Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki indukowane białkiem może uzupełniać pomiary FRET pojedynczej cząsteczki podczas badania subpopulacji strukturalnych i konformacji białek, szczególnie w przypadkach, gdy odrębne subpopulacje strukturalne zgłaszają stabilne struktury lokalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wychwytuje ona odrębne subpopulacje strukturalne specyficzne dla danego miejsca w oparciu o bliskość miejsca znakowania barwnika do powierzchni białka. Jednocząsteczkowe, indukowane białkiem wzmocnienie fluorescencji można zastosować do dowolnego systemu biomolekularnego będącego przedmiotem zainteresowania w celu zbadania odrębnych, lokalnych, strukturalnych subpopulacji.

Rozpocznij od przygotowania 25 pikomolarnych alfa-synukleiny znakowanych sulfo-Cy3 w buforze pomiarowym w probówce wiążącej o niskiej zawartości białka. Dodać 100 mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr BSA do 18-komorowego szkiełka mikroskopowego i inkubować przez jedną minutę, a następnie wyrzucić BSA. Dodać 100 mikrolitrów 25 pikomolarnych próbek alfa-synukleiny znakowanej sulfo-Cy3 do komory szkiełka nakrywkowego.

Następnie, w celu pozyskania danych, dodaj kroplę ultraczystej wody na wierzch soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie o dużej aperturze numerycznej, zamocuj szkiełko nakrywkowe w komorze stolika, a następnie zainstaluj zespół na górze stolika mikroskopu. Przesuń soczewkę obiektywu do góry, aż kropla wody na górze soczewki obiektywu rozmazie się na dole szkiełka nakrywkowego, a następnie otwórz migawkę lasera. Gdy soczewka obiektywu przesunie się w górę, sprawdź wzór przewiewnych pierścieni w kamerze CCD.

Pierwszy pierścień reprezentuje ognisko na granicy faz woda/szkło, a drugi pierścień reprezentuje ognisko na granicy faz między szklanką a roztworem próbki. Zwiększ wysokość soczewki obiektywu o 75 mikrometrów, aby skupić laser głęboko w roztworze w celu zminimalizowania autofluorescencji ze szklanej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Dostosuj moc lasera na soczewce obiektywu około 100 mikrowatów.

Rozpocznij akwizycję wykrytych fotonów na określony czas. Otwórz notesy Jupyter Notebooks, a następnie otwórz przykładowy notes. Załaduj plik danych FRETBursts i Photon-HDF5.

Użyj histogramu czasów międzyfotonowych, aby obliczyć współczynniki tła dla każdych 30 sekund pozyskiwania danych. Przesuwaj okno czasowe jednego fotonu na raz przez 20 kolejnych fotonów i zbierz dane o fotonach, jeśli chwilowa szybkość fotonów F jest co najmniej 11 razy większa niż szybkość tła dla tego okresu pozyskiwania danych. Oblicz rozmiar serii i ilość fotonów w serii, czas trwania serii, różnicę czasu między czasem ostatniego i pierwszego wykrycia fotonu w serii, jasność impulsu, największą wartość chwilowej szybkości fotonów w serii oraz separację serii, odstęp czasu między kolejnymi rozbłyskami.

Wykreśl histogram wartości jasności serii z osią zdarzeń w skali logarytmicznej. Zdefiniuj próg jasności serii jako minimalną wartość jasności serii, od której histogram wykazuje wzór zaniku, i wybiera serie o wartościach jasności większych niż próg jasności serii. Aby zmierzyć średni czas życia fluorescencji rozbłysku, wykreśl histogram nanoczasu fotonów dla wszystkich fotonów w wybranych seriach z osią liczby fotonów w skali logarytmicznej.

Zdefiniuj próg nanoczasowy jako minimalną wartość nanoczasową, od której histogram nanoczasów fotonów wykazuje wzór zaniku. Wybierz tylko te fotony, które są nanorazy większe niż próg nanoczasu. Oblicz średnią algebraiczną wszystkich wybranych nanoczasów fotonów.

Odejmij próg nanoczasowy od średniej algebraicznej nanoczasu fotonów. Uzyskana wartość to średni nanoczas fotonu rozbłysku, wprost proporcjonalny do średniego czasu życia fluorescencji. Wykreśl histogram wszystkich średnich czasów życia fluorescencji rozbłysków.

Mogą pojawić się centralnie rozmieszczone subpopulacje czasu trwania fluorescencji. Subpopulacje o niższych wartościach średnich reprezentują gatunki molekularne z Sulfo-Cy3, które nie były sterycznie zablokowane, podczas gdy subpopulacje o wyższych wartościach średnich reprezentują gatunki cząsteczek z S-Cy3, które były bardziej sterycznie zablokowane. Aby ocenić powolną dynamikę między impulsami, należy wykreślić histogram czasów separacji serii z osią czasu separacji w skali logarytmicznej.

Wybierz tę opcję, aby zapisać wszystkie pary kolejnych impulsów, które są oddzielone od siebie o czas krótszy niż maksymalny czas separacji, który definiuje subpopulację tej samej cząsteczki. Wykreśl histogram lub wykres rozrzutu średniego czasu życia fluorescencji pierwszego i drugiego rozbłysku dla wszystkich par rozbłysków, które powtórzyły się poniżej pewnego progu czasowego separacji. Histogramy średniego czasu życia fluorescencji pojedynczej, znakowanej S-Cy3 cząsteczki alfa-synukleiny-56 wykazały, że pierwsza subpopulacja miała charakterystyczny czas trwania fluorescencji wynoszący 1,6 nanosekundy i reprezentująca stany konformacyjne alfa-synukleiny z kilkoma powierzchniami białka w pobliżu reszty 56.

Druga subpopulacja miała charakterystyczny czas trwania fluorescencji wynoszący 3,5 nanosekundy i reprezentowała stany konformacyjne alfa-synukleiny z większą liczbą powierzchni białka w pobliżu reszty 56. Wiadomo, że nie-amyloidowe segmenty składnika beta cząsteczek alfa-synukleiny przyjmują spiralną, spinkę do włosów strukturę po związaniu się z pęcherzykami SDS, co zostało potwierdzone jako populacja pojedynczego kwiatu o charakterystycznym czasie życia około trzech nanosekund i braku subpopulacji o charakterystycznym czasie życia 1,6 nanosekundy. Histogram czasów separacji między kolejnymi impulsami pojedynczych cząsteczek informuje o powtarzających się cząsteczkach dla czasów separacji szybszych niż 100 milisekund, gdzie pierwszy i drugi impuls powstają z tej samej cząsteczki.

Średni histogram czasu życia fluorescencji wszystkich pojedynczych wybuchów cząsteczkowych wykazał subpopulacje o krótkim charakterystycznym czasie życia, a także o długim charakterystycznym czasie życia, co wskazuje, że poszczególne cząsteczki mogą przechodzić przejścia między różnymi średnimi wartościami czasu życia wolniej niż czas trwania impulsu. W czasie separacji serii wynoszącym maksymalnie 100 milisekund pojawiła się frakcja cząsteczek, które rozpoczęły się jako pierwszy wybuch w subpopulacji o krótkim czasie życia i powtórzyły się jako drugi wybuch w subpopulacji o długim czasie życia. Podczas gdy frakcja cząsteczek, która rozpoczęła się jako pierwszy wybuch w subpopulacji o długim czasie życia i powtórzyła się jako drugi wybuch w populacji o krótkim czasie życia, wskazuje na przejścia między dwiema subpopulacjami w ciągu 10 do 100 milisekund.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas analizy wyników eksperymentów, jest prawidłowe oddzielenie sygnałów fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek od tła i analiza rozbłysków z wystarczającą liczbą nanoczasów fotonów. Opracowanie smPIFE utorowało naukowcom drogę do zbadania interakcji białek kwasów nukleinowych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Postęp ten stanowi podstawę do badania lokalnej dynamiki strukturalnej w białkach.