Name: Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metody bioinformatyczne do analizy alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych RNA-seq. Protokół wykorzystuje podejścia oparte na eksonach i zdarzeniach do identyfikacji różnicowych miejsc splicingowych i użycia poli(A).

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Australian Research Council (ARC) Future Fellowship (FT16010043) oraz ANU Futures Scheme.

<ol><li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li>
<li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PolyASite+2.0%3A+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3%27+end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li>
<li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364(2014).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13(2016).</li>
<li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2014).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rMATS%3A+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li>
<li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li>
<li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+read+archive%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, suppl_1 19-21 (2010).</li>
<li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTange%2C+O+%22GNU+parallel-the+command-line+power+tool%22">GNU parallel-the command-line power tool</a>. 36, 42-47 (2011).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010</a> (2011).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet+journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), Oxford, England. 15-21 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25(2010).</li>
<li>Veiga, D. F. T. maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVeiga%2C+DFT+%22R+package+version+1.4.0%22">R package version 1.4.0</a>. , (2019).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25(2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ramírez, F., Dündar, F., Diehl, S., Grüning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools%3A+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li>
<li>Merino, G. A., Conesa, A., Fernández, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li>
<li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13(2016).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu oceniliśmy podejścia oparte na eksonach i zdarzeniach do wykrywania AS i APA w masowych danych sekwencjonowania RNA-Seq i końca 3'. Podejścia oparte na eksonach AS tworzą zarówno listę eksonów o zróżnicowanej ekspresji, jak i ranking na poziomie genu uporządkowany według istotności statystycznej ogólnej zróżnicowanej aktywności splicingu na poziomie genu (tabele 1-2, 4-5). W przypadku pakietu diffSplice zróżnicowane użycie określa się poprzez dopasowanie ważonych modeli liniowych na poziomi...

Metoda RNA-seq jest od lat powszechnie stosowana, zazwyczaj do szacowania różnicowej ekspresji genów oraz odkrywania nowych genów1. Ponadto może być ona wykorzystywana do szacowania zmienności poziomu wykorzystania eksonów wynikającej z ekspresji różnych izoform genu, co przyczynia się do lepszego zrozumienia regulacji genów na poziomie potranskrypcyjnym. Większość genów eukariotycznych generuje różne izoformy poprzez alternatywny splicing (AS), aby zwiększyć różnorodność ekspresji mRNA. Zdarzenia AS można podzielić na różne wzorce: pominięcie całych eksonów (SE), w którym ekson („kasetowy”) wraz z flankującymi go intronami zostaje całkowicie usunięty z transkryptu; alternatywny wybór miejsca splicingowego 5' (donora) (A5SS) oraz alternatywny wybór miejsca splicingowego 3' (akceptora) (A3SS), gdy na dowolnym końcu eksonu obecnych jest dwa lub więcej miejsc splicingowych; retencję intronów (RI), gdy intron zostaje zachowany w dojrzałym transkrypcie mRNA, oraz wzajemne wykluczanie eksonów (MXE), w którym w danym czasie może zostać zachowany tylko jeden z dwóch dostępnych eksonów2,3. Alternatywna poliadenylacja (APA) również odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów, wykorzystując alternatywne miejsca poli(A) do generowania wielu izoform mRNA z pojedynczego transkryptu4. Większość miejsc poliadenylacji (pAs) znajduje się w 3' niekodującej regionie (3' UTRs), co prowadzi do powstania izoform mRNA o różnej długości 3' UTR. Ponieważ 3' UTR jest centralnym ośrodkiem rozpoznawania elementów regulacyjnych, różna długość 3' UTR może wpływać na lokalizację, stabilność i translację mRNA5. Istnieje klasa testów sekwencjonowania końców 3', zoptymalizowanych pod kątem wykrywania APA, które różnią się szczegółami protokołu6. Opisany tutaj potok przetwarzania danych został zaprojektowany dla PolyA-seq, ale może zostać dostosowany do innych protokołów zgodnie z opisem.
W niniejszym badaniu przedstawiamy potok metod analizy różnicowej eksonów7,8 (Rysunek 1), które można podzielić na dwie szerokie kategorie: metody oparte na eksonach (DEXSeq9, diffSplice10) oraz metody oparte na zdarzeniach (replicate Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11). Metody oparte na eksonach porównują krotność zmiany (fold change) poszczególnych eksonów między warunkami z miarą ogólnej krotności zmiany genu, aby zidentyfikować różnicowo wyrażone wykorzystanie eksonów, a następnie na tej podstawie obliczają miarę aktywności AS na poziomie genu. Metody oparte na zdarzeniach wykorzystują odczyty z połączeń ekson-intron do wykrywania i klasyfikowania specyficznych zdarzeń splicingowych, takich jak pominięcie eksonu lub retencja intronów, oraz rozróżniają te typy AS w wynikach3. W ten sposób metody te zapewniają komplementarne spojrzenie dla pełnej analizy AS12,13. Do badania wybraliśmy DEXSeq (oparty na pakiecie DGE DESeq214) oraz diffSplice (oparty na pakiecie DGE Limma10), ponieważ należą one do najczęściej stosowanych pakietów w analizie różnicowego splicingu. rMATS wybrano jako popularną metodę analizy opartej na zdarzeniach. Inną popularną metodą opartą na zdarzeniach jest MISO (Mixture of Isoforms)1. W przypadku APA dostosowaliśmy podejście oparte na eksonach.
<img alt="Schemat procesu analizy alternatywnego splicingu/poliadenylacji, RNA-Seq, przetwarzanie danych, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Potok analizy. Schemat blokowy kroków wykorzystanych w analizie. Kroki obejmują: pozyskanie danych, przeprowadzenie kontroli jakości i mapowanie odczytów, a następnie zliczanie odczytów z wykorzystaniem adnotacji dla znanych egzonów, intronów i miejsc pA, filtrowanie w celu usunięcia niskich wartości zliczeń oraz normalizację. Dane PolyA-seq zostały przeanalizowane pod kątem alternatywnych miejsc pA przy użyciu metod diffSplice/DEXSeq, dane bulk RNA-Seq przeanalizowano pod kątem alternatywnego splicingu na poziomie egzonów metodami diffSplice/DEXseq, a zdarzenia AS przeanalizowano za pomocą rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Dane RNA-seq wykorzystane w niniejszym badaniu zostały pobrane z bazy Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Wykorzystano dane RNA-seq myszy z tego badania, obejmujące dwie grupy warunków: typ dziki (WT) oraz knockout Muscleblind-like type 1 (Mbnl1 KO), z trzema powtórzeniami dla każdej z grup. Aby zaprezentować analizę różnicowego wykorzystania miejsc poliadenylacji, pozyskano dane PolyA-seq z fibroblastów embrionalnych myszy (MEFs) (numer dostępu GEO GSE60487)16. Dane te obejmują cztery grupy warunków: typ dziki (WT), podwójny knockout Muscleblind-like type 1/type 2 (Mbnl1/2 DKO), Mbnl1/2 DKO z wyciszeniem Mbnl3 (KD) oraz Mbnl1/2 DKO z kontrolą Mbnl3 (Ctrl). Każda grupa warunków składa się z dwóch powtórzeń.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Numer akcesyjny GEO</td>
			<td>Numer serii SRA</td>
			<td>Nazwa próbki</td>
			<td>Warunki</td>
			<td>Powtórzyć</td>
			<td>Tkanka</td>
			<td>Sekwencjonowanie</td>
			<td>Długość odczytu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq)</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_grasica_1</td>
			<td>knockout genu Mbnl1</td>
			<td>Powtórzenie 1</td>
			<td>Grasica</td>
			<td>Parne końce</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Gruczoł żylny_2</td>
			<td>Nokaut Mbnl1</td>
			<td>Powtórzenie 2</td>
			<td>Grasica</td>
			<td>odczyty parzyste</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Nokaut genu Mbnl1</td>
			<td>Powtórzenie 3</td>
			<td>grasica</td>
			<td>Odczyty parzyste</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Typ dziki</td>
			<td>Powtórzenie 1</td>
			<td>grasica</td>
			<td>Odczyty parzyste</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_grasica_2</td>
			<td>Typ dziki</td>
			<td>Powtórzenie 2</td>
			<td>grasica</td>
			<td>Odczyty parzyste</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Typ dziki</td>
			<td>Powtórzenie 3</td>
			<td>grasica</td>
			<td>Odczyty parzyste</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Typ dziki (WT)</td>
			<td>Powtórzenie 1</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEF)</td>
			<td>Jednostronny</td>
			<td>40 pz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Typ dziki (WT)</td>
			<td>Powtórzenie 2</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEF)</td>
			<td>Jednokońcowy</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>podwójny knockout (DKO) Mbnl 1/2</td>
			<td>Powtórzenie 1</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEFs)</td>
			<td>Jednostronne</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>podwójny knockout (DKO) Mbnl 1/2</td>
			<td>Powtórzenie 2</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEF)</td>
			<td>Jednoniciowy</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Podwójny nokaut Mbnl 1/2 z siRNA dla Mbnl 3 (KD)</td>
			<td>Powtórzenie 1</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEF)</td>
			<td>Jednostronny</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Podwójny knockout Mbnl 1/2 z siRNA przeciwko Mbnl 3 (KD)</td>
			<td>Powtórzenie 2</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEFs)</td>
			<td>Jednostronne</td>
			<td>36 pz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Podwójny nokaut Mbnl 1/2 z niecelującym siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Powtórzenie 1</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEFs)</td>
			<td>Jednostronny</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Podwójny knockout Mbnl 1/2 z zastosowaniem niecelującego siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Powtórzenie 2</td>
			<td>embrionalne fibroblasty mysie (MEFs)</td>
			<td>Jednostronna</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Podsumowanie zestawów danych RNA-Seq i PolyA-seq wykorzystanych w analizie.

<table><tbody><tr><td>Nie ma znaczenia dla badań</td><td></td><td></td><td></td> obliczeniowych</tr></tbody></table>

identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych rna

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Oprócz typowej analizy RNA-Seq do pomiaru różnicowej ekspresji genów (DGE) w warunkach eksperymentalnych/biologicznych, dane sekwencyjne RNA mogą być również wykorzystane do zbadania innych złożonych mechanizmów regulacyjnych na poziomie eksonu. Alternatywny splicing i poliadenylacja odgrywają kluczową rolę w funkcjonalnej różnorodności genu, generując różne izoformy w celu regulacji ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym, a ograniczenie analiz do całego poziomu genu może pominąć tę ważną warstwę regulacyjną. W tym miejscu demonstrujemy szczegółowe analizy krok po kroku w celu identyfikacji i wizualizacji różnicowego wykorzystania eksonów i miejsc poliadenylacji w różnych warunkach, przy użyciu Bioconductor oraz innych pakietów i funkcji, w tym DEXSeq, diffSplice z pakietu Limma i rMATS.

Po przeprowadzeniu powyższego procesu krok po kroku, wyniki analizy AS oraz APA oraz reprezentatywne rezultaty są przedstawione w formie tabel i wykresów danych, wygenerowanych w następujący sposób.
AS: 
Głównym wynikiem analizy AS (Supplementary Table 1 dla diffSplice; Table 2 dla DEXSeq) jest lista eksonów wykazujących różnicowe wykorzystanie w różnych warunkach oraz lista genów wykazujących istotną ogólną aktywność splicingu jednego lub ...

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Protokół ten zapewnia kompleksowe zrozumienie izoform genów generowanych przez alternatywny splicing i poliadenylację, zapewniając krok po kroku przepływ pracy w celu identyfikacji zróżnicowanych miejsc splicingu, eksonów o zróżnicowanej ekspresji i poli(A)miejsc. Główną zaletą tego protokołu jest to, że ocenia on zarówno metody oparte na eksonach, jak i oparte na zdarzeniach do badania alternatywnego splicingu. Stosuje również metodę opartą na eksonach do badania alternatywnej poliadenylacji.Dostarczono pliki języka R Markdown, które zawierają kody i uwagi dotyczące analizy AS i AP. Wskazane byłoby wykonanie kroków w pliku R Markdown i dokładne dotarcie do notatki dla każdego kroku. Aby zidentyfikować łączenie różnicowe przy użyciu diffSplice z limma, postępuj zgodnie z plikiem notesu języka R.Przygotuj pliki wejściowe zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Upewnij się, że kroki od pierwszego do trzeciego w manuskrypcie zostały wykonane sekwencyjnie, aby przygotować pliki wejściowe, zanim przejdziesz dalej. Zacznij od załadowania niezbędnych bibliotek.Aby przeprowadzić filtrowanie niespecyficzne, najpierw wyodrębnij macierz uzyskanych wcześniej liczb odczytów i utwórz listę cech za pomocą funkcji DGEList z pakietu edgeR, gdzie wiersze reprezentują geny, a kolumny reprezentują próbki. Następnie przekształć dane ze skali surowej na liczbę na milion przy użyciu funkcji CPM z pakietu edgeR i zachowaj eksony z liczbami większymi niż ustawiony próg. Ten zestaw danych zawiera sześć próbek.W związku z tym CPM ustala się na więcej niż jedną i co najmniej trzy próbki z sześciu. Znormalizuj zliczenia w próbkach za pomocą funkcji calcNormFactors z pakietu edgeR przy użyciu średniej przyciętej wartości M. Ta funkcja obliczy współczynniki skalowania w celu dostosowania rozmiarów bibliotek.Użyj wcześniej wygenerowanej tabeli próbek, aby utworzyć macierz projektową w celu zdefiniowania warunków eksperymentalnych dla każdej próbki. Uruchom funkcję voom pakietu limma, aby przetworzyć dane sekwencjonowania RNA w celu oszacowania wariancji. Ta funkcja wygeneruje precyzyjne wagi w celu skorygowania szumu liczby Poissona i przekształci liczbę poziomów eksonów w logarytm dwóch zliczeń na milion lub logCPM.Uruchom funkcję lmfit, aby dopasować modele liniowe do danych wyrażeń dla każdego eksonu. Następnie uruchom funkcję eBayes, aby obliczyć statystyki empiryczne dla dopasowanego modelu w celu wykrycia różnicowego wyrażenia eksonów. Zdefiniuj macierz kontrastu dla interesujących porównań eksperymentalnych.Użyj funkcji dopasowania kontrastów, aby uzyskać współczynniki i błędy standardowe dla każdej pary porównań. Uruchom diffSplice na dopasowanym modelu, aby przetestować różnice w użyciu eksonów genów między typem dzikim a nokautem.Przeglądaj najwyżej oceniane wyniki za pomocą funkcji topSplice, gdzie test równy t daje ranking eksonów AS, a test równy simes daje ranking genów. Uruchom funkcję plotSplice, aby wykreślić wyniki. Umieszczając interesujący gen w argumencie ID genu, czerwone punkty pokazują eksony o zróżnicowanej ekspresji.Wygeneruj wykres wulkanu za pomocą pakietu bioprzewodników EnhancedVolcano, aby pokazać eksony o zróżnicowanej ekspresji. Aby użyć narzędzia rMATS, upewnij się, że najnowsza wersja programu rMATS w wersji 4.1.1 jest zainstalowana przy użyciu narzędzia conda lub GitHub w katalogu roboczym. Przechodzi do folderu zawierającego pliki bam uzyskane po mapowaniu.Przygotuj pliki tekstowe zgodnie z wymaganiami rMATS dla dwóch warunków kopiowania nazwy plików bam i ich ścieżki oddzielonych przecinkiem. Uruchom rmas. py przy użyciu dwóch wygenerowanych wejściowych plików tekstowych opisujących ścieżkę do plików BAM i adnotację.Plik gtf uzyskany wcześniej. W ten sposób generowany jest folder wyjściowy rmats_out zawierający pliki tekstowe opisujące statystyki, w tym wartości P i poziomy włączenia, dla każdego zdarzenia splicingu z osobna. Użyj masera pakietu bioprzewodników, aby zapoznać się z wynikami rMATS.Załaduj pliki tekstowe złącza i eksonów z rozszerzeniem JCEC do obiektu maser i uwzględnij co najmniej pięć średnich odczytów na zdarzenie splicing w celu przefiltrowania wyniku na podstawie zasięgu. Aby zwizualizować wyniki rMATS, najpierw uruchom funkcję topEvents z pakietu masera, wybierając znaczące zdarzenia splicingu przy współczynniku fałszywych wykryć wynoszącym 10% i minimalnej 10% zmianie procentu splicingu lub PSI. Sprawdź zdarzenia genetyczne dla poszczególnych genów będących przedmiotem zainteresowania i wykreśl wartości PSI dla każdego zdarzenia splicingu tego genu.Wygeneruj wykres wulkanu, określając typ zdarzenia. Użyj wyników zdarzeń splicingu uzyskanych za pomocą rMATS w postaci plików tekstowych, aby wygenerować wykresy sashimi za pomocą pakietu rmats2sashimiplot. Wykres sashimi pokazuje pominięte zdarzenie eksonu w genie Wnk1.Każdy rząd reprezentuje próbkę sekwencyjną RNA, trzy powtórzenia typu dzikiego i nokaut Mbnl1. Wysokość pokazuje pokrycie odczytu w obr./min, a łuki łączące przedstawiają odczyty złączy w poprzek eksonów. Dolna część przedstawia alternatywne izoformy modelu genów z adnotacjami.Znaczną zmianę krotności i silne dowody statystyczne rzeczywistych różnic można zaobserwować w genach znajdujących się w lewym lub prawym górnym kwadrancie wykresów wulkanicznych uzyskanych za pomocą dyfuzji Splice i DEXSeq. Stwierdzono, że ekson kasetowy różni się w zależności od różnych warunków dla genu Wnk1. Wykres różnicowego użycia eksonów wykazał dowody na różnicowy splicing w pięciu miejscach eksonów w pobliżu Wnk1.6.45, przy czym eksony zaznaczone na różowo prawdopodobnie zostaną splącone w próbkach nokautujących Mbnl1 w porównaniu z typem dzikim.Wykres wulkaniczny genów, które są alternatywnie splecione, pomógł odróżnić geny, które zostały wykluczone z typu dzikiego, od tych, które zostały włączone do typu dzikiego. Typy zdarzeń splicingu SE, A5SS, A3SS, MXE i RI zostały zwizualizowane za pomocą wykresów sashimi najważniejszych genów tych zdarzeń. Zróżnicowaną aktywność APA w trzech pierwotnych, nieulegających translacji regionach genów zaobserwowano za pomocą wykresów wulkanicznych.Znacząco zróżnicowane wyniki wykorzystania lokalizacji PA uzyskane z różnych potoków zostały zobrazowane za pomocą wykresu zdarzeń. Znaczące dystalne do proksymalnego przesunięcie miejsca PA w podwójnych nokautach można zaobserwować zarówno w genach FOSL1, jak i Papola. Średnie pokrycie w regionach flankujących zakotwiczonych w znanych miejscach cięcia PA na poziomie całego genomu określono za pomocą wykresu diagnostycznego.Upewnij się, że parametry, takie jak informacje o trans i zezwalaj na wielokrotne nakładanie się, są poprawnie używane podczas generowania metryk zliczania. Dopasowywanie modelu liniowego i generowanie par kontrastowych jest ważne dla prawidłowego porównania. W przypadku rMATS upewnij się, że wszystkie parametry są ustawione poprawnie zgodnie z danymi przed uruchomieniem polecenia.Geny uzyskane w wyniku zróżnicowanej aktywności splicingu można wykorzystać do przeprowadzenia analizy wzbogacenia zestawu genów. Inne narzędzie o nazwie MISO może być wykorzystane do dalszej analizy opartej na zdarzeniach.

identification-alternative-splicing-polyadenylation-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Ten raport opisuje metodę bioinżynierii do projektowania i konstruowania nowych sztucznych czynników splicingu (ASF), które specyficznie modulują splicing docelowych genów w komórkach ssaków. Metoda ta może być dalej rozszerzana w celu inżynierii różnych sztucznych czynników w celu manipulowania innymi aspektami metabolizmu RNA.

Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

W niniejszym materiale opisujemy sposób identyfikacji fazy cyklu rozrodczego myszy (proestrus, estrus, metestrus lub diestrus) poprzez prosty, nieinwazyjny pobór oraz ocenę cytologiczną wymazów z pochwy. Opisujemy również, w jaki sposób cytologia pochwy odzwierciedla poziomy krążących hormonów, które warunkują przejście przez poszczególne etapy cyklu rozrodczego myszy.

Wykonanie płukania pochwy, barwienia fioletem krystalicznym i cytologicznej oceny pochwy w celu identyfikacji fazy cyklu rujowego u myszy

Poznaj metody bioinformatyczne do analizy alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych RNA-seq. Protokół wykorzystuje podejścia oparte na eksonach i zdarzeniach do identyfikacji różnicowych miejsc splicingowych i użycia poli(A).

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Przeglądaj więcej filmów