Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Przepływ pracy polega na hodowaniu komórek w ściśle kontrolowanych warunkach środowiskowych, szybkim schładzaniu ich za pomocą topniejącej wody/lodu i utrwalaniu ze wstępnie zoptymalizowanym stężeniem formaldehydu i czasem inkubacji. Reakcja wiązania jest następnie wygaszana przy użyciu nadmiaru pierwszorzędowych związków zawierających grupy aminowe, takich jak glicyna lub trypsy. Komórki są zbierane, myte i mogą być przechowywane w stanie zamrożonym.

Utrwalone komórki mogą być poddawane lizie mechanicznej lub chemicznej, a lizat służy do oddzielania frakcji rybosomalnych na podstawie ich wielkości cząsteczkowej, właściwości sedymentacyjnych lub markerów powinowactwa. W wyniku tego podejścia uzyskano wszechstronny materiał nadający się do immunologicznego oczyszczania i detekcji, wzbogacania kompleksów zawierających określone czynniki w mikroskopii elektronowej. Po głębokim blokowaniu usieciowanym, amplifikacji RNA lub analizach opartych na hybrydyzacji, możliwe staje się sekwencjonowanie RNA i spektrometria mas.

Ustaw jednolitrową kulturę drożdży w wytrząsarce orbitalnej o początkowej gęstości optycznej nie większej niż 0,05 jednostki absorbancji przy 600 nanometrach i użyj pożywki peptonowej i dekstrozowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Ustawić wirówkę preparatywną z kompatybilnym rotorem i butelkami wirówkowymi do granulowania płynnej zawiesiny komórek drożdży w temperaturze 5000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zapisuj gęstość optyczną rosnących komórek.

Musi wynosić od 0,6 do 0,8 jednostki absorbancji i 600 nanometrów w momencie pobierania, jeśli faza wzrostu wykładniczego jest przedmiotem zainteresowania. Gdy komórki będą gotowe, ustaw pojemnik na lód w okapie chemicznym z piekarzem zawierającym 250 gramów czystego pokruszonego lodu wodnego, a także pokaż 25 mililitrów trypsyny i świeżo zakupionego stabilizowanego metanolem 37% roztworu formaldehydu wewnątrz okapu. Wlej jedną najnowszą kulturę komórkową do piekarza zawierającego lód.

Następnie dodaj 75 mililitrów 37% formaldehydu do końcowego stężenia 2,2% wagowo nad objętością, intensywnie mieszaj mieszaninę, aż lód się rozpuści. Gdy lód się rozpuści, ustaw minutnik na 10 minut Po inkubacji przez 10 minut przenieś kulturę do wstępnie schłodzonych butelek wirówkowych i osadzaj komórki przez odwirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 5000 G przez pięć minut. Podczas wirowania należy wstępnie schłodzić rurkę o pojemności 50 mililitrów i przechowywać świeżo przygotowany bufor A zawierający glicynę, aby zneutralizować pozostały formaldehyd na lodzie.

Po odwirowaniu umieść probówki wirówkowe na lodzie tak, aby strona z granulkami stykała się z lodem. Umieścić rurki pod wyciągiem i wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady formaldehydu. Ponownie zawiesić osad komórkowy ze starych probówek w 20 mililitrach buforu A za pomocą 25-mililitrowej stripettetki i przenieść do 50-mililitrowej probówki.

Uzupełnić objętość do 40 mililitrów buforem A i zebrać komórki płuczące przez odwirowanie do czterech stopni Celsjusza, 5000 G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 40-mililitrowym buforze A, który jest buforem A niezawierającym glicyny, w celu usunięcia zanieczyszczenia glicyną. Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 5000 G przez pięć minut.

Powtórz pranie z buforem A jeszcze raz, jeszcze raz. Odrzucić supernatant i umieścić osad komórkowy na lodzie. Zważyć probówkę z osadem, masa mokrych komórek powinna wynosić około jednego grama na jeden litr kultury komórkowej.

Wypełnij styropian z pudełka wyłożonego folią aluminiową ciekłym azotem na głębokość około trzech centymetrów. Umieść w 50 mililitrowej tubie pionowo w pudełku. Ponownie zawiesić osad w 550 mikrolitrach buforu A dwa, pipetując i wirując przez 10 sekund.

Dodaj 10 mikrolitrów po 40 jednostek na mikrolitr inhibitora RNazy i ponownie wiruj przez 10 sekund. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra wlej zawiesinę komórek do 50-mililitrowej dwulitrowej zawierającej ciekły azot. Aby przygotować się do następnego kroku, wstępnie schłodzić 1,5-mililitrowe probówki bez jąder na suchym lodzie i 10-mililitrowych naczyniach do mielenia ze stali nierdzewnej.

Przenieś kropelki zawiesiny zamrożonych komórek do słoików za pomocą czystej, sterylnej szpatułki. Zanurz naczynia mielące w ciekłym azocie na jedną minutę, upewniając się, że faza ciekła pozostaje nad złączem. Ustaw młynek mieszający Cryo na 27 Hz do mieszania przez jedną minutę.

Mieszać szczelnie zamknięte naczynia mielące o częstotliwości 27 Hz przez jedną minutę w młynie miksującym. Ponownie schłodzić słoiki w ciekłym azocie jak poprzednio i wstrząsać jeszcze przez minutę. Przenieś słoiki do pojemnika na lód zawierającego suchy lód wraz z 1,5-mililitrowymi probówkami bez jąder.

Za pomocą małej stalowej szpatułki przenieś wyniki wyściełanego daktylu do probówek. Następnie przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W dwóch kolbach T175 hoduje się komórki HEK 293 do 60 do 70% konfluencji i zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dalbeko i 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 stopni i 5% dwutlenku węgla.

Co najmniej trzy godziny przed pożądanym czasem utrwalania zastąpić pożywkę kolby T175 dokładnie 30 mililitrami wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki. Przygotuj zamrażalnik po brzegi z pokruszonym lodem wodnym i trzymaj w dygestorium wraz z wymaganymi, również lód. Aby schłodzić komórki, wyjmij kolbę T175 z inkubatora i formalnie dociśnij ją do lodu, zapewniając maksymalny kontakt z powierzchnią.

Wewnątrz okapu oparowego przechylić kolbę na bok tak, aby pożywka zbierała się po stronie przeciwnej do komórek. Odpipetować 168 mikrolitrów 37% objętościowo formaldehydu bezpośrednio do zbiorczego podłoża. Daje końcowe stężenie 0,2% formaldehydu.

Natychmiast wymieszaj. Inkubować kolby na lodzie przez kolejne 10 minut. Wylać pożywkę do odpowiedniego pojemnika na odpady przez stronę kolby przeciwną do komórek.

Za pomocą strippetu odpipetuj 30 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dalbeko bez jonów wapnia i magnezu, a dodatkowo zawierającej 50 milimolową glicynę delikatnie po stronie przeciwnej do komórek. Wymieszać, kołysząc kolbą, ustawić lampę błyskową w pozycji poziomej i inkubować na lodzie jeszcze przez 10 minut. Wylej roztwór przez stronę kolby przeciwną do komórki i delikatnie dodaj siedem mililitrów standardowego 0,25% roztworu EDTA trypsyny, aby odłączyć i ponownie zawiesić komórki.

Inkubować kolbę w temperaturze pokojowej przez pięć, maksymalnie 10 minut. Umieścić kolbę pionowo i za pomocą strippetu zebrać oderwane komórki, delikatnie myjąc wszelkie pozostałości ze ścianek kolby i przenieść zawiesinę do 50-mililitrowej rurki ustawionej na lodzie. Natychmiast uzupełnij zebrany roztwór zawiesiny 20 mililitrami kompletnej pożywki i wymieszaj, delikatnie obracając probówkę.

Granulować komórki, odwirowując probówkę o stężeniu 100 G przez pięć minut i cztery stopnie Celsjusza. Osad komórkowy musi być wyraźnie widoczny. Odlej pożywkę i delikatnie ponownie zawieś granulat w 10 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dalbeko bez glicyny.

Ponownie odwirować probówkę przy 100 G przez pięć minut i w temperaturze czterech stopni Celsjusza Odlewać bufor do przemywania i ponownie zawiesić osad w 800 mikrolitrach lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dalbeko bez glicyny, ale zawierającego jony magnezu i wapnia. Przenieś ponownie zawieszone komórki do nowej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej o niskiej wiązalności białek. Odwirować probówkę o stężeniu 100 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Na tym etapie osad komórkowy można zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub przejść do etapu lizy komórek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy na bazie niejonowego, niedenaturującego detergentu i siedem mikrolitrów inhibitora arginazy i dobrze wymieszać, pipetując za pomocą jednej mililitrowej końcówki.

Ostrożnie przymocuj igłę o rozmiarze 25 do strzykawki o pojemności od jednego do trzech mililitrów i energicznie pipetuj mieszaninę, wykonując co najmniej siedem powolnych ruchów wlotu w górę i szybkich ruchów wydechu w dół. Wyrzuć strzykawkę i igłę do pojemnika na ostre narzędzia i powtórz procedurę z igłą o rozmiarze 31 i strzykawką o pojemności 0,3 mililitra. Wyrzuć strzykawkę i igłę do pojemnika na ostry przedmiot.

Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni, aby usunąć resztki komórek. Przenieś supernatant do nowej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra o niskiej wiązalności białek. Przechowuj zarówno resztki komórek, jak i lizat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Kompleksy translacyjne są wrażliwe na skład jonowy. Pominięcie chlorku magnezu i dodanie EDTA zniosło wysokie właściwości sedymentacyjne i chociaż chlorek wapnia skutkował lepszymi pikami wyników, poprawa była marginalna. W związku z tym wybraliśmy bufor pierwszy.

2,2% wagowo formaldehydu doskonale zakonserwował polisomy i nie zmniejszył ogólnej wydajności w porównaniu z 4% objętościowo formaldehydu. W komórkach ssaków zastosowano znacznie niższe stężenie formaldehydu wynoszące 0,2% wagowo. Ponieważ wyższe stężenia powodowały znaczne straty materiału polirybosomalnego.

15 milimolowy EDTA dodany do lizatu i wszystkich kolejnych wykazywał wyraźnie mniejszy efekt destabilizacyjny na frakcje polisomalne, pochodzące z utrwalonych komórek. Efekt ten został częściowo powtórzony za pomocą 50-milimolowego EDTA z materiałem z 4% utrwalonych komórek, odpornych, rozwijających się lepiej. Niedobór glukozy wywołuje jeden z najbardziej dramatycznych i szybkich efektów hamujących translację drożdży.

Zarówno demontaż polisomów wywołany przez nerwy, jak i miejscowo wywołany przez nie rozkład polisomów był nieznacznie, ale ewidentnie więcej polisomów zatrzymywanych w nisko dodanej glukozie. Co ważne, materiał polissomalny z komórek utrwalonych wykazuje duże rozróżnienie między komórkami wygłodzonymi i niezagłodzonymi, co wskazuje na przydatność wiązania formaldehydu w celu zachowania różnic w dynamicznych procesach translacyjnych. W podejściach takich jak tacy paysake może być dodatkowo wnikliwe usunięcie małych podjednostek rybosomalnych, które nie osadzają się dobrze z kompletnymi kłączami, dla których zastosowaliśmy dwustopniowe ultrawirowanie, pozwalające na izolację diazomy opornych na RNazy SSU, LSU, RS, DS i polisomów wysokiego rzędu potwierdzonych mikroskopią elektronową frakcji stałych.

W porównaniu z komórkami nieutrwalonymi, materiał z komórek utrwalonych wykazywał podwyższoną obecność labilnego eIF4A w najszybciej sedymentujących frakcjach rybosomalnych. Używając stałego materiału ze szczepu tapi eIF4A do wychwytywania i wzbogacania kompleksów zawierających eIF4A za pomocą magnetycznych kulek IDG, byliśmy w stanie zaobserwować selektywne wzbogacanie eIF4A w porównaniu z beta-aktyną w SSU i RS, ale nie frakcje LSU z drugiego gradientu po demontażu RNazy. W porównaniu z innymi metodami odpoczynku translacyjnego, szybkość działania formaldehydu przez błony komórkowe i bezkrytyczny charakter wiązań krzyżowych obiecuje zachowanie maksymalnej różnorodności produktów pośrednich kompleksu translacyjnego.

Nasze odkrycia potwierdzają przydatność szybkiego wiązania formaldehydu do stabilizacji wysoce przejściowych kompleksów i dowodzą przydatności w scenariuszach szybkich reakcji komórkowych na zmiany środowiskowe lub warunki stresowe.