Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Makrofagi związane z nowotworami przeciwzapalnymi są związane z progresją i złym rokowaniem w przypadku raka. Protokół ten jest przewodnikiem po różnicowaniu i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Obecnie nie ma ustalonego modelu przeciwzapalnej polaryzacji THP-1.

Protokół ten wykorzystuje odpowiednie okresy spoczynku i przedłużony proces polaryzacji, aby stworzyć odrębny podtyp makrofagów podobny do M2. Rozwój guza, na przykład w raku jelita grubego i przebudowie tkanek, jest kontrolowany przez makrofagi przeciwzapalne. Wśród badań badających ich funkcję, standaryzowane tworzenie odrębnego podtypu podobnego do M2 zapewnia powtarzalne wyniki.

Zacznij od ustawienia timera na 150 sekund. Wyjąć zamrożoną fiolkę zawierającą linię komórkową THP-1 z ciekłego azotu i natychmiast rozmrozić fiolkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej, uruchamiając stoper zaraz po włożeniu fiolki do łaźni wodnej. Poluzuj nakrętkę, aby uwolnić ciśnienie powstałe w wyniku procesu rozmrażania, upewniając się, że otwór rurki nie styka się z wodą, aby uniknąć zanieczyszczenia.

Rozmrozić zawiesinę komórkową, aż w fiolce pozostanie odłamek lodu o wielkości około czterech milimetrów i natychmiast przejść do następnego kroku. Przenieś fazę ciekłą zawiesiny komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej dziewięć mililitrów ciepłej pożywki wzrostowej. Następnie przenieś jeden mililitr tej ciepłej zawiesiny komórek do fiolki THP-1 i z powrotem do 15-mililitrowej probówki, aby stopić pozostały wiór lodowy i przepłukać fiolkę, aby upewnić się, że żadne komórki nie zostały pozostawione.

Zawiesinę należy delikatnie wymieszać, pipetując ją w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Usunąć około 10 mikrolitrów próbki, aby policzyć komórki pod kątem żywotności za pomocą błękitu trypanowego. Komórki z czystą cytoplazmą są żywotne, niebieska cytoplazma wskazuje na śmierć komórki.

Podczas liczenia odkręcaj zawiesinę ciepłych komórek w temperaturze 200 razy G przez siedem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej, aby osiągnąć gęstość komórek 500 000 komórek na mililitr. Delikatnie wymieszaj zawiesinę i przenieś po 22 mililitry do kolb do kultur komórkowych T75 każda.

Przechowuj kolby pionowo w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy stężeniu 5% dwutlenku węgla i wymieniaj pożywkę wzrostową co trzy do czterech dni. Przygotuj zawiesinę komórkową, aby wysiać komórki o gęstości 300 000 na mililitr na studzienkę na 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych. Delikatnie wymieszaj podłoże i przygotuj porcje po 26 mililitrów w 50-mililitrowych probówkach.

Przenieś jeden mililitr pożywki zawierającej komórki do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Delikatnie wymieszać pożywkę, pipetując ją w górę i w dół między transferami. Trzymaj świeżo przygotowany roztwór roboczy PMA na lodzie i dodaj 100 nanogramów PMA do dołka.

Inkubować płytki w inkubatorze bez dalszej obróbki przez 72 godziny. Po 72 godzinach usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją jednym mililitrem świeżej pożywki wzrostowej, uważając, aby nie dotykać dna studzienek końcówkami pipet. Pozostaw komórki na kolejne 96 godzin w inkubatorze.

Usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją jednym mililitrem świeżego podłoża wzrostowego. Dodać 20 nanogramów interleukiny 4 i 20 nanogramów interleukiny 13 na studzienkę. Następnie pozwól komórkom odpoczywać przez 48 godzin w inkubatorze.

Powtórz cały proces po 48 godzinach i pozwól komórkom odpoczywać przez kolejne 48 godzin w inkubatorze. Usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją jednym mililitrem świeżego podłoża wzrostowego. Następnie pozwól komórkom odpoczywać przez 48 godzin w inkubatorze.

Usuń ciepłe podłoże komórkowe z każdej studzienki i zastąp je jednomililitrową mieszaniną lodowatego PBS bez wapnia i magnezu oraz 5% FBS. Następnie natychmiast umieść płytkę komórkową na lodzie na 45 minut. Po 45 minutach na lodzie zeskrob komórki za pomocą mini skrobaków do komórek.

Delikatnie przenieś oderwane makrofagi do zimnego PBS i 5% FBS w 15-mililitrowej probówce trzymanej na lodzie. Makrofagi pochodzące z metody polaryzacji wykazują ekspresję markerów CD14, a także CD11b. Markery monocytów i makrofagów CD14 i CD11b ulegały ekspresji odpowiednio w 70,9% i 74,7% komórek.

Komórki wykazywały niskie poziomy powierzchniowe markera podobnego do M1 CD80 w 0,2% komórek i wysokie poziomy powierzchniowe markera podobnego do M2 CD206 w 62,6% komórek. Ponieważ komórki THP-1 w pożywce mają tendencję do opadania na dno fiolki i są łatwe do aktywacji przez naprężenia mechaniczne, ważne jest delikatne mieszanie i obchodzenie się z komórkami. Makrofagi podobne do M2 są tworzone w sposób powtarzalny i zostały scharakteryzowane za pomocą QR-TPCR, ELISA i cytometrii przepływowej.

Jest to podstawa do badania mechanizmów przeciwzapalnych w rozwoju nowotworów lub przebudowie tkanek.