Name: Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 53 s
Description: Poznaj analizę cytometryczną biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację wczesnej i późnej apoptozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane finansowo przez National Research Foundation (NRF) i South African Medical Research Council (SAMRC). Chcielibyśmy podziękować National Health Laboratory Service (NHLS) za zakup analizatora komórek Guava Muse. Wszystkie figurki w tej publikacji zostały stworzone przy użyciu Biorender.com.

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje etapy przygotowania komórek, liczenia komórek, barwienia komórek oraz analizy komórek SiHa traktowanych aktynomicyną D z wykorzystaniem komercyjnych testów cytometrycznych, mierzonych i analizowanych na stołowym cytometrze przepływowym (Rysunek 2).
<img alt="Schemat procedury badania komórek: przygotowanie komórek, liczenie, barwienie; analiza cytometryczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat detekcji biochemicznych biomarkerów apoptotycznych za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki są hodowane i poddawane działaniu substancji zgodnie z opisem w kroku 1.1 protokołu. (1) Komórki są hodowane, (2) liczone i (3) barwione odczynnikami fluorescencyjnymi, a następnie (4) analizowane za pomocą laboratoryjnego cytometru przepływowego. Dane są następnie poddawane bramkowaniu i analizie statystycznej. Skróty: 7-AAD = 7-aminoaktynomycyna D; PBS = roztwór soli fosforanowej; PE = fikoerytryna; TMRE = ester etylowy tetrametylorodaminy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig2v2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
1. Przygotowanie hodowli komórkowych i obróbek do cytometrii przepływowej
UWAGA: Podczas pracy z kulturami komórkowymi należy przestrzegać zasad aseptyki.
<ol>
	<li>Hodować kultury komórkowe w wilgotnej atmosferze z CO2 w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Przed pasażowaniem komórek do eksperymentów upewnić się, że konfluencja kultury w kolbie macierzystej wynosi około 70%.</li>
	<li>Usunąć medium z kolby, przemyć komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS) i dodać 500 µL trypsyny w celu odlepienia komórek. Gdy komórki zaczną przybierać kształt kulisty i odlepiać się od ścianek kolby, energicznie uderzyć dnem kolby o blat stołu laboratoryjnego. Następnie zneutralizować trypsynę, dodając około 5 mL świeżego medium hodowlanego uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej, przed przystąpieniem do liczenia komórek.</li>
	<li>Zasiać komórki w zagęszczeniu 15 000 komórek/mL w 3 mL medium hodowlanego w 6-dołkowej płytce hodowlanej. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aby umożliwić przytwierdzenie się komórek do dna dołków.</li>
	<li>Traktować kultury eksperymentalne dawką 100 ng/mL aktynomycyny D, a kontrole z medium i rozpuszczalnikiem odpowiednio świeżym medium hodowlanym oraz dimetylosulfotlenkiem (DMSO) przez 24 h. Zebrać zużyte medium do probówki 15 mL i przemyć komórki 1x PBS. Następnie dodać płuczkę z 1x PBS do probówki, a do dołka dodać 500 µL trypsyny. Następnie zneutralizować trypsynę, dodając 5 mL świeżego medium hodowlanego. 
	UWAGA: (1) Przedłużona inkubacja z trypsyną lub niepełna neutralizacja mogą doprowadzić do strawienia komórek i uszkodzenia ich błon komórkowych, co może zafałszować wyniki. Dodatkowo może to zmienić asymetrię błony komórkowej, a tym samym dostępność fosfatydyloseryny. (2) Komórki, które odlepiły się i wypłynęły na powierzchnię, mogą zostać włączone do dalszej analizy poprzez odwirowanie usuniętego medium przy 300 × g przez 5 min i resuspensję komórek w świeżym medium hodowlanym.</li>
</ol>
2. Liczenie komórek przy użyciu testu żywotności
<ol>
	<li>Do probówki do mikrocentryfugi pipetować 450 µL jodku propidyny. Do probówki dodać 50 µL zawiesiny komórkowej. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 min. Policzyć komórki metodą cytometrii przepływowej (patrz sekcja 4).</li>
	<li>Przed przystąpieniem do testów apoptozy rozcieńczyć wszystkie próbki pożywką do hodowli komórkowej do stężenia 1 × 106 komórek/mL.</li>
</ol>
3. Barwienie komórek do cytometrii przepływowej
UWAGA: Na tym etapie protokołu nie są wymagane warunki sterylne.
<ol>
	<li>Wykrywanie eksternalizacji fosfatydyloseryny przy użyciu Aneksyny V
	<ol>
		<li>Do probówki do mikrowirówki dodać 100 µL zawiesiny komórkowej. Dodać 100 µL mieszaniny w stosunku 1:1 koniugatu fluorescencyjnego Aneksyny V i odczynnika 7-AAD. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza depolaryzacji błony mitochondrialnej
	<ol>
		<li>Wirować 100 µL zawiesiny komórkowej przy 300 × g przez 5 min i usunąć nadsącz.</li>
		<li>Resuspendować komórki w 1 mL 1x PBS, do każdej próbki dodać 100 µL roztworu barwiącego TMRE i wymieszać zawiesinę poprzez delikatne pipetowanie zwrotne.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 20 min w nawilżonym środowisku z CO2 w temperaturze 37 °C. Próbki zawinąć w czystą folię aluminiową, aby chronić je przed światłem. 
		UWAGA: Potencjał błony mitochondrialnej jest markerem funkcjonalnym wrażliwym na niewielkie zmiany w środowisku komórkowym. Dlatego próbki należy inkubować i mierzyć w identycznych warunkach (temperatura, pH oraz czas upływający od rozpoczęcia inkubacji do pomiaru fluorescencji), aby zachować powtarzalność. Należy również pamiętać, że niewystarczająca ochrona próbek przed światłem powoduje fotobleaching fluoroforów, co skutkuje fałszywie niską emitowaną fluorescencją.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 5 μL roztworu barwiącego 7-AAD do każdej próbki i wymieszać. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie aktywowanych terminalnych kaspaz-3 i -7 przy użyciu substratu kaspazowego DEVD 
	UWAGA: Poniższe roztwory przygotowuje się przed wykonaniem tego testu.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć peptyd wiążący DNA z przyłączonym DEVD w DMSO w stosunku 1:8 ze sterylnym 1x PBS, aby przygotować roboczy roztwór do wykrywania kaspaz. Roztwór przechowywać w lodzie lub w temperaturze 2-8 °C, chroniąc przed światłem. 
		UWAGA: Każda próbka będzie wymagać 5 µL tego roztworu.</li>
		<li>Dodać 2 µL roztworu stokowego 7-AAD do 148 µL 1x PBS, aby przygotować roboczy roztwór 7-AAD. Roztwór przechowywać w lodzie lub w temperaturze 2-8 °C, chroniąc przed światłem. 
		UWAGA: Każda próbka będzie wymagać 150 µL tego roztworu.</li>
		<li>Wirować 50 µL zawiesiny komórkowej przez 5 min przy 300 × g. Usunąć nadsącz. Resuspendować komórki w 50 µL 1x PBS, a następnie dodać 5 µL roboczego roztworu do wykrywania kaspaz. Dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Poluzować zakrętki probówek i inkubować przez 30 min w nawilżonym środowisku z CO2 w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem. Dodać 150 µL roboczego roztworu 7-AAD do każdej próbki i wymieszać. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie pęknięć obu nici DNA oraz całkowitego uszkodzenia DNA
	<ol>
		<li>Wirować 50 µL zawiesiny komórkowej przez 5 min przy 300 × g. Usunąć nadsącz.</li>
		<li>Resuspendować komórki w 500 µL 1x PBS. Dodać 500 µL buforu fiksacyjnego na bazie formaldehydu i wymieszać. Inkubować próbki w lodzie przez 10 min.</li>
		<li>Wirować przez 5 min przy 300 × g i usunąć nadsącz. Resuspendować komórki w 90 µL 1x PBS w probówce do mikrowirówki. Do probówki dodać 10 µL roztworu przeciwciał. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min w ciemności.</li>
		<li>Dodać 100 µL 1x PBS i wirować przez 5 min przy 300 × g. Usunąć nadsącz. Resuspendować komórki w 200 µL 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza próbek za pomocą cytometru przepływowego.
<ol>
	<li>Zweryfikuj wydajność analityczną cytometru przepływowego, uruchamiając zestaw do kontroli systemu instrumentu. Nie przechodź do analizy próbek, dopóki wszystkie kontrole nie zostaną zakończone pomyślnie.</li>
	<li>Znajdź żądany test, przeglądając katalog zaprogramowanych testów w instrumencie, a następnie wybierz Run Assay (Uruchom test).
	<ol>
		<li>Wymieszaj próbkę poprzez delikatne pipetowanie zwrotne przed załadowaniem jej do cytometru przepływowego. 
		UWAGA: Odpowiednie wymieszanie zapewnia utrzymanie komórek w zawiesinie i zapobiega niskim zliczeniom komórek.</li>
		<li>Najpierw załaduj do cytometru przepływowego próbkę kontrolną negatywną i wybierz Run (Adjust Settings) (Uruchom (Dostosuj ustawienia)), aby instrument rozpoczął zasysanie próbki i wyświetlił podgląd wykrywanych zdarzeń w czasie rzeczywistym. Nazwę i szczegóły instrumentu sprawdź w Table of Materials (Tabeli materiałów).</li>
		<li>Korzystając z podglądu na żywo, dostosuj progi dla fluorescencji i wielkości komórek, a następnie wyznacz prostokątne okno (gate) wokół populacji komórek. Przesuń marker progu, aby wykluczyć debris komórkowy. Wybierz Next (Set Health Profile) (Dalej (Ustaw profil zdrowia)), aby kontynuować. 
		UWAGA: Ważne jest określenie wielkości komórek. Przesuwaj suwaki i obserwuj zmiany w sposobie rozmieszczenia wykrywanych zdarzeń na podglądzie w czasie rzeczywistym, co pozwoli na dokładny wybór progów. Jeśli debris komórkowy nie zostanie wykluczony na tym etapie, nie będzie można go usunąć w analizach poakwizycyjnych.</li>
		<li>Dotknij i przesuń markery kwadrantów, aby rozdzielić populacje komórek, podczas gdy instrument nanosi wykryte zdarzenia w czasie rzeczywistym. Wykorzystaj te wykresy, aby pokierować użytkownika końcowego w odpowiednim rozmieszczeniu markerów kwadrantów. Wybierz Next (Verify Samples) (Dalej (Weryfikuj próbki)), aby instrument wyświetlił podsumowanie ustawień. Po przejrzeniu ustawień wybierz Next (Verify Settings) (Dalej (Weryfikuj ustawienia)), aby zastosować te parametry do wszystkich próbek w eksperymentie. 
		UWAGA: Instrument zapewnia 2-minutowy podgląd na żywo komórek służący do dostosowania ustawień urządzenia. Po upływie tego limitu czasowego instrument zwolni próbkę, a kroki 4.2.2-4.2.4 będą musiały zostać powtórzone. Usuń próbkę, wymieszaj dokładnie, a następnie załaduj ponownie i kontynuuj.</li>
		<li>Wyznacz okno (gate) dla populacji komórek, rysując obszar wokół tej populacji. Dostosuj progi dla fluorescencji i wielkości komórek za pomocą suwaków znajdujących się na osiach X i Y podglądu na żywo. Zastosuj te ustawienia dla wszystkich próbek w eksperymentie.</li>
		<li>Wymieszaj pierwszą próbkę poprzez delikatne pipetowanie zwrotne, załaduj ją do cytometru przepływowego i wybierz Next (Dalej). Nazwij próbkę i wybierz Run (Uruchom), aby system rozpoczął analizę próbki. 
		UWAGA: Instrument może analizować tylko jedną próbkę w danym czasie.</li>
		<li>Po analizie wszystkich próbek zapisz eksperyment, nadając mu odpowiedni tytuł. Opcjonalnie zapisz ustawienia bieżącego eksperymentu, aby móc je wykorzystać w przyszłych pomiarach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza po akwizycji
<ol>
	<li>W razie potrzeby należy przeprowadzić dostrojenie bram lub markerów kwadrantów po akwizycji danych.</li>
	<li>Zlokalizuj eksperyment wymagający korekty, korzystając z przeglądarki plików systemu, a następnie otwórz ten eksperyment.</li>
	<li>Dotknij miniatury wykresu, aby go powiększyć. Dotknij lewego górnego lub prawego dolnego rogu bramki komórkowej, aby dostosować jej wymiary. Aby przesunąć znaczniki kwadrantów, dotknij punktu przecięcia linii pionowej i poziomej i przesuń znaczniki w ich obecnej konfiguracji. Aby zmienić kąt nachylenia którejkolwiek z linii, dotknij linii i przesuń uchwyt.</li>
	<li>Dostosuj markery (zgodnie z opisem w krokach 4.1.3-4.1.4) według uznania i zastosuj te ustawienia do wszystkich próbek w eksperymencie, wybierając ptaszek ikona, oznakowanie wszystkich próbek oraz wybór Zaakceptuj.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeprowadź testy w trzech powtórzeniach i wykonaj analizę wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Bonferroniego, aby ocenić istotność różnic między próbkami traktowanymi a kontrolnymi. 
	UWAGA: Wybór testu statystycznego zależy od badacza oraz analizowanych zmiennych.</li>
</ol>

<ol><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cell+death%3A+Recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).</li>
<li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26 (4), 239-257 (1972).</li>
<li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li>
<li>Edinger, A. L., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+design%3A+apoptosis%2C+necrosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (6), 663-669 (2004).</li>
<li>Arends, M. J., Morris, R. G., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis.+The+role+of+the+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis. The role of the endonuclease.</a> The American journal of pathology. 136 (3), 593-608 (1990).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarzynkiewicz%2C+Z+%22Apoptosis%22">Apoptosis</a>. Al-Rubeai, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 33-73 (1998).</li>
<li>Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+apoptosis+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based apoptosis detection.</a> Methods in molecular biology. 559, Clifton, N.J. 19-32 (2009).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories. Introduction to Flow Cytometry Basics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html</a> (2021).</li>
<li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+localized+caspase+activity+in+early+apoptotic+cells+by+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Detection of localized caspase activity in early apoptotic cells by laser scanning cytometry.</a> Cytometry. 47 (2), 81-88 (2002).</li>
<li>Castedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+mitochondrial+alterations+associated+with+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis.</a> J Immunol Methods. 265 (1-2), 39-47 (2002).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry: An Overview.</a> Current protocols in immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+principles+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: principles and clinical applications.</a> Med Lab Sci. 45 (2), 165-173 (1988).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+in+cell+necrobiology%3A+Analysis+of+apoptosis+and+accidental+cell+death+%28necrosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytometry in cell necrobiology: Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis).</a> Cytometry. 27 (1), 1-20 (1997).</li>
<li>Ormerod, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+apoptotic+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The study of apoptotic cells by flow cytometry.</a> Leukemia. 12 (7), 1013-1025 (1998).</li>
<li>van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte, B., Reutelingsperger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V-affinity+assay%3A+a+review+on+an+apoptosis+detection+system+based+on+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure.</a> Cytometry. 31 (1), 1-9 (1998).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1), 167-190 (2000).</li>
<li>Jahan-Tigh, R. R., Ryan, C., Obermoser, G., Schwarzenberger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry.</a> J Invest Dermatol. 132 (10), 1-6 (2012).</li>
<li>Lövborg, H., Gullbo, J., Larsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+apoptosis-classical+and+emerging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-cancer+drugs%22%5BJournal%5D)">Screening for apoptosis-classical and emerging techniques.</a> Anti-cancer drugs. 16 (6), 593-599 (2005).</li>
<li>Vorobjev, I. A., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+imaging+of+cell+heterogeneity+in+apoptosis+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric imaging of cell heterogeneity in apoptosis analysis.</a> Methods. 112, 105-123 (2017).</li>
<li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods in molecular biology. 263, Clifton, N.J. 141-160 (2004).</li>
<li>Kagami, S., Rizzo, H. L., Lee, J. J., Koguchi, Y., Blauvelt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Th17%2C+Th22%2C+and+Th1+cells+are+increased+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis.</a> J Invest Dermatol. 130 (5), 1373-1383 (2010).</li>
<li>Luminex Corporation. Muse® Annexin V & Dead Cell Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/">https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/</a> (2019).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Kroemer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+cell+death%3A+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (2), 1463-1467 (2005).</li>
<li>Apoptosis assays and markers guide. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays">https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays</a> (2021).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+A+Review+of+Programmed+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Saelens, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+released+from+mitochondria+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins released from mitochondria in cell death.</a> Oncogene. 23 (16), 2861-2874 (2004).</li>
<li>Muse™ MitoPotential Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit">https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit</a> (2013).</li>
<li>McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+functions+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase functions in cell death and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (4), 008656(2013).</li>
<li>Wigdal, S. S., Kirkland, R. A., Franklin, J. L., Haak-Frendscho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+release+precedes+mitochondrial+membrane+potential+loss+in+cerebellar+granule+neuron+apoptosis%3A+lack+of+mitochondrial+swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c release precedes mitochondrial membrane potential loss in cerebellar granule neuron apoptosis: lack of mitochondrial swelling.</a> Journal of Neurochemistry. 82 (5), 1029-1038 (2002).</li>
<li>Muse® Caspase-3/7 Kit. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview">https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview</a> (2019).</li>
<li>Häcker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The morphology of apoptosis.</a> Cell and Tissue Research. 301 (1), 5-17 (2000).</li>
<li>Muse® Multi-Color DNA Damage Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview">https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview</a> (2020).</li>
<li>Kleeff, J., Kornmann, M., Sawhney, H., Korc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+D+induces+apoptosis+and+inhibits+growth+of+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Actinomycin D induces apoptosis and inhibits growth of pancreatic cancer cells.</a> International journal of cancer. 86 (3), 399-407 (2000).</li>
<li>Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+of+apoptosis.+Historical+perspective+and+new+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+oncology%22%5BJournal%5D)">Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances.</a> Experimental oncology. 34 (3), 255-262 (2012).</li>
<li>Szeberenyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+actinomycin+D+on+RNA+metabolism+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The effect of actinomycin D on RNA metabolism in human cells.</a> Biochem Mol Biol Educ. 34 (1), 50-51 (2006).</li>
<li>Ginell, S., Lessinger, L., Berman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+and+molecular+structure+of+the+anticancer+drug+actinomycin+D--some+explanations+for+its+unusual+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The crystal and molecular structure of the anticancer drug actinomycin D--some explanations for its unusual properties.</a> Biopolymers. 27 (5), 843-864 (1988).</li>
<li>Hou, M. H., Robinson, H., Gao, Y. G., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+actinomycin+D+bound+to+the+CTG+triplet+repeat+sequences+linked+to+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases.</a> Nucleic Acids Res. 30 (22), 4910-4917 (2002).</li>
</ol>

Luminex® Corporation uprzejmie zapewnił opłaty za przetwarzanie artykułów.

W tym badaniu komórki SiHa leczone aktynomycyną D, analizowane przez FC, ujawniły znaczące wczesne i późne biomarkery apoptozy. Nieoptymalne warunki przygotowania, liczenia i barwienia komórek wykazały niedokładne wyniki, podkreślając potrzebę ścisłego przestrzegania instrukcji producenta podczas wykonywania FC.
To badanie apoptozy poprzez wczesną i późną identyfikację biomarkerów jest zgodne z wytycznymi NCCD1 dotyczącymi badania apoptozy. Hodowle SiHa traktowane aktynomycyną D wykazały dodatnie biomarkery dla wczesnych i późnych etapów apoptozy. Test aneksyny V/PI i test przepuszczalności mitochondriów wykazały, że aktynomycyna D indukowała odpowiednio wzór PS-flip i rozproszenie przejścia błony mitochondrialnej. Gdy komórki apoptotyczne osiągną punkt braku powrotu wywołany zaburzeniami mitochondriów, końcowe kaspazy są aktywowane 3,7. Aktywacja końcowych kaspaz 3 i 7 zaobserwowana w tym badaniu wskazuje na późne stadium apoptozy. Co więcej, końcowa aktywacja kaspazy powoduje rozszczepienie międzynukleosomalnego DNA i rozległą fragmentację DNA, która klasycznie została opisana jako wzór drabiny schodkowej obserwowany przez elektroforezę żelową28,38.
Szkody jądrowe z ATM i H2A. Test uszkodzenia DNA X FC wykazał pęknięcia dwuniciowe w DNA i całkowite uszkodzenie DNA. Wyniki te potwierdziły klasyczne apoptotyczne uszkodzenia jądrowe wywołane kaspazą (karioreksja i kariorliza) w kulturach eksperymentalnych. Zastosowanie wielu biomarkerów cytometrycznych z wieloma przepływami pozwoliło na wykrycie sekwencyjnych wieloetapowych zdarzeń w apoptozie oraz dokładną i powtarzalną identyfikację populacji komórek we wczesnych i późnych stadiach apoptozy. Odkrycia te są zgodne ze znanymi proapoptotycznymi cechami aktynomycyny D w leczeniu raka u ludzi 37,39,40,41 i dodatkowo wspierają stosowanie aktynomycyny D jako kontroli pozytywnej w eksperymentach hodowli komórek FC badających apoptozę.
Bramkowanie populacji komórek w tym badaniu było oparte na ujemnych pożywkach i kontrolach rozpuszczalnika, które oddzielały komórki apoptotyczne od zdrowych. Alternatywnie, mieszanina populacji kontroli pozytywnych i ujemnych może być również wykorzystana do zdefiniowania żywych i apoptotycznych populacji komórek w celu ustawienia bramek populacji komórek 7,9. Po zdefiniowaniu i bramkowaniu chorych i zdrowych stanów komórkowych, ustawienia szablonu można zastosować do wszystkich kolejnych kultur eksperymentalnych i kontrolnych.
Ścisłe przestrzeganie protokołu FC jest niezbędne, aby uniknąć fałszywych wyników. Podczas optymalizacji protokołu zaobserwowano następujące problemy: (1) niskie stężenie komórek, (2) wysokie stężenie komórek, (3) zlepianie się komórek, (4) przedłużone barwienie oraz (5) słaba obsługa próbki. Problemom tym można zapobiec poprzez ścisłe przestrzeganie zoptymalizowanych wymagań protokołu. Podkreśla to kluczowy charakter etapów przedanalitycznych i analitycznych dla FC w celu uzyskania dokładnych danych. Podczas przygotowywania komórek trypsynizacja, pipetowanie, wirowanie i rozcieńczanie muszą być przeprowadzane ostrożnie. Nadmierna trypsynizacja i intensywne pipetowanie mogą spowodować odpowiednio chemiczne i mechaniczne ścinanie komórek. Długotrwałe i szybkie wirowanie może spowodować rozpad komórek i dużą liczbę zanieczyszczeń komórkowych. Wymagane jest optymalne stężenie komórek, aby zminimalizować nieprawidłowe pozyskiwanie zdarzeń komórkowych. Dlatego pierwotne zawiesiny komórek należy rozcieńczyć w celu uzyskania optymalnego stężenia komórek.
Ponadto podczas obchodzenia się z próbkami należy zachować ostrożność, aby zapobiec zlepianiu się i fragmentacji komórek oraz zapewnić, że komórki pozostają w zawiesinie podczas analizy. Postępowanie z próbkami w celu zapobieżenia zlepianiu się komórek umożliwia przepływ pojedynczych komórek laminarnych, zapobiega mechanicznemu blokowaniu rurki kapilarnej instrumentu i ogranicza fałszywe wskaźniki dużych komórek. Kolejnym zastrzeżeniem jest ochrona kultur przed światłem, aby uniknąć fotoutleniania i wygaszania fluoroforów w testach, aby zapobiec fałszywie ujemnym wynikom. Należy zadbać o to, aby zapewnić minimalne nasłonecznienie na etapie barwienia komórek i późniejszych etapach przetwarzania. Co więcej, wydłużony czas barwienia immunologicznego może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami, ponieważ białka są barwione niespecyficznie. Dlatego ważne jest przestrzeganie zalecanych przez producenta okresów barwienia inkubacji.
Podsumowując, FC może dokładnie wykrywać apoptozę i rozróżniać biomarkery wczesnej i późnej apoptozy w hodowli komórkowej. Ponadto postęp technologiczny doprowadził do wyprodukowania stacjonarnych cytometrów przepływowych dla naukowców niebędących ekspertami w celu badania zdrowia komórek i złożonych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych.

Apoptoza, klasyfikowana jako programowana śmierć komórki typu 11, zapewnia równowagę między proliferacją a śmiercią komórek2. Apoptoza jest niezbędna podczas rozwoju człowieka, po urazach oraz w zapobieganiu chorobom, takim jak nowotwory3. Wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne śmierci apoptotycznej4 wywołują sekwencyjne biochemiczne i morfologiczne zmiany wewnątrzkomórkowe2,5,6. Morfologiczne cechy apoptozy można zidentyfikować za pomocą mikroskopii, a zaburzenia biochemiczne można analizować za pomocą testów biochemicznych, w tym cytometrii przepływowej (FC)7.
Analiza cytometryczna przepływowa służąca do identyfikacji apoptozy i zrozumienia związanych z nią mechanizmów wewnątrzkomórkowych gwałtownie rozwinęła się w ciągu ostatnich dwóch dekad8. Cytometria przepływowa (FC) to metodologia naukowa, która analizuje komórki w cieczy przepływającej przez lasery jednokanałowe lub wielokanałowe (Rysunek 1)9,10,11. Komórki w cieczy są ustawiane w pojedynczy szereg przez systemy hydrauliczne cytometru przepływowego przy użyciu ogniskowania hydrodynamicznego. Gdy komórki przechodzą przez wiązkę lasera, światło jest rozpraszane lub emitowane przez komórki. Rozproszone światło może być skierowane do przodu (rozproszenie przednie, forward scatter) lub w bok (rozproszenie boczne, side scatter), co dostarcza odpowiednio informacji o wielkości komórki oraz o jej ziarnistości lub strukturach wewnętrznych.
Dodatkowo odczynniki fluorescencyjne, takie jak barwniki fluorescencyjne lub przeciwciała znakowane fluoroforami, wykrywają specyficzne struktury lub cząsteczki powierzchniowe bądź wewnątrzkomórkowe. Gdy laser pobudza fluorofory, emitowane jest światło o określonej długości fali. Detektory – najczęściej lampy fotopowielaczowe – ilościowo określają światło rozproszone i emitowane z próbek komórek. Detektory generują mierzalny prąd, który jest proporcjonalny do rozproszenia światła i emisji fluorescencji. Wyjście elektroniczne jest konwertowane na sygnały cyfrowe przez oprogramowanie komputerowe w celu identyfikacji populacji komórek na podstawie wielkości komórek, ziarnistości komórek oraz względnej fluorescencji komórkowej cząsteczek znakowanych fluoroforami9,12,13.
<img alt="Schemat procesu cytometrii przepływowej przedstawiający znakowanie komórek, analizę laserową i analizę danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat opisujący działanie techniczne i przebieg analizy w tradycyjnej cytometrii przepływowej. Komórki są barwione odczynnikami fluorescencyjnymi i poddawane analizie laserowej. Generowane sygnały fluorescencji są wykrywane i przekształcane w sygnał elektroniczny, który następnie jest digitalizowany i analizowany przez oprogramowanie komputerowe i programy statystyczne. Skróty: FSC = forward scatter (rozproszenie przednie); SSC = side scatter (rozproszenie boczne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig1v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Cytometria przepływowa (FC) jest wykorzystywana zarówno w badaniach naukowych, jak i w diagnostyce zdrowotnej. Dwoma głównymi celami FC w nekrobiologii są wyjaśnienie właściwości molekularnych i funkcjonalnych śmierci komórkowej oraz rozróżnienie różnych mechanizmów śmierci komórek14,15,16,17,18. Zastosowania FC obejmują liczenie komórek, sortowanie populacji komórkowych, immunofenotypowanie, wykrywanie biomarkerów (np. biomarkerów apoptozy), badania toksyczności oraz inżynierię białek12. Ponadto FC jest powszechnie stosowana w diagnostyce zdrowotnej w celu wspomagania diagnozy i monitorowania pacjentów z nowotworami hematologicznymi. Postępy w instrumentacji, detekcji fluoroforów i systemach detektorów rozszerzają zakres zastosowań FC o cytometrię obrazową, cytometrię masową oraz cytometrię spektralną, co otwiera szersze możliwości badawcze12.
Analiza cytometryczna przepływowa apoptozy oferuje liczne zalety w porównaniu z tradycyjnymi technikami stosowanymi w ocenie stanu komórek. FC pozwala na szybką i powtarzalną analizę wielu pojedynczych komórek w heterogenicznej próbce w celu oszacowania poziomu apoptozy3,5. Zdolność FC do dostarczania ilościowych informacji o fenotypach komórek na poziomie pojedynczych komórek, przy jednoczesnym unikaniu analizy zbiorczej, zapewnia wyższą czułość niż techniki Western blotting, enzymatyczne testy immunoabsorpcyjne (ELISA), fluorometria i spektrofotometria wykorzystywane w analizie apoptozy8,19. Ponadto zaletą jest względna łatwość analizy FC w przeciwieństwie do uciążliwych i słabo powtarzalnych manualnych etapów Western blotting oraz ELISA. Powtarzalna, dokładna i wysokoprzepustowa analiza FC jest zatem niezwykle korzystna w badaniach nad nowotworami20.
FC umożliwia również jednoczesną analizę parametrów cyklu komórkowego dla zdrowych i nieprawidłowych populacji komórek apoptotycznych21. Ponieważ apoptoza jest procesem dynamicznym, różne metody mogą dawać zmienne wyniki, które zależą od punktu czasowego, w którym pobierane są komórki22. Jednoczesna ilościowa ocena wielu parametrów fenotypu komórkowego pozwala na wykrywanie niewielkich subpopulacji z wysoką dokładnością, np. można wykryć rzadkie podzbiory komórek o niskiej częstotliwości 0,01%23. Wieloparametryczna analiza FC jest szczególnie użyteczna, ponieważ śmierć apoptotyczna zachodzi w obrębie spektrum wczesnych i późnych zmian biochemicznych, a komórki znajdują się na różnych etapach kontinuum apoptotycznego. Na przykład zastosowanie podwójnego barwienia z użyciem Aneksyny V i jodku propidyny w analizie FC komórek apoptotycznych umożliwia kategoryzację wczesnych komórek apoptotycznych, późnych komórek apoptotycznych oraz komórek martwych24. Dokładne wykrywanie apoptozy na wielu etapach zapobiega błędnej klasyfikacji i wynikom fałszywie ujemnym. W związku z tym wieloparametryczna analiza za pomocą FC zwiększa ogólną swoistość wykrywania fenotypów komórkowych i zapobiega błędnej klasyfikacji mniejszych populacji. Ponadto sortowanie komórek za pomocą FC pozwala na izolację populacji komórkowych o wysokiej czystości do późniejszych analiz7.
Wadą FC jest konieczność stosowania komórek w zawiesinie, co może być problematyczne w analizie tkanek, ponieważ dysagregacja tkanki do pojedynczych komórek może zmienić funkcje komórkowe19. Ponadto brak standaryzacji w konfiguracji aparatury FC, analizie danych i raportowaniu wyników może prowadzić do zmienności rezultatów19, co podkreśla potrzebę optymalnego przeszkolenia operatorów FC w zakresie wykonywania pomiarów, analizy i raportowania danych. Na przykład zdolność FC do odróżnienia prawdziwych szczątków apoptycznych od jąder apoptycznych wymaga: i) odpowiednich ustawień akwizycji, ii) zastosowania kulek kalibracyjnych w celu identyfikacji piku DNA diploidalnego oraz iii) specyficznych dla danej linii komórkowej kontroli negatywnych i pozytywnych3. Co więcej, analiza wieloparametryczna jest ograniczona liczbą detektorów, a w celu uniknięcia wyników niespecyficznych i przenikania emisji fluorescencyjnej (spillover) przy użyciu wielu reagentów fluorescencyjnych konieczne jest przeprowadzenie optymalnej kompensacji25. Postępy w technologii aparatury i fluoroforów pozwoliły na zwiększenie detekcji parametrów do 3012.
Identyfikacja apoptycznej śmierci komórek nie zawsze jest prosta7, dlatego należy rozważyć zastosowanie czułych i specyficznych biomarkerów. Komitet Nazewnictwa Śmierci Komórkowej (Nomenclature Committee on Cell Death, NCCD) zaleca stosowanie więcej niż jednego testu do badania i ilościowego określania procesu apoptozy26. W celu potwierdzenia apoptozy oraz uniknięcia wyników fałszywie dodatnich7 zaleca się również analizę mikroskopową w kierunku klasycznych cech apoptozy26. Cztery kluczowe cechy biochemiczne obejmujące wczesne i późne etapy apoptozy to (1) utrata asymetrii błony komórkowej; (2) spadek potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm); (3) aktywacja kaspaz oraz (4) uszkodzenie DNA26.
W wczesnej fazie apoptozy fosfatydyloseryna jest eksponowana na zewnętrzną błonę komórkową27 i może być wykrywana przez Aneksynę V znakowaną fluorescencyjnie fykoerytryną27,28,29. Ponadto podwójne barwienie z zastosowaniem fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA, 7-aminoaktynomicyny D (7-AAD), pozwala odróżnić komórki żywe, w późnej fazie apoptozy oraz martwe. W związku z tym komórki we wczesnej fazie apoptozy wykazują pozytywne barwienie dla Aneksyny V i negatywne dla 7-AAD, w przeciwieństwie do komórek w późnej fazie apoptozy, które barwią się pozytywnie dla obu barwników24.
Wewnętrzne sygnały apoptyczne indukują utratę potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm). Zaburzenie ΔΨm powoduje uwalnianie wczesnych białek proapoptotycznych z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów do cytozolu27,29,30. Zmianę ΔΨm można ocenić poprzez podwójne barwienie z użyciem dodatnio naładowanego, lipofilnego barwnika, estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE), oraz 7-AAD. Barwnik TMRE kumuluje się w wewnętrznej błonie nienaruszonych mitochondriów, gdy potencjał błonowy jest wysoki. Mitochondria zdepolaryzowane wykazują zmniejszoną fluorescencję. Żywe komórki z spolaryzowanymi mitochondriami (nienaruszoną błoną mitochondrialną) barwią się pozytywnie na TMRE i negatywnie na 7-AAD. Martwe komórki z zdepolaryzowanymi mitochondriami barwią się negatywnie na TMRE i pozytywnie na 7-AAD31.
Kaspazy to rodzina wewnątrzkomórkowych proteaz, które po aktywacji sygnalizują i przeprowadzają apoptozę26,27. Terminalne kaspazy wykonawcze (3, 6, 7) odpowiadają za późną fazę apoptozy29,32,33. Aktywność kaspazy-3 i -7 można zmierzyć za pomocą substratu znakowanego fluorescencyjnie, który po rozszczepieniu wiąże się z DNA i emituje sygnał fluorescencyjny. Ponadto wszelkie naruszenia integralności błony komórkowej można ocenić poprzez barwienie 7-AAD. Komórki apoptotyczne wykazują barwienie pozytywne dla barwnika wiążącego DNA, ale negatywne dla 7-AAD. Komórki w późnej fazie apoptozy oraz komórki martwe wykazują barwienie pozytywne dla obu barwników34.
Późna apoptoza charakteryzuje się uszkodzeniem DNA27,29,35, które można ocenić poprzez oznaczenie fosforylowanej kinazy ATM (ataxia-telangiectasia mutated) oraz histonu H2A.X. Pęknięcia obu nici DNA (DSBs) powodują fosforylację H2A.X. Uszkodzenia DNA można określić za pomocą przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko ATM i H2A.X. Brak wykrycia zarówno ATM, jak i H2A.X wskazuje na brak uszkodzeń DNA, natomiast wykrycie obu barwników wskazuje na obecność pęknięć obu nici w DNA36.
Aktynomycyna D jest silnym induktorem apoptozy, który działa poprzez wiązanie się z DNA, blokując procesy transkrypcji i translacji37. Celem niniejszego badania była ocena apoptozy biochemicznej indukowanej aktynomycyną D w linii komórkowej SiHa poprzez analizę wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy. Oceniono cztery biochemiczne biomarkery apoptozy odpowiadające kolejnym etapom kaskady apoptycznej, obejmujące utratę asymetrii błony komórkowej, zmianę potencjału błony mitochondrialnej, aktywację kaspaz terminalnych oraz uszkodzenia DNA.

<table><tbody><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Lasec</td><td>P1PLA044C-000006</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P10-040500</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek Guava Muse</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek/Eppendorf</td><td>Zestaw Merck</td><td>EP0030122208-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Muse Annexin V</td><td>Zestaw Merck</td><td>MCH100105</td><td></td></tr><tr><td>Muse Caspase-3/7</td> Zestaw <td>Merck</td><td>MCH100108</td><td></td></tr><tr><td>Muse Count and Viability Zestaw</td><td>Merck</td><td>MCH600103</td> Muse DNA Damage Zestaw Merck MCH200107 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muse MitoPotential</td><td>Merck</td><td>MCH100110</td><td></td></tr><tr><td>PBS Bufor</td><td>ThermoFisher</td><td>70013065</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Komórki SiHa</td><td>ATCC</td><td>CRL-1550</td><td></td></tr><tr><td>Kolby hodowlane T25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6231</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Pan Biotech</td><td>P10-040500</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy siha leczonych aktynomycyną d

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Biomarkery apoptozy zostały zbadane w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D za pomocą cytometru przepływowego. Wczesne biomarkery (aneksyna V i potencjał błony mitochondrialnej) i późne biomarkery (kaspazy 3 i 7 oraz uszkodzenie DNA) apoptozy mierzono w kulturach eksperymentalnych i kontrolnych. Kultury inkubowano przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Komórki następnie odłączono za pomocą trypsyny i zliczono za pomocą testu liczby komórek metodą cytometrii przepływowej. Komórki były dalej analizowane pod kątem apoptozy za pomocą testu aneksyny V, testu mitochondrialnego elektrochemicznego potencjału transbłonowego, testu kaspazy 3/7 i testu uszkodzenia DNA. Ten artykuł zawiera przegląd apoptozy i tradycyjnej cytometrii przepływowej oraz opracowuje protokoły cytometrii przepływowej do przetwarzania i analizy komórek SiHa. Wyniki opisują pozytywne, negatywne i nieoptymalne dane eksperymentalne. Omówiono również interpretację i zastrzeżenia w wykonywaniu analizy apoptozy metodą cytometrii przepływowej przy użyciu tej platformy analitycznej. Analiza cytometrii przepływowej zapewnia dokładny pomiar wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy.

Wyniki liczby komórek i ich żywotności (Rycina 3) wykazały, że 95,2% komórek w próbce była żywa, a 4,8% martwa. Całkowite stężenie komórek w oryginalnej próbce wynosiło 6,20 x 106 cells/mL.
Analiza Annexiny V i śmierci komórek (Rycina 4>) wykazała istotny wzrost (p &lt; 0,0001) liczby komórek apoptotycznych w komórkach SiHa traktowanych 100 ng/mL aktynomicyny D w porównaniu z grupami kontrolnymi. Ponieważ barwienie Annexiną V nasila się w komórkach na wczesnym etapie apoptozy, wynik ten sugeruje, że 100 ng/mL aktynomicyny D indukuje apoptozę w komórkach SiHa.
Analiza potencjału elektrochemicznego błony mitochondrialnej (Rysunek 5) wykazała istotny spadek (p &lt; 0,0001) w profilach stanu komórek (żywe, zdepolaryzowane oraz żywe, zdepolaryzowane i martwe, martwe) pomiędzy grupą z aktynominycyną D, kontrolą ośrodka a kontrolą rozpuszczalnika. Dane te sugerują, że 100 ng/mL aktynominycyny D wywołała depolaryzację mitochondriów w komórkach SiHa.
Analiza aktywności kaspazy 3/7 (Rysunek 6) wykazała istotną (p &lt; 0,0001) aktywację kaspaz 3 i 7 w komórkach SiHa traktowanych 100 ng/mL aktynomycyny D w porównaniu z grupami kontrolnymi. Wyniki te dowodzą, że 100 ng/mL aktynomycyny D indukuje apoptozę w komórkach SiHa.
Analiza uszkodzeń DNA (Rysunek 7) wykazała, że 100 ng/mL aktynomycyny D znacząco (p &lt; 0,0001) indukowała markery uszkodzeń DNA, ATM i H2A.X, w komórkach SiHa. Wynik ten sugeruje istotny wzrost uszkodzeń DNA w komórkach SiHa traktowanych aktynomycyną D.
Wyniki nieoptymalnych doświadczeń (Rysunek 8) przedstawić rozważania analityczne dla wszystkich testów. Stężenie komórek wpływa na dokładność danych. W Rysunek 8Aliczba komórek jest niedopuszczalnie niska. Populacje komórek wyodrębnione w bramkach we wszystkich czterech kwadrantach wykresu kropkowego wykazują niską intensywność sygnału. Producent optymalizuje test dla 300–700 komórek/µL w końcowej objętości próbki. Ten przykład ilustruje znaczenie stosowania prawidłowego stężenia próbki zalecanego przez producenta.
Ponadto wysokie stężenia komórek doprowadziły do błędnych wyników (Rysunek 8B). Kultury pożywkowe i eksperymentalne wykazały odpowiednio 99,95% i 100% żywych komórek. Szybkość przepływu dla obu analiz przekroczyła zoptymalizowane przez producenta stężenie 100-500 cells/μL i wymagała rozcieńczenia przy użyciu 1x Assay Buffer, aby uniknąć niedokładnej analizy.
Należy unikać agregacji komórek podczas przygotowywania kultur eksperymentalnych, ponieważ prowadzi to do fałszywych wyników wynikających ze zwiększonych indeksów wielkości komórek, co zilustrowano w teście Annexin V. Rycina 8C przedstawia podwójny problem: zbyt wysokie stężenie komórek, przekraczające instrukcje producenta, oraz agregację komórek, o czym świadczą indeksy wielkości komórek przekraczające 4 w kontroli medium SiHa. Wysokie stężenie komórek przejawia się tworzeniem warstw komórkowych w postaci jasnoczerwonej płaszczyzny w kulturach z medium, co wskazuje na niespójnie wysoką populację komórek apoptotycznych.
Przedłużone barwienie kultur może prowadzić do niespecyficznego wiązania białek i skutkować fałszywymi wynikami, co wykazano w teście z użyciem Aneksyny V. Rycina 8D przedstawia podobne wyniki dla kultur kontrolnych i eksperymentalnych w wyniku przedłużonego barwienia.
Niewłaściwa obsługa próbek, przedłużona trypsynizacja komórek adherentnych, gwałtowne pipetowanie podczas etapów płukania oraz szybkie i przedłużone odwirowywanie powodują lizę komórek i powstawanie dużej ilości zanieczyszczeń komórkowych. Na Rysunku 8E kultury analizowane testem kaspazy 3/7 wykazują zwiększoną ilość zanieczyszczeń komórkowych, co potwierdza niski wskaźnik wielkości komórek (&lt;2,2 wskaźnika wielkości komórek). Należy zatem zachować szczególną ostrożność podczas przygotowywania próbek do akwizycji danych.
<img alt="Analiza żywotności komórek; wykres rozrzutowy i tabela danych; ocena komórek żywych/martwych; żywotność 95,23%." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza liczby i żywotności komórek. Profil populacji oddziela resztki komórkowe od komórek żywych i martwych. Dwuwymiarowy wykres kropkowy jest bramowany i rozdziela populacje komórek żywych i martwych. Panel informacyjny dostarcza danych ilościowych dotyczących liczby komórek, procentowego udziału żywych komórek w populacji ogólnej oraz całkowitej liczby żywych komórek w próbce. Dane te mogą być wykorzystane do standaryzacji liczby komórek we wszystkich próbkach przed kolejnymi analizami apoptozy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę rycinię w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza apoptozy; traktowanie aktynomicyną D; test z anneksyną V; wykresy; żywotność komórek; cytometria przepływowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Test z anneksyną V. Wszystkie próbki wykazują identyczne parametry bramkowania, a analiza statystyczna każdej subpopulacji ujawnia znaczący wzrost apoptozy w komórkach traktowanych aktynomicyną D. Wszystkie testy wykonano jako trzy niezależne eksperymenty, a każdy eksperyment analizowano w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, a wartość p &lt; 0,05 uznano za statystycznie istotną. **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza żywotności komórek; wykresy rozproszenia i słupkowe przedstawiają efekty działania aktynomicyny D na populacje komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza mitochondrialnego potencjału elektrochemicznego błony wewnętrznej. Wszystkie próbki wykazują identyczne parametry bramkowania, a analiza statystyczna każdej subpopulacji wykazuje istotne zaburzenie potencjału błony mitochondrialnej w komórkach traktowanych aktynomicyną D. Wszystkie testy przeprowadzono jako trzy niezależne eksperymenty, a każdy eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, a p &lt; 0,05 uznano za istotne statystycznie. **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej; schematy ekspresji kaspazy 3/7; wykresy słupkowe apoptozy i żywotności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Analiza detekcji kaspazy 3/7.Wszystkie próbki wykazują identyczne parametry bramkowania, a analiza statystyczna każdej subpopulacji ujawnia istotny wzrost aktywności kaspazy 3/7 w komórkach traktowanych aktynomycyną D. Wszystkie testy przeprowadzono jako trzy niezależne eksperymenty, a każdy eksperyment analizowano w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD; wartość p &lt; 0,05 uznano za statystycznie istotną. **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza uszkodzeń DNA; wykresy kropkowe i słupkowe; cytometria przepływowa; aktynomycyna D, porównanie kontroli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Analiza uszkodzeń DNA. Wszystkie próbki wykazują identyczne parametry bramkowania, a analiza statystyczna każdej subpopulacji ujawnia istotny wzrost liczby pęknięć dwuniciowych DNA oraz całkowitych uszkodzeń DNA w komórkach traktowanych aktynomycyną D. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech niezależnych eksperymentach, a każdy eksperyment analizowano w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD; wartość p &lt; 0,05 uznano za istotną statystycznie. * p &lt; 0,05; *** p &lt; 0,001; **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej; analiza apoptozy, zmienność stężenia komórek, agregacja, efekty barwienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Suboptymalne warunki eksperymentalne prowadzą do słabych wyników. (A) niskie stężenie komórek, (B) wysokie stężenie komórek, (C) grudkowanie i agregacja komórek widoczna poprzez wysoki wskaźnik wielkości komórek, (D) przedłużone barwienie próbek komórkowych widoczne poprzez zwiększone barwienie pozytywne w obu próbkach oraz (E) niewłaściwa obsługa próbek widoczna poprzez zwiększoną ilość debris komórkowego (wskaźnik wielkości komórek &lt; 2.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę rycinę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>

Apoptozę można scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy. Linię komórkową raka szyjki macicy, SiHa, analizowano pod kątem biomarkerów apoptozy po leczeniu aktynomycyną D przy użyciu laboratoryjnego cytometru przepływowego.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Cytometria przepływowa to potężna technika, która umożliwia wieloparametryczną analizę pojedynczych komórek. Może identyfikować biomarkery wczesnej i późnej apoptozy dokładnie i szybko, analizując miliony komórek. Wiele cząsteczek komórek jest barwionych i wykrywanych jednocześnie.W szczególności laboratoryjna cytometria przepływowa umożliwia analizę i interpretację przez cytometrystów przepływowych niebędących ekspertami. Procedurę zademonstruje Esther Zhou, studentka studiów podyplomowych z grupy zajmującej się nowotworami witaminy D. Zacznij od wyhodowania kultur komórkowych w wilgotnym środowisku CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Upewnij się, że hodowla komórkowa jest w około 70% zlewająca się w kolbie macierzystej przed pasowaniem komórek do eksperymentów. Usunąć pożywkę z kolby i umyć komórki 1X PBS. Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny, aby oderwać komórki.Po tym, jak komórki zaczną się odłączać, zneutralizuj trypsynę, dodając około pięciu mililitrów świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą przed policzeniem komórek. Komórki nasienne w ilości 15 000 komórek na mililitr w trzech mililitrach pożywki do hodowli komórkowej na sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej. Inkubować płytki hodowlane przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, aby umożliwić przyłączenie komórek do dna studzienki.Następnego dnia należy potraktować eksperymentalne kultury 100 nanogramami na mililitr aktynomycyny D, a pożywkę i kontrole rozpuszczalnika świeżą pożywką hodowlaną i DMSO, odpowiednio, przez 24 godziny. Usuń pożywkę z dołków i zbierz zużyte podłoże do 15-mililitrowej probówki. Umyj komórki 1X PBS.Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny, aby odłączyć komórki. Delikatnie odpipetować jeden mililitr pożywki dwa do trzech razy, aby mechanicznie usunąć pozostałe komórki nadal przyczepione do dna studzienki. Dodaj roztwór z dołków do 15-mililitrowej probówki, a następnie dodaj pięć mililitrów świeżej pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę.Odpipetować 450 mikrolitrów odczynnika zawierającego barwniki wiążące DNA w probówce do mikrowirówki. Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Wylicz komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Rozcieńczyć wszystkie próbki do stężenia jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr pożywką do hodowli komórkowych przed przystąpieniem do testów apoptozy. Aby wykryć eksternalizację fosfatydyloseryny za pomocą aneksyny V, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej.Do tego dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny 1:1 fluorescencyjnej sprzężonej aneksyny V i odczynnika 7-AAD. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, chronić przed światłem. W celu analizy depolaryzacji błony mitochondrialnej należy rozpocząć od odwirowania 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o stężeniu 300 razy G przez pięć minut, a następnie odrzucić supernatant.Ponownie zawieś ogniwa w jednym mililitrze 1X PBS. Do każdej próbki dodać 100 mikrolitrów roztworu barwiącego TMRE i wymieszać zawiesinę przez delikatne pipetowanie wsteczne. Zawiń próbki w czystą folię aluminiową, aby chronić je przed światłem i inkubuj komórki przez 20 minut w wilgotnym środowisku CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji dodać do próbki roztwór roboczy 7-AAD i wymieszać. Aby wykryć aktywowaną końcową kaspazę-3 i 7, zacznij od rozcieńczenia peptydu wiążącego DNA związanego z DEVE w DMSO w stosunku 1:8 sterylnym 1X PBS, aby uzyskać działający roztwór do wykrywania kaspazy. Przechowuj roztwór na lodzie lub dodaj od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.Dodaj dwa mikrolitry roztworu podstawowego 7-AAD do 148 mikrolitrów 1X PBS, aby uzyskać roztwór roboczy 7-AAD. Roztwór należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Odwirować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach 1X PBS, a następnie w pięciu mikrolitrach roztworu roboczego do wykrywania kaspazy i dokładnie wymieszać. Poluzuj nakrętkę probówek i inkubuj przez 30 minut w wilgotnym środowisku CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Dodać 150 mikrolitrów roztworu roboczego 7-AAD do każdej próbki i wymieszać.Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. W celu wykrycia pęknięć dwuniciowego DNA i całkowitego uszkodzenia DNA, najpierw odwirować 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej przez pięć minut przy 300 razy G i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach 1X PBS i dodać 500 mikrolitrów buforu utrwalającego na bazie formaldehydu i wymieszać.Próbki należy inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 90 mikrolitrach 1X PBS w probówce do mikrowirówki.Dodać 10 mikrolitrów roztworu przeciwciała do probówki mikrowirówkowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Dodaj 100 mikrolitrów 1X PBS i wiruj przez pięć minut przy 300 razy G. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach 1X PBS.Wymieszać próbkę przez delikatne pipetowanie wsteczne przed załadowaniem próbki do cytometru przepływowego. Sprawdź wydajność analityczną cytometru przepływowego, uruchamiając zestaw kontrolny systemu przyrządu i nie przystępuj do badania próbek, dopóki wszystkie kontrole nie zostaną zakończone i zaliczone. Najpierw załaduj próbkę kontroli ujemnej do cytometru przepływowego i wybierz opcję Uruchom, Dostosuj ustawienia, aby urządzenie zaczęło zasysać próbkę i zapewniało podgląd wykrytych zdarzeń w czasie rzeczywistym.Korzystając z podglądu na żywo, dostosuj progi fluorescencji i rozmiaru komórki. Narysuj prostokątną bramę wokół populacji komórek, przeciągnij znacznik progu, aby wykluczyć szczątki komórkowe, a następnie wybierz pozycję Dalej, Ustaw profil apoptozy, aby kontynuować. Dotknij i przeciągnij znaczniki kwadrantów, aby oddzielić populacje komórek i wykreślić wykryte zdarzenia w czasie rzeczywistym.Wykresy te służą do informowania użytkownika końcowego o prawidłowym rozmieszczeniu znaczników kwadrantowych. Wybierz opcję Dalej, Sprawdź ustawienia, aby kontynuować, aby instrument wyświetlił podsumowanie ustawień. Po przejrzeniu ustawień wybierz pozycję Dalej, Zakończ ustawienia, aby zastosować te ustawienia do wszystkich próbek w eksperymencie.Wymieszać pierwszą próbkę, delikatnie pipetując wstecznie, a następnie załadować pierwszą próbkę do cytometru przepływowego. Wybierz pozycję Dalej, a następnie nazwij przykład i wybierz pozycję Uruchom, aby system rozpoczął uruchamianie przykładu. W razie potrzeby wykonaj precyzyjne dostrojenie bramek lub znaczników kwadrantów po akwizycji.Znajdź eksperyment, który wymaga dostosowania, przechodząc do systemowej przeglądarki plików i otwórz eksperyment. Stuknij w podgląd miniatury działki, aby ją powiększyć. Aby dostosować znaczniki kwadrantu, kliknij przecięcie linii pionowych i poziomych, aby przesunąć znaczniki tak, jak są, a następnie dostosuj kąt dowolnej linii, klikając linię i przeciągając uchwyt.Aby doprecyzować bramkowanie komórek, kliknij zakładkę Brama i dostosuj wymiary bramy. Dostosuj znaczniki zgodnie z potrzebami i zastosuj te ustawienia do wszystkich próbek w eksperymencie, wybierając ikonę znacznika wyboru, zaznaczając wszystkie próbki i wybierając pozycję Zaakceptuj. Przeprowadź testy w trzech egzemplarzach i przeprowadź analizę wariancji za pomocą testu Bonferroniego post hoc, aby ocenić znaczące różnice między próbkami a kontrolami.Wyniki liczby komórek i żywotności wykazały, że 95,2% komórek w próbce było żywych, a 4,8% martwych. Stwierdzono, że stężenie komórek wynosi 5,90 razy 105 komórek na mililitr. Test aneksyny V i śmierci komórki wykazał znaczny wzrost komórek apoptotycznych w komórkach SiHa traktowanych 100 nanogramami na mililitr aktynomycyny D, w porównaniu z kontrolami.Mitochondrialny elektrochemiczny test potencjału transbłonowego wykazał znaczny spadek profili zdrowia komórek między aktynomycyną-D, kontrolą pożywki i kontrolą rozpuszczalnika, co sugerowało, że 100 nanogramów na mililitr aktynomycyny D indukowało depolaryzację mitochondriów w komórkach SiHa. Test kaspazy-3 i 7 wykazał znaczącą aktywację końcowych kaspaz w komórkach SiHa traktowanych 100 nanogramami na mililitr aktynomycyny D, w porównaniu z kontrolami. Aktynomycyna D znacząco indukowała markery uszkodzenia DNA, ATM i H2A.X w komórkach SiHa, co sugerowało znaczny wzrost uszkodzeń DNA. Aby zwiększyć dokładność, upewnij się, że zbierasz całą populację komórek. Należy również przestrzegać zalecanych przez producenta stężeń komórek i czasów barwienia.Ochrona barwionych próbek przed światłem pozwala uniknąć fotowybielania lub fluoroforów. Analiza biochemiczna apoptozy metodą cytometrii przepływowej powinna być wsparta mikroskopią. Pozwoli to zidentyfikować cechy morfologiczne klasycznej apoptozy.Cechy obejmują kondensację jądrową, mieszanie błon komórkowych, ciała apoptotyczne i kariortoeksję.

flow-cytometric-analysis-apoptotic-biomarkers-actinomycin-d-treated

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano dokładną metodę oceny śmierci komórek. Protokół ten stanowi ulepszenie konwencjonalnych protokołów z użyciem Annexin V/jodku propidyny (PI), które wykazują do 40% wyników fałszywie dodatnich w liniach komórkowych i komórkach pierwotnych pochodzących z szerokiej gamy modeli zwierzęcych.

Zmodyfikowany test apoptozy z użyciem Annexin V i jodku propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórek

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek apoptotycznego raka piersi poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i dalsze wykrywanie przejścia komórek raka piersi niebędących komórkami macierzystymi do komórek podobnych do komórek macierzystych raka piersi po odwróceniu apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Tutaj pokazujemy procedury knockdownu FAM83A; testy wykrywające jego wpływ na proliferację, migrację i inwazję komórek raka szyjki macicy; oraz uwrażliwienie tych komórek na cisplatynę. Badanie to stanowi obiecujący gen docelowy dla raka szyjki macicy i punkt odniesienia dla dalszych badań nad lekami.

knockdown FAM83A w celu sprawdzenia jego roli we wzroście komórek raka szyjki macicy i wrażliwości na cisplatynę

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Poznaj analizę cytometryczną biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację wczesnej i późnej apoptozy.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Przeglądaj więcej filmów