Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Cytometria przepływowa to potężna technika, która umożliwia wieloparametryczną analizę pojedynczych komórek. Może identyfikować biomarkery wczesnej i późnej apoptozy dokładnie i szybko, analizując miliony komórek. Wiele cząsteczek komórek jest barwionych i wykrywanych jednocześnie.

W szczególności laboratoryjna cytometria przepływowa umożliwia analizę i interpretację przez cytometrystów przepływowych niebędących ekspertami. Procedurę zademonstruje Esther Zhou, studentka studiów podyplomowych z grupy zajmującej się nowotworami witaminy D. Zacznij od wyhodowania kultur komórkowych w wilgotnym środowisku CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Upewnij się, że hodowla komórkowa jest w około 70% zlewająca się w kolbie macierzystej przed pasowaniem komórek do eksperymentów. Usunąć pożywkę z kolby i umyć komórki 1X PBS. Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny, aby oderwać komórki.

Po tym, jak komórki zaczną się odłączać, zneutralizuj trypsynę, dodając około pięciu mililitrów świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą przed policzeniem komórek. Komórki nasienne w ilości 15 000 komórek na mililitr w trzech mililitrach pożywki do hodowli komórkowej na sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej. Inkubować płytki hodowlane przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, aby umożliwić przyłączenie komórek do dna studzienki.

Następnego dnia należy potraktować eksperymentalne kultury 100 nanogramami na mililitr aktynomycyny D, a pożywkę i kontrole rozpuszczalnika świeżą pożywką hodowlaną i DMSO, odpowiednio, przez 24 godziny. Usuń pożywkę z dołków i zbierz zużyte podłoże do 15-mililitrowej probówki. Umyj komórki 1X PBS.

Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny, aby odłączyć komórki. Delikatnie odpipetować jeden mililitr pożywki dwa do trzech razy, aby mechanicznie usunąć pozostałe komórki nadal przyczepione do dna studzienki. Dodaj roztwór z dołków do 15-mililitrowej probówki, a następnie dodaj pięć mililitrów świeżej pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę.

Odpipetować 450 mikrolitrów odczynnika zawierającego barwniki wiążące DNA w probówce do mikrowirówki. Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Wylicz komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Rozcieńczyć wszystkie próbki do stężenia jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr pożywką do hodowli komórkowych przed przystąpieniem do testów apoptozy. Aby wykryć eksternalizację fosfatydyloseryny za pomocą aneksyny V, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej.

Do tego dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny 1:1 fluorescencyjnej sprzężonej aneksyny V i odczynnika 7-AAD. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, chronić przed światłem. W celu analizy depolaryzacji błony mitochondrialnej należy rozpocząć od odwirowania 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o stężeniu 300 razy G przez pięć minut, a następnie odrzucić supernatant.

Ponownie zawieś ogniwa w jednym mililitrze 1X PBS. Do każdej próbki dodać 100 mikrolitrów roztworu barwiącego TMRE i wymieszać zawiesinę przez delikatne pipetowanie wsteczne. Zawiń próbki w czystą folię aluminiową, aby chronić je przed światłem i inkubuj komórki przez 20 minut w wilgotnym środowisku CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji dodać do próbki roztwór roboczy 7-AAD i wymieszać. Aby wykryć aktywowaną końcową kaspazę-3 i 7, zacznij od rozcieńczenia peptydu wiążącego DNA związanego z DEVE w DMSO w stosunku 1:8 sterylnym 1X PBS, aby uzyskać działający roztwór do wykrywania kaspazy. Przechowuj roztwór na lodzie lub dodaj od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

Dodaj dwa mikrolitry roztworu podstawowego 7-AAD do 148 mikrolitrów 1X PBS, aby uzyskać roztwór roboczy 7-AAD. Roztwór należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Odwirować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach 1X PBS, a następnie w pięciu mikrolitrach roztworu roboczego do wykrywania kaspazy i dokładnie wymieszać. Poluzuj nakrętkę probówek i inkubuj przez 30 minut w wilgotnym środowisku CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Dodać 150 mikrolitrów roztworu roboczego 7-AAD do każdej próbki i wymieszać.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. W celu wykrycia pęknięć dwuniciowego DNA i całkowitego uszkodzenia DNA, najpierw odwirować 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej przez pięć minut przy 300 razy G i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach 1X PBS i dodać 500 mikrolitrów buforu utrwalającego na bazie formaldehydu i wymieszać.

Próbki należy inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 90 mikrolitrach 1X PBS w probówce do mikrowirówki.

Dodać 10 mikrolitrów roztworu przeciwciała do probówki mikrowirówkowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Dodaj 100 mikrolitrów 1X PBS i wiruj przez pięć minut przy 300 razy G. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach 1X PBS.

Wymieszać próbkę przez delikatne pipetowanie wsteczne przed załadowaniem próbki do cytometru przepływowego. Sprawdź wydajność analityczną cytometru przepływowego, uruchamiając zestaw kontrolny systemu przyrządu i nie przystępuj do badania próbek, dopóki wszystkie kontrole nie zostaną zakończone i zaliczone. Najpierw załaduj próbkę kontroli ujemnej do cytometru przepływowego i wybierz opcję Uruchom, Dostosuj ustawienia, aby urządzenie zaczęło zasysać próbkę i zapewniało podgląd wykrytych zdarzeń w czasie rzeczywistym.

Korzystając z podglądu na żywo, dostosuj progi fluorescencji i rozmiaru komórki. Narysuj prostokątną bramę wokół populacji komórek, przeciągnij znacznik progu, aby wykluczyć szczątki komórkowe, a następnie wybierz pozycję Dalej, Ustaw profil apoptozy, aby kontynuować. Dotknij i przeciągnij znaczniki kwadrantów, aby oddzielić populacje komórek i wykreślić wykryte zdarzenia w czasie rzeczywistym.

Wykresy te służą do informowania użytkownika końcowego o prawidłowym rozmieszczeniu znaczników kwadrantowych. Wybierz opcję Dalej, Sprawdź ustawienia, aby kontynuować, aby instrument wyświetlił podsumowanie ustawień. Po przejrzeniu ustawień wybierz pozycję Dalej, Zakończ ustawienia, aby zastosować te ustawienia do wszystkich próbek w eksperymencie.

Wymieszać pierwszą próbkę, delikatnie pipetując wstecznie, a następnie załadować pierwszą próbkę do cytometru przepływowego. Wybierz pozycję Dalej, a następnie nazwij przykład i wybierz pozycję Uruchom, aby system rozpoczął uruchamianie przykładu. W razie potrzeby wykonaj precyzyjne dostrojenie bramek lub znaczników kwadrantów po akwizycji.

Znajdź eksperyment, który wymaga dostosowania, przechodząc do systemowej przeglądarki plików i otwórz eksperyment. Stuknij w podgląd miniatury działki, aby ją powiększyć. Aby dostosować znaczniki kwadrantu, kliknij przecięcie linii pionowych i poziomych, aby przesunąć znaczniki tak, jak są, a następnie dostosuj kąt dowolnej linii, klikając linię i przeciągając uchwyt.

Aby doprecyzować bramkowanie komórek, kliknij zakładkę Brama i dostosuj wymiary bramy. Dostosuj znaczniki zgodnie z potrzebami i zastosuj te ustawienia do wszystkich próbek w eksperymencie, wybierając ikonę znacznika wyboru, zaznaczając wszystkie próbki i wybierając pozycję Zaakceptuj. Przeprowadź testy w trzech egzemplarzach i przeprowadź analizę wariancji za pomocą testu Bonferroniego post hoc, aby ocenić znaczące różnice między próbkami a kontrolami.

Wyniki liczby komórek i żywotności wykazały, że 95,2% komórek w próbce było żywych, a 4,8% martwych. Stwierdzono, że stężenie komórek wynosi 5,90 razy 105 komórek na mililitr. Test aneksyny V i śmierci komórki wykazał znaczny wzrost komórek apoptotycznych w komórkach SiHa traktowanych 100 nanogramami na mililitr aktynomycyny D, w porównaniu z kontrolami.

Mitochondrialny elektrochemiczny test potencjału transbłonowego wykazał znaczny spadek profili zdrowia komórek między aktynomycyną-D, kontrolą pożywki i kontrolą rozpuszczalnika, co sugerowało, że 100 nanogramów na mililitr aktynomycyny D indukowało depolaryzację mitochondriów w komórkach SiHa. Test kaspazy-3 i 7 wykazał znaczącą aktywację końcowych kaspaz w komórkach SiHa traktowanych 100 nanogramami na mililitr aktynomycyny D, w porównaniu z kontrolami. Aktynomycyna D znacząco indukowała markery uszkodzenia DNA, ATM i H2A.

X w komórkach SiHa, co sugerowało znaczny wzrost uszkodzeń DNA. Aby zwiększyć dokładność, upewnij się, że zbierasz całą populację komórek. Należy również przestrzegać zalecanych przez producenta stężeń komórek i czasów barwienia.

Ochrona barwionych próbek przed światłem pozwala uniknąć fotowybielania lub fluoroforów. Analiza biochemiczna apoptozy metodą cytometrii przepływowej powinna być wsparta mikroskopią. Pozwoli to zidentyfikować cechy morfologiczne klasycznej apoptozy.

Cechy obejmują kondensację jądrową, mieszanie błon komórkowych, ciała apoptotyczne i kariortoeksję.