Name: Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Poznaj metodę szybkiego utrwalania kompleksów translacyjnych in vivo w komórkach drożdży i ssaczych przy użyciu formaldehydu. Technika umożliwia analizę dynamicznych interakcji RNA:białko w biologii molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Australian Research Council Discovery Project (DP180100111 dla T.P. i N.E.S.), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 dla N.E.S.) oraz Research Fellowship (APP1135928 dla T.P.). Autorzy doceniają wyposażenie Microscopy Australia w Centrum Zaawansowanej Mikroskopii Australijskiego Uniwersytetu Narodowego, placówce finansowanej przez Uniwersytet i rząd federalny.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Utrwalanie formaldehydu jest wygodną i popularną metodą szybkiego sieciowania biomolekuł in vivo 10,36,45,46,47,48. W porównaniu z innymi potencjalnymi celami biomolekuł, skuteczne wychwycenie kompleksów translacyjnych wymaga natychmiastowego utrwalenia podczas błyskawicznego schładzania komórek lub innego materiału. Bez nieopóźnionej stabilizacji istnieje możliwość kontynuowania różnych procesów związanych z translacją, przesuwając złożoną dystrybucję od niezakłóconego stanu in vivo 49. W porównaniu z innymi metodami zatrzymania translacji i stabilizacji kompleksu rybosomalnego, szybkość działania formaldehydu przez błony komórkowe i bezkrytyczny charakter wiązań krzyżowych obiecują zachowanie maksymalnej różnorodności produktów pośrednich kompleksu translacyjnego bliżej ich natywnie rozmieszczonych stanów50.
Przedstawione tutaj podejście zostało ustalone i zoptymalizowane zarówno w komórkach drożdży, jak i ssaków, a metody zostały teraz opracowane przez inne grupy do stosowania w bardziej zróżnicowanym materiale biologicznym, takim jak całe kręgowce (np. zarodki danio pręgowanego)10,38,39,49,51,52. Chociaż prace te łącznie potwierdzają wszechstronność i szerokie zastosowanie tego podejścia, szybkie sieciowanie kompleksów translacyjnych formaldehydem można uznać za nieco trudne do transpozycji do nowych typów materiału biologicznego ze względu na potrzebę optymalizacji i dostosowań.
Podstawowym warunkiem powodzenia metody jest ponowna optymalizacja stężenia formaldehydu oraz techniki zbierania i rozdzielania komórek. Mniej przepuszczalne, małe i okrągłe komórki drożdży wymagają znacznie wyższego (co najmniej 10-krotnego) stężenia formaldehydu i fizycznego rozerwania utrwalonych komórek. W przeciwieństwie do tego, duże i spłaszczone przylegające komórki ssaków w hodowli mogą być łatwo nadmiernie utrwalone i wymagać delikatnego obchodzenia się z nimi po utrwaleniu, podczas gdy ekstrakcja utrwalonych kompleksów może być przeprowadzona chemicznie z rozerwaniem błony przy użyciu detergentów. Niedostateczne usieciowanie może pozwolić mniej stabilnym lub bardziej krótkotrwałym produktom pośrednim na dysocjację lub wyciek do późniejszego stanu. Nadmierne sieciowanie może negatywnie wpływać na zdolność do izolowania i badania frakcji rybosomalnych i może powodować selektywne odchylenia, takie jak głębsze zubożenie ciężkich kompleksów. Z naszych obserwacji wynika, że nawet drobne zmiany, takie jak rodzaj użytych adherentnych komórek ludzkich, mogą wpływać na wydajność odzyskanych usieciowanych kompleksów i mogą wymagać ponownej optymalizacji schematu sieciowania. Możemy również przewidzieć, że komórki o zasadniczo różnych właściwościach przepuszczalności, takie jak komórki roślinne, będą wymagały dodatkowej szeroko zakrojonej optymalizacji warunków utrwalania52. Trudno jednak wyobrazić sobie rodzaj materiału biologicznego, który byłby całkowicie niezgodny z tym podejściem.
Jedną z kwestii związanych z protokołem utrwalania ssaków jest gęstość i ilość materiału komórkowego użytego jako wejście. Zaleca się, aby komórki rosły w sposób ciągły bez ponownego wysiewu lub innych zakłóceń przez co najmniej 2 dni, aby uniknąć zewnętrznych wpływów na dynamikę translacji komórkowej. Ma zastosowanie do większości typów komórek, ale dla większości przylegających komórek konsekwentnie osiągane poziomy konfluencji nie większe niż 70% zapewnią brak głównych efektów hamowania kontaktu, które mogą negatywnie i nieprzewidywalnie wpływać na szybkość translacji.
Inną interesującą i potencjalnie wyjątkowo wygodną cechą utrwalania formaldehydu, wynikającą z jego bezkrytycznej reaktywności, jest efekt stabilizacji kompleksów translacyjnych w układach o mieszanej taksonomii. Bakteryjne, a tym bardziej kompleksy translacyjne mitochondriów, chloroplastów i różnych pasożytów wewnątrzkomórkowych są niezwykle trudne do namierzenia za pomocą specyficznych inhibitorów translacji. W przeciwieństwie do tego, w danych TCP-seq, ślady stóp odwzorowujące mitotranskryptom są łatwo widoczne w danych 38,39,50. Interesującym późniejszym osiągnięciem może być zastosowanie tego podejścia do badania translacji w całych mikrospołecznościach, takich jak próbki gleby, wody lub jelit, gdzie niezawodne szybkie zatrzymanie translacji i złożona stabilizacja za pomocą jakichkolwiek innych środków byłyby problematyczne.
Należy również wspomnieć, że w przypadku najbardziej skomplikowanych materiałów (takich jak twarde i/lub nieporęczne tkanki) nic nie stoi na przeszkodzie, aby zastosować stabilizację formaldehydu natychmiast po rozerwaniu komórek i homogenizacji materiału. Podejście to jest już często stosowane w celu usunięcia opóźnienia wejścia do komórki podczas stabilizacji kompleksów translacyjnych za pomocą specyficznych inhibitorów drobnocząsteczkowych 33,53,54,55. Biorąc pod uwagę, że utrwalanie formaldehydu było tradycyjnie stosowane z doskonałymi wynikami do stabilizacji próbek ex vivo/in vitro w zastosowaniach takich jak mikroskopia elektronowa 45,56,57,58, możemy spodziewać się jeszcze mniej negatywnych skutków w tym przypadku, szczególnie tych związanych ze słabą ekstrakcją kompleksów translacyjnych z dokładnie utrwalonych komórek.
Nasze odkrycia potwierdzają przydatność szybkiego wiązania formaldehydu do stabilizacji wysoce przejściowych kompleksów, takich jak te, które zawierają eIF4A. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do ssaków, drożdże eIF4A są znacznie słabiej związane z kompleksem wiążącym czapeczkę eIF4F, a co za tym idzie, ogólnie z kompleksami translacyjnymi. eIF4A jest zwykle tracony podczas intensywnego oczyszczania materiału rybosomalnego w drożdżach 29,59,60,61,62,63. Jednak w materiale drożdżowym utrwalonym in vivo możliwe jest osiągnięcie niezawodnego wzbogacenia eIF4A we wszystkie frakcje kompleksów translacyjnych, w których można by się spodziewać jego obecności. Wcześniej opublikowane dane Sel-TCP-seq wykazały wzbogacenie eIF2 i eIF3, które silniej wiążą się z rybosomami (ale także ujawniły przejściowo zachodzący kotranslacyjny kompleks białkowy)39. W związku z tym metoda ta nadaje się do wykrywania zarówno silniejszych, jak i słabszych przyłączonych składników kompleksów translacyjnych.
Podsumowując, przedstawiliśmy podejście przydatne do uzyskania wglądu przede wszystkim w zmiany zachodzące w początkowej fazie translacji oraz gdy wymagany jest minimalnie zaburzony rozkład rybosomalny w mRNA. Co ważne, podejście to nadaje się do stabilizacji stosunkowo labilnych i dynamicznych składników kompleksów translacyjnych, takich jak eIF4A, i może być szeroko stosowane po poddanych niezbędnym optymalizacjom. Dostarczyliśmy również dowodów na przydatność utrwalania formaldehydu w scenariuszach szybkiej dynamicznej zmiany translacji, otwierając obszary badań, takie jak szybkie reakcje komórkowe na zmiany środowiskowe lub warunki stresowe.

Organizmy żywe podlegają dynamicznym zmianom wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym w ciągu całego swojego życia, co wymaga szybkich reakcji w celu utrzymania homeostazy i zapewnienia przetrwania. Aby umożliwić adaptację do środowiska, komórki eukariotyczne dostosowują swój metabolizm poprzez kontrola ekspresji genów. Kontrola ekspresji genów może być sprawowana podczas transkrypcji i/lub translacji, przy czym odpowiedzi translacyjne następują zazwyczaj szybciej1,2,3,4Na przykład zmiany translacyjne pojawiają się zazwyczaj w ciągu 1–30 min od wystąpienia stresu, podczas gdy zmiany na poziomie transkrypcji następują kilka godzin po ekspozycji na stres.3,4,5Zmiany w produktach translacji są osiągane szybciej dzięki stałej obecności cząsteczek mRNA (matrycowego RNA) w cytoplazmie. Z kolei na poziomie transkrypcji nowe cząsteczki mRNA muszą zostać zsyntetyzowane, a u eukariotów dodatkowo przetworzone i wyeksportowane z jądra komórkowego, co powoduje znaczne opóźnienia w czasie reakcji.2,4,6,7,8.
Ostra odpowiedź translacyjna na stres charakteryzuje się zazwyczaj ogólnym spadkiem wydajności translacji, przy jednoczesnej selektywnej upregulacji białek niezbędnych do przetrwania komórki1,3,4,9. Uważa się, że zmniejszenie produkcji białek jest kluczowe ze względu na wysokie zapotrzebowanie energetyczne tego procesu3,7. Aby umożliwić selektywne hamowanie i upregulację, odpowiedzi translacyjne są realizowane za pomocą szeregu złożonych mechanizmów regulacyjnych. Regulacja może zachodzić we wszystkich fazach translacji: inicjacji, elongacji, terminacji biosyntezy polipeptydu oraz recyklingu rybosomów10,11,12,13, jednak najsilniej przejawia się w fazie inicjacji5,7,9,10,13. Podczas inicjacji mała podjednostka rybosomalna (SSU), przy udziale eukariotycznych czynników inicjacji (eIFs), wiąże się z niezakodowaną regionem 5' (UTR) mRNA i skanuje go aż do momentu rozpoznania kodonu startowego2,5,6,8,11,12,13. Mechanizmy regulacyjne często celują w eIFs, wpływając na przyłączanie, skanowanie i rozpoznawanie kodonu startowego. Na przykład czynnik inicjacji eIF2, niezbędny czynnik translacyjny wspomagający rekrutację inicjującego Met-tRNAiMet do SSU, jest często celem w eukariotach w warunkach stresu4,6,11. U drożdży fosforylacja tego czynnika może być indukowana przez niedobór składników odżywczych i stres osmotyczny1,4,11,14,15, a w komórkach ssaków odpowiedź tę mogą wywołać głód aminokwasowy, stres retikulum endoplazmatycznego (ER), stres UV, infekcja wirusowa oraz zmieniony poziom tlenu8,9,11. Szybka upregulacja translacji specyficznych mRNA jest widoczna w odpowiedzi komórek ssaków na hipoksję, która objawia się globalnym, szybkim hamowaniem translacji i selektywną upregulacją biosyntezy czynników indukowanych hipoksją (HIFs). HIFs są czynnikami transkrypcyjnymi, które następnie wywołują długofalowe przeprogramowanie komórkowe na poziomie transkrypcji DNA8,9,16. Podobne odpowiedzi zaobserwowano u drożdży w warunkach stresu termicznego, gdzie szybkiej ekspresji translacyjnej białek szoku cieplnego (HSPs) towarzyszyły opóźnione odpowiedzi na poziomie transkrypcji17,18. Oprócz niedoboru składników odżywczych i szoku cieplnego, odpowiedzi translacyjne u drożdży badano przy różnych poziomach tlenu8,19, zasolenia5, fosforu, siarki20,21 i azotu22,23. Badania te mają szerokie znaczenie dla przemysłowych zastosowań drożdży, takich jak piekarnictwo i fermentacja24,25. Odpowiedzi translacyjne mogą być również pomocne w pogłębianiu zrozumienia chorób, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne i choroby serca, które charakteryzują się stresami wewnątrzkomórkowymi, np. stresem oksydacyjnym. Podsumowując, odpowiedzi translacyjne są integralną częścią kontroli ekspresji genów i umożliwiają szybką adaptację do szerokiego zakresu warunków stresowych u organizmów eukariotycznych.
Aby badać odpowiedzi translacyjne, niezbędne są metody dostarczające obrazu krajobrazu translacji przy minimalnych zniekształceniach. Profilowanie polisomów to klasyczne podejście stosowane w badaniu translacji poszczególnych cząsteczek mRNA, polegające na rozdzielaniu frakcji poli(rybo)somowych mRNA via ultrawirowanie w gradientach sacharozy26,27. Podejście to można wykorzystać do badania poziomów translacji dla poszczególnych mRNA (przy użyciu metod detekcji takich jak odwrotna transkrypcja i reakcja łańcuchowa polimerazy, RT-PCR26) lub globalnie, w połączeniu z technikami wysokoprzepustowymi (mikromacierze lub RNA-seq28,29). Bardziej zaawansowanym podejściem jest profilowanie rybosomów, które pozwala na badanie pozycji elongujących rybosomów wzdłuż cząsteczki mRNA w skali całego genomu, a także na wnioskowanie o efektywności translacji w obrębie transkryptomu oraz wykorzystaniu głównych i alternatywnych miejsc startu30,31. Profilowanie rybosomów obejmuje izolację i sekwencjonowanie fragmentów mRNA chronionych przez obecność rybosomów. Profilowanie rybosomów dostarczyło istotnych informacji na temat dynamiki translacji w wielu warunkach, w tym podczas stresu hipoksyjnego, szoku termicznego i stresu oksydacyjnego31,32. Technika ta została dostosowana do wielu rodzajów materiału źródłowego, w tym do komórek drożdży i ssaków.
Choć profilowanie polisomów i rybosomów miało fundamentalne znaczenie dla rozszerzenia możliwości badań nad translacją, proces translacji obejmuje różne kompleksy i produkty pośrednie translacji, które są trudne do uchwycenia za pomocą tych metod11,13. Dodatkowe ograniczenie wynika z braku możliwości badania szybkich typów odpowiedzi, ponieważ kompleksy translacyjne są stabilizowane albo in vivo poprzez dodanie specyficznych inhibitorów translacji (antybiotyków), co prowadzi do pewnych artefaktów w rozkładzie rybosomów, albo ex vivo podczas lizy komórek w sposób specyficzny (antybiotyki) lub niespecyficzny (wysokie stężenie soli lub jonów magnezu), co prowadzi do utraty krócej żyjących lub mniej stabilnych produktów pośrednich33,34,35.
Formaldehyd jest powszechnie stosowany do sieciowania kwasów nukleinowych i białek, na przykład w badaniach immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) oraz immunoprecypitacji z sieciowaniem (CLIP). Jego niewielki rozmiar i doskonała przepuszczalność komórkowa umożliwiają szybkie działanie in vivo36. W oparciu o szybkie sieciowanie formaldehydem, podejście do profilowania rybosomów zostało rozszerzone o sekwencjonowanie profilu kompleksów translacyjnych (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. Metoda TCP-seq, opracowana pierwotnie dla drożdży, pozwala na wychwycenie wszystkich produktów pośrednich translacji, w tym kompleksów SSU skanujących lub potranslacyjnych oraz wielu konfiguracji rybosomalnych37,38,41,42. Metoda ta została wykorzystana w kilku badaniach10,38,39,41,42, z których niektóre wykorzystują podejście kombinowane, łączące inhibitory translacji i sieciowanie formaldehydem, aby ułatwić zatrzymanie translacji. Kolejna zmodyfikowana wersja tej techniki, selektywne TCP-seq39, została niedawno zastosowana w celu włączenia immunopuryfikacji sieciowanych kompleksów, co rozszerzyło zakres zastosowań TCP-seq. Szybki, wydajny i odwracalny charakter sieciowania formaldehydem sprawia, że podejścia te są odpowiednie do badania przejściowych oddziaływań mRNA:kompleks translacyjny, szczególnie w kontekście wysoce dynamicznych szlaków odpowiedzi na poziomie translacji.
W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procesy sieciowania formaldehydem in vivo w celu kompleksowej stabilizacji i izolacji kompleksów translacyjnych. Przedstawiamy oddzielne protokoły dostosowane do komórek drożdży oraz ssaków (Rysunek 1). Ponadto opisujemy przykłady późniejszego wykorzystania materiału stabilizowanego poprzez sieciowanie (Rysunek 1), takie jak wykrywanie współoczyszczonych białek czynnikowych za pomocą immunoblotingu (western-blottingu), oczyszczanie wspomagane immunologicznie (lub „immunoprecypitacja”; IP) i wzbogacanie kompleksów translacyjnych zawierających specyficzne czynniki zainteresowania, mikroskopię elektronową oraz sekwencjonowanie RNA.
<img alt="Schemat frakcjonowania komórek: utrwalanie kultury drożdży, lizy, sedymentacja; metody analizy białko-RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający ogólny przebieg typowego układu eksperymentalnego. Główne etapy stabilizacji kompleksów translacyjnych za pomocą formaldehydu in vivo przedstawiono w formie schematu blokowego, uzupełnionego o informacje dotyczące kluczowych niezbędnych instrumentów. Przedstawiono potencjalne zastosowania materiału sieciowanego, w tym przykłady, które zostały z sukcesem wykorzystane, lecz nie są bezpośrednio opisane w niniejszym protokole, takie jak oczyszczanie RNA za pomocą kulek SPRI, sekwencjonowanie RNA oraz spektrometria mas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>70178</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza (dekstroza)</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>49139</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan adeniny</td><td>Amresco</td><td>0607-50G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>F11635-500ML</td><td>Odczynnik ACS, 37&nbsp;% wag. w H2O, zawiera 10-15% metanolu jako stabilizatora (zapobiegającego polimeryzacji)</td></tr><tr><td>RNazaOUT&handel; Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Invitrogen&trade; autorThermo Fischer Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&trade;, Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>COEDTAF-RO Roche firmy Merck</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu</td> <td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego</td> <td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ambion&trade; RNaza I, sklonowana, 100 U/&mikro; L</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&bull; W handlu i handlu; Inhibitor RNazy (20 U/&mu; L) </td><td>Invitrogen&trade; by Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny fenol: chloroform: alkohol izoamylowy 125:24:1 (pH 4,0-5,0)</td> <td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>P1944-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&trade; Kozia IgG Przeciw Mysim</td><td>Invitrogen&handel; przez Thermo Fisher Scientific)</td><td>11033</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (3 M), pH 5,5</td><td>Invitrogen&handel; przez Thermo Fisher Scientific)</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen (5 mg / ml)</td><td>Invitrogen&handel; przez Thermo Fisher Scientific)</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysty</td><td>Merck; Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Amersham&trade; &nbsp; Hybond&reg; P Western blotting membrany, PVDF</td><td>GE10600023</td><td></td><td>Membrana PVDF do western blotting</td></tr><tr><td>Bolt&trade; 4 do 12%, Bis-tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy</td><td>Invitrogen&trade; by ThermoFischer Sientific</td><td>NW04120BOX</td><td>Żel białkowy</td></tr><tr><td>4X Bolt&trade; Bufor do próbek LDS</td><td>Invitrogen&trade; firmy ThermoFischer Sientific</td><td>B0007</td><td>&nbsp; Bufor do ładowania próbek LDS</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein&trade; Kalejdoskop i handel; Wstępnie barwione wzorce białkowe</td><td>BioRad</td><td>1610375</td><td>Drabinka białkowa</td></tr><tr><td>20X Bolt&trade; MES SDS Running Buffer</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>B0002</td><td>PAGE runninjg buffer</td></tr><tr><td>Intercept&reg; (PBS) Bufor blokujący</td><td>LI-COR</td><td>927-70001</td><td>Odyssey Bufor koksowy (PBS)</td></tr><tr><td>IRDye&reg; 800CW Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG</td><td>LI-COR</td><td>92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye&reg; 800CW Koza anty-królicza IgG Przeciwciało wtórne</td><td>LI-COR</td><td>92632211</td><td></td></tr><tr><td>TAP Tag Przeciwciało poliklonalne</td><td>Invitrogen&trade; przez ThermoFischer Sientific</td><td>CAB1001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-beta aktyny</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td> <td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td> <td>84097</td><td>BioUltra, do biologii molekularnej, &ge; 99,5% (HPLC)</td></tr><tr><td>Roztwór DL-ditiotreitolu</td> <td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>43816</td><td>BioUltra, do biologii molekularnej, ~1 M w H2O</td></tr><tr><td>Strzykawka Terumo 1CC/mL</td><td>Strzykawka Terumo</td><td>878499</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td> <td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(</td><td>Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco z wapniem i magnezem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Tris</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rybonukleazy rnazyny</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do mielenia ze stali nierdzewnej</td><td>Retsch</td><td>02.462.0059</td><td></td></tr><tr><td>Młyn mieszający MM400</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td></td></tr><tr><td>Frakcjonownik gradientowy</td><td>Brandel</td><td>BRN-BR-188</td><td></td></tr><tr><td>Termomikser R</td> Spektrofotometr <td>Eppendorf</td><td>Z605271</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml probówki wirówkowe z urządzeniami blokującymi</td><td>Eppendorf Safe-Lock</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Mini zbiornik żelowy</td> <td>(Thermo Fisher Scientific)</td><td>A25977</td><td>PAGE zbiornik do biegania</td></tr><tr><td>5 ml, otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta tuba, 13 x 51 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, certyfikowany bezpłatny cienkościenny polipropylen otwarty, 14 x 89 mm - 50 szt</td>. <td>Beckman-Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia ultrafiltracyjne Amicon Ultra-0,5</td><td>Merck</td><td>UFC5030</td><td>Membrana z regenerowanej celulozy Ultracel-30, objętość próbki 0,5 ml</td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Wirówka</td><td>Cambridge Scientific</td><td>15566</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-90K</td><td>GMI</td><td>8043-30-1191</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 175cm2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL1250</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL1100</td><td></td></tr><tr><td>probówki lobind DNA</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td>Zimna</tr> wirówka <tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>do probówek 50 ml</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym</td><td>Ratek</td><td>OM11</td><td></td></tr><tr><td>Frezco 17 Mikrowirówka</td><td>Thermofisher Scientific 75002402</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Probówki do usuwania wiązek DNA</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; Rurki białkowe LoBind</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108116</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Wahadłowy wirnik kubełkowy</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i Inkubator CO2, 150 L</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mL ultra-fine II krótka strzykawka insulinowa</td><td>BD Medical</td><td>328822</td><td></td></tr><tr><td>3 ml strzykawka z końcówką Luer Lok</td><td>BD Medical</td><td></td><td></td>302113</tr><tr><td>Igła podskórna Terumo 25 G x 16 mm</td><td></td><td>TUAN2516R1</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Szybkie reakcje obejmujące szybką redystrybucję informacyjnego(m)RNA i zmiany w translacji mRNA są związane z trwającymi dostosowaniami homeostazy komórek. Dostosowania te mają kluczowe znaczenie dla przeżywalności komórek eukariotycznych i "kontroli uszkodzeń" podczas wahań poziomu składników odżywczych i zasolenia, temperatury oraz różnych stresów chemicznych i radiacyjnych. Ze względu na wysoce dynamiczny charakter odpowiedzi na poziomie RNA oraz niestabilność wielu produktów pośrednich RNA:RNA i RNA:białka, uzyskanie znaczącego obrazu stanu cytoplazmatycznego RNA jest możliwe tylko przy użyciu ograniczonej liczby metod. Eksperymenty z profilowaniem rybosomów w całym transkryptomie i sekwencjonowaniu RNA są jednymi z najbardziej pouczających źródeł danych do kontroli translacji. Jednak brak jednolitej stabilizacji RNA i RNA:białko pośrednie może prowadzić do różnych odchyleń, szczególnie w szybko rozwijających się szlakach odpowiedzi komórkowej. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół szybkiego utrwalania mający zastosowanie do komórek eukariotycznych o różnej przepuszczalności, aby pomóc w stabilizacji RNA i RNA: białko pośrednie. Podajemy również przykłady izolacji stabilizowanych kompleksów RNA:białko w oparciu o ich kosedymentację frakcjami rybosomalnymi i poli(rybo)somalnymi. Oddzielony ustabilizowany materiał może być następnie wykorzystany w ramach eksperymentów typu profilowanie rybosomów, takich jak sekwencjonowanie profilu zespolonego translacji (TCP-seq) i jego pochodne. Wszechstronność metod w stylu TCP-seq została obecnie zademonstrowana przez zastosowanie w różnych organizmach i typach komórek. Ustabilizowane kompleksy mogą być również dodatkowo oczyszczane pod względem powinowactwa i obrazowane za pomocą mikroskopii elektronowej, rozdzielane na różne frakcje poli(rybo)somalne i poddawane sekwencjonowaniu RNA, ze względu na łatwość odwrócenia usieciowania. W związku z tym metody oparte na szybkim schładzaniu i utrwalaniu formaldehydu, a następnie wzbogacaniu w oparciu o sedymentację lub inny rodzaj wzbogacania kompleksu RNA: białko, mogą być szczególnie interesujące w badaniu drobniejszych szczegółów szybkiej dynamiki kompleksu RNA: białko w żywych komórkach.

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Przepływ pracy polega na hodowaniu komórek w ściśle kontrolowanych warunkach środowiskowych, szybkim schładzaniu ich za pomocą topniejącej wody/lodu i utrwalaniu ze wstępnie zoptymalizowanym stężeniem formaldehydu i czasem inkubacji. Reakcja wiązania jest następnie wygaszana przy użyciu nadmiaru pierwszorzędowych związków zawierających grupy aminowe, takich jak glicyna lub trypsy. Komórki są zbierane, myte i mogą być przechowywane w stanie zamrożonym.Utrwalone komórki mogą być poddawane lizie mechanicznej lub chemicznej, a lizat służy do oddzielania frakcji rybosomalnych na podstawie ich wielkości cząsteczkowej, właściwości sedymentacyjnych lub markerów powinowactwa. W wyniku tego podejścia uzyskano wszechstronny materiał nadający się do immunologicznego oczyszczania i detekcji, wzbogacania kompleksów zawierających określone czynniki w mikroskopii elektronowej. Po głębokim blokowaniu usieciowanym, amplifikacji RNA lub analizach opartych na hybrydyzacji, możliwe staje się sekwencjonowanie RNA i spektrometria mas.Ustaw jednolitrową kulturę drożdży w wytrząsarce orbitalnej o początkowej gęstości optycznej nie większej niż 0,05 jednostki absorbancji przy 600 nanometrach i użyj pożywki peptonowej i dekstrozowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Ustawić wirówkę preparatywną z kompatybilnym rotorem i butelkami wirówkowymi do granulowania płynnej zawiesiny komórek drożdży w temperaturze 5000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zapisuj gęstość optyczną rosnących komórek.Musi wynosić od 0,6 do 0,8 jednostki absorbancji i 600 nanometrów w momencie pobierania, jeśli faza wzrostu wykładniczego jest przedmiotem zainteresowania. Gdy komórki będą gotowe, ustaw pojemnik na lód w okapie chemicznym z piekarzem zawierającym 250 gramów czystego pokruszonego lodu wodnego, a także pokaż 25 mililitrów trypsyny i świeżo zakupionego stabilizowanego metanolem 37% roztworu formaldehydu wewnątrz okapu. Wlej jedną najnowszą kulturę komórkową do piekarza zawierającego lód.Następnie dodaj 75 mililitrów 37% formaldehydu do końcowego stężenia 2,2% wagowo nad objętością, intensywnie mieszaj mieszaninę, aż lód się rozpuści. Gdy lód się rozpuści, ustaw minutnik na 10 minut Po inkubacji przez 10 minut przenieś kulturę do wstępnie schłodzonych butelek wirówkowych i osadzaj komórki przez odwirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 5000 G przez pięć minut. Podczas wirowania należy wstępnie schłodzić rurkę o pojemności 50 mililitrów i przechowywać świeżo przygotowany bufor A zawierający glicynę, aby zneutralizować pozostały formaldehyd na lodzie.Po odwirowaniu umieść probówki wirówkowe na lodzie tak, aby strona z granulkami stykała się z lodem. Umieścić rurki pod wyciągiem i wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady formaldehydu. Ponownie zawiesić osad komórkowy ze starych probówek w 20 mililitrach buforu A za pomocą 25-mililitrowej stripettetki i przenieść do 50-mililitrowej probówki.Uzupełnić objętość do 40 mililitrów buforem A i zebrać komórki płuczące przez odwirowanie do czterech stopni Celsjusza, 5000 G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 40-mililitrowym buforze A, który jest buforem A niezawierającym glicyny, w celu usunięcia zanieczyszczenia glicyną. Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 5000 G przez pięć minut.Powtórz pranie z buforem A jeszcze raz, jeszcze raz. Odrzucić supernatant i umieścić osad komórkowy na lodzie. Zważyć probówkę z osadem, masa mokrych komórek powinna wynosić około jednego grama na jeden litr kultury komórkowej.Wypełnij styropian z pudełka wyłożonego folią aluminiową ciekłym azotem na głębokość około trzech centymetrów. Umieść w 50 mililitrowej tubie pionowo w pudełku. Ponownie zawiesić osad w 550 mikrolitrach buforu A dwa, pipetując i wirując przez 10 sekund.Dodaj 10 mikrolitrów po 40 jednostek na mikrolitr inhibitora RNazy i ponownie wiruj przez 10 sekund. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra wlej zawiesinę komórek do 50-mililitrowej dwulitrowej zawierającej ciekły azot. Aby przygotować się do następnego kroku, wstępnie schłodzić 1,5-mililitrowe probówki bez jąder na suchym lodzie i 10-mililitrowych naczyniach do mielenia ze stali nierdzewnej.Przenieś kropelki zawiesiny zamrożonych komórek do słoików za pomocą czystej, sterylnej szpatułki. Zanurz naczynia mielące w ciekłym azocie na jedną minutę, upewniając się, że faza ciekła pozostaje nad złączem. Ustaw młynek mieszający Cryo na 27 Hz do mieszania przez jedną minutę.Mieszać szczelnie zamknięte naczynia mielące o częstotliwości 27 Hz przez jedną minutę w młynie miksującym. Ponownie schłodzić słoiki w ciekłym azocie jak poprzednio i wstrząsać jeszcze przez minutę. Przenieś słoiki do pojemnika na lód zawierającego suchy lód wraz z 1,5-mililitrowymi probówkami bez jąder.Za pomocą małej stalowej szpatułki przenieś wyniki wyściełanego daktylu do probówek. Następnie przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W dwóch kolbach T175 hoduje się komórki HEK 293 do 60 do 70% konfluencji i zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dalbeko i 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 stopni i 5% dwutlenku węgla.Co najmniej trzy godziny przed pożądanym czasem utrwalania zastąpić pożywkę kolby T175 dokładnie 30 mililitrami wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki. Przygotuj zamrażalnik po brzegi z pokruszonym lodem wodnym i trzymaj w dygestorium wraz z wymaganymi, również lód. Aby schłodzić komórki, wyjmij kolbę T175 z inkubatora i formalnie dociśnij ją do lodu, zapewniając maksymalny kontakt z powierzchnią.Wewnątrz okapu oparowego przechylić kolbę na bok tak, aby pożywka zbierała się po stronie przeciwnej do komórek. Odpipetować 168 mikrolitrów 37% objętościowo formaldehydu bezpośrednio do zbiorczego podłoża. Daje końcowe stężenie 0,2% formaldehydu.Natychmiast wymieszaj. Inkubować kolby na lodzie przez kolejne 10 minut. Wylać pożywkę do odpowiedniego pojemnika na odpady przez stronę kolby przeciwną do komórek.Za pomocą strippetu odpipetuj 30 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dalbeko bez jonów wapnia i magnezu, a dodatkowo zawierającej 50 milimolową glicynę delikatnie po stronie przeciwnej do komórek. Wymieszać, kołysząc kolbą, ustawić lampę błyskową w pozycji poziomej i inkubować na lodzie jeszcze przez 10 minut. Wylej roztwór przez stronę kolby przeciwną do komórki i delikatnie dodaj siedem mililitrów standardowego 0,25% roztworu EDTA trypsyny, aby odłączyć i ponownie zawiesić komórki.Inkubować kolbę w temperaturze pokojowej przez pięć, maksymalnie 10 minut. Umieścić kolbę pionowo i za pomocą strippetu zebrać oderwane komórki, delikatnie myjąc wszelkie pozostałości ze ścianek kolby i przenieść zawiesinę do 50-mililitrowej rurki ustawionej na lodzie. Natychmiast uzupełnij zebrany roztwór zawiesiny 20 mililitrami kompletnej pożywki i wymieszaj, delikatnie obracając probówkę.Granulować komórki, odwirowując probówkę o stężeniu 100 G przez pięć minut i cztery stopnie Celsjusza. Osad komórkowy musi być wyraźnie widoczny. Odlej pożywkę i delikatnie ponownie zawieś granulat w 10 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dalbeko bez glicyny.Ponownie odwirować probówkę przy 100 G przez pięć minut i w temperaturze czterech stopni Celsjusza Odlewać bufor do przemywania i ponownie zawiesić osad w 800 mikrolitrach lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dalbeko bez glicyny, ale zawierającego jony magnezu i wapnia. Przenieś ponownie zawieszone komórki do nowej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej o niskiej wiązalności białek. Odwirować probówkę o stężeniu 100 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Na tym etapie osad komórkowy można zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub przejść do etapu lizy komórek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy na bazie niejonowego, niedenaturującego detergentu i siedem mikrolitrów inhibitora arginazy i dobrze wymieszać, pipetując za pomocą jednej mililitrowej końcówki.Ostrożnie przymocuj igłę o rozmiarze 25 do strzykawki o pojemności od jednego do trzech mililitrów i energicznie pipetuj mieszaninę, wykonując co najmniej siedem powolnych ruchów wlotu w górę i szybkich ruchów wydechu w dół. Wyrzuć strzykawkę i igłę do pojemnika na ostre narzędzia i powtórz procedurę z igłą o rozmiarze 31 i strzykawką o pojemności 0,3 mililitra. Wyrzuć strzykawkę i igłę do pojemnika na ostry przedmiot.Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni, aby usunąć resztki komórek. Przenieś supernatant do nowej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra o niskiej wiązalności białek. Przechowuj zarówno resztki komórek, jak i lizat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Kompleksy translacyjne są wrażliwe na skład jonowy. Pominięcie chlorku magnezu i dodanie EDTA zniosło wysokie właściwości sedymentacyjne i chociaż chlorek wapnia skutkował lepszymi pikami wyników, poprawa była marginalna. W związku z tym wybraliśmy bufor pierwszy.2,2% wagowo formaldehydu doskonale zakonserwował polisomy i nie zmniejszył ogólnej wydajności w porównaniu z 4% objętościowo formaldehydu. W komórkach ssaków zastosowano znacznie niższe stężenie formaldehydu wynoszące 0,2% wagowo. Ponieważ wyższe stężenia powodowały znaczne straty materiału polirybosomalnego.15 milimolowy EDTA dodany do lizatu i wszystkich kolejnych wykazywał wyraźnie mniejszy efekt destabilizacyjny na frakcje polisomalne, pochodzące z utrwalonych komórek. Efekt ten został częściowo powtórzony za pomocą 50-milimolowego EDTA z materiałem z 4% utrwalonych komórek, odpornych, rozwijających się lepiej. Niedobór glukozy wywołuje jeden z najbardziej dramatycznych i szybkich efektów hamujących translację drożdży.Zarówno demontaż polisomów wywołany przez nerwy, jak i miejscowo wywołany przez nie rozkład polisomów był nieznacznie, ale ewidentnie więcej polisomów zatrzymywanych w nisko dodanej glukozie. Co ważne, materiał polissomalny z komórek utrwalonych wykazuje duże rozróżnienie między komórkami wygłodzonymi i niezagłodzonymi, co wskazuje na przydatność wiązania formaldehydu w celu zachowania różnic w dynamicznych procesach translacyjnych. W podejściach takich jak tacy paysake może być dodatkowo wnikliwe usunięcie małych podjednostek rybosomalnych, które nie osadzają się dobrze z kompletnymi kłączami, dla których zastosowaliśmy dwustopniowe ultrawirowanie, pozwalające na izolację diazomy opornych na RNazy SSU, LSU, RS, DS i polisomów wysokiego rzędu potwierdzonych mikroskopią elektronową frakcji stałych.W porównaniu z komórkami nieutrwalonymi, materiał z komórek utrwalonych wykazywał podwyższoną obecność labilnego eIF4A w najszybciej sedymentujących frakcjach rybosomalnych. Używając stałego materiału ze szczepu tapi eIF4A do wychwytywania i wzbogacania kompleksów zawierających eIF4A za pomocą magnetycznych kulek IDG, byliśmy w stanie zaobserwować selektywne wzbogacanie eIF4A w porównaniu z beta-aktyną w SSU i RS, ale nie frakcje LSU z drugiego gradientu po demontażu RNazy. W porównaniu z innymi metodami odpoczynku translacyjnego, szybkość działania formaldehydu przez błony komórkowe i bezkrytyczny charakter wiązań krzyżowych obiecuje zachowanie maksymalnej różnorodności produktów pośrednich kompleksu translacyjnego.Nasze odkrycia potwierdzają przydatność szybkiego wiązania formaldehydu do stabilizacji wysoce przejściowych kompleksów i dowodzą przydatności w scenariuszach szybkich reakcji komórkowych na zmiany środowiskowe lub warunki stresowe.

rapid-vivo-fixation-isolation-translational-complexes-from-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.<br...

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę szybkiego utrwalania kompleksów translacyjnych in vivo w komórkach drożdży i ssaczych przy użyciu formaldehydu. Technika umożliwia analizę dynamicznych interakcji RNA:białko w biologii molekularnej.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Przeglądaj więcej filmów