Name: Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych, która zmniejsza ryzyko urazu plamki żółtej dzięki plazminogenowi i OCT. Technika poprawia precyzję chirurgiczną oraz stabilność przeszczepu w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapore (H17/01/a0/013), grant NUS Start-up NUHSRO/2016/100/SU/01, grant NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) oraz National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapore (NRF-CRP21-2018-0008) do X.S., Hong Leong Endowed Professorship funds dla G.E.H. i B.V.S. Chcielibyśmy podziękować zespołowi weterynaryjnemu z Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapur) za zapewnienie wsparcia w przygotowaniu do operacji NHP i obserwacji zwierząt. Chcielibyśmy wyrazić nasze uznanie dla Jill Teo i kolegów z C. Zeiss Meditec Singapore za wsparcie techniczne dla OPMI-Lumera 700 ze zintegrowanym śródoperacyjnym urządzeniem OCT.

Boris Stanzel posiada amerykański 9980851 patentowy na instrument (skrobak RPE) używany w tym badaniu. Honorowi mówcy od C. Zeiss Meditec i Geuder dla Borisa Stanzela. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Istnieją dwa główne podejścia oceniane pod kątem podplamkowego przeszczepu RPE - wstrzyknięcie zawiesiny RPE i przeszczepienie jednowarstwowego przeszczepu RPE. Szczegółowe porównanie tych dwóch metod wykracza poza zakres tego manuskryptu. Jednak przeszczepienie jednowarstwowego przeszczepu RPE może być korzystne, ponieważ komórki RPE są bardziej zorganizowane w monowarstwie niż w zawiesinie. Komórki RPE w przeszczepie są zorganizowane w zlewającą się monowarstwę, która przypomina organizację fizjologicznej warstwy komórek RPE i umożliwia przeszczepionym komórkom RPE wykonywanie ich funkcji fizjologicznych. Umożliwia to bardziej precyzyjne parametry dozowania w porównaniu z zawiesinami komórek, co ma duże znaczenie dla prac regulacyjnych i zwiększania skali przemysłowej.
Dostarczenie przeszczepu plastra RPE do przestrzeni podsiatkówkowej wymaga starannej manipulacji plamką żółtą i dokładnego wprowadzenia przeszczepu do przestrzeni podsiatkówkowej. Postęp technologiczny w mikrochirurgii, taki jak miOCT, oraz lepsze zrozumienie śródoperacyjnej dynamiki tkanki siatkówki skróciły krzywą uczenia się tej procedury. W tej dyskusji wyjaśnione zostaną przesłanki następujących aspektów: i) przedoperacyjne wstrzyknięcie plazminogenu; ii) stosowanie śródoperacyjnego miOCT; iii) zastosowanie niestandardowej kaniuli dwuotworowej 41 G, niskich ustawień IOP i PFCL do tworzenia pęcherzyków podsiatkówkowych; iv) zeskrobanie natywnej warstwy komórek RPE przed przeszczepieniem; v) stosowanie syrolimusa, triamcynolonu, doksycykliny i minocykliny w celu zmniejszenia immunogennego odrzucenia przeszczepu.
Przedoperacyjne zastrzyki plazminogenu uwalniają zrosty przydołkowe siatkówki W początkowych eksperymentach wyzwaniem było oderwanie dołka centralnego za pomocą pojedynczej fali płynu. Po ocenie za pomocą miOCT obrazy ujawniły obecność zewnętrznych zrostów siatkówki przydołkowej do natywnego RPE wraz z dowodami na uraz śródsiatkówkowy20. Te zrosty mogły prowadzić do pionowego rozszerzania się pęcherzyka, a nie do falowania płynu podsiatkówkowego rozchodzącego się po konturze siatkówki, powodując uraz dołka. Plazminogen jest nieaktywnym prekursorem plazminy, proteazy skierowanej przeciwko fibronektynie i lamininie. Okriplazmina jest bioinżynieryjnym wariantem ludzkiego plazminy, zatwierdzonym przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków (EMA) do leczenia objawowej trakcji szklistkowo-plamkowej ze współistniejącym otworem w plamce żółtej lub bez niej. Jednak doniesienia porejestracyjne dotyczące rozwoju torbielowatego obrzęku plamki żółtej po wstrzyknięciu okryplazminy sugerują bardziej rozległy wpływ enzymu na siatkówkę23.
Chociaż dokładne mechanizmy nie zostały zidentyfikowane, zasugerowano, że plazmina może osłabiać adhezję siatkówki poprzez degradację elementów macierzy międzyfotoreceptorowej odpowiedzialnych za adhezję fotoreceptora-RPE24. W tym protokole oczy NHP były leczone plazminogenem doszklistkowym na 1 tydzień przed zabiegiem w celu uwolnienia zewnętrznych zrostów siatkówki przydołkowej. Przy założeniu, że adhezja fotoreceptor-RPE jest osłabiona, do odłączenia siatkówki neurosensorycznej, w tym dystalnego pierścienia przydołkowego, wymagana jest mniejsza siła, która zwykle opiera się fali płynu podsiatkówkowego20. W ten sposób siła wywierana podczas odwarstwiania pęcherzyka siatkówki powoduje rozszerzenie pęcherzyka w poprzek konturu siatkówki, a nie styczne rozciąganie siatkówki. Zmniejsza to ryzyko rozdarcia dołka środkowego. Należy jednak zauważyć, że wpływ plazminogenu na długoterminowe przeżycie przeszczepu nie był badany w tym protokole. Przyszłe badania powinny próbować określić ten efekt.
miOCT zapewnia anatomiczne informacje zwrotne, które kierują tworzeniem pęcherzyków podsiatkówkowych, implantacją przeszczepu i drenażem płynu podsiatkówkowego Śródoperacyjna, atraumatyczna manipulacja plamki żółtej jest kluczem do osiągnięcia dobrych wyników przeszczepu. Jednak zmiany mikrostrukturalne plamki żółtej związane z manipulacją nie zawsze muszą być widoczne pod mikroskopem operacyjnym. W takich procedurach miOCT jest ważnym narzędziem, które zapewnia w czasie rzeczywistym, trójwymiarowe, śródoperacyjne sprzężenie zwrotne struktury plamki żółtej. miOCT jest szczególnie przydatny podczas etapów odwarstwienia dołka, implantacji przeszczepu i drenażu płynu podsiatkówkowego za pomocą wymiany płyn-powietrze. Podczas odklejenia dołka miOCT może określić pionowe i poziome wymiary pęcherzyka. Mikropęknięcia dołka, które mogą nie być wyraźnie widoczne pod mikroskopem operacyjnym, można potwierdzić za pomocą miOCT (ryc. 3). Podczas implantacji przeszczepu obrazy miOCT pokazują lokalizację przeszczepu lub bliskość dołka środkowego przez często mniej przezroczystą, odklejoną siatkówkę. miOCT może również uwidocznić możliwe obszary zrostu siatkówki podczas trudnego procesu przeszczepu25. Wreszcie, w procesie drenażu płynu podsiatkówkowego, miOCT może niezawodnie kierować drenażem płynu podsiatkówkowego, aż do osiągnięcia pełnego kontaktu przeszczepu siatkówki z RPE.
Połączenie kaniuli dwuotworowej, niskich ustawień IOP i tamponady ciała szklistego PFCL synergistycznie zmniejsza uraz plamki żółtej podczas tworzenia pęcherzyków podsiatkówkowych Styczne rozciąganie siatkówki i turbulencje płynu mogą wystąpić podczas iniekcji BSS podsiatkówkowej w celu odwarstwienia dołka, co prowadzi do niepożądanych rozdarć dołka. Aby przeciwdziałać tym zjawiskom, wykazano, że istotne są takie czynniki, jak względne położenie i odległość od centrum dołka, w którym rozpoczyna się wstrzyknięcie, objętość i prędkość wstrzyknięcia, tamponada ciała szklistego, wybór instrumentacji podsiatkówkowej i IOP 20,26,27. Pęcherzyk podsiatkówkowy do odwarstwienia dołka powinien być umieszczony w miejscu odpowiednio oddalonym od dołka, ponieważ rozciąganie siatkówki może być największe w miejscu inicjacji pęcherzyka27. Ciśnienie wewnątrzgałkowe powinno być również utrzymywane na niskim poziomie przez cały okres tworzenia pęcherzyka podsiatkówkowego. Gdy ciśnienie wewnątrzgałkowe oka jest wysokie, obserwuje się większy pionowy wzrost rozmiaru pęcherzyka, a nie rozszerzanie się wzdłuż konturu siatkówki, podczas gdy pęcherzyki są płytsze przy niższych ciśnieniach20. Co więcej, chociaż wstrzyknięcie doszklistkowe 50 μl skutecznie podwoi ciśnienie wewnątrzgałkowe u ludzi28, biorąc pod uwagę krótszą długość oczu u NHP, wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas wstrzyknięcia podsiatkówkowego będzie prawdopodobnie wyższy i szybszy niż u ludzi. Podczas gdy większość urządzeń do witrektomii dostosowuje się do wahań ciśnienia wewnątrzgałkowego, regulacja nie jest procesem jednoczesnym, ale raczej reaktywnym, który zachodzi w miarę postępu wstrzykiwania podsiatkówkowego. W związku z tym im wyższe ciśnienie wewnątrzgałkowe, tym większe ryzyko nadmiernego rozciągnięcia siatkówki i wynikającego z tego urazu dołka środkowego. Dlatego ważne jest, aby utrzymać stabilny niski poziom ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas iniekcji podsiatkówkowej.
Do wstrzykiwań podsiatkówkowych zaleca się komercyjną kaniulę podsiatkówkową 20/41 G (DORC) lub wykonaną na zamówienie kaniulę podsiatkówkową 25/41 G z podwójnym otworem. Kaniula umożliwia wydostanie się płynu z jamy ciała szklistego w zamian za BSS wstrzyknięty do przestrzeni podsiatkówkowej. Zapewnia to "jednoczesną" regulację ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas iniekcji podsiatkówkowej. Schemat kaniuli dwuotworowej pokazano na rysunku 2. Wreszcie, PFCL jest stosowany w celu zmniejszenia ryzyka rozdarcia dołka 20,26,27. Ponieważ PFCL, takie jak oktalina, mają wyższy ciężar właściwy, wywierają siłę skierowaną w dół na siatkówkę podczas odwarstwienia dołka29. To dodatkowo stabilizuje proces tworzenia pęcherzyka odwarstwienia dołka i zwiększa rozszerzanie się pęcherzyka wzdłuż konturu siatkówki. Technika ta została z powodzeniem zastosowana do podsiatkówkowego wstrzykiwania rtPA w przypadku masywnego krwotoku podplamkowego z powodu nAMD30.
Przedtransplantacyjne usunięcie natywnego RPE pozwala na odtworzenie kompleksu RPE-fotoreceptor Gospodarz RPE powinien zostać usunięty przed przeszczepem przeszczepu. Dzieje się tak, ponieważ odbudowa kompleksu RPE-fotoreceptor jest niezbędna, aby przeszczep RPE mógł pełnić swoje fizjologiczne funkcje wspierania fotoreceptorów21. Gospodarz RPE, jeśli nie zostanie usunięty, może stanowić mechaniczną barierę, która uniemożliwia odbudowę tego kompleksu. Można go usunąć poprzez podanie substancji chemicznych toksycznych dla RPE lub za pomocą fizycznych środków usuwania. Metody usuwania chemicznego obejmują ogólnoustrojowe lub podsiatkówkowe podawanie jodanu sodu31,32. Ponieważ jodan sodu powoduje rozległą degenerację fotoreceptorów, komórek RPE i naczyniówki włosowatej po podaniu, jego toksyczność siatkówkowa i ogólnoustrojowa wyklucza jego zastosowanie w badaniach na ludziach32,33. W związku z tym preferowane są fizyczne techniki śródoperacyjne. Opracowano różne metody fizyczne. W przypadku stosowania metod fizycznych ważne jest, aby membrana Brucha pozostała nieuszkodzona. Wiele badań in vitro wykazało zależność przeżywalności przeszczepu RPE od nienaruszonej błony Brucha 34,35,36.
Próby hydraulicznego oczyszczania wiązały się z pęknięciami błony Brucha, zwiększonym tempem rozwoju błony nasiatkówkowej i proliferacyjną witreoretinopatią, co skutkowało trakcyjnym odwarstwieniem siatkówki37. Szpatułka z pyłem diamentowym zaproponowana do oczyszczenia RPE doprowadziła również do pęknięć błony Brucha, co spowodowało proliferację komórkową z naczyniówki do przestrzeni podsiatkówkowej38. Co ciekawe, wykonany na zamówienie instrument z wysuwaną pętlą może usunąć leżące nad nim RPE z zachowaniem błony Brucha w oczach królików i świń11,39. Usunięcie leżącego u podstaw RPE jest również przydatne do tworzenia modeli zwierzęcych z RPE i zewnętrznym zanikiem siatkówki, podobnie jak w przypadku zaawansowanej zanikowej postaci AMD. Kiedy ogniskowy obszar RPE jest usuwany z plamki żółtej, rana RPE zamyka się poprzez przerost pozostałych komórek RPE. Jednak ta reakcja gojenia się ran jest związana z atrofią zewnętrznej warstwy jądrowej40. Chociaż stworzenie modelu zwierzęcego wykracza poza zakres tego manuskryptu, podobna procedura może stworzyć model zwierzęcy zaawansowanego zanikowego fenotypu AMD do testowania terapii komórkowych pochodzących z RPE.
Stosowanie syrolimusa, triamcynolonu, doksycykliny i minocykliny w celu zmniejszenia immunogennego odrzucenia przeszczepu Uważa się, że przestrzeń podsiatkówkowa jest miejscem uprzywilejowanym immunologicznie, utrzymywanym przez nienaruszoną barierę krew-siatkówka i inne czynniki41. W wielu badaniach obejmujących podsiatkówkowe przeszczepianie pochodnych komórek macierzystych z nienaruszoną barierą krew-siatkówka, leki immunosupresyjne odgrywają znikomą rolę w przeżyciu przeszczepu42. Uważa się, że zewnętrzna bariera krew-siatkówka jest tworzona przez natywną warstwę RPE i ścisłe połączenia między komórkami RPE. Podczas gdy natywne usunięcie RPE pozwala na lepszą integrację przeszczepionego RPE i fotoreceptorów gospodarza, bariera krew-siatkówka zostaje w tym procesie zakłócona, co zwiększa prawdopodobieństwo odrzucenia immunologicznego. Klasycznie limfocyty T odgrywają kluczową rolę w procesie odrzucania przeszczepu innych narządów, takich jak nerka i wątroba43. W związku z tym początkowe schematy immunosupresyjne przeszczepu tkanki siatkówki były ukierunkowane na zmniejszenie tych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych.
Sirolimus, mechanistyczny cel inhibitora rapamycyny, i takrolimus, inhibitor kalcyneuryny, są przykładami leków immunosupresyjnych ukierunkowanych na adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. Jednak pomimo odpowiedniej supresji limfocytów T, wskaźniki przeżycia przeszczepów pozostają niskie. Ponadto wiadomo, że komórki RPE hamują aktywację limfocytów T poprzez uwalnianie czynników hamujących i promują wytwarzanie regulatorowych komórek T44. W związku z tym staje się coraz bardziej oczywiste, że odporność adaptacyjna może nie być jedynym czynnikiem przyczyniającym się do odrzucenia przeszczepu42. Podsiatkówkowe przeszczepienie produktów komórkowych może spowodować akumulację i aktywację mikrogleju45.
Mikroglej to makrofagi siatkówki. Składają się z dwóch głównych populacji: 1) mikrogleju okołonaczyniowego wewnętrznego unaczynienia siatkówki i 2) mikrogleju w miąższu tkanki siatkówki. Ponieważ mikroglej jest częścią wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, glikokortykosteroidy doszklistkowe, takie jak triamcynolon, mogą hamować proliferację cytokin, w której pośredniczą46. Doksycyklina i minocyklina mogą również hamować aktywację mikrogleju i należy je rozważyć 47,48. Wreszcie, różnice w odrzuceniu immunologicznym alloprzeszczepów RPE w porównaniu z ksenoprzeszczepami nie są w pełni poznane49. Na przykład alloprzeciwciała przeciwko indukowanym pluripotencjalnym komórkom macierzystym RPE pochodzącym z komórek macierzystych zostały zgłoszone w surowicy modeli odrzucenia immunologicznego in vivo. Jednak rola tych przeciwciał i znaczenie odrzucenia za pośrednictwem przeciwciał w przeżyciu przeszczepu pozostaje nieznane50. W związku z tym proponuje się schemat wielolekowy wykorzystujący syrolimus do tłumienia odporności adaptacyjnej oraz kombinację triamcynolonu, doksycykliny i minocykliny do tłumienia odporności wrodzonej. Schemat ten jest z powodzeniem stosowany u królików z dobrymi wynikami przeżycia przeszczepu i minimalnymi skutkami ogólnoustrojowymi11.
Ograniczenia tej techniki chirurgicznej W artykule opisano możliwą metodę chirurgiczną polegającą na dostarczeniu arkusza przeszczepu RPE do przestrzeni podsiatkówkowej NHP; Nie oznacza to jednak, że jest to jedyny zoptymalizowany sposób. Różni chirurdzy szklistkowo-siatkówkowi mogą mieć inne preferencje dotyczące instrumentacji i techniki. Na przykład ta konstrukcja urządzenia do implantacji może dostarczyć tylko płaskie implanty wsparte sztywniejszym nośnikiem komórek, a zatem może nie być odpowiednia dla stosunkowo elastycznych (lub zwijanych) implantów. Przeszczepy zawiesiny RPE mogą pominąć wiele z tej techniki. W związku z tym szczegóły chirurgiczne będą wymagały modyfikacji w oparciu o każdą strategię porodu.
Ponieważ zainteresowanie terapiami komórkowymi w leczeniu chorób zwyrodnieniowych siatkówki stale rośnie, model zwierzęcy NHP będzie miał zasadnicze znaczenie w badaniach przedklinicznych w celu zbadania czynników wpływających na przeżycie przeszczepu RPE. W niniejszym artykule zaproponowano strategie umożliwiające płynniejsze dostarczenie podplamkowego jednowarstwowego przeszczepu RPE w oku NHP. Zalecane są również metody lepszej wizualizacji powikłań śródoperacyjnych. Przewiduje się, że metody te będą nadal ulepszane wraz z rozszerzaniem się stosowania terapii komórkowych. Przyszłe prace metodyczne powinny również rozważyć zaproponowanie wyczerpującej listy badań w celu oceny różnych strukturalnych i funkcjonalnych aspektów przeszczepu.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally
to:
Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore 
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Przeszczep RPE jest bardzo obiecujący w leczeniu dziedzicznych i nabytych chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Schorzenia te obejmują barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP, dystrofia pręcikowo-czopkowa) i zaawansowane formy AMD, takie jak GA. Łącznie zaburzenia te stanowią znaczny odsetek obecnie nieuleczalnej ślepoty na całym świecie1,2. Zaawansowane stadia AMD dzielą się na neowaskularne AMD (nAMD) i GA. Chociaż istnieją skuteczne opcje leczenia nAMD, takie jak zastrzyki z czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (anty-VEGF), pacjenci z GA mają ograniczone możliwości leczenia. RP to wysoce niejednorodna grupa dziedzicznych schorzeń siatkówki charakteryzujących się postępującym zwyrodnieniem fotoreceptorów siatkówki. U niektórych pacjentów przyczynowa wada genetyczna zlokalizowana jest w RPE, a nie w fotoreceptorach; w związku z tym terapia zastępcza RPE może być alternatywną strategią, jeśli terapia genowa nie jest wykonalna.
Istnieje duże zainteresowanie opracowaniem skutecznych metod leczenia tych schorzeń. W szczególności przeszczep RPE zyskuje na popularności jako potencjalne podejście terapeutyczne3,4,5,6,7,8. Odkąd w latach 80. pojawiły się pierwsze doniesienia na temat transplantacji RPE9, dziedzina ta rozszerzyła się o różne źródła komórek RPE, strategie dostarczania oraz eksperymentalne modele chorób i transplantacji10,11,12,13,14. Spośród różnych modeli zwierzęcych tylko NHP ma "plamkę żółtą" z "dołkiem centralnym", anatomiczną specjalizacją na tylnym biegunie siatkówki dzieloną z ludźmi. Dołek centralny zawiera bardzo dużą gęstość fotoreceptorów czopków, które umożliwiają widzenie centralne w wysokiej rozdzielczości15. NHP ma również podobny genomiczny i proteomiczny skład16 w porównaniu z ludźmi. Te podobieństwa sprawiają, że jest to ważny i odpowiedni model zwierzęcy do badania chorób oczu, które wpływają na ludzką siatkówkę17,18.
Ten manuskrypt opisuje metodę podplamkowego przeszczepu ksenoprzeszczepu RPE, wspieranego przez nośnik komórek PET, u immunosupresji NHP. Technika transszklistkowa do podsiatkówkowego przeszczepu RPE u królików została opisana w poprzednim manuskrypcie19. Jednak w NHP obecność dołka centralnego wymaga szczególnej ostrożności podczas manipulacji śródoperacyjnej20. W szczególności istnieje wysokie ryzyko pęknięcia dołka, jeśli metody iniekcji płynu podsiatkówkowego generują nadmierną siłę działającą na siatkówkę20. W związku z tym niniejszy manuskrypt koncentruje się na strategiach mających na celu zmniejszenie ryzyka nieumyślnego urazu dołka w NHP.
Obejmują one przedoperacyjne wstrzykiwanie plazminogenu do ciała szklistego w celu uwolnienia zrostów przydołkowych oraz śródoperacyjną optyczną tomografię koherentną (miOCT) zintegrowaną z mikroskopem chirurgicznym do wizualizacji anatomii dołka w czasie rzeczywistym. Zaproponowano wykonaną na zamówienie dwuotworową kaniulę podsiatkówkową 25/41 G z wewnątrzgałkową tamponadą PFCL przy niskich ustawieniach IOP, aby umożliwić bardziej kontrolowany proces odwarstwiania dołka. Ponadto przed implantacją zaleca się chirurgiczne usunięcie natywnego RPE, aby umożliwić lepszą integrację między przeszczepionymi komórkami RPE a fotoreceptorami gospodarza. Na koniec opisano około- i pooperacyjny protokół immunosupresji systemowej dla modeli NHP w celu poprawy przeżycia ksenoprzeszczepu RPE po przeszczepie11,21.

<table><tbody><tr><td>1% Mydriacyl (Tropicamid 1,0%) Sterylny preparat okulistyczny</td><td>Alcon</td><td>SIN 4715P</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>10% Neutralna buforowana formalina</td><td>Leica</td><td>3800598</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>2,5% Mydfrin (chlorowodorek fenylefryny) Roztwór okulistyczny</td><td>Alcon</td><td>No. 01785</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>25 G AWH Żyrandol Vivid</td><td>Synergetics</td><td>56.54.25P</td><td>Zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Frez do ciała szklistego 25 Ga z dwoma ostrzami Połączony pakiet Stellaris Elite o szerokim polu</td><td>Bausch & Lomb</td><td>SE5525WVB</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>AMO ENDOSOL Zrównoważony roztwór soli do irygacji okulistycznej</td><td>Abbott Medical Optics</td><td>15020</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Apo-minocyklina</td><td>Apotex Inc</td><td>2084104</td><td>Immunosupresja</td></tr><tr><td>AUROVISC - Hypromeloza Roztwór okulistyczny USP 2% w/v</td><td>Aurolab</td><td>TN 00002387</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Autoklaw MELAG, Vacuklav</td><td>MELAG</td><td>1131-B2300</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Autostainer XL (ST5010)</td><td>Leica</td><td>2433</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli</td><td>fizjologicznej Beaver Visitec</td><td>581732</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Wacik</td><td>kosmetyczny WINNER MEDICAL</td><td>1NA6-100</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Diagnosys Espion E3 Konsola</td><td>Diagnosys</td><td>272</td><td>Obrazowanie oftamatyczne</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Yung Shin</td><td>MAL 19950403AEZ</td><td>Immunosupresja</td></tr><tr><td>Eozyna Y</td><td>Merck Millipore</td><td>1.15935.0100</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Elektrody do soczewek kontaktowych ERG-Jet</td><td>Fabrinal</td><td>F-06</td><td>Obrazowanie oftomatyczne</td></tr><tr><td>Wysuwana kaniula PolyTip 25 G/38 G</td><td>MedOne</td><td>3247</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>FlexTip Brush (25 g) 1,5 mm</td><td>MedOne</td><td>3222</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Fluoresceina 10% Faure</td><td>Curatis AG</td><td>5030376</td><td>Obrazowanie oftamyczne</td></tr><tr><td>Wacik z gazy</td><td>WINNER MEDICAL</td><td>1NP3275</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Strzykawka gazoszczelna Hamilton 250 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81101</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Heidelberg Spectralis HRA + OCT System komputerowy</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>N.A.</td><td>Obrazowanie oftamiczne</td></tr><tr><td>Hematoksylina Gill II</td><td>Merck Millipore</td><td>3801520</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Zaćmienie odwróconego mikroskopu Ti-E główny korpus (100-240V)</td><td>Nikon</td><td>33131</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie ketaminy</td><td>Ceva</td><td>37711/58317</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Węglan litu</td><td>Merck Millipore</td><td>1.05680.0250</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Plazminogen małpy</td><td>Innowacje molekularne</td><td>SKU-CYPLG</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Bezkontaktowa szerokokątna soczewka dna oka 128 stopni</td><td>C. Zeiss Medtech</td><td>Resight 700</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Włóknina okulistyczna Serweta okulistyczna</td><td>Alcon</td><td>8065103120</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Okulistyczny nóż rogówkowy/twardówkowy V-Lance 20 G</td><td>Alcon</td><td>8065912001</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Osadzanie parafiny Stacja</td><td>Leica</td><td>EG1150 H</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Paraplast Wysokotopliwa parafina</td><td>Leica</td><td>39601095</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Floksyna B</td><td>Merck Millipore</td><td>1.15935.0025</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Wstępnie sproszkowane rękawice chirurgiczne</td><td>MAXITEX</td><td>85-173-2/85-173-3/85-173-4</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>PRODINE Powidon-jod Roztwór BP</td><td>ICM PHARMA</td><td>PMLBLP20-01</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Lampa szczelinowa Righton Model MW50D (RAA133CB)</td><td>Righton-Oph</td><td>5200162</td><td>Obrazowanie oftamowe</td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td>Procedura histologiczna</td></tr><tr><td>Safil Kwas poliglikolowy, pleciony, powlekany, wchłanialny szew chirurgiczny 7/0</td><td>B.Braun</td><td>G1048711</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>SHINCORT I.M. INJ. Triamcynolon Acetonid 40 mg/ mL</td><td>Yung Shin</td><td>SHI40 SGP-2610015-001</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Jednorazowa igła podskórna 21 G</td><td>B.Braun</td><td>4657527</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Jednorazowa igła podskórna 23 G</td><td>B.Braun</td><td>4657667</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Sirolimus</td><td>Pfizer</td><td>SIN12034P</td><td>Immunosupresja</td></tr><tr><td>Elektroda podskórna ze stali nierdzewnej</td><td>OcuScience</td><td>F-E2</td><td>Obrazowanie oftamamiczne</td></tr><tr><td>Stellaris Elite system poprawy wzroku</td><td>Bausch & Lomb</td><td>BL15455</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Jednorazowe igły insulinowe Sterican Długi skos 27 G 12 mm</td><td>B.Braun</td><td>4665406</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Jednorazowe igły insulinowe Sterican Długi skos 30 G 12 mm</td><td>B.Braun</td><td>4656300</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Fartuch chirurgiczny + 2 ręczniki do rąk</td><td>STERIL</td><td>APP10 00 01</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Folia Tegaderm</td><td>3M</td><td>1626W</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>TERUMO Strzykawka 1 cc/mL Luer SlipTip z igłą 26 G</td><td>Teruma</td><td>SS-01S</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>TERUMO Strzykawka 3 cc/mL Luer LockTip</td><td>Teruma</td><td>SS-03L</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>TERUMO Strzykawka 5 cc/mL Luer LockTip</td><td>Teruma</td><td>SS-05L</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>TobraDex (Tobramycin, deksametazon) Sterylna maść okulistyczna</td><td>Alcon</td><td>Nr 01577</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Kamera siatkówkowa Topcon TRC-50DX</td><td>Topcon</td><td>948605</td><td>Obrazowanie okulistyczne</td></tr><tr><td>Vidisic Gel</td><td>Bausch & Lomb</td><td>GB41789155517</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Xylazil-20</td><td>Ilium</td><td>38653/50276</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr><tr><td>Zeiss Opmi Rescan 700</td><td>Carl Zeiss Meditec AG</td><td>7210</td><td>Zabieg chirurgiczny</td></tr></tbody></table>

przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) jest bardzo obiecujący w leczeniu dziedzicznych i nabytych chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Stany te obejmują barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) i zaawansowane formy zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), takie jak atrofia geograficzna (GA). Łącznie zaburzenia te stanowią znaczną część obecnie nieuleczalnej ślepoty na całym świecie. Te niezaspokojone potrzeby medyczne spowodowały wzrost zainteresowania środowiska akademickiego opracowywaniem metod zastępowania RPE. Wśród modeli zwierzęcych powszechnie wykorzystywanych do przedklinicznych testów terapeutycznych, naczelny inny niż człowiek (NHP) jest jedynym modelem zwierzęcym, który ma plamkę żółtą. Ze względu na podobieństwo anatomiczne do oka ludzkiego, oko NHP jest ważnym i odpowiednim przedklinicznym modelem zwierzęcym do opracowywania produktów leczniczych terapii zaawansowanej (ATMPs), takich jak terapia komórkowa RPE.
Ten manuskrypt opisuje metodę podplamkowego przeszczepu monowarstwy RPE, hodowanej na nośniku komórkowym z politereftalanu etylenu (PET), pod plamką żółtą, na chirurgicznie utworzoną ranę RPE u immunosupresyjnych NHP. Dołek - centralna jałowa część plamki żółtej - jest miejscem największego osłabienia mechanicznego podczas przeszczepu. Uraz dołka nastąpi, jeśli początkowe wstrzyknięcie płynu podsiatkówkowego wytworzy nadmierną siłę na siatkówkę. W związku z tym zaleca się powolne wstrzykiwanie pod tamponadę ciała szklistego w płynie perfluorowęglowym (PFCL) za pomocą dwuotworowej kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych przy niskich ustawieniach ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w celu wytworzenia pęcherzyka siatkówki. 
Zalecane jest również wstępne leczenie wstrzyknięciem plazminogenu do ciała szklistego w celu uwolnienia zrostów przydołkowych RPE-fotoreceptorów. Te połączone strategie mogą zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia rozdarcia dołka w porównaniu z konwencjonalnymi technikami. NHP jest kluczowym modelem zwierzęcym w przedklinicznej fazie rozwoju terapii komórkowej RPE. Protokół ten odnosi się do wyzwań technicznych związanych z dostarczaniem terapii komórkowej RPE w oku NHP.

Multimodalne metody obrazowania (fotografia dna oka, obrazowanie autofluorescencji dna oka (FAF), angiografia fluoresceinowa dna oka (FFA) w fazie wczesnej i późnej oraz optyczna koherentna tomografia (OCT)) podkreślają cechy udanego przeszczepu graftu RPE podplamkowy (Rycina 1). Fotografia dna oka pokazuje rozmieszczenie przeszczepu graftu RPE w dołku środkowym bez migracji w czasie. Obrazowanie FAF wykazuje minimalne zmiany w hiperautofluorescencji (przedstawione przez białe obszary o wysokiej intensywności) nakładające się na graft RPE. FFA w fazie wczesnej i późnej nie wykazuje żadnych oczywistych przecieków (przedstawionych przez białe obszary o wysokiej intensywności, które powiększają się z czasem) wokół graftu RPE. Początkowe obrazy z 3. dnia wykazują defekt okna wynikający z usunięcia natywnego RPE przed implantacją graftu. Obrazy OCT plamki wykazują zachowanie zewnętrznych warstw siatkówki (w szczególności warstwy fotoreceptorów) nad graftem RPE wraz z upływem czasu. Barwienie hematoksyliną i eosiną wykazuje nienaruszone warstwy siatkówki bez oznak mikrorzerwań. Zachowanie zewnętrznej warstwy jądrowej nad obrzeżami graftu sugeruje, że komórki RPE pełnią swoje funkcje fizjologiczne polegające na utrzymaniu zdrowia fotoreceptorów.
Widoki wewnątrzgałkowe i zewnętrzne kaniuli dwulumenowej 25/41 G ukazują mechanizm kontroli IOP podczas wstrzykiwania podsiatkówkowego (Rysunek 2). Podczas wstrzykiwania płynu podsiatkówkowego BSS dostaje się do przestrzeni podsiatkówkowej poprzez centralną, dłuższą kaniulę. Znaczne wzrosty ciśnienia wewnątrzgałkowego powodują, że BSS znajdujący się w jamie ciała szklistego opuszcza oko przez szerszy metalowy lumen kaniuli. BSS przemieszcza się następnie wzdłuż kaniuli i zostaje ostatecznie wypchnięty przez port odpływowy znajdujący się w pobliżu nasady kaniuli. Aby ocenić, czy kaniula działa prawidłowo, należy upewnić się, że płyn wypływa z portu odpływowego w pobliżu nasady kaniuli.
miOCT umożliwia śródoperacyjną wizualizację wymiarów pęcherzyka oraz potencjalnego rozdarcia dołka podczas odwarstwienia dołka (Rysunek 3). Rysunek 3A1-A3 przedstawiają przypadek pęcherzyka z rozdarciem dołka. Na Rysunku 3A1, podczas gdy dolny pęcherzyk jest widoczny pod mikroskopem chirurgicznym, wizualizacja rozdarcia jest utrudniona. Rysunek 3A2 przedstawia przekrój podłużny pęcherzyka bez żadnych rozdarć. Rysunek 3A3 pokazuje rozdarcia dołka podczas oceny przekroju pionowego pęcherzyka. Rysunek 3B1-B3 przedstawiają pomyślnie stworzony pęcherzyk bez obecności żadnych rozdarć.
Brak znaczącego pogorszenia kształtu fal ERG sugeruje, że globalna funkcja fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych jest zachowana w przypadku ksenoprzeszczepów RPE podsiatkówkowych (Rysunek 4). Kształty fal ERG odzwierciedlają ogólną funkcję siatkówki. W szczególności należy zwrócić uwagę na fale A, aby określić ewentualną utratę funkcji fotoreceptorów.
<img alt="Badanie obrazowania siatkówki: zdjęcia dna oka, angiografia fluorescencyjna, wyniki OCT w ciągu 3 miesięcy, przekrój histologiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pooperacyjna analiza in vivo z obrazowaniem multimodalnym. (A) Obrazowanie in vivo podsiatkówkowego przeszczepu RPE w lewym oku (kolor żółty na zdjęciu dna oka) przy użyciu różnych metod obrazowania (kolumny od lewej do prawej: zdjęcie dna oka, autofluorescencja, angiografia fluorescencyjna dna oka – faza wczesna, angiografia fluorescencyjna dna oka – faza późna, tomografia optyczna koherentna) w punktach czasowych do 3 miesięcy (rzędy od góry do dołu: dni 3, 14; miesiące 1, 3). Gwiazdka na zdjęciu dna oka wskazuje miejsce retinotomii; biała przerywana strzałka wskazuje kierunek skanu liniowego. Żółty narysowany kształt na obrazach autofluorescencji dna oka zaznacza lokalizację przeszczepu. Białe trójkąty na obrazach OCT wskazują odpowiednie krawędzie boczne przeszczepu (zgodnie ze skanem liniowym na kolorowym zdjęciu dna oka). (B) Barwienie hematoksyliną i eozyną przeszczepu pod zanikową plamką żółtą (z powodu śródoperacyjnego pęknięcia) z opisanymi warstwami. Paski skali = 1 mm w A (obrazy autofluorescencji i FA), 200 µm w A (obrazy OCT) oraz 100 µm w B. Skróty: FA = angiografia dna oka; OCT = tomografia optyczna koherentna; RGC = warstwa komórek zwojowych siatkówki; INL = wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa; RPE = nabłonek barwnikowy siatkówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Widoki wewnątrzgałkowe i zewnętrznej, procedura operacji oka, badanie siatkówki, obrazowanie medyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Widoki wewnątrzgałkowe i zewnętrzne kaniuli dwulumenowej 25/41 G. (A) Widok wewnątrzgałkowy kaniuli dwulumenowej 25/41 G podczas tworzenia pęcherzyka podsiatkówkowego. Biała strzałka wskazuje dłuższą kaniulę centralną do wstrzykiwania podsiatkówkowego. Przerywana strzałka wskazuje otwór kaniuli odpływowej, przez którą BSS wypływa z oka. (B) Widok zewnętrzny kaniuli dwulumenowej 25/41 G. Gwiazdka oznacza port odpływowy w pobliżu główca kaniuli, przez który odprowadzany jest wewnątrzgałkowy BSS. Skrót: BSS = zrównoważony roztwór soli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Optyczna koherentna tomografia obrazująca przekroje poprzeczne siatkówki; skan oka, analiza obrazowania medycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazy z mikroskopu śródoperacyjnego i obrazy miOCT pęcherzyka podsiatkówkowego powikłanego pęknięciem dołka środkowego. (A1) Obraz z mikroskopu śródoperacyjnego przedstawiający położenie skanów podłużnych (niebieski) i poprzecznych (czerwony) w pęcherzyku z pęknięciem dołka środkowego. (A2) Podłużny skan miOCT przedstawiający pęcherzyk podsiatkówkowy w obszarze dołka środkowego (żółta strzałka). (A3) Poprzeczny skan miOCT ukazujący pęknięcie dołka środkowego (biała grot strzałki) wraz z retinotomią (gwiazdka) i pęcherzykiem podsiatkówkowym (żółta strzałka). (B1) Obraz mikroskopowy śródoperacyjny przedstawiający położenie skanów podłużnych (niebieski) i poprzecznych (czerwony) w prawidłowo uformowanym pęcherzyku. (B2) Podłużny skan miOCT przedstawiający pęcherzyk podsiatkówkowy w obszarze dołka środkowego (żółta strzałka). (B3) Poprzeczny skan miOCT przedstawiający prawidłowo utworzony pęcherzyk podsiatkówkowy z nienaruszonym dołkiem środkowym powyżej (biały romb). Skrót: miOCT = mikro-zintegrowana optyczna koherentna tomografia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres odpowiedzi ksenoprzeszczepu RPE, amplituda w funkcji czasu, przedstawiający aktywność siatkówki w różnych warunkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: ERG oka po ksenotransplantacji RPE. W ramach oceny funkcjonalnej siatkówki, pełnopolowe pomiary ERG oka z ksenoprzeszczepem RPE wykonane w punkcie wyjściowym (górny rząd) oraz 3 miesiące po transplantacji (dolny rząd) nie wykazują istotnego wpływu ksenotransplantacji RPE na amplitudy odpowiedzi, czas ich wystąpienia ani kształt fali, zarówno w warunkach ciemnoadaptowanych, jak i jasnoadaptowanych. Skróty: RPE = nabłonek pigmentowy siatkówki; ERG = elektroretinogram; DA = ciemnoadaptowany; LA = jasnoadaptowany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Uraz dołka podczas przeszczepu nabłonka barwnikowego siatkówki może skutkować słabymi wynikami wizualnymi. Ta proponowana metoda może zmniejszyć prawdopodobieństwo rozdarcia dołka w porównaniu z konwencjonalnymi technikami. Proponowana metoda uwzględnia wiele czynników przyczyniających się do urazu dołka, w tym uwolnienie zrostów podsiatkówkowych, lepszą wizualizację warstw siatkówki i styczne siły ścinające podczas tworzenia pęcherzyków.Ta technika, która obejmuje wstępną obróbkę plazminogenu doszklistkowego, zintegrowane z mikroskopem tworzenie pęcherzyków siatkówki pod kontrolą OCT oraz tamponadę ciała szklistego z płynnym perfluorowęglowodorem przy użyciu kaniuli z podwójnym otworem, zwiększa prawdopodobieństwo urazu dołka przy łagodniejszej procedurze. Procedurę zademonstrują dr Zenping Liu, starszy pracownik naukowy, oraz pan Daniel Soo Lin Wong, asystent naukowy, obaj z laboratorium. Profesor Gopal Lingam, starszy konsultant, również zademonstruje procedury operacyjne.Na początek użyj nożyczek Vannas do nacięcia spojówki w pobliżu rąbka w celu wykonania pertomii spojówki o 360 stopni i wykonaj rozwarstwienie, aby powiększyć peritomię. Użyj mikroostrza szklistkowo-siatkówkowego o rozmiarze 25, aby wykonać trzymilimetrowe nacięcie w twardówce na godzinie ósmej w prawym oku lub na godzinie czwartej w lewym oku. Włóż niestandardową kaniulę infuzyjną z bocznym portem o rozmiarze 25 G i zszyj za pomocą szwu 7-0 Vicryl.Po potwierdzeniu lokalizacji doszklistkowej rozpocznij zbilansowany wlew roztworu soli i ustaw system tak, aby utrzymywał ciśnienie wewnątrzgałkowe 20 mililitrów rtęci. Użyj trokara z płaską główką o rozmiarze 25, aby naciąć twardówkę na godzinie drugiej w prawym oku lub na godzinie 10 w lewym oku. Włóż żyrandol o rozmiarze 25 do trokaru z płaską głowicą i zabezpiecz światło taśmą klejącą.Ustaw źródło światła na około 60%Wykonaj kolejną sklerotomię na godzinie 10 dla prawego oka lub na godzinie drugiej dla lewego oka, jak pokazano. Umieść szew Vicryl 7-0 w kształcie litery U wokół sklerotomii bez wiązania węzłów. Wprowadzić trokar witrektomii przez sklerotomię.Wykonać witrektomię wokół portu wejściowego, a następnie krótką witrektomię rdzeniową z maksymalną liczbą 5 000 cięć na minutę i maksymalną aspiracją przy 400 milimetrach słupa rtęci. Wstrzyknij od 20 do 50 mikrolitrów triamcynolonu, aby uzyskać lepszą wizualizację ciała szklistego. Oddziel ciało szkliste od siatkówki, aby wywołać tylne odwarstwienie ciała szklistego.Umieść wirektor nad tarczą nerwu wzrokowego, aby umożliwić delikatną indukcję tylnego odwarstwienia ciała szklistego. Żykorder należy przechowywać tylko podczas aspiracji przy maksymalnej wilgotności 400 milimetrów słupa rtęci bez konieczności cięcia. W razie potrzeby użyj kleszczy wewnątrzgałkowych o rozmiarze 25, aby rozerwać korę ciała szklistego, aby ułatwić odwarstwienie.Otwórz tylną błonę szklistą za pomocą noża i usuń oderwaną osłonę ciała szklistego aż do podstawy ciała szklistego. Odessać pozostały triamcynolon na powierzchni siatkówki. Wstrzyknij od jednego do dwóch mililitrów płynu perfluorowęglowego, aby pokryć tylny biegun aż do przedniej i środkowej siatkówki obwodowej.Wprowadzić do oka za pomocą kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych. Użyj niestandardowej dwuotworowej kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych o wymiarach 25 na 41 lub kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych o wymiarach 25 na 38 podłączonej do strzykawki o pojemności 250 mikrolitrów do wstrzykiwań podsiatkówkowych. Ustaw ciśnienie wewnątrzgałkowe na zero do czterech milimetrów słupa rtęci.Delikatnie wykonaj podsiatkówkowe wstrzyknięcie BSS, aby wywołać miejscowe odwarstwienie siatkówki. Gdy pęcherzyk przekroczy dołek centralny, należy przerwać wstrzykiwanie BSS. Utwórz drugi bleb z innego kierunku.Połącz oba pęcherzyki, aby całkowicie odłączyć dołek środkowy. Włącz funkcję śródoperacyjnej optycznej koherentnej tomografii w celu wizualizacji powstawania pęcherzyków, zapewniając, że skany linii i sześcianu są w trybie wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obraz w dołku środkowym. Powiększ nacięcie siatkówki do 1,5 milimetra za pomocą pary pionowych nożyczek witreoretinalnych o rozmiarze 25, aby umożliwić dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej w celu przeszczepu.Ustaw ciśnienie wewnątrzgałkowe na 50 milimetrów słupa rtęci. Użyj szczotkowanej silikonowej kaniuli, aby usunąć płyn perfluorowęglowy. Użyj noża do nacinania o średnicy 1,4 milimetra, aby przedłużyć sklerotomię.Wprowadź instrument z rozszerzalną pętlą o rozmiarze 20 i usuń podplamkowy nabłonek barwnikowy siatkówki gospodarza przez skrobanie. Przełóż końcówkę urządzenia strzeleckiego przez sklerotomię i przejdź przez jamę ciała szklistego przy ciśnieniu wewnątrzgałkowym 20 milimetrów słupa rtęci. Wstrzyknąć implant w kierunku przestrzeni podsiatkówkowej przez krawędź retinotomii utworzoną z powierzchni siatkówki, stroną nośnika komórek skierowaną w stronę błony Brooksa, a ksenoprzeszczep skierowany w stronę fotoreceptorów.Wizualizacja lokalizacji implantu poprzez włączenie funkcji śródoperacyjnej optycznej koherentnej tomografii. Dostosuj pozycję implantu za pomocą kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych lub zakrzywionych nożyczek wewnątrzgałkowych o rozmiarze 25, aby upewnić się, że implant spoczywa płasko na membranie Brooksa w przestrzeni podsiatkówkowej z nienaruszoną siatkówką leżącą nad siatkówką, a także znajduje się w odległości od utworzonej retinotomii i nie uderza w miejsce siatkówki. Użyj szczotkowanej silikonowej kaniuli końcówki do wymiany płyn-powietrze i delikatnie odessaj płyn podsiatkówkowy z odwarstwienia siatkówki pęcherzyka i przyłączenia krawędzi retinotomii, aż siatkówka zostanie ponownie przymocowana do implantu.Następnie, aby zakończyć operację, zamknij roboczą sklerotomię portu za pomocą wstępnie założonego szwu 7-0 Vicryl. Podawać 0,05 mililitra na dwa miligramy triamcynolonu doszklistkowego bez konserwantów podczas sklerotomii o ósmej. Wyjmij żyrandol i kaniulę infuzyjną.Zamknij te sklerotomie szwami Vicryl. Zbadaj palpacyjnie oko, aby upewnić się, że ciśnienie wewnątrzgałkowe mieści się w dopuszczalnym zakresie. W razie potrzeby wstrzyknąć przefiltrowane powietrze lub BSS za pomocą igły o rozmiarze 30.Obrazowanie in vivo przeszczepu nabłonka barwnikowego podplamkowego siatkówki w lewym oku za pomocą różnych metod obrazowania prowadzono przez okres do trzech miesięcy. Fotografia dna oka wykazała, że przeszczepiony przeszczep w dołku centralnym nie migrował z czasem. Obrazowanie autofluorescencji dna oka wykazało minimalne zmiany w hiperautofluorescencji nakładającej się na przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki.Angiografia fluoresceinowa dna oka we wczesnej i późnej fazie nie wykazała żadnego przecieku wokół przeszczepu. Obrazy z optycznej koherentnej tomografii plamki żółtej wykazały zachowanie zewnętrznych warstw siatkówki nad przeszczepem w miarę upływu czasu, co sugeruje funkcjonalność komórek nabłonka barwnikowego siatkówki. Barwienie HE wykazało nienaruszone warstwy siatkówki bez śladów mikro rozdarć.Śródoperacyjna optyczna koherentna tomografia pozwala na śródoperacyjną wizualizację wymiarów pęcherzyków i potencjalnego rozerwania dołka podczas odwarstwienia dołka. Obecność łez może zakłócać tworzenie się pęcherzyków. O powodzeniu prawidłowego tworzenia pęcherzyków wspomagał brak rozdarcia.W celu oceny funkcjonalnej siatkówki przeprowadzono pełną ocenę elektroretinogramu oka ksenoprzeszczepowanego nabłonkiem barwnikowym siatkówki. Brak znaczącego pogorszenia przebiegów elektroretinogramu sugeruje, że funkcja zarówno fotoreceptorów pręcikowych, jak i czopków została zachowana w przypadku ksenoprzeszczepów. Podczas tworzenia zlokalizowanego pęcherzyka siatkówki rób to bardzo delikatnie, ponieważ każda nagła zmiana prędkości strumienia może prowadzić do rozdarcia dołka.Powolne wykonywanie tego kroku jest kluczem do zmniejszenia uszkodzenia dołka. Obrazowanie multimodalne, w tym autofluorescencja dna oka, angiografia fluoresceinowa i optyczna koherentna tomografia wraz z badaniami elektrofizjologii, może zapewnić lepszy wgląd w przeżywalność przeszczepu i czynniki, które na niego wpływają.

retinal-pigment-epithelium-transplantation-non-human-primate-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Strategie wymiany nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i terapia oparta na genach są brane pod uwagę w przypadku kilku stanów zwyrodnieniowych siatkówki. Do translacji klinicznej wymagane są modele zwierzęce z dużymi oczami do badania technik chirurgicznych stosowanych u pacjentów. W tym miejscu przedstawiamy model królika do chirurgii podsiatkówkowej ukierunkowany na przeszczep RPE, który jest wszechstronny i opłacalny.

Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Implantacja podsiatkówkowa pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) jest jednym z najbardziej obiecujących podejść do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Jednak wyniki badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych z dużymi oczami pozostają wyzwaniem. W niniejszym raporcie przedstawiono wytyczne dotyczące podsiatkówkowego przeszczepiania RPE na nośniku komórkowym do świnek miniaturowych.

Podsiatkówkowa implantacja RPE na nośniku u świnek miniaturowych: wytyczne dotyczące przygotowań przedoperacyjnych, technik chirurgicznych i opieki pooperacyjnej

Eksplantaty siatkówki uzyskane od makaków dzikich były hodowane in vitro. Zwyrodnienie siatkówki i szlak sygnałowy cGMP-PKG indukowano za pomocą inhibitora PDE6 zaprynastu. Akumulację cGMP w eksplantatach przy różnych stężeniach zaprynastów zweryfikowano za pomocą immunofluorescencji.

Organotypowe kultury eksplantatów siatkówki od makaka

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Poznaj metodę przeszczepu nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych, która zmniejsza ryzyko urazu plamki żółtej dzięki plazminogenowi i OCT. Technika poprawia precyzję chirurgiczną oraz stabilność przeszczepu w czasie.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Przeglądaj więcej filmów