki wirówkowe zawierające 2 ml roztworu zwilżającego i 50 ml wody DI na instrument z nowym chipem optofluidycznym i uruchom funkcję Wet Chip. Ta funkcja automatycznie zaleje chip roztworem zwilżającym przez płyny systemu, inkubuje chip w temperaturze 50 °C i przepłukuje chip wodą 3 razy.</li>
		<li>Po zakończeniu płukania wodą przepłucz chip 3 cyklami po 250 μl pożywki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzupełnij zawiesinę komórek z kroku 1.8 substancją rozpuszczoną detergentu F-127 w stosunku 1:100 przed załadowaniem, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo przywierania komórek do kanałów chipowych.</li>
	<li>Użyj igły do eksportu instrumentu, aby zaimportować komórki z probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą operacji Load i Import małej objętości dla objętości opakowania komórek o objętości 5 μl.</li>
	<li>Ogniwa pióra wykorzystujące zoptymalizowane napięcie pozycjonowania optoelektronicznego (OEP) 4,3 V i prędkość klatki 5 μm/s. Pisanie odbywa się przy użyciu OEP. Zakończ pisanie za pomocą funkcji Autopen, która automatycznie wykryje pojedyncze komórki, otoczy je klatką OEP i przeniesie je do pobliskiego pióra. Jeśli interesujące komórki pozostają po automatycznym zapisywaniu, użyj funkcji Pióro ręczne, aby zaznaczyć komórki docelowe (za pomocą kliknięcia myszą) i pióro docelowe (po kolejnym kliknięciu myszą).</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzykiwania (albo po zakończeniu funkcji automatycznego wstrzykiwania, albo po osiągnięciu żądanej liczby wstrzykiwanych komórek), przepłucz chip 3 cyklami po 250 μl pożywki hodowlanej, aby usunąć z chipa wszelkie pozostałe niezapisane komórki.</li>
</ol>
3. Zakażenie pojedynczymi komórkami i obrazowanie funkcjonalne
<ol>
	<li>Po napisaniu komórek uzyskaj obrazy fluorescencyjne komórek w kanałach FITC, Texas Red i DAPI, aby zmierzyć podstawowe Fluo-4, mCherry i autofluorescencję.</li>
	<li>Wlać HIV-1 do mikroczipa w stężeniu 13 ng HIV-1 NL-CI na 2 x 106 komórek, powoli pipetując zawiesinę do chipa przez igłę eksportową.</li>
	<li>Natychmiast po dodaniu wirusa HIV-1 należy wielokrotnie uzyskiwać obrazy w kanałach FITC i DAPI w ciągu 10 minut.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy w kanałach Texas Red i DAPI po 1, 2, 3 i 4 dniach po infekcji (DPI).</li>
</ol>
4. Analiza danych obrazowania funkcjonalnego pojedynczej komórki za pomocą oprogramowania FIJI
<ol>
	<li>W każdym punkcie czasowym w każdym kanale obrazowania będącym przedmiotem zainteresowania użyj narzędzia FIJI Point Selection i funkcji Measure, aby zmierzyć sygnały Fluo-4, mCherry i autofluorescencji każdej komórki. Jednocześnie zmierz fluorescencję tła, obliczając średnią intensywność fluorescencji (MFI) pióra i chipa zawierających każdą komórkę.</li>
	<li>Kontroluj fluorescencję tła i autofluorescencję za pomocą funkcji Measure w celu znalezienia MFI w wyborze regionu i odjęcia tej wartości od wartości fluorescencji komórki.</li>
	<li>Znormalizuj fluorescencję tła każdego obrazu chipa: Zmierz MFI chipa w każdym polu. Następnie odejmij MFI chipa o najmniejszej fluorescencji tła od wszystkich innych pomiarów MIF chipa.</li>
	<li>Znormalizuj fluorescencję tła każdego pióra zawierającego komórkę: zmierz MFI pisaka każdej komórki w każdym polu widzenia. Następnie odejmij tę wartość od nieprzetworzonego MFI komórki dla każdego pola.</li>
	<li>Kontrola autofluorescencji komórek: Odejmij MIF dnia 0 i dnia 4 DAPI każdej komórki od mF mF dnia 0 i dnia 4.</li>
</ol>

<ol><li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+inflammation%2C+and+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Antiviral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li>
<li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li>
<li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors%3A+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Fromtiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585(2015).</li>
<li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li>
<li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li>
<li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technology%22%5BJournal%5D)">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li>
<li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+%28IL-10%29+and+IL-1%CE%B2+in+a+human+tonsil+explant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186(2019).</li>
<li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li>
<li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li>
<li>Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li>
<li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li>
<li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca%282%2B%29-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li>
<li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425(2017).</li>
<li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010(2018).</li>
<li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247(2020).</li>
<li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+cell+identification+and+sorting+%28LACIS%29+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41(2018).</li>
<li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li>
<li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692(2019).</li>
<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074(2018).</li>
<li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622(2020).</li>
</ol>

R.P.S. jest pracownikiem firmy Sema4. Pozostali autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Opisana metodologia badania związku między napływem wapnia a produktywnym zakażeniem HIV-1 w pojedynczych komórkach może być dostosowana do badania wewnątrzkomórkowej kinetyki wapnia w odpowiedzi na innych agonistów lub antagonistów będących przedmiotem zainteresowania. Przygotowanie komórek do obrazowania jest proste, minimalnie czasochłonne, a odczynniki dostępne są w wygodnych zestawach od powszechnie stosowanych producentów. Pomiar wapnia na bazie fluo-4 jest dobrze opisany w literaturze, a HIV-1 można łatwo zastąpić...

Przewlekły stan zapalny jest główną przyczyną wczesnych chorób i śmiertelności związanych z HIV1,2,3. Istnieje wiele mechanizmów, dzięki którym HIV może aktywować sygnalizację zapalną, a ostatnie dowody sugerują rolę receptorów P2X we wjeździe wirusa HIV, którymi są receptory adenozynotrifosforanu (ATP) bramkujące wapń3,4,5,6,7,8,9,10. Podtyp receptorów purynergicznych P2X (P2XR) może być ważnym czynnikiem ułatwiającym ten stan zapalny. Jednak mechanizmy molekularne interakcji HIV-P2XR są w dużej mierze nieznane i mogą wpływać na wczesne i późne etapy cyklu życiowego wirusa HIV-1. Zdefiniowanie szlaków i kinetyki napędzających przewlekły stan zapalny związany z HIV ma kluczowe znaczenie dla rozwoju możliwości leczenia osób z HIV.
Aby ocenić, czy HIV-1 bezpośrednio niszczy receptory P2X, aktywacja P2XR i zakażenie HIV-1 muszą być mierzone równolegle. Testy aktywności P2XR i zakażenia HIV-1 zostały ustalone niezależnie: Napływ wapnia do komórek jest wskaźnikiem aktywacji P2XR, a infekcję produktywną HIV-1 można określić ilościowo za pomocą obfitości RNA. Fluorescencyjne wykrywanie napływu wapnia jest możliwe za pomocą barwnika wrażliwego na wapń Fluo-4, a zakażenie HIV-1 można uwidocznić za pomocą fluorescencyjnego wirusa reporterowego mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Ponieważ te wskaźniki aktywacji P2X (ostry napływ wapnia do komórek) i zakażenia HIV-1 (synteza RNA HIV-1) występują w różnych skalach czasowych (minuty kontra dni), brakuje metody o wysokiej przepustowości, która pozwalałaby na analizę aktywacji P2XR i infekcji HIV-1. Standardowe wysokoprzepustowe techniki eksperymentalne, takie jak cytometria przepływowa, pozwalają na analizę populacji, ale nie mogą ocenić związku między ostrymi i podłużnymi zdarzeniami w pojedynczych komórkach. Alternatywnie, obrazowanie pojedynczych komórek za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej jest niskoprzepustowe. Te eksperymentalne ograniczenia stwarzają potrzebę nowatorskich, wysokoprzepustowych technik bezpośredniego pomiaru powiązań między ostrymi i podłużnymi zdarzeniami komórkowymi.
Opisany system optofluidyczny to nowatorska platforma zdolna do sortowania i izolowania pojedynczych komórek, hodowli, obrazowania i automatyzacji oprogramowania16,17,18,19. System ten stanowi zintegrowaną, wysokowydajną alternatywę dla ograniczeń tradycyjnych metod obrazowania. Platforma Beacon składa się z inkubatora z dwutlenkiem węgla (CO2 ) i kontrolowaną temperaturą, który podtrzymuje komórki zawarte na chipie. Chip posiada światłoczułe tranzystory, które generują gradient elektryczny w odpowiedzi na docelowe światło. Ta powstała siła dielektroforetyczna jest wykorzystywana do przesuwania pojedynczych komórek przez chip nanofluidyczny do pożądanych regionów. Komórki są sortowane w długopisy na chipie, które stanowią barierę do fizycznej izolacji poszczególnych komórek. Ciągły laminarny przepływ pożywki wzrostowej przez chip zapobiega migracji komórek z wstrzykiwaczy, umożliwiając jednocześnie dyfuzję składników odżywczych i odczynników specyficznych dla eksperymentu na małe cząsteczki. Mikroskop fluorescencyjny znajduje się nad chipem. Automatyzacja oprogramowania służy do przechwytywania obrazów chipa w określonym przez użytkownika punkcie czasowym.
Cała charakterystyka komórek została przeprowadzona przy użyciu systemu optofluidycznego do selekcji i manipulacji pojedynczych komórek. System ten składa się ze zintegrowanych komponentów mechanicznych, mikroprzepływowych i optycznych, które umożliwiają manipulację pojedynczymi komórkami, testy, hodowle i obrazowanie. Komórki są ładowane i hodowane na jednorazowym urządzeniu nanofluidycznym składającym się z 3500 indywidualnych komór (długopisów), z których każda jest w stanie pomieścić objętość poniżej nanolitra. Komórki można umieszczać w kojcach za pomocą indukowanych światłem "klatek" dielektroforetycznych i hodować w warunkach kontrolowanych przez temperaturę i CO2 . Mikrofluidyka umożliwia perfuzję pożywek lub na chipie w celu hodowli komórkowej lub leczenia farmakologicznego. Uruchamiana igła pozwala na import i eksport komórek z inkubowanych i zamkniętych płytek studzienkowych. Obszar chipa może być obrazowany przy 4-krotnym lub 10-krotnym powiększeniu w kanałach jasnego pola i fluorescencyjnych (w tym DAPI, FITC, TRed lub Cy5) w celu scharakteryzowania fenotypów komórkowych lub analizy funkcjonalnej. Cały system jest zautomatyzowany za pomocą oprogramowania, które można wykorzystać do wstępnie zaprojektowanych przepływów pracy lub niestandardowych eksperymentów.
Związki między zakażeniem HIV-1 a P2XR zostały zbadane, ale nie zgłoszono procedury o wysokiej przepustowości, która bezpośrednio charakteryzowałaby te interakcje równolegle. W tym miejscu autorzy opisują metodologię badania interakcji HIV-P2XR poprzez śledzenie ostrego napływu wapnia i późniejszej infekcji produktywnej HIV-1 na poziomie pojedynczej komórki. Warto zauważyć, że w ten sposób powstało nowatorskie narzędzie, które pozwala na bezpośredni, wysokoprzepustowy, podłużny pomiar wielu celów w pojedynczych komórkach.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Beacon Optofluidic System</td><td>Berkeley Lights</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; FIDŻI</td><td>Oprogramowanie Open-source</td><td>PMID: 22743772, 22930834</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Zestaw do obrazowania wapnia Fluo-4</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; F10489</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; HIV-1 NLCINL4-3</td><td>Laboratorium Benjamina Chena</td><td>PMID: 28148796</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Hyclone Pennecillin Streptomycyna roztwór</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>&nbsp; SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Komórki MT-4</td><td>Odczynnik</td><td></td> NIH AIDS<td>&nbsp; ARP-120</td></tr><tr><td>&nbsp; Układ OptoSelect 3500</td><td>Berkeley Lights</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Końcówki do pipet</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; P3020-CPS&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Prism 9.0.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; RPMI-1640 Średni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; R8758</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>marki Fisher</td><td>&nbsp; 13-678-11E Kaptur do hodowli</td><td></td></tr><tr><td>tkanek</td><td>Różne modele</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolb T75</td><td>Corning</td><td>3073</td><td></td></tr></tbody></table>

jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia hiv-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 powoduje przewlekłą infekcję, która dotyka ponad 37 milionów ludzi na całym świecie. Osoby żyjące z ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) doświadczają chorób współistniejących związanych z przewlekłym stanem zapalnym pomimo leczenia przeciwretrowirusowego. Jednak ta sygnalizacja zapalna nie została w pełni scharakteryzowana. Rola zdarzeń wczesnego wejścia w aktywację zdarzeń sygnalizacji komórkowej i ekspresję genów w dalszej części łańcucha dostaw nie została uchwycona na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu autorzy opisują metodę, która stosuje zasady mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek do zautomatyzowanej platformy jednokomórkowej, która hoduje i obrazuje komórki w dostosowanych przez użytkownika przebiegach czasowych, co pozwala na wysokoprzepustową analizę dynamicznych procesów komórkowych. Test ten może śledzić mikroskopię fluorescencyjną na żywo pojedynczej komórki wczesnych zdarzeń, które następują bezpośrednio po zakażeniu HIV-1, w szczególności napływu wapnia, który towarzyszy ekspozycji na wirusa i rozwoju produktywnej infekcji przy użyciu fluorescencyjnego wirusa reporterowego. Komórki MT-4 są ładowane barwnikiem wrażliwym na wapń i hodowane w izolowanych wstrzykiwaczach na urządzeniu nanofluidycznym. Wyhodowane komórki są zakażone wirusem reporterowym HIV-1 (HIV-1 NLCI). Mikroskop fluorescencyjny umieszczony nad urządzeniem nanofluidycznym mierzy napływ wapnia w ciągu 8 minut po ostrej ekspozycji na HIV-1. Produktywne zakażenie HIV-1 mierzy się w tych samych komórkach w odstępie 4 dni. Dane obrazowe z tych przebiegów czasowych są analizowane w celu zdefiniowania interakcji wirus-receptor gospodarza i dynamiki szlaku sygnałowego. Autorzy prezentują zintegrowaną, skalowalną alternatywę dla tradycyjnych metod obrazowania wykorzystującą nowatorską platformę optofluidyczną zdolną do sortowania, hodowli, obrazowania i automatyzacji oprogramowania pojedynczych komórek. Ten test może mierzyć kinetykę zdarzeń w różnych warunkach, w tym typ komórki, efekt agonisty lub antagonisty, jednocześnie mierząc szereg parametrów. Jest to pierwsza uznana metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania: Technika ta może być szeroko zaadaptowana do badania kinetyki sygnalizacji komórkowej i dynamicznych interakcji molekularnych.

Rysunek 1 przedstawia strukturę chipa oraz surowe dane obrazowania pozyskane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Identyfikacja i grupowanie komórek niezakażonych i zakażonych na podstawie pomiaru mCherry zostały pokazane na Rysunku 2. Grupy te są analizowane pod kątem kinetyki napływu wapnia na Rysunku 3, który wykazuje wczesny napływ wapnia w komórkach zakażonych HIV. Rysunek 4 przedstawia istotną ...

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Protokół ten może rejestrować kinetykę w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki. Możemy mierzyć parametry poszczególnych komórek w odpowiedzi na zakażenie wirusem HIV i kojarzyć wczesne zdarzenia sygnalizacyjne z opóźnionymi etapami cyklu życia wirusa. Jest to zintegrowana, skalowalna alternatywa dla tradycyjnych metod obrazowania, wykorzystująca nowatorską platformę optofluidyczną do sortowania pojedynczych komórek, hodowli, obrazowania i automatyzacji oprogramowania.Jest to pierwsza uznana metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania. Technika ta może być szeroko stosowana do badania kinetyki sygnalizacji komórkowej i dynamicznych interakcji molekularnych w różnych stanach chorobowych. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, aby przekazać, w jaki sposób eksperyment jest przygotowany, jak komórki są optycznie sortowane do wstrzykiwaczy i jak ustawić infuzje przez chip.Na początek przygotuj świeży roztwór ładujący Fluo-4 AM, dodając 25 mikrolitrów 100X stężonego rozpuszczalnika detergentowego i 2,5 mikrolitra 1000X Fluo-4 AM do 1,5 mililitrowej probówki, a następnie wiruj, aby wymieszać. Odpipetować 2,5 mililitra pożywki hodowlanej do roztworu ładującego i odwrócić do wymieszania. Odwirować dwa miliony komórek MT-4 przy 500 razy G przez trzy minuty, a następnie usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach przygotowanego roztworu ładującego Fluo-4 AM.Pipeta ponownie zawiesiła komórki na 35-milimetrowej szalce Petriego. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut, a następnie inkubować przez dodatkowe 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez trzy minuty, a następnie usunąć supernatant.Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie jednego mililitra pożywki hodowlanej i odwirować przy 500 razy G przez trzy minuty w celu przemycia. Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie w pożywce hodowlanej o stężeniu dwóch milionów komórek na mililitr przez co najmniej 50 mikrolitrów. Aby przygotować chip z roztworem zwilżającym, który ułatwia zaganianie komórek, załaduj probówki wirówkowe zawierające dwa mililitry roztworu zwilżającego i 50 mililitrów wody dejonizowanej na instrument za pomocą nowego chipa optofluidycznego i uruchom funkcję mokrego chipa, która zaleje chip roztworem zwilżającym.Inkubuj chip w temperaturze 50 stopni Celsjusza i trzykrotnie przepłucz go wodą. Po zakończeniu płukania wodą przepłucz chip trzema cyklami po 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej. Uzupełnij zawiesinę komórek z poprzedniego etapu jedną substancją rozpuszczoną detergentu F127 na 100 części przed załadowaniem, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo przywierania komórek do kanałów chipowych.Użyj igły do eksportu instrumentu, aby zaimportować komórki z 1.5-mililitrowej probówki wirówkowej z operacją ładowania i importem małej objętości dla objętości opakowania komórek o pojemności pięciu mikrolitrów. Komórki pióra przy użyciu zoptymalizowanego pozycjonowania optoelektronicznego lub napięcia OEP 4,3 V i prędkości klatki pięciu mikrometrów na sekundę za pomocą funkcji automatycznego pióra, która automatycznie wykryje pojedyncze komórki, otoczy je klatką OEP i przeniesie je do pobliskiego pióra. Jeśli interesujące komórki pozostają po automatycznym zapisywaniu, użyj funkcji pióra ręcznego, aby wybrać komórki docelowe i pióro docelowe.Po zakończeniu wstrzykiwania przepłucz chip trzema cyklami po 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej, aby usunąć z chipa wszelkie pozostałe niezapisane komórki. Po narysowaniu komórek uzyskaj obrazy fluorescencyjne komórek w kanałach FITC, Texas Red i DAPI, aby zmierzyć podstawowe Fluo-4, mCherry i autofluorescencję. Wlej HIV-1 do mikroczipa w stężeniu 13 nanogramów HIV-1 NLCI na dwa miliony komórek, powoli pipetując zawiesinę do chipa przez igłę eksportową.Natychmiast po dodaniu wirusa HIV-1 należy wielokrotnie uzyskiwać obrazy w kanałach FITC i DAPI w ciągu 10 minut. Uzyskaj obrazy w kanałach Texas Red i DAPI po jednym, dwóch, trzech i czterech dniach po zakażeniu. Metodologia ta została wykorzystana do identyfikacji i grupowania komórek zakażonych i niezakażonych wirusem HIV za pomocą pomiaru mCherry.Komórki ze zmianą sygnału mCherry większą lub niższą niż 40 000 średniej intensywności fluorescencji zostały zgrupowane odpowiednio w populacji mCherry o wysokiej lub niskiej mCherry. Klastry te analizowano pod kątem kinetyki napływu wapnia poprzez pomiar wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą fluorescencji Fluo-4 wielokrotnie w ciągu dziewięciu minut, co wykazało wczesny napływ wapnia do komórek zakażonych wirusem HIV. Zaobserwowano istotną dodatnią korelację między napływem wapnia a kwiatostanem mCherry.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zacząć od komórek w wykładniczym zakresie wzrostu zarówno dla produkcji wirusa, jak i infekcji, ponieważ przerośnięte komórki spowodują dramatyczny spadek sygnału z tego testu. Praca z HIV-1 może być niebezpieczna. Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować praktyki BSL-2 wskazane w standardzie OSHA dotyczącym patogenów przenoszonych przez krew.Ta technika jest ekscytująca, ponieważ pozwoli nam badać zmiany fenotypowe lub transkrypcyjne w pojedynczych komórkach w kontrolowanych warunkach. Ma to duży potencjał w zakresie korelacji wpływu bodźców na szlaki molekularne w wielu typach komórek.

single-cell-characterization-calcium-influx-hiv-1-infection-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Przeglądamy nasze ostatnie wyniki dotyczące integracji mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym przy użyciu kompaktowych i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. Te urządzenia do mikroanalizy oparte na telefonach komórkowych mogą być przydatne do analizy cytometrycznej, takiej jak wykonywanie różnych zadań związanych z liczeniem komórek, a także do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, np. próbek wody w warunkach ograniczonych...

Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne Cytometria przepływowa w telefonie komórkowym

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Zapewniając czułość pojedynczej komórki, cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym jest wyjątkowo odpowiednia do ilościowego określania funkcji receptorów multimodalnych w żywych kulturach. Wykorzystując dorosłe nerwowe komórki progenitorowe, funkcję receptora P2X7 oceniano poprzez napływ wapnia wykrywany przez barwnik wskaźnikowy wapnia, tworzenie porów transbłonowych przez wychwyt bromku etydyny i fagocytozę za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych.

Cytometria przepływowa żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania napływu wapnia, tworzenia porów i fagocytozy przez receptory P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje całkowicie optyczną kontrolę i obserwację wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs) dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Pokazano wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni. Wykazano długoterminowe działanie leków w ciągu godzin lub sekwencyjne pomiary w ciągu kilku dni.

Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Obrazowanie żywymi komórkami sygnalizacji wapnia jest szeroko wykorzystywane do badania mobilizacji wapnia w stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwach. Protokół ten opisuje obrazowanie fluorescencji żywych komórek sygnalizacji wapnia z użyciem barwników komórek żywych na złożonych, pierwotnych tkankach, a także wykorzystuje oprogramowanie uczenia maszynowego do ilościowego określania intensywności fluorescencji tysięcy pojedynczych komórek jednocześnie, co usprawnia analizy.

Obrazowanie wapnia oparte na fluorescencji w pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem zautomatyzowanej segmentacji komórek

Poznaj metodę jednokomórkowej analizy napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu platformy optofluidycznej. Technika umożliwia obserwację kinetyki sygnałowej w czasie rzeczywistym.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Przeglądaj więcej filmów