Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA
24 czerwca 2021
Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.
Protokół ten zapewnia kompleksowe zrozumienie izoform genów generowanych przez alternatywny splicing i poliadenylację, zapewniając krok po kroku przepływ pracy w celu identyfikacji zróżnicowanych miejsc splicingu, eksonów o zróżnicowanej ekspresji i poli(A)miejsc. Główną zaletą tego protokołu jest to, że ocenia on zarówno metody oparte na eksonach, jak i oparte na zdarzeniach do badania alternatywnego splicingu. Stosuje również metodę opartą na eksonach do badania alternatywnej poliadenylacji.
Dostarczono pliki języka R Markdown, które zawierają kody i uwagi dotyczące analizy AS i AP. Wskazane byłoby wykonanie kroków w pliku R Markdown i dokładne dotarcie do notatki dla każdego kroku. Aby zidentyfikować łączenie różnicowe przy użyciu diffSplice z limma, postępuj zgodnie z plikiem notesu języka R.
Przygotuj pliki wejściowe zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Upewnij się, że kroki od pierwszego do trzeciego w manuskrypcie zostały wykonane sekwencyjnie, aby przygotować pliki wejściowe, zanim przejdziesz dalej. Zacznij od załadowania niezbędnych bibliotek.
Aby przeprowadzić filtrowanie niespecyficzne, najpierw wyodrębnij macierz uzyskanych wcześniej liczb odczytów i utwórz listę cech za pomocą funkcji DGEList z pakietu edgeR, gdzie wiersze reprezentują geny, a kolumny reprezentują próbki. Następnie przekształć dane ze skali surowej na liczbę na milion przy użyciu funkcji CPM z pakietu edgeR i zachowaj eksony z liczbami większymi niż ustawiony próg. Ten zestaw danych zawiera sześć próbek.
W związku z tym CPM ustala się na więcej niż jedną i co najmniej trzy próbki z sześciu. Znormalizuj zliczenia w próbkach za pomocą funkcji calcNormFactors z pakietu edgeR przy użyciu średniej przyciętej wartości M. Ta funkcja obliczy współczynniki skalowania w celu dostosowania rozmiarów bibliotek.
Użyj wcześniej wygenerowanej tabeli próbek, aby utworzyć macierz projektową w celu zdefiniowania warunków eksperymentalnych dla każdej próbki. Uruchom funkcję voom pakietu limma, aby przetworzyć dane sekwencjonowania RNA w celu oszacowania wariancji. Ta funkcja wygeneruje precyzyjne wagi w celu skorygowania szumu liczby Poissona i przekształci liczbę poziomów eksonów w logarytm dwóch zliczeń na milion lub logCPM.
Uruchom funkcję lmfit, aby dopasować modele liniowe do danych wyrażeń dla każdego eksonu. Następnie uruchom funkcję eBayes, aby obliczyć statystyki empiryczne dla dopasowanego modelu w celu wykrycia różnicowego wyrażenia eksonów. Zdefiniuj macierz kontrastu dla interesujących porównań eksperymentalnych.
Użyj funkcji dopasowania kontrastów, aby uzyskać współczynniki i błędy standardowe dla każdej pary porównań. Uruchom diffSplice na dopasowanym modelu, aby przetestować różnice w użyciu eksonów genów między typem dzikim a nokautem.
Przeglądaj najwyżej oceniane wyniki za pomocą funkcji topSplice, gdzie test równy t daje ranking eksonów AS, a test równy simes daje ranking genów. Uruchom funkcję plotSplice, aby wykreślić wyniki. Umieszczając interesujący gen w argumencie ID genu, czerwone punkty pokazują eksony o zróżnicowanej ekspresji.
Wygeneruj wykres wulkanu za pomocą pakietu bioprzewodników EnhancedVolcano, aby pokazać eksony o zróżnicowanej ekspresji. Aby użyć narzędzia rMATS, upewnij się, że najnowsza wersja programu rMATS w wersji 4.1.1 jest zainstalowana przy użyciu narzędzia conda lub GitHub w katalogu roboczym. Przechodzi do folderu zawierającego pliki bam uzyskane po mapowaniu.
Przygotuj pliki tekstowe zgodnie z wymaganiami rMATS dla dwóch warunków kopiowania nazwy plików bam i ich ścieżki oddzielonych przecinkiem. Uruchom rmas. py przy użyciu dwóch wygenerowanych wejściowych plików tekstowych opisujących ścieżkę do plików BAM i adnotację.
Plik gtf uzyskany wcześniej. W ten sposób generowany jest folder wyjściowy rmats_out zawierający pliki tekstowe opisujące statystyki, w tym wartości P i poziomy włączenia, dla każdego zdarzenia splicingu z osobna. Użyj masera pakietu bioprzewodników, aby zapoznać się z wynikami rMATS.
Załaduj pliki tekstowe złącza i eksonów z rozszerzeniem JCEC do obiektu maser i uwzględnij co najmniej pięć średnich odczytów na zdarzenie splicing w celu przefiltrowania wyniku na podstawie zasięgu. Aby zwizualizować wyniki rMATS, najpierw uruchom funkcję topEvents z pakietu masera, wybierając znaczące zdarzenia splicingu przy współczynniku fałszywych wykryć wynoszącym 10% i minimalnej 10% zmianie procentu splicingu lub PSI. Sprawdź zdarzenia genetyczne dla poszczególnych genów będących przedmiotem zainteresowania i wykreśl wartości PSI dla każdego zdarzenia splicingu tego genu.
Wygeneruj wykres wulkanu, określając typ zdarzenia. Użyj wyników zdarzeń splicingu uzyskanych za pomocą rMATS w postaci plików tekstowych, aby wygenerować wykresy sashimi za pomocą pakietu rmats2sashimiplot. Wykres sashimi pokazuje pominięte zdarzenie eksonu w genie Wnk1.
Każdy rząd reprezentuje próbkę sekwencyjną RNA, trzy powtórzenia typu dzikiego i nokaut Mbnl1. Wysokość pokazuje pokrycie odczytu w obr./min, a łuki łączące przedstawiają odczyty złączy w poprzek eksonów. Dolna część przedstawia alternatywne izoformy modelu genów z adnotacjami.
Znaczną zmianę krotności i silne dowody statystyczne rzeczywistych różnic można zaobserwować w genach znajdujących się w lewym lub prawym górnym kwadrancie wykresów wulkanicznych uzyskanych za pomocą dyfuzji Splice i DEXSeq. Stwierdzono, że ekson kasetowy różni się w zależności od różnych warunków dla genu Wnk1. Wykres różnicowego użycia eksonów wykazał dowody na różnicowy splicing w pięciu miejscach eksonów w pobliżu Wnk1.6.45, przy czym eksony zaznaczone na różowo prawdopodobnie zostaną splącone w próbkach nokautujących Mbnl1 w porównaniu z typem dzikim.
Wykres wulkaniczny genów, które są alternatywnie splecione, pomógł odróżnić geny, które zostały wykluczone z typu dzikiego, od tych, które zostały włączone do typu dzikiego. Typy zdarzeń splicingu SE, A5SS, A3SS, MXE i RI zostały zwizualizowane za pomocą wykresów sashimi najważniejszych genów tych zdarzeń. Zróżnicowaną aktywność APA w trzech pierwotnych, nieulegających translacji regionach genów zaobserwowano za pomocą wykresów wulkanicznych.
Znacząco zróżnicowane wyniki wykorzystania lokalizacji PA uzyskane z różnych potoków zostały zobrazowane za pomocą wykresu zdarzeń. Znaczące dystalne do proksymalnego przesunięcie miejsca PA w podwójnych nokautach można zaobserwować zarówno w genach FOSL1, jak i Papola. Średnie pokrycie w regionach flankujących zakotwiczonych w znanych miejscach cięcia PA na poziomie całego genomu określono za pomocą wykresu diagnostycznego.
Upewnij się, że parametry, takie jak informacje o trans i zezwalaj na wielokrotne nakładanie się, są poprawnie używane podczas generowania metryk zliczania. Dopasowywanie modelu liniowego i generowanie par kontrastowych jest ważne dla prawidłowego porównania. W przypadku rMATS upewnij się, że wszystkie parametry są ustawione poprawnie zgodnie z danymi przed uruchomieniem polecenia.
Geny uzyskane w wyniku zróżnicowanej aktywności splicingu można wykorzystać do przeprowadzenia analizy wzbogacenia zestawu genów. Inne narzędzie o nazwie MISO może być wykorzystane do dalszej analizy opartej na zdarzeniach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy złożoności alternatywnego splatania (AS) i alternatywnej poliadenylacji (APA) w regulacji ekspresji genów. Korzystając z protokołów bioinformatycznych do analizy danych sekwencjonowania RNA, badanie podkreśla zalety zarówno metod opartych na eksonach, jak i na zdarzeniach, w wykrywaniu i wizualizowaniu alternatywnego splatania i poliadenylacji w różnych warunkach eksperymentalnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Alternatywne splatanie
- Alternatywna poliadenylacja
- Bioinformatyka
Tło
- Wzrost różnorodności izoform transkryptów
- Wpływ na ekspresję genów
- Postępy technologiczne w sekwencjonowaniu RNA
Zastosowane metody
- Bioinformatyczne protokoły do analizy RNA-seq
- Metody wykrywania oparte na eksonach i zdarzeniach
- Wizualizacja miejsc splatania i zdarzeń poliadenylacji
Główne wyniki
- Identyfikacja różnicowych miejsc splatania i użycia miejsc poli(A)
- Dowód alternatywnego splatania i poliadenylacji w różnych warunkach eksperymentalnych
- Udana wizualizacja wyników poprzez wykresy i wyjścia bioinformatyczne
Wnioski
- Wyniki wskazują na znaczną zmienność AS i APA w różnych warunkach.
- Praca ta przyczynia się do naszego zrozumienia różnorodności transkryptów i jej implikacji dla badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Alternative splicing and polyadenylation analysis enables biopharma R&D teams to resolve isoform-specific regulatory mechanisms that are obscured at the gene-expression level. This mechanistic de-risking supports target validation by clarifying functional consequences of genetic perturbations and improving predictive confidence in lead identification. Integrating exon- and event-based RNA-seq workflows enhances assay readiness for downstream screening and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by identifying differential exon usage and polyadenylation site shifts that reflect isoform-specific gene regulation.
- Operational Value: Apply exon-based methods to study alternative polyadenylation, enabling unified analysis of splicing and 3' end processing from a single RNA-seq dataset.
- Predictive Value: Detect cassette exon variations and distal-to-proximal polyadenylation shifts that inform functional target de-risking and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generate quantitative exon-level and splicing-event readouts (e.g., percent spliced in, inclusion levels) suitable for high-resolution compound screening.
- Operational Value: Normalize and filter count data using edgeR and limma workflows to ensure reproducibility across replicates and conditions.
- Assay Readiness: Produce visualization-ready outputs such as volcano plots, sashimi plots, and event plots for cross-functional review of splicing and polyadenylation dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Link differential splicing and polyadenylation events to disease-relevant genes (e.g., Wnk1, FOSL1) observed in knockout models, supporting mechanistic continuity.
- Operational Value: Use rMATS and maser packages to filter significant splicing events by false discovery rate and percent spliced-in change, enabling robust biomarker candidate selection.
- Translational Value: Visualize isoform-specific expression changes via sashimi plots to support preclinical validation of target engagement and mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing isoform-resolution data that informs target validation, assay development, and mechanistic follow-up in lead optimization.
- Discovery Biology: Test hypotheses about isoform regulation by comparing exon usage and polyadenylation site distribution across genetic or pharmacological conditions.
- Screening: Generate standardized, quantitative exon and splicing event metrics that support reliable compound effect assessment in phenotypic or target-based assays.
- Analytics: Derive empirical statistics, p-values, and effect sizes from linear modeling (voom, lmfit, eBayes) and event-based tools (rMATS, diffSplice) to compare conditions objectively.
- Translational Research: Connect splicing and polyadenylation changes to gene-level phenotypes in preclinical models, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Deploy the R Markdown-based protocol as a reusable bioinformatics capability across projects studying genetic models, drug treatments, or disease tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduce mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific regulatory layers missed in conventional gene-level differential expression analysis.
- Operational Value: Ensure reproducibility through standardized normalization (CPM, calcNormFactors), filtering thresholds, and validated Bioconductor packages (limma, edgeR, rMATS, maser).
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by providing early evidence of isoform-level target modulation, reducing late-stage biological attrition risk.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization of targets based on concordant splicing and polyadenylation evidence across orthogonal methods (exon-based and event-based).
Implementation Considerations
- Requires bioinformatics expertise in RNA-seq analysis, linear modeling, and splicing event interpretation using R/Bioconductor.
- Dependent on aligned BAM files, gene annotation (GTF), and count matrices generated from standard RNA-seq preprocessing.
- Necessitates cross-team standardization of filtering criteria (e.g., CPM >1 in ≥3 samples) and statistical thresholds (FDR <0.1, ΔPSI ≥10%) for reproducible results.
- Involves adaptation of parameters (e.g., overlap settings, transpecific information) when applying count metrics to alternative splicing and polyadenylation pipelines.
- Includes practical limitations such as the need for sufficient sequencing depth to detect low-abundance isoforms and the importance of validating computational predictions with orthogonal methods (e.g., PCR, long-read sequencing).
