Name: Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę implantacji okna czaszkowego do powtarzalnego obrazowania neuronów i astrocytów u obudzonych myszy. Technika ta umożliwia badanie zmian strukturalnych i funkcjonalnych w modelach zaburzeń neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez IACUC w Centrum Medycznym Uniwersytetu Nebraska.
1. Przed operacją
<ol>
	<li>Przygotuj pipety do wstrzykiwań wirusowych. Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet i ukosuj pipetę pod kątem 20°. Wysterylizuj pipety przez noc.</li>
	<li>Przygotuj świeże kawałki sterylnej pianki żelowej, krojąc je na małe kwadraty. Zanurz piankę żelową w sterylnej probówce do mikrofugi zawierającej 0,5 ml soli fizjologicznej. Namocz piankę żelową w soli fizjologicznej na co najmniej 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj świeże kawałki pasków biszkoptu, krojąc je w cienkie paski.</li>
	<li>Dwadzieścia minut przed zabiegiem wstrzyknij 4-6-tygodniowym myszom GLAST-CreER/GCaMP6f dootrzewnowo 0,2 mg/kg deksametazonu, aby zapobiec obrzękowi mózgu i 5 mg/kg karprofenu, aby zmniejszyć stan zapalny><.
	UWAGA: Aby indukować rekombinację i ekspresję GCaMP6f w około 40% astrocytów, myszom GLAST-CreER/GCaMP6f wstrzyknięto 100 mg/kg tamoksyfenu przez 3 tygodnie przez 5 kolejnych dni.</li>
</ol>
2. Rozpoczęcie operacji
<ol>
	<li>Po 20 minutach znieczulić myszy 3% izofluranem z tlenem przy natężeniu przepływu 1 l/min przez około 1,5 minuty.</li>
	<li>Po znieczuleniu umieść mysz na ramie stereotaktycznej, która znajduje się na kocu recyrkulującym wodę, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C przez cały czas trwania operacji. Przymocuj mysz do ramy za pomocą zacisku pyska i nauszników. Upewnij się, że zacisk pyska i pręty uszne są na tyle stabilne, że głowa nie będzie się poruszać podczas zabiegu, ale nie na tyle ciasno, aby czaszka została uszkodzona.</li>
	<li>Utrzymuj znieczulenie 1-1,5% izofluranem z tlenem przy natężeniu przepływu 1-2 l/min. Należy pamiętać, że niektóre zwierzęta mogą potrzebować mniej lub więcej izofluranu, aby utrzymać uspokojenie. Monitoruj oddech zwierzęcia, a także jego odruchy na szczypanie palców u nóg i ogona oraz odpowiednio dostosuj izofluran.</li>
	<li>Nałóż maść na oko na każde oko za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu.</li>
	<li>Za pomocą trymerów do gryzoni zgol włosy od szyi do tuż za oczami. Zachowaj ostrożność, aby upewnić się, że wąsy zwierzęcia nie zostaną przypadkowo przycięte.</li>
	<li>Oczyść ogolony obszar jednym wacikiem jodowym, a następnie jednym wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków tkankowych i nożyczek chirurgicznych przeciąć i usunąć skórę od szwów czołowych przed bregmą aż do lambda.</li>
	<li>Po usunięciu skóry dodaj około 0,1 ml 1% ksylokainy (lidokainy z epinefryną 1:200 000) do czaszki, aby zminimalizować krwawienie czaszki.</li>
	<li>Używając sterylnego ostrza chirurgicznego ze stali węglowej w rozmiarze 11 przymocowanego do rękojeści, delikatnie zeskrob tkankę łączną z czaszki. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania tkanki łącznej w pobliżu krawędzi czaszki, ponieważ pozostała tkanka może zapobiec późniejszemu silnemu przyleganiu szkła lub płytki głowy.</li>
	<li>Użyj sterylnych kleszczyków tkankowych, aby usunąć luźną tkankę łączną z czaszki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką usuń pozostałą ksylokainę z czaszki.</li>
	<li>Po zakończeniu dokładnie odtłuść czaszkę za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką zamoczonego w acetonie. Użyj sprężonego powietrza, aby natychmiast wysuszyć czaszkę.</li>
</ol>
3. Kraniotomia
<ol>
	<li>Za pomocą cienkiego markera punktowego i linijki zmierz odpowiedni rozmiar otworu w żądanym miejscu. Potwierdź rozmiar otworu, porównując go z rozmiarem szkła nakrywkowego (o średnicy 3 lub 5 mm); Upewnij się, że otwór jest nieco mniejszy niż rozmiar szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Za pomocą wiertła dentystycznego stopniowo śledź kontur otworu, przerzedzając kość. Wiercić powoli, aby zapobiec przewiercaniu się przez kość, i wiercić w koncentrycznych okręgach, aby ułatwić równomierne przerzedzenie kości.</li>
	<li>Po każdym koncentrycznym przejściu dodaj kroplę lub dwie sterylnej soli fizjologicznej do wierconego obszaru. Pozostaw sól fizjologiczną na co najmniej 10 sekund, aby zapobiec przegrzaniu kości i uszkodzeniu leżącej pod nią opony twardej.</li>
	<li>Użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną. Przedmuchaj obszar sprężonym powietrzem, aby upewnić się, że cała pozostała sól fizjologiczna wyparowała przed wznowieniem wiercenia. Zrób to, aby zdmuchnąć resztki kości, które pozostały.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.2-3.4, aż kość zostanie odpowiednio rozrzedzona do usunięcia.</li>
	<li>Upewnij się, że kość jest odpowiednio cieńsza do usunięcia, delikatnie naciskając na środkową część kości cienkimi kleszczami, aby sprawdzić, czy przerzedzona czaszka się porusza. Znajdujące się poniżej naczynia krwionośne powinny być widoczne w miejscu, w którym nastąpiło wiercenie. Zauważ, że kość może wyglądać tak, jakby pękła w miejscu, w którym nastąpiło przerzedzenie. 
	UWAGA: Trening na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla określenia, kiedy kość została odpowiednio przerzedzona.</li>
	<li>Przed próbą usunięcia kości sprawdź, czy mysz jest całkowicie uspokojona. Jeśli nie, należy stopniowo zwiększać konserwację izofluranu, aby zapobiec obrzękowi mózgu podczas usuwania kości.</li>
	<li>Dodaj mały kawałek pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną do rozcieńczonej czaszki. Dodaj jedną lub dwie dodatkowe krople soli fizjologicznej do rozcieńczonej czaszki. 
	UWAGA: Duża ilość soli fizjologicznej na przerzedzonej czaszce pomaga zmniejszyć krwawienie i chronić oponę twardą podczas usuwania płata kostnego.</li>
	<li>Używając miniaturowego ostrza spiczastego pod kątem 15°, ostrożnie włóż ostrze do przerzedzonej kości i przetnij wzdłuż przerzedzonej kości. Utrzymuj piankę żelową nasączoną solą fizjologiczną, gotową do zatrzymania wszelkich krwawień, które mogą wystąpić.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś i usuń kość. Bądź tak delikatny, jak to możliwe, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki i naczyń krwionośnych. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opony twardej.</li>
	<li>Po usunięciu płata kostnego dodaj do kory świeży kawałek pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej, aby zapobiec wysychaniu pianki żelowej, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki znajdującej się pod spodem.</li>
</ol>
4. Zastrzyki wirusowe
<ol>
	<li>Wykonaj zastrzyki wirusowe za pomocą aparatu stereotaktycznego.
	<ol>
		<li>Przygotuj AAV1. CaMKII.0.4.Cre (miano 3 × 1013 kopii genomu (GC)/ml) w stosunku 1:5 000 przez seryjne rozcieńczenia w roztworze soli fizjologicznej.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5 000) oraz AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (miano 5 × 1012 GC/mL) na małym kawałku parafilmu.</li>
		<li>Napełnij sterylną szklaną pipetę ze ściętym skosem o rozmiarze końcówki 20 μm mieszaniną wirusów, delikatnie umieszczając pipetę na roztworze.</li>
		<li>Opuścić pipetę tak, aby dotykała tylko powierzchni mózgu i kontynuować obniżanie o dodatkowe 200-300 μm w przypadku wstrzyknięć L2/3. Korzystając z wewnątrzkomórkowego systemu dozowania mikroiniekcji (patrz Tabela materiałów), wstrzyknij ciśnieniowo 12-15 razy w ciągu 2 minut (20 psi, czas trwania impulsu 9 ms). Przy każdym wstrzyknięciu należy obserwować menisk w kropli pipety, aby upewnić się, że pipeta nie jest zablokowana.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu pozostaw pipetę w mózgu na 4-5 minut, aby zapobiec cofaniu się. Powoli wycofaj pipetę.</li>
		<li>Powtórzyć wstrzyknięcia w 2-3 miejscach (około 500 μm od siebie).</li>
		<li>Wyrzuć zużyte szklane pipety, parafilm, końcówki do pipet i probówki do mikrofug używane do seryjnych rozcieńczeń wirusa Cre do 10% wybielacza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Implantacja okna czaszkowego
<ol>
	<li>Usuń piankę żelową i użyj małego paska pasków gąbki, aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną.</li>
	<li>Dodaj kilka kropli antybiotyku enrofloksacyny (22,7 μg/ml) do otworu i pozostaw go tam na 1 minutę. Po 1 minutach użyj świeżego kawałka biszkoptu, aby wchłonąć pozostałą enrofloksacynę. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Po trzecim praniu dodaj kilka kropel soli fizjologicznej do otworu i pozostaw ją tam na 1 minutę. Po 1 minutie użyj świeżego kawałka biszkoptu, aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną. Powtórz ten proces prania jeszcze dwa razy, a po trzecim praniu dodaj małą kroplę soli fizjologicznej do otworu.</li>
	<li>Umieść szklankę nakrywkową nad otworem. Użyj kleszczyków, aby upewnić się, że szkło jest równo z otworem, aby uzyskać obrazy dobrej jakości.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymując szybę na miejscu, nałóż klej cyjanoakrylowy (tabela materiałów) na obwodzie szkła, aby uszczelnić krawędzie okna do czaszki. Upewnij się, że klej nie przedostanie się pod szkło nakrywkowe i trzymaj jak najwięcej kleju z powierzchni szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Nałóż warstwę super kleju na żel adhezyjny. Nałóż warstwę płynu z cementu dentystycznego na klej, aby mógł stwardnieć.</li>
	<li>Weź odpowiedniej wielkości płytę czołową typu helikopterowego i nałóż cienką warstwę kleju wokół środkowego otworu. Umieść płytę głowicy na szkle nakrywkowym i poczekaj, aż klej na chwilę wyschnie.</li>
	<li>W probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml dodaj proszek cementu dentystycznego do oznaczenia 0,1 ml na probówce. Dodaj 7-8 kropli szybkoutwardzalnego, błyskawicznego kleju i wymieszaj. Pobrać do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 19 g, która została przecięta w celu utworzenia większego otworu.</li>
	<li>Wstrzyknąć mieszaninę przez boczne otwory pręta helikoptera, aż zacznie wyciekać z obu stron. Nałóż mieszankę cementu dentystycznego i kleju na resztę odsłoniętej czaszki, aby przymocować płytkę głowy do czaszki, co zmniejszy artefakty ruchu podczas obrazowania.</li>
	<li>Pozostaw mieszaninę do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Wstrzyknij mysz 0,5 ml soli fizjologicznej podskórnie, aby wspomóc regenerację.</li>
</ol>
6. Operacja po operacji
<ol>
	<li>Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją z powrotem w klatce.</li>
	<li>Umieść część klatki na kocu recyrkulacyjnym wody, poduszkach grzewczych z żelu kosmicznym lub podkładkach izotermicznych, aby pomóc w rekonwalescencji.</li>
	<li>Zapewnij zwierzęciu niewielką porcję granulek pokarmowych i mokrej karmy, oprócz regularnej diety, aby jeszcze bardziej pomóc w powrocie do zdrowia. Dodawaj nowe granulki karmy i mokrą karmę każdego dnia po operacji na czas rekonwalescencji.</li>
	<li>Dzień po zabiegu należy wstrzyknąć myszom raz 5 mg/kg karprofenu i 5 mg/kg enrofloksacyny.</li>
	<li>W dniach 2-6 wstrzyknąć myszom raz 5 mg/kg karprofenu i dwa razy 5 mg/kg enrofloksacyny, w oczekiwaniu na zatwierdzenie przez lokalny IACUC. Wstrzyknięcia enrofloksacyny należy oddzielić od siebie o co najmniej 8 godzin.</li>
	<li>W dniach 7-20 należy codziennie wstrzykiwać myszom 5 mg/kg karprofenu.</li>
</ol>
7. Przyzwyczajenie zwierząt do obrazowania
<ol>
	<li>W 14 dniu po zabiegu zbadaj okno czaszki pod kątem jasności optycznej. Nie używaj myszy z niejasnymi lub w inny sposób uszkodzonymi oknami (tj. nadmierną angiogenezą).</li>
	<li>Sprawdź ekspresję tdTomato pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jeśli można zidentyfikować znakowane komórki, przystąp do habituacji zwierząt.</li>
	<li>Pierwszy dzień habituacji (obsługi)
	<ol>
		<li>Przytrzymaj mysz przez kilka minut, a po użyciu włóż ją z powrotem do klatki. Powtórz obsługę trzy razy w 15-minutowym odstępie między sesjami.</li>
		<li>Po trzeciej próbie przyzwyczaj mysz, owijając zwierzę w mały kawałek materiału.</li>
		<li>Trzymaj mysz owiniętą w szmatkę przez około 1 minutę.</li>
		<li>Po próbie włóż mysz z powrotem do klatki. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, pozostawiając 15-minutowy odstęp między każdą próbą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugi dzień habituacji
	<ol>
		<li>Zważ i zapisz wagę myszy.</li>
		<li>Owiń mysz w szmatkę i przymocuj ją za pomocą płyty czołowej do ramienia mocującego głowę klatki domowej podnoszonej powietrzem.</li>
		<li>Pozostaw klatkę domową wystawioną na działanie światła.</li>
		<li>Pozostaw mysz zabezpieczoną w klatce domku mobilnego przez 15 minut.</li>
		<li>Po przyzwyczajeniu wyjmij mysz z klatki domowej i wyłącz przepływ powietrza.</li>
		<li>Zważ mysz i umieść ją z powrotem w klatce. Uważaj, aby uwzględnić tylko myszy, które nie tracą więcej niż 10% masy ciała. Wyklucz z eksperymentów obrazowych myszy, które tracą więcej niż 10% swojej wagi w ciągu dowolnego dnia przyzwyczajenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzeci dzień przyzwyczajenia i kolejne dni
	<ol>
		<li>Zważ i zapisz wagę myszy przed przymocowaniem jej do podniesionej pneumatycznie klatki domowej.</li>
		<li>Przymocuj mysz do podniesionej pneumatycznie klatki domowej.</li>
		<li>Przykryj klatkę domową czymś, co zapewni ciemne wnętrze, np. pudełkiem, i pozwól myszy pozostać zabezpieczoną przez 30 minut.</li>
		<li>Po 30 minutach odsłoń klatkę domową, wyjmij mysz i wyłącz przepływ powietrza.</li>
		<li>Zważ i zapisz wagę myszy po przyzwyczajeniu.</li>
		<li>Powtarzaj ten proces codziennie, wydłużając czas mocowania myszy do klatki domowej o 15 minut. Kontynuuj ten proces, aż mysz będzie mogła zostać przymocowana do klatki domowej na 1,5 godziny, ponieważ jest to przybliżony czas trwania sesji obrazowania dwufotonowego.</li>
		<li>Aby przyzwyczaić mysz do hałasu, wykonaj kilka sesji habituacyjnych pod mikroskopem, aby przyzwyczaić mysz do dźwięków luster skanujących laser. Wyklucz myszy, które nie przyzwyczajają się wystarczająco (tj. wokalizacje i defekacja wywołana stresem).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Obrazowanie wielofotonowe
<ol>
	<li>Rozpocznij obrazowanie 3 tygodnie po operacji, aby umożliwić oczyszczenie okna.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie na specjalnie wykonanym lub dostępnym na rynku mikroskopie wielofotonowym wyposażonym w laser Ti:Sapphire. Rejestruj obrazy za pomocą obiektywu zanurzeniowego w wodzie z dużą aperturą numeryczną (NA). 
	UWAGA: Obrazowanie dwukanałowe uzyskuje się dzięki zastosowaniu zwierciadła dichroicznego 565 nm i dwóch zewnętrznych lamp fotopowielaczy. Filtr pasmowoprzepustowy 535/50 służy do wykrywania emisji GCaMP6f, a filtr pasmowoprzepustowy 610/75 służy do wykrywania tdTomato. Do uzyskania obrazów pokazanych na Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2) użyto obiektywu z 25-krotnym zanurzeniem w wodzie (1,05 NA) i skanerów rezonansowych. Każdy obszar zainteresowania składał się ze stosu obrazów oddzielonych osiowo o 1 μm. Każdy wycinek optyczny został zebrany w rozdzielczości 512 x 512 pikseli, 0,18 μm/piksel. Obrazy uzyskano z obszaru kończyn przednich pierwszorzędowej kory ruchowej, zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi.</li>
	<li>Ustaw długość fali lasera na 920 nm (990 nm, jeśli używany jest GECI z przesunięciem ku czerwieni).</li>
	<li>Umieść mysz na klatce domu mobilnego i clamp płytę główną do ramienia mocującego głowę.</li>
	<li>Dodaj kilka kropel wody na środek okna.</li>
	<li>Korzystając z trybu szerokokątnego mikroskopu, wybierz 2-3 pozycje łatwo rozpoznawalnego układu naczyniowego. Zapisz obrazy tych naczyń krwionośnych i zapisz współrzędne X i Y, które pojawiają się na sterowniku silnika, aby przemieścić dendryty znakowane tdTomato na kolejne sesje obrazowania. Za każdym razem dostosowuj współrzędne X i Y, aby wyrównać je z zapisanymi obrazami naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Po zobrazowaniu układu krwionośnego i zarejestrowaniu pozycji zlokalizuj regiony, w których neurony wyrażają tdTomato (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Obraz struktur synaptycznych (dendrytów i aksonów) neuronów i aktywności GCaMP6f w astrocytach. 
	UWAGA: Dendryty będą służyć jako punkty orientacyjne, aby niezawodnie powrócić do tych samych regionów i obrazować te same dendryty i astrocyty przez powtarzające się dni. Nie zaobserwowano wykrywalnego przesunięcia w płaszczyźnie obrazowania przy stabilnym unieruchomieniu głowy i po przyzwyczajeniu do fiksacji głowy. Przemieszczenie występujące w kierunkach X i Y jest korygowane ruchem.</li>
	<li>Po zobrazowaniu umieść mysz z powrotem w klatce. 
	UWAGA: Myszy są zwykle trzymane na lunecie przez maksymalnie 2 godziny. Gdy obrazowanie utrzymuje się przez długi czas, woda pod obiektywem może wyschnąć. Podczas eksperymentów należy dodawać wodę. Alternatywnie zamiast wody można użyć żelu ultradźwiękowego.</li>
</ol>

<ol><li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch-specific+dendritic+Ca2%2B+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li>
<li>Goncalves, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li>
<li>Padmashri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+structural+and+functional+synaptic+plasticity+with+motor+skill+learning+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).</li>
<li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li>
<li>Poskanzer, K. E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+cortical+state+switching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate cortical state switching in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+calcium+signaling+transforms+cholinergic+modulation+to+cortical+plasticity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+long-term+dendritic+spine+stability+in+diverse+regions+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex.</a> Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742(2014).</li>
<li>Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li>
<li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+opening+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+induces+microdomain+calcium+transients+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li>
<li>Bindocci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Ca2%2B+imaging+advances+understanding+of+astrocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology.</a> Science. 356 (6339), (2017).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Han, S., Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+volumetric+imaging+of+neuronal+activity+of+cortical+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns.</a> Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Chen, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+plasticity+of+inhibitory+circuits+in+motor+cortex+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li>
<li>Matsui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024(2011).</li>
<li>Roth, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+synaptic+AMPA+receptor+plasticity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning.</a> Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).</li>
<li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Suresh, A., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+synaptic+AMPAR+and+spine+dynamics%3A+impairments+in+the+FXS+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse.</a> Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+two-photon+imaging+of+synaptic+structures+in+the+cortex+of+awake+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-floored+air-lifted+platform%3A+a+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869(2014).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Hauglund, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+lymphangiogenesis+and+enhanced+glymphatic+activity+in+mice+with+chronically+implanted+EEG+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes.</a> Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).</li>
<li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+calcium+imaging+at+different+depths+with+spatiotemporal+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing.</a> Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742(2012).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium--implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li>
<li>Pryazhnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+two-photon+imaging+in+somatosensory+cortex+of+behaving+mice+reveals+dendritic+spine+formation+enhancement+by+subchronic+administration+of+low-dose+ketamine%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6464(2018).</li>
<li>Thrane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li>
<li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li>
<li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422(2014).</li>
</ol>

Tutaj przedstawiliśmy protokół implantacji przewlekłych okien czaszkowych do obrazowania in vivo astrocytów korowych i neuronów u obudzonych, skrępowanych głowami myszy na podniesionej powietrzem klatce domowej. Podano konkretne przykłady zastosowania okna czaszkowego do obrazowania astrocytów, które wyrażają GECI i neuronalne struktury synaptyczne. Dzięki zastosowaniu mikroskopii wielofotonowej astrocytowa dynamika sygnalizacji wapniowej i strukturalna dynamika synaptyczna mogą być rejestrowane wielokrotnie w c...

Zdolność do wykonywania in vivo wielofotonowej mikroskopii fluorescencyjnej w korze myszy jest kluczowa dla badania sygnalizacji komórkowej i struktury1,2,3,4,5,6,7,8, 9, patologia choroby10,11, oraz rozwój komórkowy12,13. Dzięki implantacji przewlekłych okien czaszkowych możliwe jest obrazowanie podłużne, co pozwala na wielokrotne obrazowanie obszarów korowych przez dni, tygodnie lub miesiące13,14 u żywych zwierząt. Mikroskopia wielofotonowa jest idealna do wielokrotnego obrazowania in vivo ze względu na ulepszone sondowanie głębokości i zmniejszone fotouszkodzenia związane z zastosowanym laserem na podczerwień. Pozwala to na badanie dynamiki molekularnej i komórkowej określonych komórek w różnych obszarach kory mózgowej.
Mikroskopia wielofotonowa została wykorzystana do obrazowania in vivo komórek neuronalnych i glejowych u myszy15,16,17,18,19,20. Można wdrożyć różne strategie oznaczania określonych typów komórek i obszarów zainteresowania. Jednym z powszechnych podejść jest sterowanie ekspresją genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych w sposób specyficzny dla komórki za pomocą systemu rekombinacji Cre-Lox. Można to przeprowadzić na genetycznie zmodyfikowanych myszach, np. krzyżując "floxowaną" mysz tdTomato (Ai14) z myszą wykazującą ekspresję Cre-rekombinazy pod promotorem zainteresowania21. Alternatywnie, znakowanie specyficzne dla komórek i miejsca można osiągnąć za pomocą zastrzyków wirusowych. W tym przypadku wirus kodujący rekombinazę Cre pod promotorem specyficznym dla komórki i wirus kodujący kłaczkowaty gen będący przedmiotem zainteresowania są wstrzykiwane do określonego regionu. Odpowiednie typy komórek, które otrzymają oba wektory wirusowe, będą następnie wyrażać pożądane geny (geny). Geny te mogą być markerami strukturalnymi, takimi jak tdTomato, do wyświetlania zmian w morfologii komórek22 lub genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia (GECI), takimi jak GCaMP i/lub RCaMP, w celu zbadania dynamiki wapnia23. Metody rekombinacji genetycznej mogą być stosowane pojedynczo lub w połączeniu w celu oznakowania jednego lub więcej typów komórek. Trzecim podejściem, niewymagającym transgenicznych myszy lub konstruktów wirusowych (które mają ograniczoną zdolność pakowania), jest elektroporacja konstruktów DNA w macicy24. W zależności od czasu elektroporacji, różne typy ogniw mogą być celowane25,26,27.
Podczas wykonywania obrazowania wielofotonowego, myszy mogą być obrazowane w stanie czuwania lub znieczulone. Obrazowanie obudzonych myszy można wykonać, zabezpieczając mysz za pomocą dołączonej płyty czołowej28. Podejście to jest mniej stresujące, ponieważ pozwala na względnie swobodne poruszanie się zwierzęcia za pomocą takich metod, jak swobodnie unoszące się, wspierane powietrzem kulki styropianowe29, bieżnie swobodnie pływające1, lub system klatek domowych podnoszony powietrzem, w którym myszy są mocowane za pomocą dołączonej płyty czołowej i mogą poruszać się w otwartej komorze30. W przypadku każdego z tych warunków obrazowania konieczne będzie najpierw przyzwyczajenie myszy do konfiguracji obrazowania. W artykule opisano procedurę habituacji i obrazowania przy użyciu systemu klatek domowych podnoszonych powietrzem.
Ten protokół opisuje implantację przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania in vivo w korze mózgowej. Tutaj użyjemy myszy, które warunkowo eksprymują GCaMP6f w astrocytach, aby monitorować dynamikę sygnalizacji wapnia. Ponadto w artykule opisano procedurę wstrzykiwania wirusa przy użyciu tdTomato jako etykiety dla neuronów. Pozwala to na określenie zmian w strukturze synaptycznej neuronów i/lub dostępności jako markera strukturalnego, który umożliwia wielokrotne obrazowanie tego samego astrocytu. W całym protokole podkreślone zostaną kluczowe kroki mające na celu zapewnienie najlepszej możliwej jakości obrazów uzyskanych z mikroskopii wielofotonowej.

<table><tbody><tr><td>15o Pointed Blade</td><td>Surgistar</td><td>6500</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>19 G Igły</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Addgene</td><td>28306-AAV1</td><td>Wektor wirusowy</td></tr><tr><td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td><td>Addgene</td><td>105558-AAV1</td><td>Wektor wirusowy</td></tr><tr><td>Acteone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Podkładki do przygotowania alkoholu</td><td>Fisher Scientific</td><td>Covidien 5750</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Beveler</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment Szkło borokrzemianowe</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Wiertła z węglików spiekanych</td><td>SS White Dental</td><td>14717</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>Karprofen (Rimadyl), 50 mg / ml</td><td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.Drug</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sprężone powietrze</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022-523</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>836-WC NO BINDER</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe do chirurgii, nr 1 grubość, 3 mm/5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720, 64-0700</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Sprzęt aseptyczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon, 4 mg/mL</td><td>Mylan Institutional, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do preparowania</td> leków <td>Sprzęt Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duralay Liquid&nbsp; (płyn do cementu dentystycznego)</td><td>Odczynnik Duralay w proszku Patterson Dental</td><td>602-8518</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; (proszek cementu dentystycznego)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-7932</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Enrofloksacyna, 2,27%</td> maść <td>do oczu Bayer</td><td></td><td>Drug</td></tr><tr><td></td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Chirurgia Dostawa</td></tr><tr><td>Fiber Lite Oświetlacz o wysokiej intensywności</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td></td><td>Kleszcze do sprzętu</td></tr><tr><td>(duże)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>Kleszcze ( Small)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501764</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>Numer magazynowy: 024105</td><td>Linia myszy</td></tr><tr><td>Sprzęt naukowy</td><td></td><td>Germinator</td> Fisher <td></td></tr><tr><td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>Nr magazynowy: 012586</td><td>Linia myszy</td></tr><tr><td>Headplate</td><td>Neurotar</td><td>Model 1, Model 3</td><td>Chirurgia Zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>Uchwyt na 15o Pointed Blade</td><td>World Precision Instruments</td><td>501247</td><td>Uchwyt na narzędzia chirurgiczne</td></tr> do <tr><td>ostrzy skalpela</td> World <td>Precision Instruments</td><td>500236</td><td>Narzędzia</td></tr> <tr>chirurgiczne<td>Jodowe podkładki przygotowawcze</td><td>Avantor</td><td>15648-926</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Piramal</td><td></td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dostawa System blatów izofranowych z pudełkiem indukcyjnym</td><td>Sprzęt</td><td>do aparatury</td><td></td> Harvarda</tr><tr><td>Waporyzator izofluranu</td> Sprzęt <td>SurgiVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>Office Depot</td><td>KG517</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>40140</td><td>szybkoutwardzalny klej błyskawiczny</td></tr><tr><td>Loctite 454</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9194415</td><td>cyjanoakrylowy żel samoprzylepny</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments Sprzęt</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>do</td><td>mikroskopów</td><td></td><td></td> wielofotonowych</tr><tr><td>Azot</td><td>Matheson</td><td>NI M200</td><td>Gaz</td></tr><tr><td>Tlen</td><td>Matheson</td><td>OX M250</td><td>Gas</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker</td><td></td><td>wewnątrzkomórkowy system dozowania mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td></td><td>17014340 Surgery Supply</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów gryzoni</td><td></td><td>Sprzęt</td>Sól <td></td></tr><tr><td>fizjologiczna (0,9% chlorku sodu)</td> <td>Med Vet International</td><td>RX0.9NACL-30BAC</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Zaopatrzenie Ostrza skalpela, rozmiar 11</td><td>Integra</td><td>4-111</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>503667</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr>Sprzęt <td></td>do <td>stoeltingu</td><td></td><td>Instrumenty stereotaktyczne</td></tr><tr><td>Paski gąbki Sugi (paski gąbki)</td><td>Zaopatrzenie chirurgii</td> <td>Kettenbach Dental</td><td>31002</td></tr><tr><td>SURGIFOAM (pianka żelowa)</td><td>Ethicon</td><td>1972</td> Strzykawka <td>zaopatrzeniowa chirurgiczna</td></tr><tr><td>z igłą 26 G</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Ti: Szafirowe laserowe</td><td>koherentne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Koc wodny zaopatrzenia chirurgicznego</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Xylocaine MPF z epinefryną (1:200 000), 10 mg / mL</td><td>Fresenius Kabi USA</td><td></td><td>Lek</td></tr></tbody></table>

implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Aby w pełni zrozumieć fizjologię komórkową neuronów i gleju u zachowujących się zwierząt, konieczne jest wizualizację ich morfologii i zarejestrowanie ich aktywności in vivo u zachowujących się myszy. W artykule opisano metodę implantacji przewlekłego okna czaszkowego, aby umożliwić podłużne obrazowanie komórek mózgowych u przytomnych, skrępowanych głowami myszy. W połączeniu ze strategiami genetycznymi i iniekcjami wirusowymi możliwe jest znakowanie określonych komórek i regionów za pomocą markerów strukturalnych lub fizjologicznych. Protokół ten pokazuje, jak łączyć zastrzyki wirusowe w celu znakowania neuronów w pobliżu astrocytów wykazujących ekspresję GCaMP6 w korze mózgowej w celu jednoczesnego obrazowania obu komórek przez okno czaszkowe. Wielofotonowe obrazowanie tych samych komórek może być wykonywane przez dni, tygodnie lub miesiące u jawych, zachowujących się zwierząt. Takie podejście zapewnia naukowcom metodę obserwacji dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym i może być stosowane do odpowiedzi na wiele pytań w neurobiologii.

Jakość okna czaszkowego można ocenić na podstawie ostrości obrazu struktur neuronalnych. W przypadku dobrze wykonanego okna kolce dendrytyczne są wyraźnie widoczne (Rycina 1). Dzięki zapisaniu danych strukturalnych i pozycyjnych, to samo zwierzę może być obrazowane wielokrotnie przez dni, tygodnie lub miesiące w celu badania tych samych komórek (Rycina 1). Obrazy na Rycynie 1 uzyskano z obszaru kończyny przedniej pierwotnej kory ruc...

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Protokół opisuje, jak wykonywać zastrzyki wirusowe i wszczepiać okno czaszkowe do obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głowami myszy. Zaletą tej metody jest to, że struktura i aktywność neuronów i astrocytów mogą być obrazowane wielokrotnie w ciągu wielu sesji. Podejście to można wykorzystać do określenia, w jaki sposób komórki nerwowe są zmieniane w modelach zaburzeń neurorozwojowych lub neurodegeneracyjnych, lub czy plastyczność zależna od doświadczenia jest upośledzona.Zacznij od przymocowania znieczulonej myszy do ramy stereotaktycznej za pomocą zacisku pyska i nauszników. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych przeciąć i usunąć skórę od szwów czołowych od przodu do bregmy do tyłu do lambda. Używając sterylnego ostrza chirurgicznego ze stali węglowej w rozmiarze 11, delikatnie zeskrob całą tkankę łączną z czaszki.Za pomocą wiertła dentystycznego stopniowo wiercić kość czaszki wzdłuż obrysu otworu w koncentrycznych kręgach, aby ułatwić równomierne przerzedzenie kości. Po każdym koncentrycznym przejściu dodaj kroplę lub dwie soli fizjologicznej do wierconego obszaru i pozwól soli fizjologicznej pozostać przez co najmniej 10 sekund przed wznowieniem wiercenia. Delikatnie popchnij środkową część kości czaszki cienkimi kleszczami, aby sprawdzić, czy czaszka jest odpowiednio cieńsza i porusza się.Upewnij się, że znajdujące się pod spodem naczynia krwionośne, w których doszło do wiercenia, jest nienaruszone, a kość nie jest pęknięta. Ostrożnie włóż miniaturowe spiczaste ostrze pod kątem 15 stopni w rozrzedzoną kość, a następnie przetnij i użyj pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną, aby zatrzymać krwawienia, które mogą wystąpić. Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś i usuń kość, uważając, aby nie uszkodzić opony twardej.Do wstrzyknięcia należy napełnić sterylną pipetę ze szkła ze skośnym skosem z końcówką o długości 20 mikrometrów z mieszaniną wirusów. Następnie opuść pipetę, aby dotknąć powierzchni mózgu, i kontynuuj obniżanie o dodatkowe 200 do 300 mikrometrów w przypadku wstrzyknięć warstwy 2/3. Korzystając z wewnątrzkomórkowego systemu dozowania mikroiniekcji, wstrzyknij system pod ciśnieniem od 12 do 15 razy w ciągu dwóch minut.W przypadku implantacji okna czaszki umieść szkło nakrywkowe nad otworem w czaszce. Użyj kleszczyków, aby upewnić się, że szkło jest równo z otworem. Aby uszczelnić krawędzie szklanego okienka do czaszki, nałóż klej w żelu cyjanoakrylowym na obwodzie powierzchni szkła.Na żel adhezyjny nałóż warstwę kleju. Następnie dodaj warstwę płynu z cementu dentystycznego. Gdy cement dentystyczny stwardnieje, nałóż cienką warstwę kleju wokół środkowego otworu płyty czołowej typu helikopter i umieść płytę czołową typu helikopter o odpowiednim rozmiarze na szkle nakrywkowym.Pozostaw klej do wyschnięcia. Dodaj proszek cementu dentystycznego do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofugi do znaku 0,1 mililitra. Wymieszaj siedem do ośmiu kropli szybkoutwardzalnego kleju błyskawicznego z proszkiem i wciągnij powstałą mieszaninę do jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 19, która została przycięta, aby utworzyć większy otwór.Wstrzyknąć mieszaninę proszku przez boczne otwory pręta helikoptera, aż zacznie wyciekać z obu stron. Nałóż mieszankę kleju do cementu dentystycznego na resztę odsłoniętej czaszki, aby przymocować płytkę głowy do czaszki. Owiń mysz w szmatkę i przymocuj ją za pomocą płyty czołowej do ramienia mocującego głowę klatki domowej transportowanej drogą powietrzną, a następnie pozostaw klatkę domową wystawioną na działanie światła.Po upływie 15 minut od przyzwyczajenia wyjmij mysz z klatki domowej. Korzystając z trybu szerokiego pola mikroskopu, wybierz dwie lub trzy pozycje łatwego do zidentyfikowania układu naczyniowego. Zapisz obrazy naczyń krwionośnych i zapisz współrzędne x i y, które pojawiają się na sterowniku silnika.Obrazuj struktury synaptyczne neuronów i aktywność GCaMP6f w astrocytach. W analizie reprezentatywnej jakość okna czaszkowego oceniano za pomocą wielokrotnego obrazowania dendrytów i astrocytów wykazujących ekspresję GCaMP6f przez kilka dni. W dobrym oknie struktury neuronalne wydawały się wyraźne z wyraźnie widocznymi kolcami dendrytycznymi.Dwa nowe kolce pojawiły się w drugim dniu obrazowania. Tylko jeden kręgosłup przetrwał i był widoczny w piątym dniu. Aktywność wapnia badano w astrocytach wykazujących ekspresję GCaMP6f w różnych punktach czasowych.Globalne zdarzenie, które objęło całą komórkę, było obserwowane podczas ataku lokomocji. Dwa kluczowe etapy tego protokołu to odpowiednie rozrzedzenie kości przed usunięciem kości oraz prawidłowe umieszczenie szkła nakrywkowego nad otworem. Obrazowanie można połączyć z analizą behawioralną, zarówno podczas obrazowania, jak i po zachowaniu, takim jak uczenie się nowej umiejętności motorycznej, w celu określenia, w jaki sposób struktura i funkcja neuronów i astrocytów jest modulowana przez uczenie się.

implantation-cranial-window-for-repeated-vivo-imaging-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu okna czaszkowego w modelu mysim w celu zapewnienia stabilnego dostępu optycznego do różnych obszarów mózgu.

Implantacja okienka obrazowania czaszki w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu szkiełka nakrywkowego na bazie szkła w celu stabilnego dostępu optycznego do obszarów mózgu myszy

Ten film demonstruje rejestrację aktywności neuronalnej mózgu przez okno optyczne u myszy transgenicznych. Myszy wyrażają białko fluorescencyjne, które umożliwia wykrywanie aktywności neuronalnej. Niewielka część czaszki jest ostrożnie usuwana w celu zainstalowania okna optycznego, a następnie czaszka jest pokrywana czarnym cementem, aby zablokować światło przed obrazowaniem.

Instalacja okien optycznych w mózgu myszy transgenicznych w celu zobrazowania aktywności neuronalnej

Źródło: Pietruczyk, E. A., et al. Laminektomia i implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje wszczepienie okienka rdzenia kręgowego znieczulonej myszy do obrazowania in vivo. Protokół stabilizuje odsłonięty rdzeń kręgowy za pomocą borokrzemianowego szkła osłonowego i wydrukowanej w 3D płyty tylnej. Metoda ta umożliwia mikroskopię dwufotonową o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania dynamiki bariery krew-mózg i interakcji nerwowo-naczyniowych.

Implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy do obrazowania in vivo

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Protokół ten opisuje dwufazową metodę chirurgiczną mającą na celu stworzenie dużego, ponownie zamykalnego, oszczędzającego dura okno czaszkowe u myszy. Technika ta umożliwia przewlekłe, wielomodalne zapisy elektrofizjologiczne z rozproszonych, głębokich sieci mózgowych, takich jak Sieć Trybu Domyślnego, przez kilka tygodni.

Protokół chirurgiczny dla dużego, zamykalnego okna czaszkowego umożliwiającego podłużne, wielomodalne rejestrowanie elektrofizjologii sieci domyślnej myszy

Poznaj metodę implantacji okna czaszkowego do powtarzalnego obrazowania neuronów i astrocytów u obudzonych myszy. Technika ta umożliwia badanie zmian strukturalnych i funkcjonalnych w modelach zaburzeń neurologicznych.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Przeglądaj więcej filmów