Name: Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Odkryj technikę wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem na poziomie pojedynczych cząsteczek do badania lokalnych konformacji α-synukleiny. Ta metoda umożliwia identyfikację stabilnych struktur białkowych niewidocznych w klasycznych pomiarach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plazmid pT-t7 kodujący mutanta A56C α-Syn został nam podarowany w prezencie przez Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir i Dr. Elisha Haas. Artykuł ten był wspierany przez National Institutes of Health (NIH, grant R01 GM130942 dla E.L. jako subnagroda), Israel Science Foundation (grant 3565/20 w ramach KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), Milner Fund i Hebrew University of Jerusalem (fundusze startowe).

Wszystkich autorów nie łączy konflikt interesów.

Przeprowadzono szeroko zakrojone badania biochemiczne i biofizyczne w celu zbadania cech strukturalnych α-Syn i jego nieuporządkowanej natury 33,34,35,36,37,38. W kilku pracach wykorzystano już swobodnie dyfuzyjny smFRET do zbadania wewnątrzcząsteczkowej dynamiki monomeru α-Syn wolnego od wiązania. Prace te wykazały wysoką dy...

W ciągu ostatnich dwóch dekad, metody oparte na fluorescencji pojedynczych cząsteczek stały się potężnym narzędziem do pomiaru biomolekuł1,2, badając, jak rozkładają się różne parametry biomolekularne, a także jak dynamicznie przekształcają się między różnymi subpopulacjami tych parametrów z rozdzielczością poniżej milisekundy3,4,5. Parametry w tych technikach obejmują efektywność transferu energii w pomiarach FRET 6,7, anizotropia fluorescencji8,9, wydajność kwantowa fluorescencji i czas życia10,11, jako funkcja innego wygaszania fluorescencji12 lub wzmocnienie13 mechanizmów. Jeden z tych mechanizmów, lepiej znany jako wzmocnienie fluorescencji indukowanej białkiem (PIFE)14 wprowadza zwiększenie wydajności kwantowej fluorescencji i czasu życia jako funkcję sterycznej niedrożności swobodnej izomeryzacji fluoroforu w stanie wzbudzonym, spowodowanej przez powierzchnie białek w pobliżu barwnika14,15,16,17,18,19. Zarówno FRET, jak i PIFE są uważane za linijki spektroskopowe lub czujniki zbliżeniowe, ponieważ ich mierzony parametr jest bezpośrednio związany z miarą przestrzenną w znakowanej biocząsteczce podlegającej pomiarom. Podczas gdy wydajność FRET jest związana z odległością między parą barwników w zakresie 3-10 nm20, PIFE śledzi wzrost wydajności kwantowej fluorescencji lub czasu życia związany z odległością między barwnikiem a powierzchnią pobliskiego białka w zakresie 0-3 nm19.
Jednocząsteczkowy FRET jest szeroko stosowany do dostarczania informacji strukturalnych o wielu różnych systemach białkowych, w tym o białkach wewnętrznie nieuporządkowanych (IDPs)21, takich jak α-synukleina (α-Syn)22. α-Syn może tworzyć uporządkowane struktury po związaniu z różnymi biomolekułami i w różnych warunkach23,24,25,26,27,28,29,30. Jednak po odwiązaniu monomer α-Syn charakteryzuje się wysoką niejednorodnością konformacyjną z szybko konwertującymi konformacjami31,32.
Konformacje α-Syn były wcześniej badane przy użyciu różnych technik, które pomagają w identyfikacji dynamiki konformacyjnej takich wysoce heterogenicznych i dynamicznych układów białkowych33,34,35,36,37,38,39. Co ciekawe, jednocząsteczkowe pomiary FRET (smFRET) α-Syn w buforze wykazały pojedynczą populację FRET39,40, co jest wynikiem uśredniania w czasie dynamicznych konformacji, które przekształcają się w czasie znacznie szybszym niż typowy czas dyfuzji α-Syn przez plamkę konfokalną (czasy tak szybkie, jak kilka mikrosekund, a nawet szybsze, w stosunku do typowych milisekundowych czasów dyfuzji)40,41. Jednak użycie linijki spektroskopowej FRET o czułości odległości 3-10 nm czasami informuje tylko o ogólnych zmianach strukturalnych w małym białku, takim jak α-Syn. Pomiary pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem spektroskopowych czujników zbliżeniowych o czułości mniejszej odległości mogą potencjalnie informować o dynamice struktur lokalnych. W tym celu przeprowadzamy pomiary pojedynczych cząsteczek PIFE α-Syn i identyfikujemy różne subpopulacje czasów życia fluorescencji, mapując je na różne struktury lokalne z przejściami między nimi tak wolnymi, jak 100 ms. Praca ta podsumowuje czasowo-rozdzielcze pomiary smPIFE swobodnie dyfuzyjnych cząsteczek α-Syn pojedynczo, w buforze i po związaniu z membranami opartymi na SDS jako spektroskopowy czujnik zbliżeniowy pojedynczej cząsteczki krótkiego zasięgu.

<table><tbody><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15</td><td>Merc</td><td>C7715</td><td>odcięcie: 100 kDa</td></tr><tr><td>siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>cysteamina</td> Worki dializacyjne <td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>- MEGA GeBaFlex-tube</td><td>Gene Bio-Application</td><td>MEGA320</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia Fast SeeBand</td><td>Bio-Application</td><td>genu SB050</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Odsalanie 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1408</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy (TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>izopropyl &beta;-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>Magnez chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna MonoQ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54807</td><td></td></tr><tr><td>białkowa rurka LoBind</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108094</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Płukanie &mikroszkiełka 18</td><td>Ibidi</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacze sterylnych komórek, szpatułki Drigalskiego</td><td>mini-plast</td><td>815-004-05-001</td><td></td></tr><tr><td>siarczan streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-Cy3&nbsp; maleimidowy</td><td>abcam</td><td>ab146493</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Używanie linijek spektroskopowych do śledzenia wielu konformacji pojedynczych biomolekuł i ich dynamiki zrewolucjonizowało zrozumienie dynamiki strukturalnej i jej wkład w biologię. Podczas gdy linijka oparta na fret informuje o odległościach między barwnikami w zakresie 3-10 nm, inne techniki spektroskopowe, takie jak wzmocnienie fluorescencji indukowane białkiem (PIFE), informują o bliskości między barwnikiem a powierzchnią białka w krótszym zakresie 0-3 nm. Niezależnie od wybranej metody, jej zastosowanie do pomiaru swobodnie dyfuzujących biomolekuł pojedynczo uzyskuje histogramy parametru eksperymentalnego, dając oddzielne, centralnie rozmieszczone subpopulacje biomolekuł, gdzie każda subpopulacja reprezentuje albo pojedynczą konformację, która pozostała niezmieniona w ciągu milisekund, albo wiele konformacji, które interkonwertują znacznie szybciej niż milisekundy, a zatem uśrednioną subpopulację. W jednocząsteczkowym FRET, gdzie parametrem zgłaszanym na histogramach jest wydajność FRET między barwnikami, wewnętrznie nieuporządkowane białko, takie jak monomer α-synukleiny w buforze, zostało wcześniej zgłoszone jako wykazujące pojedynczą uśrednioną subpopulację wielu konformacji szybko ulegających intertransformacji. Chociaż te wcześniejsze odkrycia zależą od zakresu 3-10 nm linijki opartej na FRET, staraliśmy się przetestować to białko za pomocą jednocząsteczkowego PIFE, w którym śledzimy czas trwania fluorescencji specyficznych dla miejsca białek α-synukleiny znakowanych sCy3 pojedynczo. Co ciekawe, przy użyciu tego spektroskopowego czujnika zbliżeniowego krótszego zasięgu, α-synukleina znakowana sCy3 wykazuje kilka subpopulacji o wyraźnie różnych średnich czasach życia, które przekształcają się w ciągu 10-100 ms. Wyniki te pokazują, że chociaż α-synukleina może być globalnie zaburzona, to jednak osiąga stabilne struktury lokalne. Podsumowując, w tej pracy podkreślamy zalety stosowania różnych spektroskopowych czujników zbliżeniowych, które śledzą lokalne lub globalne zmiany strukturalne po jednej biomolekułach na raz.

Jako białko wewnętrznie nieuporządkowane (IDP), w stanie niezwiązanym z inną biomolekułą, α-Syn wykazuje dynamikę strukturalną pomiędzy wieloma konformacjami, z przejściami zachodzącymi w czasie kilku mikrosekund40&#160;a nawet setek nanosekund41. Gdy α-Syn przechodzi przez punkt konfokalny, może przejść tysiące przejść między konformacjami. Rzeczywiście, tak właśnie było w przypadku zastosowania smFRET39,40. W nini...

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki indukowane białkiem może uzupełniać pomiary FRET pojedynczej cząsteczki podczas badania subpopulacji strukturalnych i konformacji białek, szczególnie w przypadkach, gdy odrębne subpopulacje strukturalne zgłaszają stabilne struktury lokalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wychwytuje ona odrębne subpopulacje strukturalne specyficzne dla danego miejsca w oparciu o bliskość miejsca znakowania barwnika do powierzchni białka. Jednocząsteczkowe, indukowane białkiem wzmocnienie fluorescencji można zastosować do dowolnego systemu biomolekularnego będącego przedmiotem zainteresowania w celu zbadania odrębnych, lokalnych, strukturalnych subpopulacji.Rozpocznij od przygotowania 25 pikomolarnych alfa-synukleiny znakowanych sulfo-Cy3 w buforze pomiarowym w probówce wiążącej o niskiej zawartości białka. Dodać 100 mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr BSA do 18-komorowego szkiełka mikroskopowego i inkubować przez jedną minutę, a następnie wyrzucić BSA. Dodać 100 mikrolitrów 25 pikomolarnych próbek alfa-synukleiny znakowanej sulfo-Cy3 do komory szkiełka nakrywkowego.Następnie, w celu pozyskania danych, dodaj kroplę ultraczystej wody na wierzch soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie o dużej aperturze numerycznej, zamocuj szkiełko nakrywkowe w komorze stolika, a następnie zainstaluj zespół na górze stolika mikroskopu. Przesuń soczewkę obiektywu do góry, aż kropla wody na górze soczewki obiektywu rozmazie się na dole szkiełka nakrywkowego, a następnie otwórz migawkę lasera. Gdy soczewka obiektywu przesunie się w górę, sprawdź wzór przewiewnych pierścieni w kamerze CCD.Pierwszy pierścień reprezentuje ognisko na granicy faz woda/szkło, a drugi pierścień reprezentuje ognisko na granicy faz między szklanką a roztworem próbki. Zwiększ wysokość soczewki obiektywu o 75 mikrometrów, aby skupić laser głęboko w roztworze w celu zminimalizowania autofluorescencji ze szklanej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Dostosuj moc lasera na soczewce obiektywu około 100 mikrowatów.Rozpocznij akwizycję wykrytych fotonów na określony czas. Otwórz notesy Jupyter Notebooks, a następnie otwórz przykładowy notes. Załaduj plik danych FRETBursts i Photon-HDF5.Użyj histogramu czasów międzyfotonowych, aby obliczyć współczynniki tła dla każdych 30 sekund pozyskiwania danych. Przesuwaj okno czasowe jednego fotonu na raz przez 20 kolejnych fotonów i zbierz dane o fotonach, jeśli chwilowa szybkość fotonów F jest co najmniej 11 razy większa niż szybkość tła dla tego okresu pozyskiwania danych. Oblicz rozmiar serii i ilość fotonów w serii, czas trwania serii, różnicę czasu między czasem ostatniego i pierwszego wykrycia fotonu w serii, jasność impulsu, największą wartość chwilowej szybkości fotonów w serii oraz separację serii, odstęp czasu między kolejnymi rozbłyskami.Wykreśl histogram wartości jasności serii z osią zdarzeń w skali logarytmicznej. Zdefiniuj próg jasności serii jako minimalną wartość jasności serii, od której histogram wykazuje wzór zaniku, i wybiera serie o wartościach jasności większych niż próg jasności serii. Aby zmierzyć średni czas życia fluorescencji rozbłysku, wykreśl histogram nanoczasu fotonów dla wszystkich fotonów w wybranych seriach z osią liczby fotonów w skali logarytmicznej.Zdefiniuj próg nanoczasowy jako minimalną wartość nanoczasową, od której histogram nanoczasów fotonów wykazuje wzór zaniku. Wybierz tylko te fotony, które są nanorazy większe niż próg nanoczasu. Oblicz średnią algebraiczną wszystkich wybranych nanoczasów fotonów.Odejmij próg nanoczasowy od średniej algebraicznej nanoczasu fotonów. Uzyskana wartość to średni nanoczas fotonu rozbłysku, wprost proporcjonalny do średniego czasu życia fluorescencji. Wykreśl histogram wszystkich średnich czasów życia fluorescencji rozbłysków.Mogą pojawić się centralnie rozmieszczone subpopulacje czasu trwania fluorescencji. Subpopulacje o niższych wartościach średnich reprezentują gatunki molekularne z Sulfo-Cy3, które nie były sterycznie zablokowane, podczas gdy subpopulacje o wyższych wartościach średnich reprezentują gatunki cząsteczek z S-Cy3, które były bardziej sterycznie zablokowane. Aby ocenić powolną dynamikę między impulsami, należy wykreślić histogram czasów separacji serii z osią czasu separacji w skali logarytmicznej.Wybierz tę opcję, aby zapisać wszystkie pary kolejnych impulsów, które są oddzielone od siebie o czas krótszy niż maksymalny czas separacji, który definiuje subpopulację tej samej cząsteczki. Wykreśl histogram lub wykres rozrzutu średniego czasu życia fluorescencji pierwszego i drugiego rozbłysku dla wszystkich par rozbłysków, które powtórzyły się poniżej pewnego progu czasowego separacji. Histogramy średniego czasu życia fluorescencji pojedynczej, znakowanej S-Cy3 cząsteczki alfa-synukleiny-56 wykazały, że pierwsza subpopulacja miała charakterystyczny czas trwania fluorescencji wynoszący 1,6 nanosekundy i reprezentująca stany konformacyjne alfa-synukleiny z kilkoma powierzchniami białka w pobliżu reszty 56.Druga subpopulacja miała charakterystyczny czas trwania fluorescencji wynoszący 3,5 nanosekundy i reprezentowała stany konformacyjne alfa-synukleiny z większą liczbą powierzchni białka w pobliżu reszty 56. Wiadomo, że nie-amyloidowe segmenty składnika beta cząsteczek alfa-synukleiny przyjmują spiralną, spinkę do włosów strukturę po związaniu się z pęcherzykami SDS, co zostało potwierdzone jako populacja pojedynczego kwiatu o charakterystycznym czasie życia około trzech nanosekund i braku subpopulacji o charakterystycznym czasie życia 1,6 nanosekundy. Histogram czasów separacji między kolejnymi impulsami pojedynczych cząsteczek informuje o powtarzających się cząsteczkach dla czasów separacji szybszych niż 100 milisekund, gdzie pierwszy i drugi impuls powstają z tej samej cząsteczki.Średni histogram czasu życia fluorescencji wszystkich pojedynczych wybuchów cząsteczkowych wykazał subpopulacje o krótkim charakterystycznym czasie życia, a także o długim charakterystycznym czasie życia, co wskazuje, że poszczególne cząsteczki mogą przechodzić przejścia między różnymi średnimi wartościami czasu życia wolniej niż czas trwania impulsu. W czasie separacji serii wynoszącym maksymalnie 100 milisekund pojawiła się frakcja cząsteczek, które rozpoczęły się jako pierwszy wybuch w subpopulacji o krótkim czasie życia i powtórzyły się jako drugi wybuch w subpopulacji o długim czasie życia. Podczas gdy frakcja cząsteczek, która rozpoczęła się jako pierwszy wybuch w subpopulacji o długim czasie życia i powtórzyła się jako drugi wybuch w populacji o krótkim czasie życia, wskazuje na przejścia między dwiema subpopulacjami w ciągu 10 do 100 milisekund.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas analizy wyników eksperymentów, jest prawidłowe oddzielenie sygnałów fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek od tła i analiza rozbłysków z wystarczającą liczbą nanoczasów fotonów. Opracowanie smPIFE utorowało naukowcom drogę do zbadania interakcji białek kwasów nukleinowych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Postęp ten stanowi podstawę do badania lokalnej dynamiki strukturalnej w białkach.

utilizing-time-resolved-protein-induced-fluorescence-enhancement-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Odkryj technikę wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem na poziomie pojedynczych cząsteczek do badania lokalnych konformacji α-synukleiny. Ta metoda umożliwia identyfikację stabilnych struktur białkowych niewidocznych w klasycznych pomiarach.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Przeglądaj więcej filmów